KR102081569B1

KR102081569B1 - 돼지 등지방 두께 예측용 snp 마커 조성물

Info

Publication number: KR102081569B1
Application number: KR1020180159336A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 장길원; 임다정; 박원철; 채한화; 박종은; 최봉환; 고해수; 차지혜; 임영조; 김하나; 양병철; 신문철
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-02-26

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 돼지 등지방 두께를 예측할 수 있으며, 상기 유전자형을 고려하여 교배를 할 경우, 등지방 두께가 증가된 또는 저감된 돼지를 선별 및 육성할 수 있다.

Description

돼지 등지방 두께 예측용 SNP 마커 조성물{SNP marker for predicting backfat thickness of pig}

본 발명은 돼지 등지방 두께 예측용 SNP 마커에 관한 것이다.

가축 육종은 형질이 우수한 개체를 선발하고 선발된 가축을 이용하여 후대를 생산하고, 다시 이들 후대의 형질을 검정하여 우수한 가축을 선발하는 일련의 과정을 반복하여 수행하고 있다. 기존의 경우 가축이 사육과정에서 발현되는 표현형 정보를 바탕으로 통계적 방법에 따라 육종가치를 추정하고 이에 근거하여 우수한 가축이 선별되어져 왔다. 따라서, 사람들에게 보다 효용성이 높은 가축을 얻기 위해서는 다음 세대의 가축을 생산하는 데 쓰일 우수한 종축(breeding stock)을 선발(selection)하는 것이 매우 중요하다.

선발을 통한 개량 대상으로 하는 가축의 형질(산유량, 체중 등)은 대부분 많은 수의 유전자에 의해 영향을 받는 양적 형질(quantitative trait)이다. 양적 형질은 일반적으로 다수의 유전자에 의하여 영향을 받을 뿐만 아니라 여러 가지 환경요인에 의해서도 상당히 영향을 받는다. 따라서 양적 형질에 있어서는 이에 영향을 미치는 개별적인 유전자 작용이나 특성과 같은 것을 규명하는 것이 질적 형질(qualitative trait)보다 극히 곤란하다. 때문에, 양적 형질의 유전을 연구하는데 통계적 방법이 강력한 수단으로 사용되고 있으며 양적 형질에 영향을 주는 유전적 요인을 여러 환경 요인으로부터 분리하여 효과적으로 추정하고자 하는 연구가 여러 학자들에 의해 수행되어 왔다.

가축 개량을 위한 분자 유전학적 기법의 이용은 DNA 수준에서의 개체의 유전적 소질에 대한 연구를 가능토록 할 수 있을 것이며, 개량 대상형질에 관련된 유전자, 즉 주유전자(major gene) 혹은 양적 형질 유전자좌위(QTL: Quantitative Trait Loci)에 대한 직접적인 선발 혹은 양적 형질 유전자좌위(QTL)에 연관되어 있는 유전적 표지(genetic marker)에 대한 선발을 통해 유전적 소질을 실현시킬 수 있는 도구를 제공할 수 있다. 표현형 정보에만 의존하는 것이 아니라 분자 유전학적인 정보의 추가적인 이용을 통해 유전적 개량을 보다 가속화할 수 있을 것이다. DNA 수준에서의 정보는 생산자뿐만 아니라 육종가들에게도 특정한 주요 변이체를 선발하는데 중요한 정보를 제공해준다. 이러한 DNA 정보는 표지인자 도움 선발(marker-assisted selection; MAS)이라고 하는 양적 형질(quantitative trait)의 선발에 활용될 수 있다. 또한, 분자표지인자는 종축 등의 선발 정확도를 높이고 성별에 제한적인 형질을 선별할 수 있게 하며, 육질과 같은 도체 형질에 대해서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

현재까지 몇몇 유전자 또는 표지인자가 실제로 양돈 산업에 활용되고 있다. 지금까지는 종돈을 선발하기 위한 기존 방법으로서 단지 표현형 값에 근거하는 선발 지수식을 사용하였다. 그러나, 최근 분자 표지인자를 활용한 변이체의 선발 또는 도태가 단일 유전자에 의하여 조절되는 형질뿐만 아니라 양적 유전좌위(quantitative trait loci, QTL)에 의해 조절되는 형질에서도 효과적으로 활용될 수 있다는 것이 시뮬레이션을 통해 확인되어 보고되고 있다.

종돈에 있어서 생산성과 관계되는 형질, 즉 경제형질은 복당산자수, 이유두수, 일당증체량, 사료요구율, 등지방 두께, 도체율, 정육율, 체형 및 내구성(연산성)등이 있다.

대한민국 등록특허 제10-1890350호

본 발명의 목적은 돼지 등지방 두께 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 돼지 등지방 두께 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 등지방 두께의 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 제1항의 조성물을 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기인 SNP를 증폭시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 증폭된 SNP의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 등지방 두께의 예측 방법을 제공한다.

