KR101972107B1 - Ap1ar 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 유전체 각인 판별 방법 - Google Patents

Ap1ar 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 유전체 각인 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 624번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 624번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 766번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 766번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 995번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 995번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 1145번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 1145번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1종 이상을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.

Description

AP1AR 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP 마커 및 이를 이용한 유전체 각인 판별 방법{SNP marker from AP1AR gene for identifying genomic imprinting and method for identifying genomic imprinting using the same}
본 발명은 AP1AR(Adaptor related protein complex 1 associated regulatory protein) 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP 마커 및 이를 이용한 유전체 각인 판별 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 소의 유전체 각인을 판별하는 방법에 관한 것이다.
한우는 한국 고유의 품종으로 한반도에서 2,000년 이상 독자적으로 키워온 세계 유일의 품종으로, 한국 고유 품종인 한우가 외국소(중국 연변우, 유럽 앵거스, 홀스타인 등)의 품종과 다르게 진화하였으며, 이에 따라 육량과 육질이 독특하게 발달한 것으로 나타났다. 특히, 한우 내 고기의 육질과 관련된 유전자들이 많다는 것이 보고되고 있다.
국내 유통되는 소육의 종류는 한우육, 젖소육 및 수입육으로 나뉠 수 있으며, 소비자들의 한우육에 대한 수요가 높아지면서 수입육이 한우육으로 판매되는 경우가 종종 있어, 신뢰도 있는 한우와 비한우(특히 한국과 근접한 중국 연변우)의 품종 식별에 대한 요구가 높아졌다.
이에 따라 한우 및 비한우(특히 한국과 근접한 중국 연변우)를 감별하는 한우 특이 유전자 마커 개발하고, PCR을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA)의 DNA 다형 분석기법, 소 품종이 가진 특이적인 모색을 이용한 기술로 MC1R 유전자를 통한 식별 방법, 및 PCR-RFLP(restriction fragment polymorphism) 방법 등을 이용하여 적절한 유전자 표지를 검색하는 연구가 이루어지고 있다.
상기 PCR을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA)의 DNA 다형 분석기법의 경우, 각종 동물의 유전 분석 및 종 또는 품종 식별에 폭넓게 응용되어 왔으나, 결과의 재현성이나 정확성이 낮아 실용화에 어려운 단점이 있다.
이와 관련된 특허로 한국 등록특허 10-0871145에는 특이적인 SNP를 이용하여 PCR로 증폭시켜 소의 품종을 판단하는 소품종 판단 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 AP1AR 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 이를 이용하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 AP1AR 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 AP1AR 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 검출할 수 있는 상기 조성물을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 AP1AR 유전자 유래의 유전체 각인 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 이용하여 소의 유전체 각인을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 624번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 624번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 766번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 766번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 995번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 995번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 1145번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 1145번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1종 이상을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1은 소의 AP1AR 유전자에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 상기 추출된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 분석 단계를 포함하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상 소 시료는 자식 개체의 근육 또는 지방 부위에서 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상 소 시료는 대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 척수, 심장근, 등심근, 대퇴근, 간, 비장, 림프, 신장, 부신, 혈액, 소장, 대장, 및 폐 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 핵산은 모계를 따라 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 핵산은 소의 AP1AR 유전자에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소는 한우일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, AP1AR 유전자의 유전체 각인 판별에 이용 가능한 SNP 마커를 제공하여 AP1AR 유전자의 유전체 각인 여부를 정확하며 신속하고 용이하게 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, AP1AR 유전자의 유전체 각인 판별에 이용 가능한 SNP 마커를 제공하여 한우 개량에 있어 부계 또는 모계 특이적인 교배 계획에 활용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 소의 유전체 각인 판별용 유전자를 제공함으로서, 전장유전체 기반 메틸화 영역(methylated regions) 탐색 등의 유전체 각인 관련 후속 연구에 활용되어 이를 이용한 관련 산업 발전에 기여할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색체 6번에 위치한 AP1AR 유전자의 유전체 각인 판별용 SNP를 포함하는 서열정보(서열번호 1)를 나타낸 것이다. 프라이머 서열 위치는 초록색으로 표시하고, SNP 위치는 [ ]로 표시한다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 한우에서 직접 서열분석(direct sequencing) 기술을 이용하여 AP1AR 유전자의 유전체 각인 여부를 판별한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 있어서, “SNP(Single Nucleotide polymorphism)”는 단일 핵산 염기 다형성을 의미하는 것으로, SNP는 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억 개의 염기 서열 중 개인의 편차를 나타내는 한개 또는 수십 개의 염기변이를 말하며, 이로 인해 표현형, 약제에 대한 반응성 및 질병에 대한 내성 등의 차이가 발생한다.
