TWI410499B - 用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法、套組及寡核苷酸 - Google Patents

用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法、套組及寡核苷酸 Download PDF

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TWI410499B
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用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法、套組及寡核苷酸
本發明係關於一種用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法、套組及分離的寡核苷酸。
傳統家畜、禽的育種選拔，以往多仰賴依據個體之體表型選拔或停留在利用傳統數量遺傳的技術進行選種。體表型是遺傳與環境的綜合表現，倘若僅依據個體之體表型選拔，易造成失誤。利用傳統數量遺傳的技術進行選種，所需時間長，並須有足夠大數目的族群，維持費用高，而且當性能達到提高態(plateau)，會因選拔差變小，以致無法獲得足夠有效之遺傳改進量。
菜鴨(Tsaiya ducks)是蛋用的主要水禽品種之一，也是生產肉用土番鴨的母本，在產蛋性能上仍有很大的改進空間。因此，在此領域中，仍有需要發展快速有效之鑑別菜鴨產蛋性能之方法，例如利用分子標記輔助選及配種，以提升菜鴨之產蛋性能。
細胞骨架蛋白(destrin，DSTN)是構成細胞骨架的一種組成蛋白，該蛋白負責促進生物體內肌動蛋白(actin)的更新。第十型膠原蛋白(type X collagen，TYPEXC)起初是在人類肥大增生的軟骨中發現，後來研究證實該蛋白亦存在蛋殼膜中，且具抑制蛋殼膜鈣化之功用。碳酸酐酶II(carbonic anhydrase II，CA2)屬於一種體內常在性的碳酸酐酶。蛋殼的乳頭狀突層中可發現碳酸酐酶的存在，該酵素負責催化產生碳酸鹽類，以幫助蛋殼的形成。
在此領域中，有需要發展快速有效之菜鴨育種選拔方法，特別是鑑別菜鴨產蛋性能之方法。
在一方面，本發明提供一種用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法，其包括：
(1)分析來自菜鴨的核酸樣本，以檢測選自下列(A)至(E)所組成之群的單核苷酸多態性之基因型：
(A)細胞骨架蛋白基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO:1之第93個鹼基位置(DSTN-C93A)；
(B)細胞骨架蛋白基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO:1的第106個鹼基位置(DSTN-T106C)；
(C)第十型膠原蛋白基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO:2的第74個鹼基位置(TYPEXC-T74C)；
(D)無水碳酸酶II基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO:3的第65個鹼基位置(CA2-A65G)；及
(E)前述(A)至(D)之任二者或二者以上之組合；以及
(2)依檢測所得單核苷酸多態性之基因型，鑑別菜鴨之產蛋性能，其中：
(i)如菜鴨測得具有選自以下(a)至(e)所組成之群之單核苷酸多態性之基因型，則該菜鴨具提升的產蛋性能：
(a) DSTN-C93A之基因型為CC或CA、
(b) DSTN-T106C之基因型為CC、
(c) TYPEXC-T74C之基因型為TT或TC、
(d) CA2-A65G之基因型為GG、
(e)前述(a)至(d)之任二者或二者以上之組合；或
(ii)如菜鴨測得具有以下(f)至(j)所組成之群之單核苷酸多態性之基因型，則該菜鴨不具提升的產蛋性能：
(f) DSTN-C93A之基因型為AA、
(g) DSTN-T106C之基因型為TT或TC、
(h) TYPEXC-T74C之基因型為CC、
(i) CA2-A65G之基因型為AA或AG、及
(j)前述(f)至(i)之任二者或二者以上之組合。
在另一方面，本發明提供一種套組，其係用於檢測前述菜鴨單核苷酸多態性的基因型，該套組包括選自以下所組成之群之引子組：
(1)第一引子組，其包括：
(a)第一PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有DSTN-C93A之核酸片段；及
(b)第一延伸反應引子，其3’端對應於SEQ ID NO:1之DSTN-C93A往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第一PCR引子對及第一延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨DSTN-C93A之基因型；