본 발명의 SNP 마커를 이용하여 돼지 등지방 두께를 예측할 수 있으며, 상기 유전자형을 고려하여 교배를 할 경우, 등지방 두께가 증가된 또는 저감된 돼지를 선별 및 육성할 수 있다.

도 1은 돼지의 등지방 두께 표현형 분석을 위해 4번과 5번 갈비뼈 사이, 11과 12번 갈비뼈 사이, 및 마지막 갈비뼈와 흉추 사이의 등지방 두께를 측정하는 모습이다.
도 2는 4번과 5번 갈비뼈 사이의 등지방 두께 형질과 관련된 유전자 좌위를 찾기 위한 GWAS(genome wide association study) 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 11번과 12번 갈비뼈 사이의 등지방 두께 형질과 관련된 유전자 좌위를 찾기 위한 GWAS(genome wide association study) 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 마지막 갈비뼈와 흉추 사이의 등지방 두께 형질과 관련된 유전자 좌위를 찾기 위한 GWAS(genome wide association study) 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 2번 염색체의 등지방 두께 연관 유전자 좌위 내에 있는 후보 QTN(quantitive trait nucleotide)을 나타낸 도이다.
도 6은 후보 QTN인 IGF2 유전자의 exon14 영역 및 상기 exon14 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 나타낸 도이다.
도 7은 파이로시퀀싱을 이용하여 IGF2 유전자의 exon14 영역 내 SNP 유전자형을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "SNP(single nucleotide polymorphism, 단일염기다형성)"는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 말한다.

본 발명에서, 용어 "서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 돼지 등지방 두께에 관여하는 유전자의 SNP를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)을 말하며, 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

상기 SNP는 돼지의 2번 염색체에 있는 IGF2 유전자의 exon14 영역에 위치하는 것일 수 있다.

유전자	서열번호	염기서열
IGF2 유전자의 exon 14 영역	1	TCAGTTCTGAGCCGGCGGAGATCTCCTGGGCCACAGGCTGCAGCAGCTCACCTGGGGGCTGGGGTCTCGGGCAGCCCTGGCCTGCTGCAGCTCAGG[C/T]TGGGGGGCAGCTGGGGCGCGCGGCTGAGCCCGAGGAGATGTGGGGCCCTGGGGCTGGGGGCTGGAATCCGGCTGCTCGTCCTCAAGTTCAGGGGTGACTCTTCGGCCC

본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 증폭할 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

상기 돼지는 재래돼지, 랜드레이스 또는 재래돼지와 랜드레이스의 교잡종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 등지방 두께 예측용 조성물을 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 키트를 제공한다.

상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 등지방 두께를 예측할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 재래돼지와 랜드레이스를 잡종 교배하여 얻은 F₂ 집단을 대상으로 4번과 5번 갈비뼈 사이, 11번과 12번 갈비뼈 사이, 및 마지막 갈비뼈와 흉추 사이의 등지방 두께를 측정하고 (도 1 참조), SNPchip을 이용하여 GWAS 분석한 결과, 3개의 부위(4번과 5번 갈비뼈 사이, 11번과 12번 갈비뼈 사이, 및 마지막 갈비뼈와 흉추 사이)에서 공통적으로 등지방 두께 관련 유전자 좌위는 2번 염색체임을 확인하였다 (도 2 내지 도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 돼지 2번 염색체의 1 내지 3M bp 영역에서 후보 유전자를 선정하기 위해, 상기 영역 내에 존재하는 유전자를 NGS 자료를 통해 추출한 결과, 근육의 발달과 관련된 IGF2 유전자의 exon14 영역에서 후보 QTN(quantitive trait nucleotide)를 추출하였다 (도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 IGF2 유전자 exon14 영역의 SNP를 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하고, PCR 생성물에 포함된 SNP의 유전자형을 결정하기 위하여 파이로시퀀싱을 실시한 결과, 상기 SNP의 유전자형은 각각 CC, CT, TT임을 확인하였다 (도 7 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 SNP의 유전형에 따른 등지방 두께를 비교한 결과, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 경우 등지방 두께가 가장 두꺼우며, 유전자형이 CC인 경우 등지방 두께가 가장 얇아, T 유전자형이 돼지의 등지방 두께를 두껍게 하는 효과가 있음을 확인하였다 (표 2 참조).

