TWI417545B - 檢測豬隻分子標記之基因型的方法及套組 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種分析豬隻分子標記之基因型的方法及套組。
種畜禽產業是畜牧產業的火車頭，畜產先進國家無不重視種畜禽產業。傳統家畜、禽的育種選拔，以往多仰賴依據個體之體表型選拔或停留在利用傳統數量遺傳的技術進行選種。體表型是遺傳與環境的綜合表現，倘若僅依據個體之體表型選拔，易造成失誤。利用傳統數量遺傳的技術進行選種，所需時間長，並須有足夠大數目的族群，維持費用高，而且當性能達到提高態(plateau)，會因選拔差變小，以致無法獲得足夠有效之遺傳改進量。近年來發現基因的突變，造成基因單一核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)，有些會導致表型的改變，影響生產性狀，而成為分子選種標記。利用分子標記輔助選種(marker assisted selection,MAS)，可快速、準確的篩檢出具優良基因型之種畜禽，用於配種。
已知有許多基因上的分子標記與豬隻重要的經濟性狀有關，例如，離子釋放通道接受體(calcium release channel receptor,CRC)、酸肉基因(rendement napole,RN)、鈣激活蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)、及心臟型脂肪酸結合蛋白(heart-fatty acid binding protein,H-FABP)等基因上的分子標記之基因型與屠體肉質性狀有關；又，雌激素受體(estrogen receptor,ESR)、催乳素受體(prolactin receptor,PRLR)、視黃醇結合蛋白4(retinol-binding protein 4,RBP4)、瘦體素(leptin,LEP)、備解素(complement factor protein B,BF)、瘦體素受體(leptin receptor,LEPR)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、紅血球生成素受體(erythropoietin receptor,EPOR)、促濾泡素受體(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)、及促性腺素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor,GNRHR)等基因上的分子標記之基因型與繁殖性狀有關；另外，黑色素皮質素受體4(Melanocortin 4 receptor,MC4R)及α1岩藻糖轉移酶FUT1(α1-fucosyltransferase)等基因上的分子標記之基因型則與生長或抗病能力性狀有關。針對與豬隻重要的經濟性狀有關的分子標記進行基因型篩檢，對豬隻育種效率及生產性能之提升有莫大助益。
目前分析種豬隻的分子標記之基因型，普遍採用的方法是聚合酶連鎖反應及限制片段多態性(PCR-RFLP)分析方法，其係以PCR增殖基因片段並進行限制酶切割後，再進行電泳分析其多態性。PCR-RFLP方式操作簡單，但缺點則是分析速度慢。通常一次僅針對單一標記進行分析，且為了提升其準確性，如遇電泳圖環帶不夠清晰時，需重複同一試驗多次來確認，而若欲檢測之DNA片段缺乏適當之限制酶切割位置，則難以進行。以2009年11月份資料而言，台閩地區的養豬戶有10,539戶，總計在養的種公豬有25,796頭及種母豬有672,511頭，對此龐大的種豬數量而言，欲以傳統PCR-RFLP方式普遍篩檢與種豬重要經濟性狀有關之基因型，誠屬戛乎其難。
因此，有需要發展更快速、準確的檢測方法，特別是能同時檢測多種與豬隻重要的經濟性狀有關的分子標記之基因型的方法，以提升種豬的選拔效率。
本發明針對多種與豬隻重要的經濟性狀有關的單核苷酸多態性分子標記設計引子組，可用以在同一反應中進行引子延伸反應，產生反應產物，然後分析該反應產物，檢測出多種分子標記之基因型。本發明成功克服在同一反應中使用多種引子組易產生相互干擾及結果難以判讀的問題，而可同時檢測多種重要的豬隻分子標記之基因型，達到一次篩檢多種分子標記之目的。
在第一方面，本發明提供一種可同時檢測多種豬隻分子標記的基因型之方法，其包括：
(A)以來自豬隻的核酸樣本為模板，在同一反應中使用多種引子組進行引子延伸反應，產生反應產物，其中所述多種引子組係選自以下第一引子組至第九引子組所組成之群之任四者或四者以上的組合：
(1)第一引子組，其包括：
(a)第一PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 1及2之核苷酸序列，以及
(b)第一延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 3之核苷酸序列；其中，第一引子組係用於檢測動情素接受體(ESR)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 28的第65個鹼基位置的(ESR-A65G)；
(2)第二引子組，其包括：
(a)第二PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 4及5之核苷酸序列，以及
(b)第二延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 6之核苷酸序列；其中，第二引子組係用於檢測視黃醇結合蛋白4(RBP4)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 29的第29個鹼基位置(RBP4-G29C)；
(3)第三引子組，其包括：
(a)第三PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 7及8之核苷酸序列，以及