(2)第二引子組，其包括：
(a)第二PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有DSTN-T106C之核酸片段；及
(b)第二延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:1之DSTN-T106C往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第二PCR引子對及第二延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨DSTN-T106C之基因型；
(3)第三引子組，其包括：
(a)第三PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有TYPEXC-T74C之核酸片段；及
(b)第三延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:2之TYPEXC-T74C往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第三PCR引子對及第三延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨TYPEXC-T74C之基因型；
(4)第四引子組，其包括：
(a)第四PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有CA2-A65G之核酸片段；及
(b)第四延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:3之CA2-A65G往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第四PCR引子對及第四延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨CA2-A65G之基因型；以及
(5)前述第一至四引子組之任二者或二者以上之組合。
在又一方面，本發明提供分離的寡核苷酸，其具有一段選自SEQ ID NOS:4至13所組成之群組之核苷酸序列。此等分離的寡核苷酸可用以鑑別菜鴨產蛋性能。
本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。
無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。
本試驗利用DNA晶片、核苷酸定序及毛細管電泳分析等技術，尋找與菜鴨產蛋性能相關之分子標記，並建立基因型鑑定方法。試驗結果顯示，DSTN、TYPEXC及CA2等基因有單核苷酸多態性之存在，且其基因型與菜鴨產蛋性能有關連性。
本發明作為菜鴨產蛋性能之單核苷酸多態性分子標記包括：
(A) DSTN-C93A，其為DSTN基因之單核苷酸多態性，位於SEQ ID NO:1的第93個鹼基位置；
(B) DSTN-T106C，其為DSTN基因之單核苷酸多態性，位於SEQ ID NO:1的第106個鹼基位置；
(C) TYPEXC-T74C，其為TYPEXC基因之單核苷酸多態性，位於SEQ ID NO:2的第74個鹼基位置；
(D) CA2-A65G，其為CA2基因之單核苷酸多態性，位於SEQ ID NO:3的第65個鹼基位置；
本發明分子標記對應的序列可參酌圖1至3，其中SEQ ID NO:1係圖1所示DSTN基因序列之5’端引子TpiDSTN-F對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共470個鹼基；SEQ ID NO:2係圖2所示TYPEXC基因序列之5’端引子TisTYPEXC-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共242個鹼基；以及SEQ ID NO:3係圖3所示CA2基因序列之5’端引子TisCA2-F1對應之第1個鹼基為起始至最後一個鹼基之序列，共508個鹼基。
I.　鑑別菜鴨產蛋性能之方法
在第一方面，本發明提供一種用於鑑別菜鴨繁殖性能之方法，其包括：
(1)分析來自菜鴨的核酸樣本，以檢測選自以下所組成之群的單核苷酸多態性之基因型：(A) DSTN-C93A；(B) DSTN-T106C；(C) TYPEXC-T74C；(D) CA2-A65G；(E)前述(A)至(D)之任二者或二者以上之組合；以及
(2)依檢測所得單核苷酸多態性之基因型，鑑別菜鴨之產蛋性能，其中：
(i)如菜鴨測得具有選自以下(a)至(e)所組成之群之單核苷酸多態性之基因型，則該菜鴨具提升的產蛋性能：
(a) DSTN-C93A之基因型為CC或CA、
(b) DSTN-T106C之基因型為CC、
(c) TYPEXC-T74C之基因型為TT或TC、
(d) CA2-A65G之基因型為GG、
(e)前述(a)至(d)之任二者或二者以上之組合；或