본 발명에 있어서, “유전체 각인(genomic imprinting)"은 대립유전자(allele)가 모계와 부계 유래에 따라 차별적으로 발현되는 현상을 말한다. 이에 따라 부모에 따라 후대에 유전자형이 전달되거나 전달되지 않을 수 있다.
본 발명자들은 유전자 스크리닝 기술을 이용하여, ‘부/모/자’관계의 한우 3두의 DNA 시료에 대해 전장유전체분석(re-sequencing)을 실시하여, 유전체 각인 분석을 위한 단일염기다형성(SNP) 자료를 확보하고, 근육(등심근, 대퇴근)과 지방(복부지방)에서 RNA를 추출하여 전사체분석(RNA-sequencing)을 실시하여 조직별 대립유전자 발현양상 분석을 위한 자료를 확보하였으며, 이를 이용하여 상기 유전자의 대립유전자가 모계 발현을 나타냄을 확인하였다. 또한, 직접 염기서열 분석 기술을 이용하여, AP1AR 유전자의 유전체 각인 여부를 판별하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 624번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 624번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 766번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 766번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 995번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 995번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 1145번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 1145번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1종 이상을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1은 소의 AP1AR 유전자에서 유래한 것을 특징으로 하는 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커가 제공된다. 상기 AP1AR 유전자(NSBTAG00000003941, MGC155012)는 adaptor related protein complex 1 associated regulatory protein을 나타낸다.
일반적으로 상염색체상의 대립유전자(allele)는 부계, 모계에 관계없이 동일하게 발현되나, 일부는 모계와 부계 유전자가 차별적으로 발현된다. 이때 하나의 대립유전자는 유래된 부모의 기원에 의해 후생유전학적 메틸화(epigenetic methylation)를 통해 침묵화되고, 다른 하나의 대립유전자가 단일대립유전자성 발현(mono-allelic expression)을 나타내며, 이를 유전체 각인(genomic imprinting)이라고 한다. 본 발명은 AP1AR 유전자의 대립유전자가 모계 발현(maternal expression) 패턴을 나타냄을 확인하고 AP1AR 유전자 유래 SNP 마커를 이용하여 소의 유전체 각인을 판별하고자 하였다.
본 발명의 AP1AR 유전자의 4개 SNP(단일염기다형성; rs210984344, rs379535668, rs379709765, rs108949780)는 모두 이형접합체(heterozygote)이다. 소염색체(BTA) 6번에 위치한 AP1AR 유전자의 4개의 SNP의 위치는 도 1에 나타나 있다. 또한, 자식 개체 3두의 각 조직에 추출한 RNA으로부터 합성된 cDNA에 대해 직접 서열분석(direct sequencing)을 실시하여, 상기 SNP들의 대립유전자 모두가 단일대립유전자성 발현(mono-allelic expression)을 나타냄을 확인하였다(도 2).
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
상기 SNP 마커를 검출할 수 있는 제제는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는 소의 유전체 각인 판별용 키트가 제공된다.
본 발명에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다.
본 발명에서 사용되는 용어 “프라이머”는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머들의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 대상 소 시료에서 핵산을 추출하는 단계; 상기 추출된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 분석 단계를 포함하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명에 있어서, 대상 소 시료로부터 핵산을 추출하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 소 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 염기서열을 분석하는 단계는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립유전자-특이적 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.
본 발명에 일 실시예에 의하면, 상기 대상 소 시료는 자식 개체의 근육 또는 지방 부위에서 추출한 것을 특징으로 하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 대상 소 시료는 대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 척수, 심장근, 등심근, 대퇴근, 간, 비장, 림프, 신장, 부신, 혈액, 소장, 대장, 및 폐 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 핵산은 모계를 따라 발현되는 것을 특징으로 하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 핵산은 소의 AP1AR 유전자에서 유래한 것을 특징으로 하는 소의 유전체 각인 판별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소는 한우인 것을 특징으로 하는 유전체 각인 판별방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다.