(b)第三延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 9之核苷酸序列；其中，第三引子組係用於檢測鈣離子釋放通道接受體(CRC)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 30的第33個鹼基位置(CRC-C33T)；
(4)第四引子組，其包括：
(a)第四PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 10及11之核苷酸序列，以及
(b)第四延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 12之核苷酸序列；其中，第四引子組係用於檢測泌乳素受體(PRLR)之單核苷酸多態性之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 31的第77個鹼基位置(PRLR-A77G)；
(5)第五引子組，其包括：
(a)第五PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 13及14之核苷酸序列，以及
(b)第五延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 15之核苷酸序列；其中，第五引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 32的第47個鹼基位置(CAST-G47A)；
(6)第六引子組，其包括：
(a)第六PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 16及17之核苷酸序列，以及
(b)第六延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 18之核苷酸序列；其中，第六引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 33的第143個鹼基位置(CAST-C143A)；
(7)第七引子組，其包括：
(a)第七PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 19及20之核苷酸序列，以及
(b)第七延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 21之核苷酸序列；其中，第七引子組係用於檢測α1岩藻醣轉移酶(FUT1)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 34的第156個鹼基位置的(FUT1-G66A)；
(8)第八引子組，其包括：
(a)第八PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 22及23之核苷酸序列，以及
(b)第八延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 24之核苷酸序列；其中，第八引子組係用於檢測黑色素皮質素受體4(MC4R)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 35的第156個鹼基位置(MC4R-G156A)；以及
(9)第九引子組，其包括：
(a)第九PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 25及26之核苷酸序列，以及
(b)第九延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 27之核苷酸序列；其中，第九引子組係用於檢測酸肉基因(RN)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 36的第216個鹼基位置(RN-G216A)；以及
(B)分析前述反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。
本發明亦提供一種可同時檢測多種豬隻分子標記的基因型之套組，其包括選自前述第一引子組至第九引子組所組成之群之任四者或四者以上的組合。
在第二方面，本發明提供一種同時檢測心臟型脂肪酸結合蛋白(heart-fatty acid binding protein,H-FABP)之多種分子標記的基因型之方法，其包括：
(A)以來自豬隻的核酸樣本為模板，在同一反應中使用多種引子組進行引子延伸反應，產生反應產物，其中所述多種引子組係包括：
(1)第十引子組，其包括：
(a)第十PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 37及38之核苷酸序列，以及
(b)第十延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 39之核苷酸序列；其中，第十引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 44的第204個鹼基位置的(H-FABP-T204C)；
(2)第十一引子組，其包括：
(a)第十一PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 40及41之核苷酸序列，以及
(b)第十一延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 42之核苷酸序列；其中，第十一引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 45的第89個鹼基位置(H-FABP-T89C)；
(3)第十二引子組，其包括：
