KR102019993B1 - 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법 - Google Patents

소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소의 성 및 품종 판별을 위한 성염색체 표지인자 및 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)를 이용한 다중(Multiplex) PCR을 통하여 종래 기술보다 신속, 정확하고 경제적으로 소의 성 판별, 품종, 개체 식별, 친자감정을 할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법{Composition for discrimination of sex and breed for cattle, and discriminating method using the same}
본 발명은 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 소의 성 및 품종 판별을 위한 성염색체 표지인자 및 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)를 이용한 다중(Multiplex) PCR을 통하여 종래 기술보다 신속, 정확하고 경제적으로 소의 성 판별, 품종, 개체 식별, 친자감정을 할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
우리나라 식생활에서 외식이 크게 증가하고 있는 가운데, 최근 광우병, 구제역 등의 발병으로 인하여 쇠고기에 대한 소비자의 불안감이 커지고 있어 보다 위생적이고 안전한 축산물에 대한 소비자들의 요구가 급속히 증가하고 있다.
이에 국내산 쇠고기에 대한 소비자의 선호도가 증가하고 있으나, 일부 음식점에서는 수입육 또는 국내산 육우를 한우로 둔갑 판매하는 사례가 늘어나 성실한 생산업자에게 불측의 손해를 끼칠 뿐만 아니라, 소비자의 올바른 인식을 저해하고 시장을 교란하고 있는 실정이다. 또한, 외국산 쇠고기의 수입으로 국내의 한우산업 구조로는 저렴한 수입육과의 경쟁에서 살아남을 수 있는 경쟁력이 절대적으로 부족하다.
따라서, 축산물 유통에 대한 거래내역을 기록, 관리함으로써 축산물 유통에 대한 투명성을 높여, 원산지 허위표시 등 둔갑 판매 방지로 축산업 및 관련 산업의 건전한 발전에 이바지하기 위하여 쇠고기 이력제 관련 DNA 동일성 검사가 실시되고 있다.
다양한 동식물에 대한 품종 식별 및 성판별을 위해 생명공학기술을 이용한 유전자 마커들이 계속 개발 및 이용 중이다. 특히 축산업에서 암수 성비의 조절은 축군의 규모를 결정함과 동시에 도체의 등급을 결정하는 가장 중대한 요소 중 하나이다.
따라서, 축산물 이력제 관련 DNA 동일성 검사를 보완할 수 있는 기술력 향상이 필요한 실정이며, 보다 신속하고, 정확하게 품종을 식별하고, 친자 감정 및 성 판별 분석을 할 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 배경기술로는 대한민국 등록특허공보 제10-1360238호(2014.02.14.)가 있다.
본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 신속, 정확하고 경제적으로 소의 성 판별, 품종, 개체 식별, 및 친자감정을 가능하게 하는 성염색체 표지인자 및 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker) 및 성염색체 표지인자 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 소의 성 및 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 중 적어도 1 이상의 프라이머 세트를 포함하는 소의 성 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트를 포함하는 소의 성 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하여 소의 품종 판별이 추가로 가능한 소의 성 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 소의 성 판별용 조성물을 포함하는 소의 성 판별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 소 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; 추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 상기 기재된 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 및 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 성별 및 품종을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭된 산물이 216bp 및 156bp인 경우 수소라고 판별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트를 포함하는 소의 성 및 품종 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 30의 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 및 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 소의 성별 및 품종을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소는 영암한우, 장흥한우, 브라운 스위스, 리무진, 앵거스, 심멘탈, 헤어포드, 샤룰레, 또는 홀스타인 것을 특징으로 하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, PCR 증폭만으로 소의 암수를 동시에 신속하고 정확하게 판별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 최근 체세포 복제 및 수정란 이식 등을 통하여 암수 맞춤형 동물 생산에도 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 성판별, 품종 식별, 개체 식별, 및 친자감정이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 쇠고기 이력제의 기술적 향상 및 추적이력 시스템의 보완 등에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 중 적어도 1 이상의 프라이머 세트를 포함하는 소의 성 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 소의 성 판별 유전자 마커인 CattleX_1 및/또는 CattleY_2를 PCR 증폭하여 소의 암수를 동시에 신속하고 정확하게 판별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 최근 체세포복제 및 수정란 이식 등을 통하여 암수 맞춤형 동물 생산에도 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머들의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 상기 구성에 의하여, 성 판별을 보다 정확하게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하여 소의 품종 판별이 추가로 가능한 소의 성 판별용 조성물이 제공된다.
상기한 구성에 의하면, 소의 성 판별 뿐만 아니라 소의 품종, 개체식별 및 친자감정도 동시에 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명의 소의 성 판별용 조성물을 포함하는 소의 성 판별용 키트가 제공된다.