실시예
AP1AR 유전자의 SNP에 대한 염기서열 결정
1. 공시 재료 및 게놈 DNA 추출
본 발명에 이용된 공시재료는 자식개체의 등심에서 추출한 DNA와 17개 조직(대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 척수, 심장근, 등심근, 대퇴근, 간, 비장, 림프, 신장, 부신, 혈액, 소장, 대장, 및 폐)에서 추출한 RNA을 이용하였다.
2. 프라이머 제작 및 유전자증폭(PCR)
한우에서 차세대 시퀀싱(next generation sequencing) 기술을 이용하여 유전체 각인 현상이 확인된 SNP 4개(rs210984344, rs379535668, rs379709765, rs108949780)에 대한 염기서열 결정을 위해, Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용하여 프라이머를 제작하였다. DNA와 RNA에 대해 범용적으로 유전자 증폭이 가능하게 하기 위해 exon 영역에 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 2 및 3)가 위치하도록 하였다(표 1). 표 1은 본 발명의 프라이머 정보를 나타낸다.
Figure 112017107521413-pat00001
총 20㎕의 PCR 반응액은 gDNA 3ng, Slog 2x mater mix 10㎕, primer (10pmol/㎕) 2㎕ (F, 1.0㎕; R, 1.0㎕), 나머지 증류수로 구성되었다.
상기 혼합물은 Verti 96 well Thermal Cycler(Applied Biosystem, CA, USA)을 이용하여 96℃에서 2분간의 첫 반응을 시작으로 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 40초간 결합, 72℃에서 1분간 신장하여 총 35 cycle 실시한 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장반응을 실시하였다.
3. 증폭산물 정제 및 염기 서열 결정을 이용한 검증
증폭 산물은 MultiScreen HTSTM PCR (MILLIPORE, Seoul, Korea)을 이용하였다. 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로판올(isopropanol) 및 에탄올(ethanol)을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet에 10㎕의 Hi-Di 포름아마이드(formamide)를 넣었다. 95℃에서 2분간 변성 과정을 거쳐 36cm 의 캐필러리(capillary)를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
결과
한우에서 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 기술을 이용한 AP1AR 유전자의 유전체 각인 여부 판별 결과, 자식 개체의 DNA에 대한 직접 염기서열 분석을 통해 AP1AR 유전자의 SNP 4개(rs210984344, rs379535668, rs379709765, rs108949780)에 대한 유전자형 분석을 실시하여, 모두가 이형접합체(heterozygote임)을 확인하였다. 또한 자식 개체 3두의 대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 척수, 심장근, 등심근, 대퇴근, 간, 비장, 림프, 신장, 부신, 혈액, 소장, 대장, 및 폐 조직에 추출한 RNA으로부터 합성된 cDNA에 대해 직접 염기서열 분석(direct sequencing)을 실시하여, 상기 SNP들의 대립유전자가 단일대립유전자성(mono-allelic expression)을 나타내고 있음을 확인하였다.
