KR101787260B1 - 종우 판별을 위한 키트 및 종우 판별 방법 - Google Patents

종우 판별을 위한 키트 및 종우 판별 방법 Download PDF

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단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
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Abstract

본 발명은, 종우의 유전자 중에서 복수의 STR 좌위를 증폭할 수 있는 복수의 프라이머 쌍을 포함하는, 종우 판별 키트 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로서, 종우 또는 종우의 혈통을 정확하게 판별하여 종우의 혈통관리 및 품질관리에 활용할 수 있다.

Description

종우 판별을 위한 키트 및 종우 판별 방법 {A KIT AND THE METHOD FOR DETERMINING SEED BULLS}
본 발명은 종우를 판별할 수 있는 키트 및 이를 이용한 종우 판별 방법에 관한 것이다.
제주 흑우는 제주도에서 사육되어 온 재래 소로, 조선왕조실록, 탐라순력도, 탐라기년 등 옛 문헌에 기록된 바와 같이 진상품으로 공출되며, 국가적으로 엄격히 사육 관리되어온 품종이다. 현재 제주 흑우는 멸종위기 품종으로서 제주에서만 사육되고 있으며 사육두수가 1,600여 마리에 불과하다.
제주 흑우는 모색이 일반 한우와는 구별되는 흑색을 나타내지만, 개체 또는 성장 단계에 따라 모색의 농도 차가 나타날 수 있으며, 불분명한 호반무늬나 갈흑색의 모색이 관찰되는 경우도 있다. 소의 모색은 소의 품종 식별에 중요한 형질에 해당하나, 외래종인 블랙 앵거스(Black angus)는 모색이 흑색이고, 헤어포드(Hereford) 및 일본화우의 일부에서 흑색 또는 어두운 적갈색의 모색을 나타내는 경우가 있어, 모색 만으로 제주 흑우와 명백한 구별을 하는 것은 어렵다. 나아가, 도축된 후의 우육에 대하여 모색을 구별하는 것은 지극히 어려우며, 이와 같은 도축 전의 개체를 육안으로 확인하는 방법 이외의 품종 판별법에 대한 연구가 계속되고 있다.
제주 흑우의 유전자를 분석한 결과, 제주 흑우는 한우, 칡소, 교잡우와는 다른 제주 흑우만의 고유한 혈통을 가진 재래종으로 밝혀졌으며, 현재 제주축산진흥원에서 체계적인 혈통관리 및 사양관리를 하고 있다. 제주 흑우의 혈통을 잘 유지하려면 종우를 판별하여 근친교배를 방지하여 우수한 품종을 이어나갈 수 있도록 관리하는 것이 중요하다. 현재 제주에서 사육되는 흑우 중에서 종우의 개체는 매우 소수인 것으로 알려져 있으며, 이들의 계통을 파악하는 것이 흑우의 혈통관리에 매우 중요하지만, 육안으로는 일반 흑우와 종우를 구별하기 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 일부 종우가 현재 구별되어 있기는 하지만, 향후 이들의 1세대, 2세대 또는 3세대의 자손들에 대하여도 어느 종우의 혈통인지를 파악할 수 있어야, 동일 혈통끼리의 교배를 방지할 수 있으므로, 흑우 종우 혈통을 확인할 수 있는 도구 및 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은, 종우 또는 종우의 혈통을 신속하고 정확하게 구별할 수 있는 키트 및 이를 이용한 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 제1 측면은, 소의 상염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제1 내지 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은, 소의 상염색체 또는 Y염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19 및 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제7 내지 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면은, 소의 Y 염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제13 내지 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍을 이용하여, 상염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은, 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19. 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍을 이용하여, 상염색체 또는 Y염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은, 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍을 이용하여, Y염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 종우 판별 키트 및 종우 판별 방법을 이용하여, 일반 품종과 종우를 신속하고 정확하게 구별할 수 있으며, 이를 이용하여 개체들 사이의 혈통도를 작성할 수 있으며, 또한 품종관리 및 혈통관리에 활용할 수 있는 기초 데이터로 활용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머를 이용하여 증폭되는 유전자의 크기를 비교한 모식도이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
종우의 혈통을 유지하고 근친교배를 방지하여 우수한 품종을 유지할 수 있도록, 각 개체들의 혈통을 파악할 필요가 요구되고 있다. 이에 대하여, 본 발명자들은 STR를 이용하여 종우에 대한 유전자 프로파일을 확립하였다.