본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 성별을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭된 산물이 216bp 및 156bp인 경우 수소라고 판별할 수 있다. 또한, 상기 증폭된 산물이 216bp인 경우 암소라고 판별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트를 포함하는 소의 성 및 품종 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 30의 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 및 상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 소의 성별 및 품종을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소는 영암한우, 장흥한우, 브라운 스위스, 리무진, 앵거스, 심멘탈, 헤어포드, 샤룰레, 또는 홀스타인 것을 특징으로 하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
본 발명에 있어서, 대상 소 시료로부터 핵산을 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시료에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
본 발명에 있어서, PCR 조건은 95℃에서 15분간의 첫 반응을 시작으로 94℃에서 60초간 변성, 60℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 9cycle, 94℃에서 60초간 변성, 59℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 5cycle, 94℃에서 60초간 변성, 58℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 25cycle을 실시한 후, 마지막으로 65℃에서 30분간 최종 신장반응을 실시할 수 있으나, 통상의 기술자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
본 발명에 있어서, PCR 증폭 산물의 DNA를 크기별 분석은 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3730 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 PCR 단계에서 수행한다.
한편, 본 발명은 소의 유전자 개체식별/친자감정 및 성판별을 위한 다중(Multiplex) PCR 방법을 통한 유전자 감식방법으로서 선정된 초위성체 마커들은 한우 차세대염기서열결정 정보를 통한 Tandem Repeat Finder program을 구동하여 microsatellite genetic loci를 선정하였고, 성판별은 성염색체상의 ZFP 유전자 염기서열의 길이 차이를 활용하여 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp.), 증폭산물의 크기(Product Size) 형광물질(Dye) 등을 고려하여 최종적으로 총 15개 유전자 마커로 구성된 1개 세트로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)이 가능하도록 조합되었다.
본 명세서에서 사용된 "초위성체(Microsatellites)"란 진핵세포(eukaryotes) 유전자 전역에 걸쳐 분포하는 모노-, 디-, 트리- 및 테트라뉴클레오타이드 형태의 짧은 반복 염기서열을 의미한다. 일반적으로 이러한 반복서열은 염색체 내에서 10 내지 40 번 정도 단순반복(tandem repeat)된 형태로 존재한다.
본 명세서 사용된 "초위성체 마커(Microsatellite Marker)"란 마이크로새틀라이트를 이용한 DNA 다형검출 마커를 의미한다. 개체마다 마커들의 유전자형 조합에 특이성을 나타내므로 충분한 수의 마커의 조합으로 품종 식별은 물론 개체 식별도 가능하다. 유전자 감식기법의 정확성 및 신속성을 높이기 위해서는 많은 초위성체 마커를 대상으로 조사가 수행되어야 하는데, 많은 초위성체를 대상으로 유전자 감식을 수행할 경우에는 수많은 초위성체 마커들 마다의 대립유전자 확인에 따른 시간과 인력의 소모라는 문제점이 있었다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해 한 번의 PCR 반응에 여러 표지인자의 프라이머를 넣고 동시에 반응을 수행하는 다중 PCR(multiplex-PCR) 방법이 유용하다.
본 발명의 상기 마커 조성물은 BZSY, BZSX, BHXC29, BPC113, BPC115, BPC19, BPC21, BPC7, BTEC17, BTEC4, BTRC11, BTRC16, BTRC19, BTRC6, BTRC9로 이루어지며, 각 마커는 표 1에 나타난 서열번호 1 내지 30으로 표시되는 해당 정방향 및 역방향 프라이머 세트로 증폭된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소는 영암한우, 장흥한우, 브라운 스위스, 리무진, 앵거스, 심멘탈, 헤어포드, 샤룰레, 또는 홀스타인 것을 특징으로 하는 소의 성 및 품종 판별 방법이 제공된다.
하기 표 1은 상기 소의 유전자 마커(2개 성판별 마커 및 13개 초위성체 마커)를 나타내었으며, 염색체 위치, 프라이머 염기 서열, 증폭산물 크기, 형광염색방법, 서열번호를 나타낸 것이다.
Figure 112017101114774-pat00001
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
실시예
본 발명에 이용된 공시재료는 축산과학원에서 보유한 영암한우 30두, 장흥한우 30두, 브라운스위스 19두, 리무진 20두, 앵거스 18두, 심멘탈 15두, 해어포드 21두, 샤룰레(12두), 홀스타인(10두) 총 9품종 185두의 혈액으로부터 게놈 DNA 추출 키트(Promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 genomic DNA(20ng/㎕) 4㎕, 각각의 초위성체 조합별 형광염색 프라이머(10pmole) 세트당 0.3㎕ - 0.4㎕, Hot Start Taq DNA중합효소 (2Unit/㎕) 1.8㎕, 10X buffer 3㎕, 2.5mM dNTP 2.4㎕의 조성에 증류수를 채워 총 반응액은 20㎕가 되도록 하였다. 상기 혼합물은 Thermal Cycler PTC-0240(MJ Research, Inc., MA, USA)을 이용하여 95℃에서 15분간의 첫 반응을 시작으로 94℃에서 60초간 변성, 60℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 9cycle, 94℃에서 60초간 변성, 59℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 5cycle, 94℃에서 60초간 변성, 58℃에서 60초간 결합, 72℃에서 60초간 신장하여 25cycle을 실시한 후, 마지막으로 65℃에서 30분간 최종 신장반응을 실시하였다.
