TWI531654B - 用於鑑別ｈ５禽流感病毒病原性之寡核酸探針、含其之套組及方法 - Google Patents

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TWI531654B
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Description

用於鑑別H5禽流感病毒病原性之寡核酸探針、含其之套組及方法
本發明係關於一種感染性病原體之偵測，更具體而言，為藉由使用一寡核酸探針及包含該探針之套組以快速鑑定H5禽流感病毒之病原性。
禽流感病毒(AIV)感染許多動物，例如人類、豬隻、馬、海洋哺乳類動物及鳥類等。其自然宿主為水鳥，而流感病毒常導致禽鳥於呼吸道及腸胃道局部輕微感染。大部份禽流感病毒歸類為低致病性禽流感病毒(LPAIV)，而其中H5及H7亞型具有能夠突變為高致病性禽流感病毒(HPAIV)的能力。高致病性禽流感病毒對於禽類具有高致病性，其突然地爆發感染使得受感染的家禽之高死亡率。對人類來說，受到HPAIV感染後會產生一種具有高傳染性的急性呼吸道疾病，更可能進一步引發具有傳染性的大規模感染。因此，快速偵測流感病毒且即時鑑別其為LPAIV或HPAIV的方法是相當重要的。
用於鑑定AIV H5病毒之病原性的可靠方法有：基於特定無病原雞隻(specific pathogen free,SPF)之靜脈內接種致病性指數(IVPI)做為鑑別，以及藉由定序區別其血凝素(HA)基因之切割位(cleavage site,CS)特性。 H5病毒之HA前驅物蛋白之CS位點之胺基酸基序具有高度保留的序列，PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)(Leijon et al.,Journal of Clinical Microbiology,Nov.2011,p.3860-3873)並對其已有大量基因庫分析(m麩醯胺酸佔其中大多數，雖可能有其他殘基但為極少數。X：所有種類殘基，於本發明中，具體為精胺酸及離胺酸；n為X之數目。*為HA0實際經由宿主蛋白酶切割的切割位。)X之鹼性胺基酸數目為其致病性的指標；通常來說，LPAIVs具有一至三個鹼性胺基酸(n=1~3)，而HPAIVs具有四個或以上鹼性胺基酸(n=4或4以上)。
目前，有許多技術可以用來鑑定生物樣品中H5禽流感之病原性，包含PCR反應後利用跨越CS位點之核苷酸序列定序、即時聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)，反轉錄PCR之產物經限制酶切割之模式等。然而，這些方法在執行上通常需要耗費很多時間、勞力、金錢且過於複雜。曾有報導一種微陣列系統，ArayTube，可鑑定AIV之病原性，然而，測量結果的分析需要一種特定的閱讀器且僅限於鑑定部分H5病毒，例如高致病性之H5/N1亞洲分支2.2。
因此，目前仍然需要發展一種低價、簡便、全面性且快速，並具有高敏感度及專一性之方法。
本發明之一目的係在於提供一種探針，其係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO： 13。
本發明之另一目的係在於提供一種用於鑑定H5禽流感病毒病原性之套組，包含選自由下列所組成之群組之探針：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。
於一較佳實施例中，其中該探針更進一步於序列尾端加入19個T鹼基，並且佈於一微陣列基材上。
於另一較佳實施例中，其中該套組更進一步包含一寡核酸序列SEQ ID NO：14佈於該微陣列基材上作為一陽性控制探針。
本發明之另一目的係在於提供一種用於鑑定一樣本中H5禽流感病毒病原性之方法，包含：(a)由該樣品中取得一核酸；(b)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13；且(c)基於該雜交結果鑑定該樣本為低致病性禽流感病毒(LPAIV)或高致病性禽流感病毒(HPAIV)。
於一較佳實施例中，其中該核酸係由萃取樣本之RNA，將RNA反轉錄為一DNA且藉由一PCR反應放大該DNA所獲得。
於另一較佳實施例中，其中該PCR反應係使用一對引子進行，該對引子之序列為SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16。
於另一較佳實施例中，其中該對組引子之5’端生物素化。
於另一較佳實施例中，其中該核酸更進一步包含一種標記，其中該標記較佳可為一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射標記、一放射不透標記、一含有一酵素、一胜肽或一配體之蛋白質。
於另一較佳實施例中，其中當核酸與選自由SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所組成之群組之探針雜交，或利用所有探針但該核酸僅與探針SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或同時雜交時，該H5禽流感病毒為高致病性禽流感病毒。
於另一較佳實施例中，其中當該核酸與選自由：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11所組成之群組之探針雜交時，該H5禽流感病毒為一低致病性禽流感病毒。