현재 개체식별이나 친자감별 등에 활용되고 있는 STR(short tandem repeat)은 논-코돈 (non-coding)부위에 존재하며, 2 내지 8 개 염기의 비교적 짧은 DNA 단편이 반복되어있는 서열로서, 전체 염색체에 고르게 분포되어 있다. STR은 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 간편하고 정확하게 분석될 수 있으며, 대립인자가 많이 존재하여 다형성이 높으므로, 유전자 지도 작성, 개인 식별, 진화 유전학 분야 등에 매우 유용하게 사용되고 있다.
본 명세서에서 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 이루어진 dNTP, 중합효소, 주형 DNA 등등), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머 내에는 프라이머 간의 상보적인 염기서열이 존재하지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "PCR 또는 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)"은, 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법으로서, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있는 방법이다. PCR은 통상적으로 3단계로 이루어지며, 1) 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하는 열변성 과정(denaturation), 2) 프라이머가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)하는 과정, 3) DNA를 합성하는 중합 반응(polymerization or extension)이다.
본 발명은 상기한 과제를 해결하기 위하여, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용할 수 있다. 구체적으로 소의 게놈 DNA에서 STR 부위를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하고, PCR 산물을 분석하여 종우를 판별할 수 있다.
본 발명의 제1 측면은, 소의 상염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
본 발명의 일측에 따른, 상기 프라이머 쌍은 소의 종에 있어서 변이 분석에 적합한 상염색체 상에 위치한 STR 유전자 마커를 증폭할 수 있도록 디자인된 프라이머 쌍일 수 있다.
각각의 프라이머 쌍의 명칭과 유전자 염기서열은 다음과 같다.
Locus 서열번호 방향 프라이머 염기서열 크기 패턴
제1쌍
 ETH152
(D5S1)		 1 정방향 5'-TTGGTGATCAGAGGGCACCT-3' 277bp
 (CA)n
2 역방향 5'-CGGGAAGTAGTAGAAGTCCT-3'
제2쌍
 ILSTS005
(D10S25)		 3 정방향 5'-CGCATTGCAGGCAGATTCTT-3' 246bp (TG)n
4 역방향 5'-AGAAATGTTCTGTGAGTTTGTAAGCA-3'
제3쌍
 BM2113
(D2S26)		 5 정방향 5'-AGACAGCAGACTGATGCAAC-3' 306bp
 (CA)n
6 역방향 5'-CAGAGAAGGTCCTCGGTCAG-3'
제4쌍
 ETH131
(D21S4)		 7 정방향 5'-GGAGGACATGACAACCCACT-3' 243bp
 (CA)n
8 역방향 5'-GGTCAGTGCTGTCTGTTTGC-3'
제5쌍
 ETH10
 9 정방향 5'-AGCCACTGCTTACACTGAAGA-3' 158bp
 (CA)n
10 역방향 5'-TGGGTCTGTAGCTCTGTCCA-3'
제6쌍
 ETH3
 11 정방향 5'-ATGGGAAGGGAAGACCAGGT-3' 219bp
 (TG)n
12 역방향 5'-CAAGGAATTCTCCAGGCAAG-3'
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제1 내지 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은, 소의 상염색체 또는 Y염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19 및 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
본 발명의 일측에 따른, 상기 프라이머 쌍은 소의 종에 있어서 변이 분석에 적합한 상염색체 또는 Y염색체 상에 위치한 STR 유전자 마커를 증폭할 수 있도록 디자인된 프라이머 쌍일 수 있다. Y 염색체 상의 미소위성(Microsatellite) DNA는 부계유전양상을 보이며 재조합의 가능성이 낮으므로, Y 염색체 상의 STR 부분을 증폭할 수 있도록 프라이머 쌍을 디자인 하였다.
각각의 프라이머 쌍의 명칭과 유전자 염기서열은 다음과 같다.