PCR 후의 증폭된 산물은 ABI-3730 DNA 자동 염기서열 분석장치(Applied Biosytems, USA)를 이용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하고, GeneMapper version 4.0(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 PCR산물의 크기와 표지인자의 종류별로 분류하여 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel, USA) 프로그램으로 자료를 수집하였다.
최종적으로 Genotyper Software에 의해 결정되어진 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)별 대립 유전자들은 microsatellite Toolkit software (Park, 2000)를 이용하여 분석 집단별 및 개체별로 정리한 후 전체 집단에 대한 관측 이형접합률 (observed heterozygosity), 대립유전자수 (allele count)를 산출하였다(표 2). 표 2는 소의 품종별 이형접합율의 평균 및 표준오차 및 평균대립유전자수를 나타내고, 표 3은 초위성체 마커의 품종별 증폭산물 크기와 대립유전자수 및 이형접합율을 나타낸다.
Figure 112017101114774-pat00002
Figure 112017101114774-pat00003
또한, 각 표지인자의 9 품종에 대한 기대 및 관측 이형접합율과 PIC은 다양한 값을 나타내고 있음을 확인하였다(표 4). 각 표지인자의 9 품종에 대한 기대 및 관측 이형접합율과 PIC 값을 통하여 13개의 초위성체 마커의 다양성을 확인하였고 개체식별 또는 친자감정 유전자 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다. 표 4는 각 표지인자의 9품종에 대한 기대 및 관측 이형접합율과 PIC값을 나타낸다.
Figure 112017101114774-pat00004
또한, 소의 성판별 마커는 X염색체에서는 216bp 크기로 증폭시켰고, Y염색체에서는 156bp로 증폭시켜서 수소(♂)일 때는 XY이므로 216bp, 156bp로 2개의 피크를 보였고, 암소(♀)일 때는 XX이므로 216bp, 216bp로 1개의 피크로 유전자형을 표현하였다(표 5). 표 5는 소의 성판별 유전자 마커의 증폭산물의 크기(bp)를 나타낸다.
Figure 112017101114774-pat00005
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Composition for discrimination of sex and breed for cattle, and discriminating method using the same <130> NPF-31514 <160> 30 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 agcagttggg agtcacatgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 ggctcaccat gtcctccttc 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 cagcatcctg taagggttat ttg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 ccccatggac tctcttgttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 ctcccatcga gctctttcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 cctacctggc agaggacaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 attccaccca aaaccagtca 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 8 actcattgtc tgaagtgaaa agca 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 9 gcaagaggtc cagatggtgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 10 agagaacaac aaggcgaagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 11 atgaggtggg agaaaagcaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 12 ttctcaggag tacgcaagca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 13 tggatccttt ttggctctgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 14 agcactggca ggtactggag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 15 ccctgacttc cagatcctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 16 aacccagact ggttctgctt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 17 ttcctggttc tccaatttgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 18 ggctttcaaa aggctcaaca 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 19 gggattacat aagtcggtgg a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 20 tgaggcaatc aaaagtccaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 21 cgagagctgc acctaccttc 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 22 cccgagctct ctttcccta 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 23 aagcaaggga aatcattcca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 24 cacctacctg agcggagaag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 25 ccatgcctat tttgtgctga 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 26 actgaggtca agtagggtga tagaa 25 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 27 tggaattttc tttgatagaa ttagcc 26 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 28 tttcccagca gtttttaacg a 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 29 tccacagttt gcttagccat t 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 30 ggtgtggctc tgtgttcctt 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 및
    서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 중 적어도 1 이상의 프라이머 세트를 포함하고,
    서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는,
    소의 성 및 품종 판별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트를 포함하고,
    서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는, 소의 성 및 품종 판별용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 기재된 소의 성 및 품종 판별용 조성물을 포함하는, 소의 성 및 품종 판별용 키트.
  5. 대상 소 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 성별 및 품종을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 증폭된 산물이 216bp 및 156bp인 경우 수소라고 판별하는, 소의 성 및 품종 판별 방법.
  7. 서열번호 1 및 2의 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 제6 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 제7 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 제8 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 제9 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 제10 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 제11 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 제12 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 제13 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 제14 프라이머 세트; 및 서열번호 29 및 30의 제15 프라이머 세트를 포함하는, 소의 성 및 품종 판별용 조성물.
  8. 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
    추출된 상기 핵산을 주형으로 하고, 제7항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 소의 성별 및 품종을 판별하는 단계를 포함하는 소의 성 및 품종 판별 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 소는 영암한우, 장흥한우, 브라운 스위스, 리무진, 앵거스, 심멘탈, 헤어포드, 샤룰레, 또는 홀스타인 것을 특징으로 하는 소의 성 및 품종 판별 방법.
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