KR102108738B1 - Snp를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 소의 지방색 판별용 조성물 - Google Patents

Snp를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 소의 지방색 판별용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 소의 지방색과 관련이 높은 SNP 9개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 지방색을 확인한 것인 바, 이를 이용하여 소의 지방색 형질을 정확하게 판별할 수 있다.

Description

SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 소의 지방색 판별용 조성물{Composition for determining the adipose color of a bovine including an agent capable of detecting or amplifying SNP}
본 발명은 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 소의 지방색을 판별하기 위한 키트, 및 소의 지방색 판별 방법에 관한 것이다.
소고기의 지방색은 배최장근단면의 근내지방, 주위의 근간지방과 등지방의 색깔을 의미하고, 소고기의 풍미와 연도와 관련이 있어서 소고기의 등급을 결정하는데 매우 중요한 인자로 알려져 있다.
고품질의 한우를 용이하게 판별하기 위해서 지방색의 판별에 생명공학적 방법을 이용하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 구체적으로 대한민국 공개특허 제10-2015-0047672호에는 SNP를 이용하여 한우의 육색 조성 등의 특성을 판별하는 방법에 대해서 개시되어 있고, CNU Journal of Agricultural Science 38(2), 2011. 6에는 한우의 FASN 유전자를 이용하여 한우의 지방색 형질을 판별하는 방법에 대해서 개시(이 외, 2011)되어 있다.
본 발명자들은 한우의 고급육을 용이하고 정확하게 판별하기 위한 지방색 형질 판별용 신규 SNP를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소의 지방색을 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소의 지방색 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 단일염기다형성(SNP)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소의 지방색을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 소의 지방색 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 소의 지방색 판별용 조성물을 이용하면 소의 지방색 형질을 정확하게 판단할 수 있고, 이를 통해 고급육을 용이하고 정확하게 판별할 수 있다.
도 1은 한우 지방색 형질과 관련된 신규한 SNP를 선별하기 위해서 전장유전체연관분석을 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP);
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 T인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 T인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물에 관한 것이다.
상기 소는 한우 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명에서 용어, “SNP(Single Nucleotide polymorphism)”는 단일염기다형성을 의미하는 것으로, SNP는 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억 개의 염기 서열 중 개인의 편차를 나타내는 한개 또는 수십 개의 염기변이를 말하며, 이로 인해 표현형, 약제에 대한 반응성 및 질병에 대한 내성 등의 차이가 발생한다.
본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "연관불평형(Linkage Disequilibrium)" 이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하지는 않는 둘 이상의 유전자좌(loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관(non-random association)을 의미한다. 즉, 연관불평형은 서로 다른 위치의 대립형질들간의 결합의 척도로서, 만약 각 유전자가 완전히 독립적으로 배합된다면, 유전자 집합은 아마도 연관 평형(linkage equilibrium)을 유지할 것이나, 어떤 대립유전자들은 서로 같이 발견되는 예가 많으며 즉, 무작위적으로 뒤섞이지 않으며, 이런 대립유전자는 연관불평형상태에 있다. 이러한 연관불평형 상태는 대립유전자들이 서로 근접하여 위치하거나, 대립 형질들이 서로 모여 있으면 더 유리한 경우에 자연선택의 결과로 나타나는 것으로 해석되고 있다.
또한, 본 발명은 상기 소의 지방색 판별용 조성물을 포함하는 소의 지방색을 판별하기 위한 키트에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP);
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 T인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 T인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP;
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR 증폭과정에 적용되는 경우, "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 소로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계로서,
상기 SNP는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기 또는 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기인, 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 소의 지방색 판별 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 단계 2)의 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 C 또는 A인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 A 또는 G인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 G 또는 T인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 G 또는 A인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 G 또는 A인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 A 또는 T인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 C 또는 T인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 C 또는 T인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 소의 지방색 판별 방법에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번째의 염기가 C 또는 A인 경우 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 소의 지방색 또는 지방색 등급이 우수한 경우 이를 고급육으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 한우 2108두의 전장유전체(whole-genome sequencing) 자료에 존재하는 25,676,502개 단일염기다형성(SNP) 마커 중 15,489,195개의 단일염기다형성 마커의 GWAS 분석을 통해 한우 지방색과 연관성이 높은 SNP 마커 9개를 선별하였고, 유의성이 있음을 확인하였다(실시예, 표 1 및 표 2 참조).