Locus 서열번호 방향 프라이머 염기서열 크기 패턴
제7쌍
 ETH225 13 정방향 5'-GCCAAATGACACATGACAGC-3' 231bp
 (CA)n
14 역방향 5'-ACTTGGGGGAAAAGAGCAAT-3'
제8쌍
 RASA 15 정방향 5'-CGGGTTACGGGAAGAGAAGT-3' 145bp (TG)n
16 역방향 5'-GTGCAGCCAGGAAGTTTTTC-3'
제9쌍
 BM1818
(D23S21)		 17 정방향 5'-TAGGGCTACTGTGTGATCCA-3' 359bp
 (TG)n
18 역방향 5'-GGTTTAGGTTTTTAAATGCCACAT-3'
제10쌍
 ILSTS006
(D7S8)		 19 정방향 5'-GAACTATTTGTCCAGATTCCACA-3' 213bp
 (TG)n
20 역방향 5'-AAGATATGGCGCACACACAC-3'
제11쌍
 UMN0103
 21 정방향 5'-TCACCTGAGACTTAAACACACACA-3' 173bp
 (CA)n
22 역방향 5'-TGCTTGATTGATTGGTTTGC-3'
제12쌍
 UMN0307
 23 정방향 5'-TTGCAAAGAGTCAGATACAG-3' 267bp
 (CA)n
24 역방향 5'-TCTTTCCTGTTTTCCCAACAA-3'
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제7 내지 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면은, 소의 Y 염색체 상의 유전자를 증폭하기 위한, 서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 종우 판별 키트를 제공한다.
본 발명의 일측에 따른, 상기 프라이머 쌍은 소의 종에 있어서 변이 분석에 적합한 Y염색체 상에 위치한 STR 유전자 마커를 증폭할 수 있도록 디자인된 프라이머 쌍일 수 있다. Y 염색체 상의 미소위성(Microsatellite) DNA는 부계유전양상을 보이며 재조합의 가능성이 낮으므로, Y 염색체 상의 STR 부분을 증폭할 수 있도록 프라이머 쌍을 디자인 하였다.
각각의 프라이머 쌍의 명칭과 유전자 염기서열은 다음과 같다.
Locus 서열번호 방향 프라이머 염기서열 크기 패턴
제13쌍
 UMN0929 25 정방향 5'-TAGTTTCATCGGGTGGTAGG-3' 172bp
 (CA)n
26 역방향 5'-CATGATGTTGGTCAGAGAATGAA-3'
제14쌍
 UMN0920 27 정방향 5'-GGACTCTTGCATCTGTATTC-3' 122bp (TG)n
28 역방향 5'-CCACATATCAGGCAAAGTCA-3'
제15쌍
 UMN2404 29 정방향 5'-GCAGGATCTAATGATTTGC-3' 200bp
 (CA)nNn(TA)n
30 역방향 5'-CACTGATATGTTCAAATAGGC-3'
제16쌍
 DYZ-1 31 정방향 5'-GCAAGCAGATTGTTGCGTAT-3' 394bp
 (TG)n
32 역방향 5'-AGGGCTGAAAACTGGTCAAA-3'
제17쌍
 INRA189
 33 정방향 5'-ACATGCTGTGCTGGAAGAGCT-3' 320bp
 (TG)n
34 역방향 5'-ACCTCGTCTCCTTGTAGCCT-3'
제18쌍
 BYM-1
 35 정방향 5'-TATTTGCAGGCACAGAAACG-3' 264bp
 (AC)n
36 역방향 5'-TCCCTTGTTTGAGCTTGACC-3'
일측에 따르면, 상기 종우 판별 키트는 상기 제13 내지 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍을 이용하여, 상염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은, 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19. 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍을 이용하여, 상염색체 또는 Y염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은, 소의 생체 시료를 준비하는 단계; 서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍을 이용하여, Y염색체 상의 6개 구간의 유전자를 각각 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 종우의 STR 프로파일과 비교하여 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 종우 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 소(bovine)의 생체 시료를 준비하는 단계는, 세포 또는 조직을 포함하는 검체로부터 DNA를 분리하는 것을 포함할 수 있으며, 상기 검체는 예를 들어 소의 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기 등일 수 있다. DNA를 분리하는 방법은, 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로, 효소 또는 화학적 방법에 의하여 DNA를 단백질, RNA 및 기타 물질과 같은 오염 물질로부터 실질적으로 분리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 유전자를 증폭하는 단계는, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하는 것일 수 있다. PCR은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 구체적으로 초기 변성(predenaturation), 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)의 순차적 단계를 포함하는 1사이클(cycle)을 반복하여 수행하고, 열사이클(thermal cycle)을 수행하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중합효소연쇄반응에 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, 예를 들어 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow)단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 구체적으로 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, 및 Thermococcus literalis를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 중합효소연쇄반응의 반응액에 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하는 dNTP 혼합물, PCR 완충액(buffer) 및 Mg2+와 같은 DNA 중합 효소 보조인자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 데이터베이스에는 종우의 STR 프로파일이 저장된 것일 수 있다. 종우들의 STR을 미리 분석하여 유전자 프로파일링을 하여, 데이터베이스를 구축한 후, 판별이 필요한 개체의 STR을 분석한 결과와 비교하여, 종우의 혈통을 확인할 수 있다.