(a)第十二PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 40及41之核苷酸序列，以及
(b)第十二延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 43之核苷酸序列；其中，第十二引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 45的第411個鹼基位置(H-FABP-G411C)；以及
(B)分析前述反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。
本發明亦提供一種可同時檢測H-FABP之多種分子標記的基因型之套組，其包括前述第十引子組至第十二引子組。
本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。
無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。
在第一方面，本發明針對九種與豬隻重要的經濟性狀有關的單核苷酸多態性分子標記設計出九種引子組，此等分子標記包括ESR-A65G、RBP4-G29C、CRC-C33T、PRLR-A77G、CAST-G47A、CAST-G143A、FUT1-G66A、MC4R-G156A、及RN-G216A。表1列出本發明設計的引子組、對應的分子標記、及相關序列編號。
前述九種分子標記ESR-A65G、RBP4-G29C、CRC-C33T、PRLR-A77G、CAST-G47A、CAST-G143A、FUT1-G66A、MC4R-G156A、及RN-G216A係與豬隻重要的經濟性狀有關。該等分子標記對應的序列可參酌圖1至9。SEQ ID NO: 28係圖1所示第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共121個鹼基。SEQ ID NO: 29係圖2所示RBP4基因序列之5’端引子REB4-F2對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共140個鹼基。SEQ ID NO: 30係圖3所示CRC基因序列之5’端引子Stress gene-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共243個鹼基。SEQ ID NO: 31係圖4所示PRLR基因序列之5’端引子PRLR-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共166個鹼基。SEQ ID NO: 32係圖5所示CAST基因序列之5’端引子CAST249-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共300個鹼基。SEQ ID NO: 33係圖6所示CAST638基因序列之5’端引子CAST638-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共248個鹼基。SEQ ID NO: 34係圖7所示FUT1基因序列之5’端引子FUT1-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共231個鹼基。SEQ ID NO: 35係圖8所示MC4R基因序列之5’端引子MC4R-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共410個鹼基；以及SEQ ID NO: 36係圖9所示RN基因序列之5’端引子γAMPK-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共407個鹼基。
根據本發明，可選擇所設計的九種引子組中之任四者或四者以上的組合在同一反應中進行引子延伸反應，產生反應產物；然後分析該反應產物，獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔，不相互干擾，因此可達到同時檢測出多種分子標記之基因型的目的。
因此，本發明提供一種可同時檢測多種豬隻分子標記的基因型之方法，其包括：
(A)以來自豬隻的核酸樣本為模板，在同一反應中使用多種引子組進行引子延伸反應，產生反應產物，其中所述多種引子組係選自以下第一引子組至第九引子組所組成之群之任四者或四者以上的組合：
(1)第一引子組，其包括：
(a)第一PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 1及2之核苷酸序列，以及
(b)第一延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 3之核苷酸序列；其中，第一引子組係用於檢測動情素接受體(ESR)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 28的第65個鹼基位置的(ESR-A65G)；
(2)第二引子組，其包括：
(a)第二PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 4及5之核苷酸序列，以及
(b)第二延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 6之核苷酸序列；其中，第二引子組係用於檢測視黃醇結合蛋白8(RBP4)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 29的第29個鹼基位置(RBP4-G29C)；
(3)第三引子組，其包括：
(a)第三PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 7及8之核苷酸序列，以及