따라서, 본 발명의 SNP를 이용하여 돼지의 등지방 두께를 예측할 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"는 등지방 두께를 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미한다. 구체적으로, 돼지는 재래돼지, 랜드레이스 또는 재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 시료는 혈액, 타액, 뇨, 털, 분리된 세포 또는 분리된 조직 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 단계 2)의 증폭된 SNP의 염기를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단계 2)의 SNP가 모두 T인 경우, 돼지의 등지방 두께가 두꺼운 것으로 예측할 수 있다. 또한, 상기 단계 2)의 SNP가 모두 C인 경우, 돼지의 등지방 두께가 저감된 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 SNP의 유전형에 따른 등지방 두께의 변화를 비교한 결과, 상기 SNP의 유전자형이 TT인 경우 등지방 두께가 가장 두꺼우며, 유전자형이 CC인 경우 등지방 두께가 가장 얇아, T 유전자형이 돼지의 등지방 두께를 두껍게 하는 효과가 있음을 확인하였다 (표 2 참조).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 공시축 선정

재래돼지(KNP) 19두와 랜드레이스(landrace) 17두를 잡종 교배하여 얻은 F₂ 집단의 돼지 1,106두를 이용하였다.

< 실시예 2> 등지방 두께 표현형 분석

F₂ 집단의 모든 개체를 대상으로 등지방 두께의 표현형을 분석하였다. 각 개체의 4번과 5번 갈비뼈 사이, 11과 12번 갈비뼈 사이, 및 마지막 갈비뼈와 흉추 사이의 등지방 두께를 측정하였다 (도 1).

< 실시예 3> 등지방 두께 관련 유전자 좌위 검색

등지방 두께 형질과 관련된 유전자 좌위를 찾기 위해, illumina porcine 60K SNPchip을 이용하여 GWAS(Genome-wide association study)를 분석하여 등지방 두께 연관 유전자좌위(Quantative Trait Loci, QTL)를 검색하였다.

그 결과, 3개의 부위(4번과 5번 갈비뼈 사이, 11과 12번 갈비뼈 사이, 및 마지막 갈비뼈와 흉추 사이)에서 공통적으로 돼지 2번 염색체에 가장 유의성 높은 SNP가 있는 것으로 나타났으며, 다른 염색체와 비교하여 major QTL은 2번 임을 확인하였다. 등지방 두께 형질과 연관 유의성이 높은 상위 10개의 SNP를 살펴보면, 3개의 부위에서 공통적으로 MARC0051258 SNP가 등지방 두께 형질과 유의성이 높았다. MARC0051258 SNP의 위치는 돼지 2번 염색체의 1,267,622 bp로 LSP1 유전자 근처에 있는 것으로 확인되었다 (도 2 내지 도 4).

< 실시예 4> 등지방 두께 유전자좌위 내 후보 유전자 선정

실시예 3의 등지방 두께 형질과 연관 유의성이 높은 2번 염색체의 상위 10개의 SNP를 살펴보면, 2번 염색체의 1 내지 3M bp 영역이 돼지 등지방 두께 조절 영역임을 유추할 수 있다. 따라서, 돼지 2번 염색체의 1 내지 3M bp 영역을 대상으로 후보 유전자를 탐색하였다. 상기 영역 내에 존재하는 유전자를 NGS(차세대 염기서열 분석) 자료를 통해 후보 QTN(quantitive trait nucleotide)를 추출하였다.

그 결과, 근육의 발달과 관련된 유전자인 IGF2 유전자의 exon14 영역에서 SNP가 추출되었다 (도 5).

< 실시예 5> 후보 QTL의 유전자형 분석

IGF2 유전자의 exon14 영역 시작부터 109번째 서열이 후보 QTN임을 확인하고, 이를 증폭할 수 있는 하기의 프라이머(서열번호 2 및 3)를 제작하고 (도 6), 이를 이용하여 PCR을 수행하여 300 bp의 PCR 생성물을 수득하였다. 정방향 프라이머의 5' 말단에는 바이오틴 형광물질을 부착하였다.

- IGF2 유전자의 exon14 영역

:TCAGTTCTGAGCCGGCGGAGATCTCCTGGGCCACAGGCTGCAGCAGCTCACCTGGGGGCTGGGGTCTCGGGCAGCCCTGGCCTGCTGCAGCTCAGG[C/T]TGGGGGGCAGCTGGGGCGCGCGGCTGAGCCCGAGGAGATGTGGGGCCCTGGGGCTGGGGGCTGGAATCCGGCTGCTCGTCCTCAAGTTCAGGGGTGACTCTTCGGCCC (서열번호 1)

- IGF2 유전자의 exon14 영역 정방향 프라이머 (IGF2_ex14F)

: 5'-TGG-GGT-CTG-GAG-ACA-CTC-AC-3' (서열번호 2)

- IGF2 유전자의 exon14 영역 역방향 프라이머 (IGF2_ex14R)

: 5'-TTG-GTT-TGA-AAA-GAG-AAC-AAA-TAG-G-3' (서열번호 3)