非限制且非詳盡之實施例將結合附圖說明如下。必須了解的是下列圖式僅依據本說明書公開之內容描繪數個實施例，因此，勿因而限制其範圍，本發明所揭示之內容將特別詳細的藉由這些圖式作為說明，其中：圖1為藉由寡核酸微陣列偵測及辨別AIVs。(A)微陣列圖，其中每一個探針及其所偵測之病毒株所代表的意義顯示於表3。P：控制組。微陣列偵測LPAIVs、HPAIVs及CS位點具有五個或以上之鹼性胺基酸之人工寡核苷酸所得之結果各別顯示於(B)、(C)及(D)。各人工寡核苷酸之序列分別表示於表2。
圖2顯示使用A/CK/新竹/A1939/11(LV7)作為範例進行偵測極限。(A)選殖的質體經由序列稀釋(意指拷貝數目)且使用之成對引子H5f/H5r進行PCR-放大。M：100bp階梯狀分子量標記；1：4.6x107拷貝數/μL；2：4.6x106拷貝數/μL；3：4.6x105拷貝數/μL；4：4.46 x104拷貝數/μL；5：4.6x103拷貝數/μL；6：4.46 x102拷貝數/μL；7：4.46 x101拷貝數/μL；8：4.46 x100拷貝數/μL；9：陰性控制組。(B)對應之結果顯示於寡核苷酸微陣列。
於下文中，將對本發明所揭示之例性實施例及範例進行詳細的描述，並且附有圖式，使得本發明之概念得以經由本發明技術領域人員輕易實行。
然而，必須注意的是本發明所揭示之內容並不應被限制於發明實施例，且可以不同方式實現。於圖式中，部份與本發明不直接相關之內容省略以提高圖式之清晰度，標號於文件當中標示。
整篇說明書當中，所使用之詞彙「包含(comprises)」或「包括(includes)」意謂著除了描述的組成、步驟、操作指令及/或元素以外，不排除一或多個其他組成、步驟、操作指令及/或存在或附加元素。所使用之詞彙「大約(about)或約(approximately)」意指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明所揭示之準確或絕對的數值受未知的第三方非法或非正當使用的。詞彙「一」意指該冠詞之語法對象為一或一個以上(例如：至少為一)。
本發明提供用於快速鑑定H5禽流感病毒病原性之一寡核酸 探針、一包含該寡核酸探針之套組及方法。
[用於鑑別H5禽流病毒病原性之探針]
本發明主要提供一種探針，其係選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13，用於鑑定H5禽流感病毒之病原性為低致病性之禽流感病毒(LPAIV)或高致病性之禽流感病毒(HPAIV)。
本發明術語「H5禽流感病毒之病原性」係指偵測H5 AIV之HA前驅物蛋白之一CS胺基酸基序，亦即式PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)中X之數目，其中X為鹼性胺基酸(精胺酸(R)或離胺酸(K))。本發明中，術語「低致病性禽流感病毒(LPAIV)」係指於上述該H5 AIV胺基酸基序當中具有一至三個鹼性胺基酸；本發明中，術語「高致病性禽流感病毒(HPAIV)」係指於上述該H5 AIV胺基酸基序當中具有四個或以上的鹼性胺基酸。
於本發明中，術語「探針」表示其核酸序列中至少包含十個核苷酸，可表現特定胺基酸或蛋白質。當提到探針時，術語「特異性(針對目標序列)」意指該探針於嚴格的條件下實質上僅與一樣本中的目標序列進行雜交。本發明中術語「雜交」，意指寡核酸及/或其類似物藉由氫鍵結合的過程，包含互補鹼基間之華生-克立克配對、胡思町鹼基配對或反胡思町鹼基配對等。一般來說，核酸由含氮鹼基如嘧啶(胞嘧啶(C))、尿嘧啶(U)及胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)與鳥糞嘌呤(G))所組成。這些含氮鹼基形成由嘧啶與嘌呤之鍵結組成的氫鍵，而其中嘧啶與嘌呤之鍵結稱為「鹼基配 對」。更進一步地說，A會與T或U產生鍵結，而G會與C產生鍵結。術語「互補」意指發生在兩個不同核酸序列間或一相同核酸序列中兩不同區域間之鹼基配對。本領域技術人員可依據本文內容輕易理解，術語「結合」、「進行雜交」或「雜交」可互相使用而無歧義。於本發明中，該探針具有核酸序列不定性(ambiguity)，其中，一核苷酸位置為不定的而可能代表一個或多個核苷酸，此將利用標準化符號或字母來表示，而本領域技術人員可藉由本發明所附之序列表清楚的了解。這些符號或字母依據國際純粹與應用化學聯合標準提出，並同時符合WIPO標準ST.25附錄2表1，詳列如下：M為A或C；R為A或G；W為A或T；S為C或G；Y為C或T；K為G或T；V為A或C或G；H為A或C或T；D為A或G或T；B為C或G或T；N為G或A或T或C。
於本發明中，該探針係用於偵測並鑑別H5病毒之HA前驅蛋白CS位置之PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)基序中，X之鹼性胺基酸之數目。於本發明中，該探針選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4，可偵測於X位置具有一個鹼性胺基酸(n=1)之LPAIV；該探針選自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9，可偵測於X位置具有兩個鹼性胺基酸(n=2)之LPAIV；該探針選自SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11，可偵測於X位置具有三個鹼性胺基酸(n=3)之LPAIV；該探針選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13，可偵測於X位置具有四個鹼性胺基酸(n=4)之HPAIV。