<실시예 1: 종우의 유전자 프로파일 확립>
제주 흑우 종우로 알려진 7마리 각 개체로부터 얻은 정액을 1.5 ㎖ 튜브에 분주한 후 H2 buffer 92 ㎕와 DTT 8 ㎕, Proteinase K 20 ㎕를 넣고 56℃ 항온수조에서 1시간 반응시킨 후에 BL buffer 200 ㎕를 넣어준 후 다시 56℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 이후 100 % EtOH 200 ㎕를 넣어주고 최대한의 양을 SV column에 분주하여 8,000 rpm에서 1분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 BW buffer 600 ㎕와 TW buffer 700 ㎕를 넣어준 후 각각 8,000 rpm에서 1분간 원심분리 하였으며, 최종적으로 13,000 rpm에서 1분간 원심분리를 진행하였다. DNA는 AE buffer 200 ㎕를 분주한 후 8,000 rpm의 원심분리를 이용하여 1.5 ㎖ 튜브에 용해시켰다.
추출된 DNA를 대상으로 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 20 ㎕ PCR반응 용액(2 ㎕의 10ㅧ 버퍼, 2 mM MgCl2, 1mM dNTPs, 각 10 pmol/㎕의 1쌍의 프라이머)과 20 ng의 주형 DNA, 1 U의 NV DNA 중합효소(NAVI BioTech사, Korea)를 0.2 ㎖ PCR 반응 튜브에 넣은 후, C1000 TouchTM Thermal Cycler(Bio-Rad 사, CA)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
Locus PCR condition
Initial
denaturaion		 Denaturation Annealing Extension Cycle Final denaturation
ETH152 95℃ 5분 95℃ 1분 59℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ILSTS005 95℃ 5분 95℃ 1분 55℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
BM2113 95℃ 5분 95℃ 1분 56℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ETH131 95℃ 5분 95℃ 50초 55℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ETH10 95℃ 5분 95℃ 1분 65℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ETH3 95℃ 5분 95℃ 50초 64℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ETH225 95℃ 5분 95℃ 1분 10초 57℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
RASA 95℃ 5분 95℃ 1분 10초 63℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
BM1818 95℃ 5분 95℃ 1분 58℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
ILSTS006 95℃ 5분 95℃ 1분 56℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
UMN0103 95℃ 5분 95℃ 1분 10초 58℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
UMN0307 95℃ 5분 95℃ 1분 58℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
UMN0929 95℃ 5분 95℃ 1분 61℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
UMN0920 95℃ 5분 95℃ 1분 10초 61℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
UMN2404 95℃ 5분 95℃ 1분 54℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
DYZ-1 95℃ 5분 95℃ 1분 60℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
INRA189 95℃ 5분 95℃ 1분 58℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
BYM-1 95℃ 5분 95℃ 1분 58℃ 72℃ 10분 38 72℃ 10분
상기 PCR 산물은 정제과정을 거친 후 Sanger sequencing 방법을 이용하여 STR반복 수를 계산하였다.