따라서, 본 발명의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소의 지방색 판별용 조성물을 이용하는 경우 소의 지방색 형질을 정확하게 판별할 수 있고, 나아가 이를 통해 고급육을 용이하고 정확하게 판별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예: 한우 지방색 SNP 마커 선별
한우 2108두의 전장유전체(whole-genome sequencing) 자료에 존재하는 25,676,502개 단일염기다형성(SNP) 마커 중, MAF 값이 0.01 이상, MWE 값이 0.001 이상, R2 값이 0.4 이상인 기준을 통과하는 15,489,195개의 단일염기다형성(SNP) 마커를 GWAS 분석에 사용하였다.
구체적으로, 한우 지방색 형질과 관련된 한우 지방색 SNP 마커를 선별하기 위하여, 상기 15,489,195개의 단일염기다형성(SNP) 마커를 하기 수학식 1의 분석모형을 이용하한 차세대염기서열 기반의 전장유전체연관분석(Genome Wide Association Study; GWAS)을 수행하였다.
[수학식 1]
y = Xb + Zq + Wg + e
상기 분석모형 수학식에서 y는 개체에 대한 표현형 관측치 벡터, X는 고정효과(검정차수)에 대한 벡터, b는 고정효과에 대한 추정치 벡터, Z는 개체에 대한 임의효과 벡터, q는 QTL에 대한 유전자형 대체효과에 대한 벡터(고정효과), g는 마커 효과에 대한 상가적 유전 효과, e는 임의 오차를 의미한다
혼합선형모형 연관분석 기법(Mixed Linear Model based Association analysis, MLMA)과 제한최대우도(REML, restricted maximum likelihood) 분석 방법을 이용하여 한우 지방색 형질과 상기 15,489,195개의 단일염기다형성(SNP) 마커의 연관 유의성을 확인하였고, 이때 한우 지방색 표현형에 미치는 효과가 큰 성별과 도축월령을 공변수로 추가하여 보정하였다.
선별한 한우 지방색 SNP 마커에 대하여 형질에 따른 유의성 검증을 위해 GCTA(version 1.91, https://cnsgenomics.com/software/gcta/#Overview) 통계 소프트웨어를 활용하였고, 한우의 지방색 형질 정보는 농협중앙회 한우개량사업소에서 제공받았다. 각 형질에 대한 유의적인 한우 지방색 SNP 마커는 유의성 검정을 통해, -log10P-value 값이 6 이상인 것으로 선별하였다.
그 결과 유의성이 가장 높은 9개의 한우 지방색 SNP 마커(서열번호 1 내지 9)를 선별하였다(도 1). 선별된 한우 지방색 SNP 마커는 한우 지방색 형질과 고도의 유의성(P-value, -log10P-value, %Vg)을 나타냈다(표 1).
SNP ID 염색체 위치 MAF Allele P-value -log10P-value %Vg (유전적 분산 효과)
rs209994670 21 21767030 0.016 C/A 0.00000000014 9.853872 9
rs382047302 21 21767514 0.016 A/G 0.00000000014 9.853872 9
rs210647091 7 38135632 0.028 G/T 0.00000000745 8.127844 7.1
rs382836662 7 37837021 0.012 G/A 0.000000066 7.180456 7.2
12:46590012 12 46590012 0.014 G/A 0.00000000917 8.037631 7
rs456360935 12 29879355 0.014 A/T 0.00000021 6.677781 6
16:69913004 16 69913004 0.171 C/T 0.0000000124 7.906578 7.9
rs43646756 10 89619111 0.016 C/T 0.0000000674 7.17134 6.5
rs43644179 10 89645544 0.016 C/A 0.0000000674 7.17134 6.5
상기 선별한 한우 지방색 SNP 칩 제작을 위한 한우 지방색 SNP 마커의 염기서열은 서열번호 1 내지 9에 기재되어 있다(표 2).