探針SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2為一種通用探針，所有AIV H5病毒皆可與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或兩者進行雜交。因此，當所有13個探針(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：13)皆使用時，若該AIV H5病毒樣本於X(n=5)位點具有五個或五個以上之鹼性胺基酸時(分類為HPAIV)，僅 會與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或兩者雜交，而不與偵測X位點具有1至4個鹼性胺基酸(n=1至4)之探針SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：13雜交。
[快速鑑定H5禽流感病毒病原性之方法]
依據本發明內容，本發明提供一種用於鑑定一樣本中H5禽流感病毒病原性之方法，包含：(a)取得該樣品的核酸；(b)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13；及(c)基於該雜交結果鑑定該樣本為低致病性禽流感病毒(LPAIV)或高致病性禽流感病毒(HPAIV)。
依據本發明內容，術語「樣品」可為生物性樣品，例如任何取自於懷疑可能帶有H5或H5N1亞型禽流感病毒之個體之樣品。該樣品可為任何取自於受感染個體包含病毒之樣品，包含組織或液體樣品，例如：血液、血清、血漿、周邊血液細胞包含淋巴球及單核球細胞、痰液、黏液、尿液、糞便、咽喉拭抹樣品、皮膚損傷拭抹樣品、腦脊髓液、膿及組織包含脾臟、腎及肝。
依據本發明內容，其中該來自於樣品之核酸為由樣本萃取而來，以進行進一步分析。其中較好為先由樣品中萃取出RNA，進而利用反轉錄作用將RNA反轉錄為DNA(即cDNA)，而該DNA再進一步經由PCR反應放大。
術語「RNA」意指一具有兩個或兩個以上共價鍵結之序列，為自然產生或經修飾之核醣核酸。RNA可為單股或雙股。術語「DNA」意 指具有兩個或兩個以上共價鍵結之序列，包含cDNA或合成(例如化學生成)DNA，可能為雙股或單股。藉由「藉反轉錄而形成之DNA」或「DNA反轉錄由」表示互補或拷貝DNA(cDNA)產物是由RNA模版藉由RNA依賴型DNA聚合酶(反轉錄酶)所生成。進行反轉錄作用之RNA模版可藉由本領域習知之樣品RNA萃取方法獲得。RNA萃取套組亦可為商業化之產品，例如RNeasy kits(Qiagen)，其購買及用法可為本領域技術人員輕易得知及理解。
一旦反轉錄反應完成，該單股DNA分子即可被用於放大反應。術語「放大」或「增幅」意指一種核酸分子反應，並依據該核酸分子來鑑定H5禽流感病毒之病原性為一種HPAIV或一種LPAIV。可使用一種適合的聚合酶於欲將一核酸模板合成新的序列以形成多重拷貝的情況。
放大步驟可與反轉錄反應在相同的反應中進行，只要反轉錄反應中的狀態及試劑不影響放大反應即可。另外，反轉錄產物可先進行純化以作為放大反應之模板。
依據本發明內容，放大反應藉由PCR擴增反應進行。因此，放大反應步驟之進行可搭配DNA聚合酶使用，例如，Taq聚合酶，並使用本技術領域人員熟知之標準方法與技術進行。用於DNA分子放大過程之DNA聚合酶可為商業化之產品。放大反應於所需之反應劑存在情況下進行，例如去氧核醣核酸、緩衝液及相關正向及反向引子，以便使該DNA聚合酶有更佳之聚合酶活性。
該PCR放大反應包含一變性步驟，於該步驟中加熱至足以使得所轉錄出之DNA變性並且防止引子結合於DNA任一股。該變性步驟後為一黏合步驟，該黏合步驟中反應之溫度下降至引子可黏合至DNA股上之溫 度。最後之步驟為一延伸步驟，其中該反應中加熱溫度至一適合引子藉由DNA聚合酶延伸之溫度。此三步驟循環數次使得可與反轉錄DNA配對之DNA互補股產生，且分別藉由配對於該反轉錄DNA之正向及反向引子進行延伸。在每一輪放大循環過程中，所產生的每一股DNA都會在下一輪的反應中成為模板，使得DNA產量能夠放大。本領域技術人員可輕易決定放大步驟當中每一環節之適當溫度並決定其循環數。
依據本發明之內容，PCR擴增過程分別使用特定引子放大HAPI及LPAI病毒株之HA前驅蛋白CS位點之保留區域。
本領域技術人員可輕易理解「引子」為一定義序列之單股DNA或RNA分子，可配對於另一包含互補序列之DNA或RNA分子(目標分子)。所產生之雜交分子之穩定度取決於所發生之鹼基配對程度，且同時受到如引子與目標分子互補時之溫度及雜交時之條件嚴格程度等參數影響。雜交程度之嚴格度受到各種參數影響例如溫度、鹽濃度及有機分子之濃度如甲醯胺等，藉由本領域熟知之方法決定。其中該引子較好為經標記修飾而使得該引子或經引子所形成或延伸之DNA產物可被偵測。例如，該標記可為一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射性標記、一不透射線標記、一蛋白包含一酵素、一胜肽或一相對於所舉例之生物素之配體等。其中該引子較好為5’端生物素標記，以使得該PCR產物為生物素標記，預期分子量大小約為440bp。
依據本發明之內容，由於在PCR過程中使用受標記之引子因而使該PCR產物(本文中同時被定義為「核酸」)受標記，因此該PCR產物可進一步偵測，如經由核酸雜交方法、單股構型多形性(SSCP)分析、限制片 段長度多形性(RFLP)分析、南方雜交法、北方雜交法、原位雜交法、電泳遷移率變動分析(EMSA)、核酸微陣列及其他本領域習知之方法等。