(ii)如菜鴨測得具有選自以下(f)至(j)所組成之群之單核苷酸多態性之基因型，則該菜鴨不具提升的產蛋性能：
(f) DSTN-C93A之基因型為AA、
(g) DSTN-T106C之基因型為TT或TC、
(h) TYPEXC-T74C之基因型為CC、
(i) CA2-A65G之基因型為AA或AG、及
(j)前述(f)至(i)之任二者或二者以上之組合。
本文所使用的冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即，至少一個)之由該冠詞所銜接的受詞。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。
本文所述「產蛋性能」是指菜鴨產蛋的能力，代表性狀包括但不限於總產蛋數(total number of eggs)及平均蛋重(average egg weight)。
本文所述「核酸」是指核苷酸單體之聚合體，其可以是單股或雙股、直線型或環狀、去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸單體包括磷酸基部分、糖基部分及鹼基部分。常見的核苷酸之鹼基部分包括鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶配對，以及鳥糞嘌呤與胞嘧啶配對。
本文所述「核酸樣本」是指任何含有核酸之試劑或樣本，其可由天然生物體來源分離獲得或以化學合成法或聚合酶連鎖反應(PCR)擴增技術所製得。核酸之純化方法、化學合成法及PCR擴增技術可參見Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook J等人編著，1989以及Current Protocols in Molecular Biology，Frederick M.A.等人編著，2001，John Wiley ＆ Sons,Inc.。
本文所述「分離的寡核苷酸」是指從天然來源純化而來或以化學合成法或PCR擴增技術所製得之寡核苷酸。
本文所述「交替基因(allele)」又稱對偶基因或等位基因。基因位於染色體之特定位置(基因座)上。以雙套染色體之生物體而言，在同一基因座上有一對(兩個)交替基因，這兩個交替基因之形式可為相同或不同，相同者，稱為同型交替基因(homozygous allele)，不同者，稱為雜型交替基因(heterozygous allele)。
本文所述「單核苷酸多態性(SNP)」是指不同個體間DNA在同一基因座上的交替基因，僅有單個核苷酸的差異。SNP的種類可為置換(transition)或顛換(transversion)，置換為嘌呤與嘌呤或嘧啶與嘧啶間的替換(AG或CT)，而顛換則為嘌呤與嘧啶間的替換(AC,AT,GC或GT)。
本文所述「單核苷酸多態性之基因型」或「SNP基因型」或其他類似用語是指SNP之交替基因的序列組成。
本文所述具特定編號之核苷酸序列包括其互補序列，該互補序列與該具特定編號之核苷酸序列具相同數目之核苷酸，進行序列比對時，兩者在對應位置上的核苷酸依前述的鹼基配對方式是完全配對的。
本文所述核苷酸序列亦包括其實質相同序列，該實質相同序列與該具特定編號之核苷酸序列，在序列結構及生物功能上實質相同。
在序列結構上，該實質相同序列與其所對應的核苷酸序列，兩者長度可以相同或不同，而在進行序列比對時，對應的鹼基有60%、較佳有70%、更佳有80%、再更佳有90%、最佳有95%以上者是相同的。或者，該實質相同序列與所對應的核苷酸序列之互補序列，在適當條件下，可相互雜合，也就是說兩者在對應位置上，有相當比例的核苷酸依前述鹼基配對方式而相互結合形成鹼基對；所述相當比例較佳為60%、較佳為70%、更佳為80%、再更佳為90%、最佳為95%以上。
前述序列比對可用此一領域所熟知的技術進行，例如，美國威斯康辛大學基因電腦小組(GCG)之BLASTN程式，或類似技術。另一方面，此一領域已揭露各種進行核酸操作之方法與條件，可參見前述Sambrook J等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual及Frederick M.A.等人的Current Protocols in Molecular Biology。
除了序列結構之外，本文所述實質相同序列與所對應的核苷酸序列在生物功能上實質相同，例如，均具有雜合至對應基因序列而可進行聚合酶連鎖反應或引子延伸反應之功能。
根據本發明，為鑑別菜鴨的產蛋性能，對來自菜鴨之核酸樣本進行分析，檢測前述單核苷酸多態性之基因型，其中(1)如測出以下基因型，則該菜鴨具提升的產蛋性能：DSTN-C93A之基因型為CC或CA；DSTN-T106C之基因型為CC；TYPEXC-T74C之基因型為TT或TC；及/或CA2-A65G之基因型為GG；或(2)如測出以下基因型，則該菜鴨不具提升的產蛋性能：DSTN-C93A之基因型為AA；DSTN-T106C之基因型為TT或TC；TYPEXC-T74C之基因型為CC；及/或CA2-A65G之基因型為AA或AG。
