KR101700622B1 - 개의 품종 식별을 위한 dna 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별방법 - Google Patents

개의 품종 식별을 위한 dna 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개의 품종식별을 위한 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 개 품종 식별용 DNA 마커, 상기 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 이를 이용한 개 품종 식별방법에 관한 것이다. 본 발명을 활용하면, 보다 신속, 정확하여 경제적으로 개채식별 및 친자감별이 가능하고, 반려견 등록제의 과학적 근거 마련 및 추적이력시스템의 보완 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

개의 품종 식별을 위한 DNA 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별방법 {A DNA marker for breed discrimination of dog and discriminating method using the same}
본 발명은 개의 품종 식별을 위한 DNA 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 indel 좌위를 이용하여 보다 신속, 정확하고 경제적으로 개의 개체식별 및 친자감별을 할 수 있는 DNA 마커, 프라이머 세트, 키트 및 이를 이용한 개 품종 식별방법에 관한 것이다.
개는 전 세계적으로 사육되는 동물이며, 약 200여 품종이 있다. 국내에 애견산업이 성장하고 있지만, 그에 따라 유기견도 증가하고 있는 실정이다. 유기견이 증가함에 따라, 광견병과 같은 질병감염이나 자연파괴와 같은 문제가 대두되고 있다. 따라서 유기견 발생을 줄이기 위해 반려견 등록제 제도를 도입하여 실행되고 있다.
반려견 등록제는 내장형 무선식별장치, 즉 마이크로칩을 동물 몸속에 삽입하는 것과 외장형 무선식별장치를 부착하는 것, 또는 등록인식표를 부착하는 것을 포함한다. 하지만, 내장형 무선식별장치의 경우 반려견의 몸에 이물질을 삽입하여 생기는 부작용에 대한 우려가 있어서 실질적으로 적용이 되지 않고 있는 실정이다. 또한, 외장형인 경우에는 쉽게 분리가 가능하므로 그 실효성에 많은 의문이 있다. 그러므로 보다 안정하고 실용적인 개체식별에 활용 가능한 품종식별 마커에 관한 필요성이 대두되고 있다.
본 발명과 관련된 선행기술로는 한국공개특허공보 제2011-0030808호 (2011.03.24.)가 있다.
본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 신속, 정확하고 경제적으로 개 품종식별을 가능하게 하는 개 품종식별용 DNA 마커를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 이용한 개 품종 식별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 개 품종 식별용 DNA 마커가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 5 내지 12 중 어느 하나의 프라이머 세트로 이루어진, 개 품종 식별용 상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 프라이머 세트를 포함하는 개 품종 식별용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 DNA 마커를 포함하는 개 품종 식별용 마이크로어레이 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물을 제1항의 DNA 마커와 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 개채식별 및 친자감별이 가능하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 마커는 반려견 등록제의 과학적 근거 마련 및 추적이력시스템의 보완 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의한 TCF7L1 유전자 내의 서열번호 1의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 Hypothetical protein 유전자 내의 서열번호 2의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명에 의한 SNTA1 유전자 내의 서열번호 3의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 의한 DFNA5 유전자 내의 서열번호 4의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 개 품종 식별용 DNA 마커가 제공될 수 있다
본 발명에서 사용되는 상기 유전자는 미국국립보건원의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다 (TCF7L1: NC 006599.3, Hypothetical protein: NC 006583.3, SNTA1: NC 006606.3, DFNA5: NC 006596.3)
하기 표 1은 본 발명에 의한 개 게놈상의 DNA 마커를 나타낸다.
Figure 112014108577771-pat00001
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1 내지 4의 마커에서 빨간색으로 표시된 부분은 삽입이 일어난 부분을 나타내며, 서열번호 1에서는 26bp, 서열번호 2에서는 46bp, 서열번호 3에서는 47bp 및 서열번호 4에서는 22bp의 삽입이 각각 존재한다. 또한 상기 표 1에서 밑줄 친 부분은 각각 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머를 나타낸다. 개 품종에 따라서 상기 표 1의 서열번호 2에서는 2bp, 서열번호 3에서는 4bp, 서열번호 4에서는 2bp가 추가적으로 더 삽입될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 5 내지 12 중 어느 하나의 프라이머 세트로 이루어진, 개 품종 식별용 상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트가 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 상기 프라이머는 바람직하게 15~30 염기쌍의 길이로 이루어져 있다.
상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타난다.