(b)第三延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 9之核苷酸序列；其中，第三引子組係用於檢測鈣離子釋放通道接受體(CRC-C33T)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 30的第33個鹼基位置(CRC-C33T)；
(4)第四引子組，其包括：
(a)第四PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 10及11之核苷酸序列，以及
(b)第四延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 12之核苷酸序列；其中，第四引子組係用於檢測泌乳素受體(PRLR)之單核苷酸多態性之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 31的第77個鹼基位置(PRLR-A77G)；
(5)第五引子組，其包括：
(a)第五PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 13及14之核苷酸序列，以及
(b)第五延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 15之核苷酸序列；其中，第五引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 32的第47個鹼基位置(CAST-G47A)；
(6)第六引子組，其包括：
(a)第六PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 16及17之核苷酸序列，以及
(b)第六延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 18之核苷酸序列；其中，第六引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 33的第143個鹼基位置(CAST-C143A)；
(7)第七引子組，其包括：
(a)第七PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 19及20之核苷酸序列，以及
(b)第七延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 21之核苷酸序列；其中，第七引子組係用於檢測α1岩藻醣轉移酶(FUT1)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 34的第66個鹼基位置的(FUT1-G66A)；
(8)第八引子組，其包括：
(a)第八PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 22及23之核苷酸序列，以及
(b)第八延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 24之核苷酸序列；其中，第八引子組係用於檢測黑色素皮質素受體4(MC4R)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 35的第156個鹼基位置(MC4R-G156A)；以及
(9)第九引子組，其包括：
(a)第九PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 25及26之核苷酸序列，以及
(b)第九延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 27之核苷酸序列；其中，第九引子組係用於檢測酸肉基因(RN)之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 36的第216個鹼基位置(RN-G216A)；以及
(B)分析前述反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。
如未特別敘明，本文所使用的冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即，至少一個)之由該冠詞所銜接的受詞。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。
本文所述「核酸」或「寡核苷酸」是指核苷酸單體之聚合體，其可以是單股或雙股、直線型或環狀、去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸單體包括磷酸基部分、糖基部分及鹼基部分。常見的核苷酸之鹼基部分包括鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶配對，以及鳥糞嘌呤與胞嘧啶配對。
本文所述「核酸樣本」是指任何含有核酸之試劑或樣本，其可由天然生物體來源分離獲得或以化學合成法或聚合酶連鎖反應(PCR)擴增技術所製得。核酸之純化方法、化學合成法及PCR擴增技術可參見Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook J等人編著，1989以及Current Protocols in Molecular Biology，Frederick M.A.等人編著，2001，John Wiley ＆ Sons,Inc.。
本文所述「單核苷酸多態性(SNP)」是指不同個體間DNA在同一基因座上的交替基因，僅有單個核苷酸的差異。SNP的種類可為置換(transition)或顛換(transversion)，置換為嘌呤與嘌呤或嘧啶與嘧啶間的替換(或)，而顛換則為嘌呤與嘧啶間的替換(或)。