進一步說明，如菜鴨測出在DSTN-C93A之基因型為CC或CA、及/或CA2-A65G之基因型為GG，則該菜鴨之總產蛋數較其他基因型高；而如菜鴨在DSTN-C93A之基因型為AA、及/或CA2-A65G之基因型為AA或AG，則該菜鴨之總產蛋數較其他基因型低。
又進一步說明，如菜鴨測出在DSTN-T106C之基因型為CC、及/或TYPEXC-T74C之基因型為TT或TC，則該菜鴨之平均蛋重較其他基因型高；而如菜鴨測出在DSTN-T106C之基因型為TT或TC、及/或TYPEXC-T74C之基因型為CC，則該菜鴨之平均蛋重較其他基因型低。
吾人可運用任何已知的方法，從待測菜鴨身上取得核酸樣本進行分析。在一具體實例中，從菜鴨抽取血液樣本，進行基因組DNA之抽取。
吾人可運用任何已知的方法，對來自菜鴨之核酸樣本進行分析，以檢測前述單核苷酸多態性之基因型。
具體而言，可使用的分析方法包括，但不限於，引子延伸(primer extension)、限制內切酶截切(restriction enzyme digestion)、單股DNA結構分析(single strand DNA conformation)、寡核苷酸接合分析(oligonucleotide ligation assay)、核酸外切酶檢測(exonuclease detection)、侵入性切割分析(invader assay)以及焦磷酸定序法(pyrosequencing)等。
又進一步說明，吾人可依據本文所揭露的單核苷酸多態性及參照此一領域之既有知識及運用習知技術，設計出適當的寡核苷酸，作為引子或探針，以進行前述分析方法。應注意的是，該等寡核苷酸不限於特定序列，本發明所屬領域具通常知識者均可所使用的分析方式設計出所需寡核苷酸。
舉例而言，可使用引子延伸方法，對菜鴨之核酸樣本進行分析，以檢測前述之一或多個單核苷酸多態性之基因型。進一步說明，首先可依據本文所揭露的單核苷酸多態性及參照已公開的基因序列，設計出PCR引子對及延伸反應引子。接著，以待測菜鴨的核酸樣本為模板，使用所設計的PCR引子對，增幅涵蓋單核苷酸多態性之核酸片段。然後，去除多餘的引子及不必的試劑後，加入延伸反應引子，進行單鹼基延伸反應。最後，經毛細管電泳分析，即可測得單核苷酸多態性的基因型。
特定而言，根據本發明之引子延伸方法係使用選自以下(1)至(5)所組成之群之引子組：
(1)第一引子組，其包括：
(a)第一PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有DSTN-C93A之核酸片段；及
(b)第一延伸反應引子，其3’端對應於SEQ ID NO:1之DSTN-C93A往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第一PCR引子對及第一延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨DSTN-C93A之基因型；
(2)第二引子組，其包括：
(a)第二PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有DSTN-T106C之核酸片段；及
(b)第二延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:1之DSTN-T106C往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第二PCR引子對及第二延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨DSTN-T106C之基因型；
(3)第三引子組，其包括：
(a)第三PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有TYPEXC-T74C之核酸片段；及
(b)第三延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:2之TYPEXC-T74C往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第三PCR引子對及第三延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨TYPEXC-T74C之基因型；
(4)第四引子組，其包括：
(a)第四PCR引子對，其可用於以菜鴨之核酸樣本為模版，增幅出帶有CA2-A65G之核酸片段；及
(b)第四延伸反應引子，其3’端位置對應於SEQ ID NO:3之CA2-A65G往上游或下游方向一個鹼基之位置；
其中，第四PCR引子對及第四延伸反應引子可用於進行引子延伸反應，以檢測菜鴨CA2-A65G之基因型；以及
(5)前述第一至四引子組之任二者或二者以上之組合。