유전자 CFA Chr dbSNP 크기 온도 정배열 프라이머 역배열 프라이머
TCF7L1
(서열번호 1)		 CFA557 22 8921725 114 64 ATGACTGGAGCAAGGGGAAC
(서열번호 5)		 ACCATCTCTGGGGAGGG
(서열번호 6)
hypothetical
protein
(서열번호 2)		 CFA608 1 8963260 103 68 CTATTCCCACAGGAGGAGCC

(서열번호 7)		 GGACTGAGCAGGCAGGTGTC

(서열번호 8)
SNTA1
(서열번호 3)		 CFA857 24 9153663 96 64 TTCTACCACACTGCCTGGTC
(서열번호 9)		 ACACATCACAATTGTCACTA
(서열번호 10)
DFNA5
(서열번호 4)		 CFA892 14 9183708 277 66 GTCTTCCTGGACCATCTGCC
(서열번호 11)		 GCCACTGAGGTGAGTCCTGC
(서열번호 12)
상기 프라이머는 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머가 하나의 세트로 구성되며, 서열번호 1의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 2의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 3의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 4의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 프라이머 세트를 포함하는 개 품종 식별용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR 증폭과정에 적용되는 경우, "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명에 있어 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 DNA 마커를 포함하는 개 품종 식별용 마이크로어레이 키트가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 마커에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 있어 대상 시료는 개 일 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 내지 12 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 대립유전자형이 하나 이상이 결실인 경우 (도 1a 및 도 1b의 AA 또는 AB) 잉글리쉬 스프링거 스파니엘이고, 하나 이상이 삽입인 경우 (도 1a 및 도 1b의 AB 또는 BB) 삽살개이고, 하나는 결실이고 다른 하나는 삽입인 경우 (도 1a 및 도 1b의 AB) 동경이 개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 대립유전자형이 하나 이상이 결실인 경우 (도 2a 및 도 2b의 AA 또는 AB)는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘, 독일 세퍼트 또는 라브라도 래트리버이고, 하나 이상이 삽입인 경우 (도 2a 및 도 2b의 AB 또는 BB) 풍산개, 또는 진돗개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 대립유전자형이 하나 이상이 삽입인 경우 (도 3a 및 도 3b의 AB 또는 BB)는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘이고, 하나 이상이 결실인 경우 (도 3a 및 도 3b의 AA 또는 AB)는 풍산개 또는 삽살개이고, 모두 결실인 경우 (도 3a 및 도 3b의 AA)는 독일 세퍼트, 진돗개 또는 동경이 개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 대립유전자형이 하나 이상이 결실인 경우 (도 4a 및 도 4b의 AA 또는 AB) 독일 세퍼트 또는 라브라도래트리버이고, 모두 결실인 경우 (도 4a 및 도 4b의 AA)는 삽살개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
상기 증폭 산물의 동정은 InDel 마커의 경우에는 증폭 산물을 겔 전기영동함으로써 수행될 수 있다. 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 개 품종별 증폭산물의 크기는 표 2에 나타나 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물을 제1항의 DNA 마커와 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 개 품종 식별 방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 있어서 "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.
본 발명에 있어 "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P32 또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1
진도개(JinDo Dog) 12두, 삽살개(Sapsal Dog) 12두, 저먼 세퍼트(German Shepherd) 12두, 라브라도 리트리버(Labrador Retriever) 12두, 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English Springer Spaniel) 12두, 풍산개(PoongSan Dog) 12두, 동경이(DongKangEi) 30두 총 6품종 102두의 혈액 DNA을 이용하여 게놈 DNA를 분리하여 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 실시하였다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 Genomic DNA (20ng/ul) 2μl, 각 프라이머(10pmol) 1.5μl, Hot Start Taq DNA 중합효소(4Unit/μl) 0.2μl , 10X 버퍼 및 2.5μl dNTP 200mM의 조성에 증류수를 채워 총 반응액이 25μl가 되도록 하여, 각 유전자 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 최초 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 대응하는 어닐링 온도에서 40초 그리고 72℃에서 50초 합성시키는 총 35 사이클로 증폭하고 72℃에서 10분 마지막 합성 반응을 실시하는 것에 의해 수행되었다.
PCR 후의 증폭 산물은 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 씨퀀싱 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로파놀 및 에탄올을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet 에 8 μl 의 Hi-Di 포름아미드를 넣었다. 95℃에서 5분간 변성 과정을 거쳐 36 cm의 capillary를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명에 의한 TCF7L1 유전자 내의 서열번호 1의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도면에서 표시되는 AA는 114bp (결실2), BB는 114+26= 140 bp(삽입2), AB는 114bp, 140bp로 (결실+삽입)을 나타낸다. 또한, ESS는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English springer spaniel), PS는 풍산개(Poongsan), GS는 독일세퍼트(German shepherd), JD는 진돗개(Jindo), SAP는 삽살개(Sapsal), LR은 라브라도래트리버(Labrador Retriver), DKE는 동경이개(Dongkange)를 각각 나타낸다.