本文所述「交替基因(allele)」又稱對偶基因或等位基因。基因位於染色體之特定位置(基因座)上。以雙套染色體之生物體而言，在同一基因座上有一對(兩個)交替基因，這兩個交替基因之形式可為相同或不同，相同者，稱為同型交替基因(homozygous allele)，不同者，稱為雜型交替基因(heterozygous allele)。
本文所述「單核苷酸多態性之基因型」或「SNP基因型」或其他類似用語是指SNP之交替基因的序列組成。針對來自個體之核酸樣本進行單核苷酸多態性之基因型檢測可包括判斷此單核苷酸多態性之交替基因的序列組成。以雙倍體生物而言，針對特定SNP具有兩份C等位基因的個體是C等位基因之同型組合，其基因型是CC；而具有兩份A等位基因的個體是A等位基因之同型組合，其基因型是AA；另具有各一份等位基因的個體則是異型組合者，其基因型係AC。
本文所述「引子」是指具特定序列的寡核苷酸，其與目標核酸之序列互補，可作為由DNA聚合酶所催化之核苷酸聚合作用的起始點。
本文所述「引子延伸反應」主要是運用PCR與核酸定序，基本上先針對特定的SNP設計一PCR引子對，利用該PCR引子對以PCR技術將涵蓋該SNP的核酸片段增幅出來，然後去除不必要的試劑後，加入延伸反應引子，針對增幅出來的核酸片段進行單鹼基延伸；其中此延伸反應引子的3’端位置是位於該SNP往上游(5’端)或下游(3’端)方向一個鹼基之位置，當加入標定不同螢光染劑的雙去氧核苷酸(ddNTP)進行DNA聚合反應時，類似於定序之原理，ddNTP會終止DNA的合成，最後可藉由不同螢光的呈現，判讀欲檢測的SNP的基因型。
本文所述「同一反應」在描述引子延伸反應之進行時，是指至少有二種以上不同的PCR引子對及/或延伸反應引子在同一反應室(例如，試管)中同時進行反應。在一具體實例中，可在單一試管加入多對PCR引子同時進行多重式PCR反應，再於相同試管加入多條延伸反應引子後，接續進行單鹼基延伸反應。在另一具體實例中，亦可先在不同試管內以不同引子組個別進行的PCR反應，再將增殖之PCR產物整合至單一試管後，加入多條延伸反應引子，接續進行單鹼基延伸反應。
本文所述具特定編號之核苷酸序列包括其互補序列，該互補序列與該具特定編號之核苷酸序列具相同數目之核苷酸，進行序列比對時，兩者在對應位置上的核苷酸依前述的鹼基配對方式是完全配對的。
本文所述核苷酸序列亦包括其實質相同序列，該實質相同序列與該具特定編號之核苷酸序列，在序列結構及生物功能上實質相同。
在序列結構上，該實質相同序列與其所對應的核苷酸序列，兩者長度可以相同或不同，而在進行序列比對時，對應的鹼基有60%、較佳有70%、更佳有80%、再更佳有90%、最佳有95%以上者是相同的。或者，該實質相同序列與所對應的核苷酸序列之互補序列，在適當條件下，可相互雜合，也就是說兩者在對應位置上，有相當比例的核苷酸依前述鹼基配對方式而相互結合形成鹼基對；所述相當比例較佳為60%、較佳為70%、更佳為80%、再更佳為90%、最佳為95%以上。
前述序列比對可用此一領域所熟知的技術進行，例如，美國威斯康辛大學基因電腦小組(GCG)之BLASTN程式，或類似技術。另一方面，此一領域已揭露各種進行核酸操作之方法與條件，可參見前述Sambrook J等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual及Frederick M.A.等人的Current Protocols in Molecular Biology。
除了序列結構之外，本文所述實質相同序列與所對應的核苷酸序列在生物功能上實質相同，例如，均具有雜合至對應基因序列而可進行聚合酶連鎖反應或引子延伸反應之功能。
根據本發明，可選用所設計的九種引子組中的任四種或四種以上的組合進行引子延伸反應，以檢測所對應的分子標記的基因型。在部份具體實施例中，本發明之方法係在所設計的九種引子組中選用任四種引子組、任五種引子組、任六種引子組、任七種引子組、任八種引子組、或全部九種引子組進行引子延伸反應。一般而言，所屬領域具通常知識者可依選用的引子之序列，參照現有知識及技術調整出適當的反應條件，進行步驟(A)，例如，依據引子序列計算出熱融點(Tm)，再調整適當的PCR及引子延伸反應條件。在一具體實例中，本發明使用全部九種引子組，其中加入PCR引子對的PCR反應條件最佳是94℃進行7分鐘後，再進行94℃1分鐘、59℃1分鐘、72℃1.5分鐘，共35次循環，最後進行72℃7分鐘；以及加入延伸反應引子後的延伸反應條件最佳是96℃10秒、50℃5秒、60℃30秒，供25次循環。以下實例記載其餘特定的反應細節。
在一特定具體實例中，本發明係在單一試管加入所選引子組的PCR引子對同時進行多重式PCR反應，再於相同試管加入所選引子組的延伸反應引子後，接續進行單鹼基延伸反應。
關於步驟(B)，所屬領域具通常知識者可選用任何習知用於分析引子延伸反應之產物以檢測所涉分子標記之基因型的技術進行之。在一具體實施例中，本發明之步驟(B)係使用毛細電泳法(capillary electrophoresis)，進行基因型之檢測。毛細電泳法是在微小內徑的毛細管柱內用高電壓分離核酸樣本，具有靈敏度高、需要樣本量少及成本低等優點，商業上可購得的產品包括Sixteen-Capillary Array(ABI Prism 3100 Genetic Analyzer)。
根據本發明，在步驟(B)中，分析來自步驟(A)之反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。進一步說明，在一具體實例中，使用毛細電泳法進行步驟(B)，其中所得代表各個單核苷酸多態性之基因型之峰值可相互區隔，不會重疊或相互干擾，成功達到同時檢測多種豬隻分子標記的基因型之目的。
此外，本發明亦提供一種可同時檢測多種豬隻分子標記的基因型之套組，其包括上述第一引子組至第九引子組所組成之群之任四者或四者以上的組合。在部分具體實施例中，本發明之套組包括其中的任四種引子組、任五種引子組、任六種引子組、任七種引子組、任八種引子組、或全部九種引子組。特定而言，本發明之套組可進一步含有其他試劑，例如，緩衝液、酵素、螢光標記物及染劑等。