前述引子組的特定實例說明如下：在第一引子組中，第一PCR引子對含有二種引子，其分別具有SEQ ID NOS:4及5之核苷酸序列，以及第一延伸反應引子具有SEQ ID NO:6之核苷酸序列；在第二引子組中，第二PCR引子對含有二種引子，其分別具有SEQ ID NOS:4及5之核苷酸序列，以及第二延伸反應引子具有SEQ ID NO:7之核苷酸序列；在第三引子組中，第三PCR引子對含有二種引子，其具有SEQ ID NOS:8及9之核苷酸序列，以及第三延伸反應引子具有SEQ ID NO:10之核苷酸序列；在第四引子組中，第四PCR引子對含有二種引子，其分別具有SEQ ID NOS:11及12之核苷酸序列，以及第四延伸反應引子具有SEQ ID NO:13之核苷酸序列；
II.　鑑別菜鴨單核苷酸多態性的基因型之套組
在第二方面，本發明提供一種套組，其可用於檢測前述菜鴨之單核苷酸多態性的基因型，該套組包括選自以下所組成之群之引子組：前述第一至四引子組及其任二者或二者以上之組合。此處所述之第一至四引子組的特定實例與前述者相同。吾人可使用此一領域之既有知識與技術，例如，化學合成法或PCR擴增技術，依此處所揭示的序列資訊，獲得本發明之各個引子。
可視需要地，本發明之套組尚包括使用說明單，其提供用以判斷菜鴨是否具提升的產蛋性能之資訊，其係選自以下所組成之群：
(1)如菜鴨於DSTN-C93A之基因型為CC或CA，則該菜鴨具提升的產蛋性能；
(2)如菜鴨於DSTN-T106C之基因型為CC，則該菜鴨具提升的產蛋性能；
(3)如菜鴨於TYPEXC-T74C之基因型為TT或TC，則該菜鴨具提升的產蛋性能；
(4)如菜鴨於CA2-A65G之基因型為GG，則該菜鴨具提升的產蛋性能；
(5)如菜鴨於DSTN-C93A之基因型為AA，則該菜鴨不具提升的產蛋性能；
(6)如菜鴨於DSTN-T106C之基因型為TT或TC，則該菜鴨不具提升的產蛋性能；
(7)如菜鴨於TYPEXC-T74C之基因型為CC，則該菜鴨不具提升的產蛋性能；
(8)如菜鴨於CA2-A65G之基因型為AA或AG，則該菜鴨不具提升的產蛋性能；以及
(9)前述(1)至(8)之任二者或二者以上之組合。
III. 　分離的寡核苷酸
在第三方面，本發明提供分離的寡核苷酸，其具有一段選自SEQ ID NOS:4至13所組成之群組之核苷酸序列。依據本發明，該等分離的寡核苷酸可用以鑑別菜鴨產蛋性能，例如，可藉由進行引子延伸反應而達成。
實例1：菜鴨cDNA基因庫之建構
本實例所使用的組織樣本係採自菜鴨(Anas platyrhynchos var. domestica )，具有繁殖相關之性狀紀錄，然後採集菜鴨之腦下垂體組織，萃取純化mRNA，進行菜鴨cDNA基因庫之建構。
簡言之，取1g組織樣本，置於含有液態氮之研缽中，迅速磨成粉末狀，再將粉末倒入裝有1mL RareRNA(GenePure,Kaysville,UT,USA)的離心管，輕緩混合後靜置待作用完全。加入氯仿反轉混合，冰浴5分鐘以抑制RareRNA作用後，於4℃下離心。取上層液分裝至2個新的離心管中，各別加入等體積之異丙醇反應，離心後，去除上層液，加入75%冰酒精清洗。再次離心，去除上層液，然後乾燥加入適量DEPC水回溶。以分光光度計測定濃度及純度，加入RNA保存液(RNAsecure)，將RNA濃度調整為36μg/100μL，然後採用商業套組Mag-NetTM ,mRNA Isolation from Total RNA Kit(Amresco,USA)並依據其方法純化出mRNA以供cDNA基因庫之建立。使用所得mRNA，採用商業套組Creaator SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech)並參考其說明建立cDNA基因庫。
實例2：cDNA微陣列晶片之製備、雜交與定序
依實例1方式自菜鴨的腦下垂體組織取得RNA樣本，利用商業套組TSATM Labeling and Detection Kit(PerkinElmer,Inc.,Wellesley,MA,USA)，製備成螢光標誌之標的。
從實例1建立的cDNA基因庫，產生PCR增殖產物，以基因晶片製備儀(OmidGrid AccentTM Microarrayer,GeneMachine)進行點片製成cDNA微陣列晶片。使用前述螢光標誌之標的，與cDNA微陣列晶片進行雜交反應。晶片先經清洗後，利用上述螢光標誌製備之商業套組，將螢光訊號大放後，再以螢光掃描儀(Genepix 4000B,Axon)進行掃描，再以商業軟體(GenePix Pro 4.1、Avadis version 3.3)分析掃描結果。比較結果後，找出與產蛋性狀相關的差異表現株系。
利用DNA序列分析儀(ABI,Genetic Analyzer 3100)及商業套組(BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit)，對差異表現株系進行DNA定序分析。以線上程式BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比對基因庫資料(http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/ )，確認差異表現株系所含候選基因之身分。