실시예 2
진도개(JinDo Dog) 12두, 삽살개(Sapsal Dog) 12두, 저먼 세퍼트(German Shepherd) 12두, 라브라도 리트리버(Labrador Retriever) 12두, 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English Springer Spaniel) 12두, 풍산개(PoongSan Dog) 12두, 동경이(DongKangEi) 30두 총 6품종 102두의 혈액 DNA을 이용하여 게놈 DNA를 분리하여 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 실시하였다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 Genomic DNA (20ng/μl) 2μl, 각 프라이머(10pmol) 1.5μl, Hot Start Taq DNA 중합효소(4Unit/ul) 0.2μl , 10X 버퍼 및 2.5μl dNTP 200mM의 조성에 증류수를 채워 총 반응액이 25μl가 되도록 하여, 각 유전자 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 최초 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 대응하는 annealing 온도에서 40초 그리고 72℃에서 50초 합성시키는 총 35 사이클로 증폭하고 72℃에서 10분 마지막 합성 반응을 실시하는 것에 의해 수행되었다.
PCR 후의 증폭 산물은 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 씨퀀싱 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로파놀 및 에탄올을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet 에 8 μl 의 Hi-Di 포름아미드를 넣었다. 95℃에서 5분간 변성 과정을 거쳐 36 cm 의 capillary를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 Hypothetical protein 유전자 내의 서열번호 2의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도면에서 나타난 AA는 103bp (결실2), BB는 103+(46+2)= 149~151bp(삽입2), AB는 103bp, 149~151bp로 (결실+삽입)을 나타낸다. 또한, ESS는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English springer spaniel), PS는 풍산개(Poongsan), GS는 독일세퍼트(German shepherd), JD는 진돗개(Jindo), SAP는 삽살개(Sapsal), LR은 라브라도래트리버(Labrador Retriver), DKE는 동경이개(Dongkange)를 각각 나타낸다.
실시예 3
진도개(JinDo Dog) 12두, 삽살개(Sapsal Dog) 12두, 저먼 세퍼트(German Shepherd) 12두, 라브라도 리트리버(Labrador Retriever) 12두, 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English Springer Spaniel) 12두, 풍산개(PoongSan Dog) 12두, 동경이(DongKangEi) 30두 총 6품종 102두의 혈액 DNA을 이용하여 게놈 DNA를 분리하여 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 실시하였다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 Genomic DNA (20ng/μl) 2μl, 각 프라이머(10pmol) 1.5μl, Hot Start Taq DNA 중합효소(4Unit/ul) 0.2μl , 10X 버퍼 및 2.5μl dNTP 200mM의 조성에 증류수를 채워 총 반응액이 25μl가 되도록 하여, 각 유전자 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 최초 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 대응하는 어닐링 온도에서 40초 그리고 72℃에서 50초 합성시키는 총 35 사이클로 증폭하고 72℃에서 10분 마지막 합성 반응을 실시하는 것에 의해 수행되었다.
PCR 후의 증폭 산물은 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 씨퀀싱 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로파놀 및 에탄올을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet 에 8 μl 의 Hi-Di 포름아미드를 넣었다. 95℃에서 5분간 변성 과정을 거쳐 36 cm 의 capillary를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명에 의한 SNTA1 유전자 내의 서열번호 3의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도면에서 나타난 AA는 96bp (결실2), BB는 96+(49+4)= 143~147bp(삽입2), AB는 96bp, 143~147bp로 (결실+삽입)을 나타낸다. 또한, ESS는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English springer spaniel), PS는 풍산개(Poongsan), GS는 독일세퍼트(German shepherd), JD는 진돗개(Jindo), SAP는 삽살개(Sapsal), LR은 라브라도래트리버(Labrador Retriver), DKE는 동경이개(Dongkange)를 각각 나타낸다.
실시예 4
진도개(JinDo Dog) 12두, 삽살개(Sapsal Dog) 12두, 저먼 세퍼트(German Shepherd) 12두, 라브라도 리트리버(Labrador Retriever) 12두, 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English Springer Spaniel) 12두, 풍산개(PoongSan Dog) 12두, 동경이(DongKangEi) 30두 총 6품종 102두의 혈액 DNA을 이용하여 게놈 DNA를 분리하여 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 실시하였다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 Genomic DNA (20ng/μl) 2μl, 각 프라이머(10pmol) 1.5μl, Hot Start Taq DNA 중합효소(4Unit/μl) 0.2μl , 10X 버퍼 및 2.5μl dNTP 200mM의 조성에 증류수를 채워 총 반응액이 25μl가 되도록 하여, 각 유전자 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 최초 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 대응하는 annealing 온도에서 40초 그리고 72℃에서 50초 합성시키는 총 35 사이클로 증폭하고 72℃에서 10분 마지막 합성 반응을 실시하는 것에 의해 수행되었다.