在另一方面，本發明針對豬隻心臟型脂肪酸結合蛋白(heart-fatty acid binding protein,H-FABP)之單核苷酸多態性分子標記設計出三種引子組，此等分子標記包括H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C。表2列出本發明設計的引子組、對應的分子標記、及相關序列編號。
前述三種分子標記H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C係與豬隻重要的經濟性狀有關。該等分子標記對應的序列可參酌圖12及13。SEQ ID NO: 44係圖11所示H-FABP基因序列之5’端引子H-FABPUPST-F2對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共709個鹼基。SEQ ID NO: 45係圖12所示H-FABP基因序列之5’端引子H-FABPintr-F2對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共816個鹼基。
根據本發明，可使用所設計的第十引子組至第十二引子組在同一反應中進行引子延伸反應，產生反應產物；然後分析該反應產物，獲得代表三種分子標記H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C之基因型的訊號，其中該等訊號可相互區隔，不相互干擾，因此可達到同時檢測出三種H-FABP分子標記之基因型的目的。
因此，本發明提供一種同時檢測豬隻H-FABP之多種分子標記的基因型之方法，其包括：
(A)以來自豬隻的核酸樣本為模板，在同一反應中使用多種引子組進行引子延伸反應，產生反應產物，其中所述多種引子組係包括：
(1)第十引子組，其包括：
(a)第十PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 37及38之核苷酸序列，以及
(b)第十延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 39之核苷酸序列；其中，第十引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 44的第204個鹼基位置的(H-FABP-T204C)；
(2)第十一引子組，其包括：
(a)第十一PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 40及41之核苷酸序列，以及
(b)第十一延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 42之核苷酸序列；其中，第十一引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 45的第89個鹼基位置(H-FABP-T89C)；
(3)第十二引子組，其包括：
(a)第十二PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS: 40及41之核苷酸序列，以及
(b)第十二延伸反應引子，其具有SEQ ID NO: 43之核苷酸序列；其中，第十二引子組係用於檢測H-FABP之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO: 45的第411個鹼基位置(H-FABP-G411C)；以及
(B)分析前述反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。
在一特定具體實例中，先在不同試管內以第十引子組至第十二引子組的PCR引子對個別進行的PCR反應，再將增殖之PCR產物整合至單一試管後，加入第十引子組至第十二引子組的延伸反應引子，接續進行單鹼基延伸反應。
根據本發明，在步驟(A)加入PCR引子對進行的PCR反應條件最佳是94℃進行7分鐘後，再進行94℃1分鐘、60℃1分鐘、72℃1.5分鐘，共35次循環，最後進行72℃7分鐘，或是94℃進行7分鐘後，再進行94℃1分鐘、56℃1分鐘、72℃1.5分鐘，共35次循環，最後進行72℃7分鐘；以及加入延伸反應引子進行的延伸反應條件最佳是96℃10秒、50℃5秒、60℃30秒，供25次循環。另，在步驟(B)，較佳可使用毛細電泳法分析反應產物，檢測所述分子標記之基因型。
根據本發明，在步驟(B)中，分析來自步驟(A)之反應產物，以獲得代表前述單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。例如，以毛細電泳法進行步驟(B)時，所得代表各個單核苷酸多態性之基因型之峰值可相互區隔，不會重疊或相互干擾，成功達到同時檢測三種豬隻分子標記(H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C)的基因型之目的。
此外，本發明亦提供一種可同時檢測H-FABP之多種分子標記的基因型之套組，其包括前述第十引子組至第十二引子組。特定而言，本發明之套組可進一步含有其他試劑，例如，緩衝液、酵素、螢光標記物及染劑等。
下文詳述本發明之各種具體實例。本發明之其他特徵將可由下列有關各種具體實例之詳述及申請專利範圍而清楚呈現。
本實例使用的來自豬隻(Sus scrofa
)之血液樣本。取10ml豬血，加入抗凝血劑後，置於50ml之加有Modified Alsevers solution(葡萄糖20.5g、檸檬酸鈉8.0g、檸檬酸0.55g、氯化鈉4.2g、加2dH2O至1000ml，調pH至7.2-7.4)之離心管中，以3,000rpm離心15分鐘。吸取中間層之白血球細胞入另一離心管，加入0.9%生理鹽水至10ml，以塑膠吸管吸放數次使白血球重新均勻懸浮，經3,000rpm離心15分鐘後，收集白血球於另一乾淨離心管中。加入三倍體積之0.87% NH4