實例3：單股構形多態性分析 3.1菜鴨來源及基因組DNA萃取
本實例使用試驗動物為菜鴨(Anas Platyhynchos Var Domestica )，紀錄菜鴨各種產蛋相關性狀，包括總產蛋數及平均蛋重等。取得菜鴨血液樣本，分別進行基因組DNA之萃取。
簡言之，將含抗凝血劑的菜鴨血液樣本以TNE緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,10mM EDTA)反覆清洗血球。將清洗完畢的血球移至另一乾淨離心管中。加入0.87% NH4 Cl混合均勻，使血球溶解完全，再離心去上層液。然後加入SDS、蛋白酶K及膠原蛋白酶，置於45℃振盪水槽中反應12小時以上。分別以同體積酚、酚/氯仿及氯仿各萃取一次，取上層液。加入兩倍體積之異丙醇及1/10體積量之3M CH3 COONa(pH 5.2)使DNA沉澱析出。將析出的DNA以70%冰酒精清洗二次後，移入乾淨的離心管中，接著置入55℃恆溫箱3~4小時使酒精揮發完全。待DNA乾燥後加入適量滅菌去離子水溶解DNA，使DNA最終濃度為50ng/uL，以供後續分析使用。
3.2單股構型多態性分析
以前述基因組DNA為模板，依候選基因之序列資料，設計適當引子，進行PCR反應及單股構型多態性分析。
簡言之，取0.2mL滅菌之微離心管，依序加入10X PCR反應緩衝液、2.5mM dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、適量之引子(10μM)、0.2UTaq DNA polymerase及適量之基因組DNA模板，以滅菌水將體積調整至10μL，輕緩混和後，置入離心機中短暫離心。取2.5μL單一片段PCR產物，加入5μL染料緩衝液與1μL變性緩衝液，最終總體積為8.5μL。於熱循環機GeneAmp 2700(Applied Biosystems,USA)中經95℃5分鐘變性後，進行電泳。電泳後以10X冰醋酸稀釋液浸漬膠片45分鐘，以去離子水搖盪清洗膠片2分鐘。使用新鮮配製的1%硝酸銀染液進行銀染。選出具有單股構型多態性之基因，供後續DNA定序之用。
實例4：單核苷酸多態性之位置及基因型
依實例3結果，針對具有單股構型多態性之基因，進行DNA定序分析，找出單核苷酸多態性之位置及基因型種類，結果顯示於表2。
實 例5：單核苷酸多態性與菜鴨產蛋性能之相關性分析
本實例以引子延伸方法，利用毛細管電泳鑑定各個候選基因的單核苷酸多態性之基因型。首先，依照候選基因之序列及單核苷酸多態性之位置，設計適當的PCR引子對，然後以前述所得菜鴨的基因組DNA樣本為模板，進行PCR反應，以擴增含有單核苷酸多態性之基因片段。表3顯示PCR引子序列及反應條件。
進行PCR反應時，取0.2mL滅菌之微離心管，依序加入10X PCR反應緩衝液、2.5mM dNTPs(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、適量之引子(10uM)、0.2U Taq DNA聚合酶及適量的基因組DNA模板，以滅菌水將體積調整至10μL，輕緩混和後，置入離心機中短暫離心。於PCR增幅儀(GeneAmpPCR system 2700，Applied Biosystems)進行PCR反應，反應條件如表3所示。以電泳分析PCR產物，確認DNA環帶長度。
接著，去除PCR產物之多餘引子及dNTP後，加入延伸反應引子，進行單鹼基延伸反應，以毛細管電泳分析反應後的產物，判斷候選基因的單核苷酸多態性之基因型。表4顯示延伸反應引子之序列及延伸反應條件。
4 .3統計分析
收集前述基因型鑑定結果數據，以統計方式分析不同基因型之菜鴨與各種產蛋性狀間的關連性。表5至8顯示分析結果。
在DSTN基因方面，如表5所示，在C93A變異中可區分出CC、CA及AA三種基因型，其中以CC與CA基因型者之40週齡總產蛋數顯著較AA基因型者多(P<0.05)；以及如表6所示，在T106C變異中可區分出TT、TC及CC三種基因型，其中以CC基因型者之40週齡平均蛋重顯著較TT與TC基因型者高(P<0.05)。
在TYPEXC基因方面，如表7所示，在T74C變異中可區分出TT、TC及CC三種基因型，其中以TT與TC基因型者之30週齡平均蛋重顯著較CC基因型者高(P<0.05)。
在CA2基因方面，如表8所示，在A65G變異中可區分出AA、AG及GG三種基因型，其中以GG基因型者之40週齡總產蛋數顯著較其他基因型者多(P<0.05)。
總結，依上述方法所得各種基因的單核苷酸多態性分子標記，與菜鴨的產蛋性能有相關性，可用於建立分子標記輔助選種(marker-assisted selection)方法，利用分子選種技術，供篩選高產蛋性能之種禽，對於菜鴨選育有相當大的助益。
無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。此外，所有在此引述的公開文獻在此併入本文作為參考文獻。