SNP ID 염기서열 서열번호
rs209994670 AATTTTTAAAATGGGCAAAGGATTAGCTAGACACTGCACTGAAGGGGAAACACAGAAGTCTAGAAAACACAGGAAGGGATATTCCGTCTTACCAGTAACG[C/A]GAAAAATGCAAATCAAAACAACTGACACCGCTTTACAAAAGGAAGAAGTTAGATGTTATCAAGTTCTGGAGAATATGGGGGGATGAAGAGCCCTCGTGTC 1
rs382047302 TGCTGTTTTTAAAATGGATGACCAACAAGGACCTACTGTATAGCACAGGGAACTCTGCTCAATATTATGTAACAACCTAAATGGGGAAATAATTTGAGAG[A/G]AATAGACATATATATGTACAACTGAATCACTTTGCTGTACACTAGAAACTATCATAACTGTTAATCAACTATACTCCAATATAAAATAAGAAGCTGTTTA 2
rs210647091 CAGCTGTTCAAGTTTTCTAAACCTGTTTCCTCACCACACATCCGTCTCAAGACCAGGATCTAAGAGGCAGTGGGATAAGGGTGAAGACATGCTCATTACA[G/T]TGCCAGGTACCCACTGGGATGGATGCCTTGTTAGCACCACTCCCTAAATACTTAGGGCTTCCCTCATAGCTCAGTCAGTAAAGAATCTGCCTGCAATTCA 3
rs382836662 AGACCATCCCCAAGGGGGAAAAAAAATGCAAAAAGGCAAAATGGTTGTCTGAGGAGGCTTTACGAAAGCTATGAAAAGAAGAGAAGCTAAAGGCAAAGGA[G/A]AAAAGGAAAGATATACCCATTTGAATGCAGAGTTCCACAGAAGAGCAAGGTGAGATAAGAAAGCCCTCCTCAGTGATCAGAGCAAAGAAATAGAGGAAAA 4
12:46590012 TCTAAGTTACTTATTAGCAATGTTACTACTAGAAGCTAAATCTTCTGACATATTTTGCCCTTTGCTTCCCATCTCAGCTTTTAGAAGCATCTAGAAGGAC[G/A]TGTTTTGATCAGACTATAAGCTTTCAAATGATAATTTTGTCTTAAATTAGCTATTTATTCTTTGTATTTTCACATCAGATTACCTTATTTAAAATATTTC 5
rs456360935 GGTTGCGATTATCAGCCCAAGACCTAGCACTAGGCCTGGCACATAGCAGGAACTTGTCTGTATTCTTTGAATGAATAAGTGAGTGAATGGACCCGTGATC[A/T]CATTAGCAGACAACAAAGAGAGAGCCTTGAAGAACTAGGACCAGTGCAGAGGAATTGGGAAGAGTGCAGTGGGACAGTGGGGAGTTTTGTAGTATAAAGT 6
16:69913004 GATGAATGAATGAGAAAGCTGTGGTGCATATATACAATGGAGTGTTACTCAGCCATTAAAAAGAATAAATTTCAATCAGTTCTAATGAGGTGGATGAAAC[C/T]GGAACCTATTATACAGACTGAAGTAAGCCAGAAAGAAAAACACCAATACAGTATACTAACACATATATATGGAATTTAAAAGATGGTAACAATAACTCTG 7
rs43646756 GACTTAGAAAAGGGAAAGGAGAGAAGGAGAGGCAGGGTGAAATCACCAGCCCTCCAGAGGCAGTGAGGGCTCCCAGCCTGTGCTAGAGAACGGGCAGAAC[C/T]AGCAGGCGGGAATACGGCAGTGGTGAGAGGCTGGCCAGAGCTTTCCGCATCCCCGACACTGGGCTCCTTCACGGACAGAGTGCTGTTCCCTCTTTCTGTC 8
rs43644179 TGGGCTACAGTTCATGGGGTCGCAGAGAGTTGGACACGACTGAGCAACTAATATTTTACTTCTTTCCTATACATGGAGGGAAGTTTCTGAGTCTCAGTAT[C/A]TCAGTGATGGCGCTTCCTCTCCTTCCCAATCCAAGTGACAATCAAAATGTCCCCTAGGAGAGGCAAAATCTCTCCTAGTTGAGAACCACTGCTTTAACCT 9
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for determining the adipose color of a bovine including an agent capable of detecting or amplifying SNP <130> 2018P-12-018 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #1 <400> 1 aatttttaaa atgggcaaag gattagctag acactgcact gaaggggaaa cacagaagtc 60 tagaaaacac aggaagggat attccgtctt accagtaacg cagaaaaatg caaatcaaaa 120 caactgacac cgctttacaa aaggaagaag ttagatgtta tcaagttctg gagaatatgg 180 ggggatgaag agccctcgtg tc 202 <210> 2 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 <400> 2 tgctgttttt aaaatggatg accaacaagg acctactgta tagcacaggg aactctgctc 60 aatattatgt aacaacctaa atggggaaat aatttgagag agaatagaca tatatatgta 120 caactgaatc actttgctgt acactagaaa ctatcataac tgttaatcaa ctatactcca 180 atataaaata agaagctgtt ta 202 <210> 3 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #3 <400> 3 cagctgttca agttttctaa acctgtttcc tcaccacaca tccgtctcaa gaccaggatc 60 taagaggcag tgggataagg gtgaagacat gctcattaca gttgccaggt acccactggg 120 atggatgcct tgttagcacc actccctaaa tacttagggc ttccctcata gctcagtcag 180 taaagaatct gcctgcaatt ca 202 <210> 4 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #4 <400> 4 agaccatccc caagggggaa aaaaaatgca aaaaggcaaa atggttgtct gaggaggctt 60 tacgaaagct atgaaaagaa gagaagctaa aggcaaagga gaaaaaggaa agatataccc 120 atttgaatgc agagttccac agaagagcaa ggtgagataa gaaagccctc ctcagtgatc 180 agagcaaaga