PCR 후의 증폭 산물은 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 씨퀀싱 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로파놀 및 에탄올을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet 에 8 μl 의 Hi-Di formamide를 넣었다. 95℃에서 5분간 변성 과정을 거쳐 36 cm 의 capillary를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 의한 DFNA5 유전자 내의 서열번호 4의 indel 좌위별 유전자형과 유전자빈도를 분석한 결과를 나타낸다.
도면에서 나타난 AA는 277bp (결실2), AB는 227, 227+(22+2)= 299~302 bp(삽입2), BB는 302bp로 (결실+삽입)을 나타낸다. 또한, ESS는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘(English springer spaniel), PS는 풍산개(Poongsan), GS는 독일세퍼트(German shepherd), JD는 진돗개(Jindo), SAP는 삽살개(Sapsal), LR은 라브라도래트리버(Labrador Retriver), DKE는 동경이개(Dongkange)를 각각 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> A DNA marker for breed discrimination of dog and discriminating method using the same <130> NPF-26783 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 140 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 1 atgactggag caaggggaac ctgacctcag cgatgggctc ttggtataca atggttggtg 60 agctgttgtg agtgtccccc acaaaatgat ggaggtgggg gtgggggtga tggtaagcat 120 gtgccctccc cagagatggt 140 <210> 2 <211> 149 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 2 ctattcccac aggaggagcc aacagacaca aacaggaaaa cagcacacag gccaggccca 60 actgcaaaca gggggcttct agatgcacat aatgtgcagt tctgatcaga ttgcccatga 120 ccctgcaggg acacctgcct gctcagtcc 149 <210> 3 <211> 143 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 3 ttctaccaca ctgcctggtc agagacttta gcttagagcc tccttctaag ctctatagct 60 ctttagctta gagcctcctc taagcctcta tagtgatata gaacataaat taaactctta 120 tgaattagtg acaattgtga tgt 143 <210> 4 <211> 299 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 4 gtcttcctgg accatctgcc ttttcgagag tttgcatacg gggacatgcc agatgctggg 60 cagggatcat ctgccctgga ttggccgttg gatgttttaa aacaaggtat tgcctgcagg 120 gtgaggtgtg gtgagctgat ggctactcga gcactgcggt gcaagaggtg atgtggcctt 180 catgagccat gactccttag agatgtaata gagaacattt gagaaccgag ttggacctca 240 gttggacctc agaggacagt gcctccaagt tggacctcag caggactcac ctcagtggc 299 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 atgactggag caaggggaac 20 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 accatctctg gggaggg 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 ctattcccac aggaggagcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ggactgagca ggcaggtgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ttctaccaca ctgcctggtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 acacatcaca attgtcacta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gtcttcctgg accatctgcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 gccactgagg tgagtcctgc 20

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1의 염기서열을 증폭하기 위한 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 2의 염기서열을 증폭하기 위한 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 3의 염기서열을 증폭하기 위한 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 4의 염기서열을 증폭하기 위한 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 개 품종 식별용 조성물.
  3. 제2항 기재의 조성물을 포함하는 개 품종 식별용 키트.
  4. 삭제
  5. 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항 기재의 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 서열번호 1 내지 4의 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 증폭된 산물을 검출하는 단계는 상기 증폭된 산물을 겔 전기영동하여 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 서열번호 1의 표적 서열의 유전자 삽입에 따른 대립유전자형 AA, AB 및 BB 중 대립유전자형이
    AA 및 AB만 있는 경우는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘이고,
    AB 및 BB만 있는 경우는 삽살개이고,
    AB만 있는 경우는 동경이 개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 서열번호 2의 표적 서열의 유전자 삽입에 따른 대립유전자형 AA, AB 및 BB 중 대립유전자형이
    AA 및 AB만 있는 경우는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘, 독일 세퍼트 또는 라브라도 래트리버이고,
    AB 및 BB만 있는 경우는 풍산개, 또는 진돗개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 서열번호 3의 표적 서열의 유전자 삽입에 따른 대립유전자형 AA, AB 및 BB 중 대립유전자형이
    AB 및 BB만 있는 경우는 잉글리쉬 스프링거 스파니엘이고,
    AA 및 AB만 있는 경우는 풍산개 또는 삽살개이고,
    AA만 있는 경우는 독일 세퍼트, 진돗개, 또는 동경이 개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 서열번호 4의 표적 서열의 유전자 삽입에 따른 대립유전자형 AA, AB 및 BB 중 대립유전자형이
    AB 및 BB만 있는 경우는 독일 세퍼트 또는 라브라도래트리버이고,
    AA만 있는 경우는 삽살개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
  11. 삭제
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