圖1顯示菜鴨DSTN基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖2顯示菜鴨TYPEXC基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。
圖3顯示菜鴨CA2基因序列、PCR引子與延伸反應引子設計位置及名稱。

Claims (11)

  1. 一種用於鑑別菜鴨產蛋性能之方法，其包括：(1)分析來自菜鴨的核酸樣本，以檢測選自下列所組成之群的單核苷酸多態性之基因型：(A)細胞骨架蛋白基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：1的第93個鹼基位置(DSTN-C93A)；(B)細胞骨架蛋白基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：1的第106個鹼基位置(DSTN-T106C)；及前述(A)DSTN-C93A及(B)DSTN-T106C之組合；以及(2)依檢測所得單核苷酸多態性之基因型，鑑別菜鴨之產蛋性能，其中相較於DSTN-C93A之基因型為AA之菜鴨，DSTN-C93A之基因型為CC或CA之菜鴨具有較高40週齡總蛋數，以及相較於DSTN-T106C之基因型為TT或TC之菜鴨，DSTN-T106C之基因型為CC之菜鴨具有較高40週齡平均蛋重。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其包括使用引子延伸方法，分析菜鴨的核酸樣本，以檢測所述之一或多個單核苷酸多態性之基因型。
  3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中引子延伸方法包括使用分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，以及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-C93A之基因型。
  4. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中引子延伸方法包括使用分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，以及具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-T106C之基因型。
  5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括：(3)分析來自菜鴨的核酸樣本，以檢測無水碳酸酶II基因之單核苷酸多態性，其位於SEQ ID NO：3的第65個鹼基位置(CA2-A65G)；以及 (4)依檢測所得單核苷酸多態性之基因型，鑑別菜鴨之產蛋性能，其中相較於CA2-A65G之基因型為AA或AG之菜鴨，CA2-A65G之基因型為GG之菜鴨具有較高40週齡總蛋數。
  6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其包括使用引子延伸方法，分析菜鴨的核酸樣本，以檢測所述之一或多個單核苷酸多態性之基因型。
  7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中的引子延伸方法包括使用分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-C93A之基因型。
  8. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中的引子延伸方法包括使用分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-T106C之基因型。
  9. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中的引子延伸方法包括使用分別具有SEQ ID NOS：11及12之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：13之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨CA2-A65G之基因型。
  10. 一種用於檢測菜鴨產蛋性能之套組，其包括：(1)分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-C93A之基因型；以及(2)分別具有SEQ ID NOS：4及5之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測菜鴨DSTN-T106C之基因型。
  11. 根據申請專利範圍第10項之套組，其進一步包括：分別具有SEQ ID NOS：11及12之核苷酸序列之PCR引子，及具有SEQ ID NO：13之核苷酸序列之延伸反應引子，以檢測 菜鴨CA2-A65G之基因型。
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