AP1AR 유전자 염기서열, SNP 위치 및 대립유전자 정보(Bovine UMD3.1 reference genome 기준)는 도 1 및 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112017107521413-pat00002
한우에서 직접 염기서열 분석 기술을 이용한 AP1AR 유전자의 유전체 각인여부 판별한 결과를 도 2에 나타내었다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> SNP marker from AP1AR gene for identifying genomic imprinting and method for identifying genomic imprinting using the same <130> NPF31558 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1684 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 ttgcagggca cgggctctcg gcacgcaggc ttcagtagtt gtggctcacg ggcttaactg 60 ccccgtgcca tgtgggatct tctggaccaa ggattaaacc cgtgtccctt gcattggcag 120 gcagattctt ggttaagaag aatcttaacc aaggaagatt ggacttactg gaccaccagg 180 gaagtccagg attggttttt ttaagttaat tcacacgtca agcctgatag tttcagtctt 240 ttaataaagt ttttaaatct tcactaagat ttctaataac tctgcccata taataggaat 300 gaatcgaatg cttccaatga gagaacgttc caaaacagag gaagacattc tccgggcagc 360 acttaagtat agctgcaaga agacgggaag taatcctaca tcagcctctg atgattccaa 420 tgggctggag tgggagaatg attttgttag tgccgaaatg gatgataatg gcaattccga 480 gtattgtgga tttgtaaatc ctgtattaga actgtccgat tctggtctaa agcaatatga 540 ttcagatcaa caaaaacgat aggaaaaaat tgtgtgatct tgtttatcag ttatgaccaa 600 atgttacaaa ccaactagaa tgtagtaaat ggttgtgctg agcctttttg tgaggggagg 660 taagaaattg ttttgtaaat gctttttaga aaggaatagg aatgataggc tgtatctgaa 720 ctgcttcaga attaagtgca atttcatcat ctgccttctg cttttccaaa aacaattgaa 780 tggttctgtc atgctactaa tgaaatttat ttaactcttt agcaatcctg tttactattt 840 gttgcttttc actttttaaa atagttttgt tgattttact tcaaatgctt ccttaatcct 900 gtttcagtag ctaactgtga aaatattaag gcattttgtg ttaattctca gcagacatga 960 agggagcatg aagagggact gccagattca gacagatata gtgttccctt ttccagcatt 1020 atttattcct atgacttact taaattatgt catctaatag taagcacaat taatttgagt 1080 agatgaccct aaagaaagcc tgaaatatca gtttcttcct acacttactg catatcctag 1140 tataccaagt gttcattcag tctgaacaaa ggatatgata cattaaaata atctttcaga 1200 atttggacac ttgaagttac tatcaaaaga tatttaagaa aatacatata cttaggtttt 1260 tcacttcctt ttctgtgcca ctataaatga atgttgcatt tagtcaattg atacattcaa 1320 tttctagctg tcatttttaa aaattctata tttccagtga atggtcttga aagattttac 1380 atggaacata ttctctgtgc atggtttatt aagaaaggaa aacctaaaaa agataatacg 1440 ggtacctttg ccttgtaata caaggtactg taataggatg gaactaagta aatcaatata 1500 taactgcatt ttatgatata caattaactt tttttgctct aaagtttatg tatcaattta 1560 agagaccaag gatatagcac actctattgc ttgtcttgat tttgctgagg attgagtatg 1620 attttagtaa gcaaactttt ttcaattttt ccttagtttt ttttttttct tgcaacaatg 1680 acag 1684 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ctgatgattc caatgggctg g 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ggcacagaaa aggaagtgaa aaac 24

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 624번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 624번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 1로 표시되는 염기서열의 766번째 염기는 C 또는 A이고, 상기 766번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 1로 표시되는 염기서열의 995번째 염기는 T 또는 A이고, 상기 995번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
    서열번호 1로 표시되는 염기서열의 1145번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 1145번째 염기를 포함하고, 서열번호 1의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1종 이상을 포함하는, 한우의 유전체 각인 판별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1은 한우의 AP1AR 유전자에서 유래한 것인, 한우의 유전체 각인 판별용 조성물.
  3. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한우의 유전체 각인 판별용 조성물.
  4. 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 한우의 유전체 각인 판별용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 한우의 유전체 각인 판별용 조성물을 포함하는, 한우의 유전체 각인 판별용 키트.
  6. 대상 한우 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
    상기 추출된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 분석 단계를 포함하는, 한우의 유전체 각인 판별 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 대상 한우 시료는 자식 개체의 근육 또는 지방 부위에서 추출한 것인, 한우의 유전체 각인 판별 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 대상 한우 시료는 한우의 대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 척수, 심장근, 등심근, 대퇴근, 간, 비장, 림프, 신장, 부신, 혈액, 소장, 대장, 및 폐 중 1종 이상인, 한우의 유전체 각인 판별 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 핵산은 모계를 따라 발현되는 것인, 한우의 유전체 각인 판별 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 핵산은 한우의 AP1AR 유전자에서 유래한 것을 특징으로 하는 한우의 유전체 각인 판별 방법.
  11. 삭제
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