aatagaggaa aa 202 <210> 5 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 <400> 5 tctaagttac ttattagcaa tgttactact agaagctaaa tcttctgaca tattttgccc 60 tttgcttccc atctcagctt ttagaagcat ctagaaggac gatgttttga tcagactata 120 agctttcaaa tgataatttt gtcttaaatt agctatttat tctttgtatt ttcacatcag 180 attaccttat ttaaaatatt tc 202 <210> 6 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #6 <400> 6 ggttgcgatt atcagcccaa gacctagcac taggcctggc acatagcagg aacttgtctg 60 tattctttga atgaataagt gagtgaatgg acccgtgatc atcattagca gacaacaaag 120 agagagcctt gaagaactag gaccagtgca gaggaattgg gaagagtgca gtgggacagt 180 ggggagtttt gtagtataaa gt 202 <210> 7 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #7 <400> 7 gatgaatgaa tgagaaagct gtggtgcata tatacaatgg agtgttactc agccattaaa 60 aagaataaat ttcaatcagt tctaatgagg tggatgaaac ctggaaccta ttatacagac 120 tgaagtaagc cagaaagaaa aacaccaata cagtatacta acacatatat atggaattta 180 aaagatggta acaataactc tg 202 <210> 8 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8 <400> 8 gacttagaaa agggaaagga gagaaggaga ggcagggtga aatcaccagc cctccagagg 60 cagtgagggc tcccagcctg tgctagagaa cgggcagaac ctagcaggcg ggaatacggc 120 agtggtgaga ggctggccag agctttccgc atccccgaca ctgggctcct tcacggacag 180 agtgctgttc cctctttctg tc 202 <210> 9 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #9 <400> 9 tgggctacag ttcatggggt cgcagagagt tggacacgac tgagcaacta atattttact 60 tctttcctat acatggaggg aagtttctga gtctcagtat catcagtgat ggcgcttcct 120 ctccttccca atccaagtga caatcaaaat gtcccctagg agaggcaaaa tctctcctag 180 ttgagaacca ctgctttaac ct 202

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP);
    서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
    서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 T인 SNP;
    서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
    서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
    서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 A 또는 T인 SNP;
    서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
    서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 T인 SNP; 및
    서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 101번째 염기가 C 또는 A인 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한우의 지방색 판별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브인, 한우의 지방색 판별용 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는, 한우의 지방색을 판별하기 위한 키트.
  5. 삭제
  6. 1) 한우로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계로서,
    상기 SNP는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기 또는 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 101번 염기인, 단계; 및
    2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 한우의 지방색 판별 방법.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 C 또는 A인 경우,
    서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 A 또는 G인 경우,
    서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 G 또는 T인 경우,
    서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 G 또는 A인 경우,
    서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 G 또는 A인 경우,
    서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 A 또는 T인 경우,
    서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 C 또는 T인 경우,
    서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 C 또는 T인 경우, 또는
    서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의SNP인 101번 염기가 C 또는 A인 경우 한우의 지방색이 우수한 것으로 판단하는 것인, 한우의 지방색 판별 방법.

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