흑우 1 흑우 2 흑우 3 흑우 4 흑우 5 흑우 6 흑우 7
ETH152
(D5S1)		 (CA)13 (CA)12 (CA)11 (CA)13 (CA)13 (CA)12 (CA)13
ILSTS005
(D10S25)		 (TG)6 (TG)12 (TG)12 (TG)12 (TG)9 (TG)12 (TG)12
BM2113
(D2S26)		 (CA)22 (CA)19 (CA)19 (CA)19 (CA)14 (CA)20 (CA)19
ETH131
(D21S4)		 (CA)18 (CA)20 (CA)19 (CA)18 (CA)19 (CA)19 (CA)19
ETH10 (CA)14 (CA)18 (CA)18 (CA)11 (CA)18 (CA)19 (CA)18
ETH3 (TG)7 (TG)6 (TG)7 (TG)17 (TG)20 (TG)8 (TG)7
ETH225 (CA)14 (CA)14 (CA)13 (CA)15 (CA)13 (CA)14 (CA)12
RASA (TG)9 (TG)11 (TG)11 (TG)11 (TG)11 (TG)13 (TG)11
BM1818
(D23S21)		 (TG)18 (TG)16 (TG)19 (TG)18 (TG)19 (TG)19 (TG)17
ILSTS006
(D7S8)		 (TG)19 (TG)19 (TG)21 (TG)19 (TG)19 (TG)20 (TG)21
UMN0103 (CA)12 (CA)12 (CA)13 (CA)13 (CA)11 (CA)9 (CA)13
UMN0307 (CA)15 (CA)14 (CA)14 (CA)13 (CA)14 (CA)14 (CA)14
UM0N929 (CA)13 (CA)14 (CA)14 (CA)21 (CA)21 (CA)14 (CA)14
UMN0920 (TG)8 (TG)8 (TG)4 (TG)4 (TG)4 (TG)6 (TG)4
UMN2404 (CA)6N22
(TA)2 		(CA)6N21
(TA)5 		(CA)7N7
(TA)2 		(CA)6N23
(TA)5 		(CA)6N26
(TA)2 		(CA)8N18
(TA)2 		(CA)6N22
(TA)2
DYZ-1 (TG)14 (TG)14 (TG)14 (TG)11 (TG)14 (TG)14 (TG)14
NRA189 (TG)14 (TG)23 (TG)15 (TG)20 (TG)21 (TG)21 (TG)14
BYM-1 (AC)24 (AC)24 (AC)24 (AC)25 (AC)24 (AC)24 (AC)25
상기 표 5를 참고하면, 7마리의 종우 간에 뚜렷한 STR 반복수 차이가 있는 바, 이를 이용하여, 종우의 혈통을 추적하여 혈통관리에 활용할 수 있다.
<실시예 2: 종우 혈통 판별>
종우 혈통 판별을 위해 추출된 DNA는 상기 측면에서 기술된 18개의 STR 좌위를 증폭하기 위해 설계된 프라이머를 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하였다. 본 발명의 프라이머 세트는 한번의 PCR 수행으로 동시에 6개 STR 좌위를 증폭시킬 수 있도록 구성될 수 있으며, 총 3번의 다중 중합효소 연쇄반응으로 18개의 STR 좌위를 확인 할 수 있다.
다중 중합효소 연쇄반응의 수행은 20 ㎕의 PCR반응 용액(2 ㎕의 10ㅧ 버퍼, 2 mM MgCl2, 1mM dNTPs, 10 pmol/㎕의 프라이머)과 20 ng의 주형 DNA, 1 U의 NV DNA 중합효소(NAVI BioTech사, Korea)를 0.2 ㎖ PCR 반응 튜브에 넣은 후, C1000 TouchTM Thermal Cycler(Bio-Rad 사, CA)를 사용하여 수행하였다. 다중 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭된 18개의 STR 좌위는 1차적으로 2% agarose gel에서 전기영동(electrophoresis)을 통해 중폭산물을 분류하고 증폭여부를 확인하였다. 전기영동이 끝난 gel에서 분류된 증폭산물이 포함되어 있는 DNA band들을 수술용 메스를 이용하여 오려낸 후 gel 정제방법으로 DNA를 추출하였다. 이후, 추출된 DNA를 주형으로 서열분석을 수행하여 각 좌위의 STR 반복 수를 확인하였다. 분석된 18개 STR 좌위의 반복 수 변이를 상기 표 1에서 제시된 7마리 종우의 18개 STR 좌위의 반복 수 변이와 비교하여 혈통을 판별하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, DANKOOK UNIVERSITY <120> A KIT AND THE METHOD FOR DETERMINING SEED BULLS <130> APC-2016-0185 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ETH152 <400> 1 ttggtgatca gagggcacct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ETH152 <400> 2 cgggaagtag tagaagtcct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ILSTS005 <400> 3 cgcattgcag gcagattctt 20 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ILSTS005 <400> 4 agaaatgttc tgtgagtttg taagca 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying BM2113 <400> 5 agacagcaga ctgatgcaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying BM2113 <400> 6 cagagaaggt cctcggtcag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ETH131 <400> 7 ggaggacatg acaacccact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ETH131 <400> 8 ggtcagtgct gtctgtttgc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ETH10 <400> 9 agccactgct tacactgaag a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ETH10 <400> 10 tgggtctgta gctctgtcca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ETH3 <400> 11 atgggaaggg aagaccaggt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ETH3 <400> 12 caaggaattc tccaggcaag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ETH225 <400> 13 gccaaatgac acatgacagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ETH225 <400> 14 acttggggga aaagagcaat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying RASA <400> 15 cgggttacgg gaagagaagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying RASA <400> 16 gtgcagccag gaagtttttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying BM1818 <400> 17 tagggctact gtgtgatcca 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying BM1818 <400> 18 ggtttaggtt tttaaatgcc acat 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying ILSTS006 <400> 19 gaactatttg tccagattcc aca 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying ILSTS006 <400> 20 aagatatggc gcacacacac 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying UMN0103 <400> 21 tcacctgaga cttaaacaca caca 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying UMN0103 <400> 22 tgcttgattg attggtttgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying UMN0307 <400> 23 ttgcaaagag tcagatacag 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying UMN0307 <400> 24 tctttcctgt tttcccaaca a 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying UMN0929 <400> 25 tagtttcatc gggtggtagg 20 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying UMN0929 <400> 26 catgatgttg gtcagagaat gaa 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying UMN0920 <400> 27 ggactcttgc atctgtattc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying UMN0920 <400> 28 ccacatatca ggcaaagtca 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying UMN2404 <400> 29 gcaggatcta atgatttgc 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying UMN2404 <400> 30 cactgatatg ttcaaatagg c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying DYZ-1 <400> 31 gcaagcagat tgttgcgtat 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying DYZ-1 <400> 32 agggctgaaa actggtcaaa 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying INRA189 <400> 33 acatgctgtg ctggaagagc t 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying INRA189 <400> 34 acctcgtctc cttgtagcct 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying BYM-1 <400> 35 tatttgcagg cacagaaacg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying BYM-1 <400> 36 tcccttgttt gagcttgacc 20

Claims (9)

  1. 제주흑우 상염색체 또는 Y염색체 상의 특이적 유전자를 증폭하기 위한,
    서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 제1 프라이머 세트;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19 및 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 제2 프라이머 세트; 및
    서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 제3 프라이머 세트;를 포함하는, 제주흑우의 종우 판별용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제주흑우의 생체 시료를 준비하는 단계;
    서열번호 1 및 서열번호 2의 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8의 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10의 제5 프라이머 쌍, 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 제6 프라이머 쌍으로 이루어진 제1 프라이머 세트를 이용하여, 상염색체 상의 6개 구간의 제주흑우 특이적 유전자를 각각 증폭하는 단계;
    서열번호 13 및 서열번호 14의 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 서열번호 16의 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 및 서열번호 18의 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19. 서열번호 20의 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 및 서열번호 22의 제11 프라이머 쌍, 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 제12 프라이머 쌍으로 이루어진 상염색체 또는 Y염색체 상의 6개 구간의 제주흑우 특이적 유전자를 각각 증폭하는 단계;
    서열번호 25 및 서열번호 26의 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 및 서열번호 28의 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 및 서열번호 30의 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 및 서열번호 34의 제17 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 및 서열번호 36의 제18 프라이머 쌍으로 이루어진 Y염색체 상의 6개 구간의 제주흑우 특이적 유전자를 각각 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 각각의 유전자에 대하여 STR 반복 수를 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 각각의 STR 반복 수를 데이터베이스에 저장된 제주흑우 종우의 STR 프로파일과 비교하여 제주흑우 종우를 판별하는 단계;를 포함하는, 제주흑우 종우 판별 방법.
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