Cl混合均勻，作用10至20分鐘，使紅血球溶解，再以3,000rpm(Model SCT5B，HITACHI)離心15分鐘，去上層液。沈澱的白血球加入10ml 0.9%生理鹽水洗滌2次，均以3,000rpm離心15分鐘，再去除上層液。然後加入3ml TNE緩衝液(10mM Tris-Cl pH 8.0,150mM NaCl,10mM EDTA)重懸浮白血球細胞。加入150μl 10% SDS，50μl蛋白酶K(10mg/ml)與45μl膠原蛋白酶，置於45℃振盪水槽中水浴至少12小時。分別以同體積的酚、酚/氯仿及氯仿各萃取一次，每次皆以3,300rpm離心20分鐘，取上層液。上述之上層液，加入兩倍體積量之異丙醇及1/10體積量之3M CH3
COONa(pH 5.2)或5M NaCl沉澱後，加入適量之TE緩衝液或滅菌去離子水溶解DNA，供後續分析使用。
依據前人文獻提及之基因的核苷酸序列，針對ESR-A65G、RBP4-G29C、CRC-C33T、PRLR-A77G、CAST-G47A、CAST-C143A、FUT1-G66A、MC4R-G156A、及RN-G216A等分子標記設計出第一引子組至第九引子組(表1及圖1至9)，以及針對H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C等分子標記設計出第十引子組至第十二引子組(表2及圖11及12)，以進行多重式SNP基因型檢測。
進行PCR增殖時，取0.2mL滅菌之微離心管，依序加入10X PCR反應緩衝液、2.5mM dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、一或多對適量之PCR引子、0.2UTaq
DNA聚合酶及適量之豬隻基因組DNA模板，以滅菌水將體積調整至10μL，輕緩混和後，置入離心機中短暫離心。於PCR system 2700(Applied Biosystems)儀器中進行PCR反應。使用不同引子組進行的PCR反應，可視需要在同一試管以相同反應模式一起進行，或在不同試管以不同反應模式分開進行。將增殖之PCR產物取2μL與適量指示劑，充填於2%瓊脂糖膠體梳孔內，電泳條件為100伏特電壓，時間為30分鐘，電泳完成後之膠體經溴化乙錠染色，以紫外光燈照射觀察DNA環帶長度。進行多重式SNP基因型檢測時，在同一試管內，將PCR產物與數條SNP延伸反應引子同時進行延伸反應，反應後之產物進行毛細管電泳，判斷所對應的分子標記之基因型。
表3記載使用第一引子組至第九引子組之PCR反應、引子延伸反應、及毛細管電泳之詳細反應條件。
表4記載使用第十引子組至第十二引子組之PCR反應、引子延伸反應、及毛細管電泳之詳細反應條件。
圖10顯示使用本發明之第一引子組至第九引子組進行多重式引子延伸反應，檢測ESR-A65G、RBP4-G29C、CRC-C33T、PRLR-A77G、CAST-G47A、CAST-G143A、FUT1-G66A、MC4R-G156A、及RN-G216A等分子標記之基因型的結果。圖13顯示使用本發明之第十引子組至第十二引子組進行多重式引子延伸反應，檢測H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C等分子標記之基因型的結果。如圖10及13所示，根據本發明進行的多種豬隻分子標記之基因型檢測，不會相互干擾，每個峰值代表特定分子標記之基因型均可清楚判讀，不會重疊。本發明突破進行多重式引子延伸反應常見的干擾現象，成功達到一次檢測多種分子標記之基因型之目的，對於篩選具重要經濟性狀之種豬有重大貢獻。
圖1顯示豬隻ESR-A65G基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖2顯示豬隻RBP4-G29C基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖3顯示豬隻CRC-C33T基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖4顯示豬隻PRLR-A77G基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖5顯示豬隻CAST-G47A基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖6顯示豬隻CAST-C143A基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖7顯示豬隻FUT1-G66A基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖8顯示豬隻MC4R-G156A基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖9顯示豬隻RN-G216A基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖10顯示毛細管電泳分析ESR-A65G、RBP4-G29C、CRC-C33T、PRLR-A77G、CAST-G47A、CAST-G143A、FUT1-G66A、MC4R-G156A、及RN-G216A等分子標記之基因型的結果，其中(1)至(4)是來自不同豬隻個體的檢測結果。
圖11顯示豬隻H-FABP(5’上游區域)基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖12顯示豬隻H-FABP(內含子2)基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖13顯示毛細管電泳分析H-FABP-T204C、H-FABP-T89C及H-FABP-G411C等分子標記之基因型的結果，其中(A)、(B)及(C)是來自不同豬隻個體的檢測結果，基因型分別為ddaaHH、DdAaHh、及DDAAhh。