상기 PCR 생성물에 포함된 SNP의 유전자형을 결정하기 위하여, 하기 서열번호 4의 미니 시퀀싱용 프라이머(Mini-seq)를 이용하여 SNP 유전자형을 확인하였다. 파이로-시퀀서 기기에 넣고 반응하기 전에 SNP를 분석할 위치를 지정해야 하므로 프로그램에 하기 서열번호 5의 서열을 입력하였다. PCR 생성물에 포함된 SNP의 유전자형은 각각 GG, GA, AA임을 확인하였다 (도 7). 정방향 프라이머에 바이오틴이 붙어 있어 시퀀싱 방향이 역방향이므로, 원래 서열을 기준으로 본다면 유전자형은 CC, CT, TT이다.

- IGF2 유전자의 exon14 영역 미니 시퀀싱용 프라이머 (IGF2_ex14_mini)

: 5'-CGC-GCC-CCA-GCT-GCC-CCC-CA-3' (서열번호 4)

- 입력: [G/A]CCTGAGCTGCAGC (서열번호 5)

<실시예 5> 2번 염색체 SNP의 유전자형과 등지방 두께의 연관성 분석

상기 실시예 4에서 확인한 SNP의 유전형에 따른 등지방 두께의 변화를 비교하였다 (표 2).

구분	유전자형	개체수	등지방 두께 (평균±표준편차)
갈비뼈 4번과 5번 사이	TT	589	34.92±7.715
	CT	394	33.26±7.171
	CC	62	30.34±8.061
갈비뼈 11번과 12번 사이	TT	589	28.75±7.683
	CT	394	27.26±4.419
	CC	62	25.29±6.617

상기 SNP의 유전자형이 TT인 경우 등지방 두께가 가장 두꺼우며, 유전자형이 CC인 경우 등지방 두께가 가장 얇아, T 유전자형이 돼지의 등지방 두께를 두껍게 하는 효과가 있음을 확인하였다. 갈비뼈 11번과 12번 사이의 등지방 보다 4번과 5번 사이의 등지방 두께가 더 두꺼운 것으로 나타났다. 마지막 갈비뼈와 흉추 사이의 부위의 SNP는 유의수준에 도달하지 못하여 분석하지 않았다.

따라서, 상기 유전자형을 고려하여 교배를 할 경우, 등지방 두께가 증가된 또는 저감된 돼지를 선별 및 육성할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP marker for predicting backfat thickness of pig <130> 2018P-11-038 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP nucleotide <220> <221> variation <222> (97) <223> N is C or T <400> 1 tcagttctga gccggcggag atctcctggg ccacaggctg cagcagctca cctgggggct 60 ggggtctcgg gcagccctgg cctgctgcag ctcaggntgg ggggcagctg gggcgcgcgg 120 ctgagcccga ggagatgtgg ggccctgggg ctgggggctg gaatccggct gctcgtcctc 180 aagttcaggg gtgactcttc ggccc 205 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2_exon14 forward primer <400> 2 tggggtctgg agacactcac 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2_exon14 reverse primer <400> 3 ttggtttgaa aagagaacaa atagg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2_exon14 mini sequencing primer <400> 4 cgcgccccag ctgcccccca 20 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini sequencing_input sequence <220> <221> variation <222> (1) <223> n is G or A <400> 5 ncctgagctg cagc 14

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기가 C 또는 T인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 조성물에 있어서,
상기 SNP가 T인 경우, C인 경우보다 돼지의 등지방 두께가 두꺼운 것으로 예측하되, 상기 돼지의 등지방은, 돼지의 갈비뼈 4번과 5번 사이, 또는 갈비뼈 11번과 12번 사이의 등지방이고,
상기 돼지는 재래돼지, 랜드레이스 또는 재래돼지와 랜드레이스의 교잡종인 것을 특징으로 하는, 돼지 등지방 두께 예측용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 프라이머 세트 또는 프로브인, 돼지 등지방 두께 예측용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 역방향 프라이머를 포함하는, 돼지 등지방 두께 예측용 조성물.
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제1항의 조성물을 포함하는 돼지 등지방 두께 예측용 키트.
1) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 97번째 염기인 SNP를 증폭시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 증폭된 SNP의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 등지방 두께의 예측 방법에 있어서,
상기 단계 2)의 SNP가 T인 경우, C인 경우보다 돼지의 등지방 두께가 두꺼운 것으로 예측하되, 상기 돼지의 등지방은, 돼지의 갈비뼈 4번과 5번 사이, 또는 갈비뼈 11번과 12번 사이의 등지방이고,
상기 돼지는 재래돼지, 랜드레이스 또는 재래돼지와 랜드레이스의 교잡종인 것을 특징으로 하는, 돼지 등지방 두께의 예측 방법.
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