依據本發明之內容，其中該標記之PCR產物(核酸)與一探針進行雜交，該探針係選自由下列所組成之群組，包含：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13，針對LPAIV或HPAIV雜交結果而分別有所不同。如上所述，當核酸與下列探針包含SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13雜交，或當所有探針皆使用之情況下，核酸僅與探針SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或同時與兩者雜交時，該樣品包含HPAIV；核酸與至少一個選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11雜交時，該樣品包含HPAIV。
偵測雜交結果之方法依據不同標記方式之PCR產物有所不同，為本領域技術人員可輕易理解之方式。其中該PCR產物較好以生物素標記，使得雜交之結果可經由生物素-鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)系統進行偵測。
[包含寡核酸探針之套組]
本發明亦關於一可鑑定一生物材料所分離/純化之樣品中H5禽流感病毒病原性之套組。
依據本發明之內容，提供一用於鑑定H5禽流感病毒病原性之套組包含選自由下列探針所組成之群組：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2， SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。其中該探針較好為使用標準方法固定於固態支持物上，該方法包含化學交互聯結、光交互聯結或經由探針之機能基團進行特殊固定。依據本發明之內容，一長19個T鹼基之序列添加至探針之5’端，且每一探針皆利用自動化定位機及UV產生連結而固定於微陣列聚合物基材上。依據本發明之內容，該套組可包含一陽性控制探針，例如，一核酸或至少為該核酸其中之一部份。其中較好為一SEQ ID NO：14之寡核酸固定於微陣列基材上作為正向控制探針。該套組可更進一步包含使用該套組所需之訊息。該訊息可為製造商所提供之範例訊息。
[實施例]
在下文中，將利用範例及圖式特別描寫本發明所揭示之內容。然而，本發明所揭示之內容不限制於該範例及圖式。
[禽流感病毒參考病毒株來源以及野外樣品]
本發明所使用之AIV參考病毒株詳列於表1。LV1-LV3為由台灣大學獸醫醫學研究所獲得之野外分離病毒株。LV4-LV10及HV1-HV5由台灣淡水之農業部動物衛生研究所流行病學處所獲得。
[RNA萃取、反轉錄及PCR]
採用源於購買而得之SPF雞群，含9-至10-天-大之胚胎的卵內之尿囊腔中培養病毒。於尿囊腔中利用QIAamp Viral RBA套組(Qiagen,Valencia,CA)萃取病毒RNA。野外組織樣品置於液態氮中，以QIAamp RNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)萃取RNA。依據Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis套組(Roche,Mannheim,Germany)之製造商提供之說明書進行以12單位引子進行反轉錄作用(HoffmannB,Harder T,Starick E,et al.：2007,J Clin Microbiol 45：600-603)。對H5具有特異性之引子對(H5f/H5r)是依據由基因庫所獲得之數據特別針對HPAI及LPAI菌株之CS位點保留區域所設計而成。引子H5f(5'-ATWGCTCCNGAATATGCATWWAARA-3'(SEQ ID NO：15))及H5r(5'-TCRAAYTGARTGTTCATTTTRTCAATG-3'(SEQ ID NO：16))具5’端生物素標定且目標產物大小約為440bp。PCR反應之總體積為50μl，包含模板5μl、每一引子5μl(10μM)、5μl之10x PCR緩衝液、每一dNTP各4μl(2.5mM)、0.3μl之GenTaq Plus DNA聚合酶(GeneMark,Taichung,Taiwan)。用於擴增之反應溫度曲線為94℃持續3分鐘，40x(94℃持續30s、50℃持續30s及72℃持續40s)，72℃持續7min。以1.5%瓊脂糖凝膠(Gibco, Grand Island,NY)分離10μl PCR產物，於0.5x TAE溶液及0.5μg/ml之溴化乙錠(Gibco,Grand Islan,NY)於100V之電壓下持續40分鐘之電泳，並於UV燈下觀察結果。
[選殖與定序]
PCR產物依據製造商所提供之說明書經由PCR clean-up套組(GeneMark,Taichung,Taiwan)純化並選殖於質體載體pGEM-T EASY載體系統(Promega,Madison,WI)。該質體而後經由轉殖作用進入勝任細胞(ARROWTEC,Taipei,Taiwan)並更進一步培養於LB瓊脂(BD Difco,Sparks,MD)中。利用質體T7及SP6引子並於LB液態培養基(BD Difco,Sparks,MD)中放大，進而以PCR確認成功插入目標DNA之菌落。質體DNA更進一步以Miniprep Purification套件(Protech Co.,Taipei,Taiwan)萃取，且插入之DNA片段更進一步經由商業化服務進行定序(Protech Co.,Taipei,Taiwan)。獲得跨越每一個所參考之病毒及測試樣品切割位之HA0核苷酸序列。
[人工寡核苷酸]