Claims (3)
- 一種可同時檢測多種豬隻經濟性狀相關之分子標記的基因型之引子套組，其包括第一引子組至第九引子組如下：(1)第一引子組，其包括(a)第一PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：1及2之核苷酸序列，以及(b)第一延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列；其中，第一引子組係用於檢測動情素接受體之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：28的第65個鹼基位置的(ESR-A65G)；(2)第二引子組，其包括(a)第二PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列，以及(b)第二延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列；其中，第二引子組係用於檢測視黃醇結合蛋白4之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：29的第29個鹼基位置(RBP4-G29C)；(3)第三引子組，其包括(a)第三PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：7及8之核苷酸序列，以及(b)第三延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列；其中，第三引子組係用於檢測鈣離子釋放通道接受體之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：30的第33個鹼基位置(CRC-C33T)；(4)第四引子組，其包括(a)第四PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：10及11之核苷酸序列，以及(b)第四延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：12之核苷酸序列；其中，第四引子組係用於檢測泌乳素受體之單核苷酸多態性之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：31的第77個鹼基位置(PRLR-A77G)；(5)第五引子組，其包括(a)第五PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：13及14之核苷酸序列，以及(b)第五延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：15之核苷酸序列；其中，第五引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：32的第47個鹼基位置(CAST-G47A)；(6)第六引子組，其包括(a)第六PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：16及17之核苷酸序列，以及(b)第六延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：18之核苷酸序列；其中，第六引子組係用於檢測鈣激活蛋白酶抑制蛋白之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：33的第143個鹼基位置(CAST-C143A)；(7)第七引子組，其包括(a)第七PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：19及20之核苷酸序列，以及(b)第七延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：21之核苷酸序列；其中，第七引子組係用於檢測岩藻醣轉移酶之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：34的第156個鹼基位置的 (FUT1-G66A)；(8)第八引子組，其包括(a)第八PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：22及23之核苷酸序列，以及(b)第八延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：24之核苷酸序列；其中，第八引子組係用於檢測黑色素皮質素受體4之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：35的第156個鹼基位置(MC4R-G156A)；以及(9)第九引子組，其包括(a)第九PCR引子對，其含有二種引子，分別具有SEQ ID NOS：25及26之核苷酸序列，以及(b)第九延伸反應引子，其具有SEQ ID NO：27之核苷酸序列；其中，第九引子組係用於檢測酸肉基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：36的第216個鹼基位置(RN-G216A)。
- 一種使用如請求項1之引子套組以同時檢測多種豬隻經濟性狀相關之分子標記的基因型之方法，其包括：(A)以來自豬隻的核酸樣本為模板，在同一反應中使用如請求項1之引子套組進行引子延伸反應，產生反應產物；以及(B)分析步驟(A)所得之反應產物，以獲得該引子套組中所含第一引子組至第九引子組所對應的單核苷酸多態性之基因型之訊號，其中該等訊號可相互區隔。
- 根據申請專利範圍第2項之方法，其中在步驟(B)中，使用毛細管電泳法檢測所述單核苷酸多態性之基因型。
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