由於H5 AIVs之CS位點之核酸序列具有高度變異性及不同的病毒特徵，在台灣並無法分離出PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)基序中，X具有五個或五個以上鹼性胺基酸之病毒。進一步進行綜合分析及比對基因庫中所有AIV H5序列，並選擇其中九個於X位置具有五個或五個以上鹼性胺基酸及具有CS切割位多樣性之代表性序列。其中橫跨CS區域間，長114-112鹼基並具有九個代表序列之核苷酸為人工合成(表2)。這些人工寡核酸經由對應於其序列兩端之引子進行放大。所獲得之擴增子經由瓊脂糖凝膠區別且更進一步以微陣列測試以模擬真正的病毒。
[探針設計]
可用於所有AIV H5亞型之通用探針之設計方式為針對HA基因之保留性區域，亦即H5f/H5r之擴增子區域所設計。所有AIV H5病毒可與通用探針U1或U2或兩者雜交。其中用於區別LPAIVs及HPAIVs之探針為依據CS位點之PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)基序中X所包含之鹼性胺基酸數量而決定。總共設計了11個不同的探針，全面涵蓋了H5病毒具有高度變異性之CS區域。所設計之探針及引子對H5f/H5r皆經由檢索後比對及分析龐大的基因庫而得之核苷酸序列再經由MegAlign程式之數據統計而來(DNASTAR,Madison,WI,US)。該引子之序列列於表3。
[寡核酸微陣列之製備及雜交反應]
於每個寡核酸探針的5’端加上19T鹼基的尾端，包含陽性控制探針(一源自於人類腸病毒71型之VP1外殼蛋白基因之寡核酸序列，5’-ATGAAGCATGTCAGGGCTTGGATACCTCG-3’(SEQ ID NO：14))。每一個濃度為15mM之探針以自動化佈放機器佈於微陣列聚合基材上之特定位置(DR.Easy spotter,Maio-Li,Taiwan)，且使用UV crosslinker(STRATAGENE UV Stratalinker 1800,Santa Clara,USA)以0.24J將其固定。利用DR.Chip DIY套組(DR.Chip Biotech,Maio-Li,Taiwan)進行每一DNA模板及探針間之雜交反應。該過程依據實驗手冊進行，並且詳述如下。該PCR產物以95℃ 10分鐘進行變性作用後，於冰浴中降溫2分鐘。在微陣列腔室內加入200ml雜交溶液(包含與陽性控制探針序列互補之5’端生物素標定寡核酸序列)及1μl變 性PCR產物，於培養於47℃震動培養1小時，而後以清洗溶液清洗三次。阻斷反應以混合0.2ml之Strep-AP(鏈黴抗生物素蛋白共軛鹼性磷酸酶)及200ml阻斷劑於室溫下進行30分鐘，而後以清洗溶液清洗三次。比色反應之實施方式為加入4ml NBT/BCIP及196ml偵測溶液於腔室中，並於暗房中於室溫下顯影20分鐘，而後以蒸餾水清洗兩次。微陣列雜交反應結果如圖1所示，可直接以肉眼觀察。
如圖1所示，為15個H5 AIVs，其中包含10個LPAIV及5個HPAIVs(表1)使用PCR後利用寡核酸微陣列測試而得之結果。所有病毒皆明確地受偵測及鑑定其病原性，並無交互反應發生(圖1(B)及(C))。微陣列所得之結果與直接分析橫跨H5基因之CS區域序列之結果完全一致(表3)。
以微陣列鑑定人工寡核酸之結果如圖1(D)所示。其中九個代表於X位置具有五個或五個以上鹼性胺基酸之寡核酸序列與陽性控制探針(無論是U1或U2或兩者)雜交之結果皆為陽性，而與其他偵測X位點為一至四個鹼性胺基酸之探針無交互反應發生，顯示良好探針之特異性。所設計之13個探針可成功辨別鹼性胺基酸數量及辨認於CS PQm-Xn-*GLF(SEQ ID NO：51)基序之X中包含具有五個或五個以上鹼性胺基酸之HPAIVs。本發明之微陣列雜交訊號係指利用比色法使得能夠以肉眼清楚觀察所得之鑑定結果，而不需配合其他影像裝置，顯示本發明使用寡核酸微陣列可低價且簡易的偵測AIV H5病毒及其病原性。
[偵測極限]
經由分光光度計定量經萃取後所得之成功插入目標DNA之質體DNA(WPA UV1101,Biochrom Ltd,Cambridge,UK)。計算DNA之拷貝 數並以TE溶液進行序列稀釋。將源於AIV參考病毒株之DNA(107至100拷貝數)以10倍序列稀釋，用以比較瓊脂糖凝膠與寡核酸微陣列敏感度之差異。
瓊脂糖凝膠電泳法與寡核酸微陣列之敏感度差異測試為使用A/CK/Hsinchu/A1939/11(LV7)作為範例示於圖2。結果顯示當DNA之濃度低於4.6x102拷貝數/μL時，便無法於瓊脂糖凝膠中觀察到。然而，DNA濃度為4.6拷貝數/μL時仍能讀取得到寡核酸微陣列結果。這項結果表示寡核酸微陣列之敏感度高出瓊脂糖凝膠電泳法之敏感度一百倍。
本發明所描述之寡核酸微陣列方法提供一種簡單、快速且準確之區別LPAIVs及HPAIVs之方法。本方法提供一種新的禽流感偵測及診斷機會，特別是在疑似為AIV H5大規模爆發的期間可於實驗室中做診斷。
僅管實施例已於本文實施例當中公開，但仍須了解其仍有許多種可能的變化存在。而這些實施例之變化並不視為背離本發明應用之精神及範圍，且若這些修改對於本領域技術人員而言都為顯而易見則仍包含於原申請專利範圍之範圍內。
<110> 國立臺灣大學
<120> 用於鑑別H5禽流感病毒病原性之寡核酸探針、含其之套組及方法
<130> P140883TW
<160> 51
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(22)
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 探針
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<221> misc__特徵
<222> (1)..(22)
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
<400> 4
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
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<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
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<221> misc_特徵
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 探針
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<221> misc_特徵
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<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 探針
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<221> misc_特徵
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
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<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 探針
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<221> misc_特徵
<222> (1)..(18)
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<212> DNA
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<221> misc_特徵
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
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<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(122)
<400> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
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<221> misc_特徵
<222> (1)..(118)
<400> 20
<210> 21
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(121)
<400> 21
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(121)
<400> 22
<210> 23
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(124)
<400> 23
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<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(124)
<400> 24
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 橫跨AIV之CS區域之人工寡核酸
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)..(124)
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<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(10)
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(11)
<400> 27
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(13)
<400> 28
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(11)
<400> 29
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(12)
<400> 30
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(12)
<400> 31
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(13)
<400> 32
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(13)
<400> 33
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(13)
<400> 34
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 35
<210> 36
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 36
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 37
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 38
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 39
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 40
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 41
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 42
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 43
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 44
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(7)
<400> 45
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 47
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 48
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 49
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與AIV鄰近CS位點相應之胺基酸
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<400> 50
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽流感病毒
<220>
<221> MISC_特徵
<222> (1)..(6)
<223> Xaa表示精胺酸(R)離胺酸(K)
<400> 51

Claims (10)

  1. 一種用於鑑定H5禽流感病毒病原性之套組，包含SEQ NO：1、SEQ NO：2之至少其中之一者；SEQ NO：3、SEQ NO：4之至少其中之一者；SEQ NO：5、SEQ NO：6、SEQ NO：7、SEQ NO：8、SEQ NO：9之至少其中之一者；SEQ NO：10、SEQ NO：11之至少其中之一者；及SEQ NO：12、SEQ NO：13之至少其中之一者。
  2. 如請求項1之套組，其中該探針進一步於尾端加入19個T鹼基，並且佈於一微陣列基材上。
  3. 如請求項2之套組，進一步包含一寡核酸序列SEQ ID NO：14佈於該微陣列基材上作為一陽性控制探針。
  4. 一種用於鑑定一樣本中H5禽流感病毒病原性之方法，包含：(a)由該樣品中取得一核酸；(b)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針係包含如請求項1所述之探針中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2之至少其中之一者；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4之至少其中之一者；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9之至少其中之一者；SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11之至少其中之一者；SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13之至少其中之一者；且(c)基於該雜交結果鑑定該樣本病原性為低致病性禽流感病毒(LPAIV)或高致病性禽流感病毒(HPAIV)；其中當該核酸與選自由SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所組成之群組之探針雜交時，或利用所有探針但該核酸僅與探針SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或同時雜交 時，該H5禽流感病毒為高致病性禽流感病毒；其中當該核酸與選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11所組成之群組之探針雜交時，該H5禽流感病毒為一低致病性禽流感病毒(LPAIV)。
  5. 如請求項4之方法，其中該核酸係由萃取樣本之RNA，將該RNA反轉錄為一DNA且藉由一PCR反應放大該DNA所獲得。
  6. 如請求項5之方法，其中該PCR反應係使用一對引子進行，該對引子之序列為SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16。
  7. 如請求項6之方法，其中該對引子之5’端生物素化(5’end-biotinylated)。
  8. 如請求項6之方法，其中該核酸更進一步包含一標記。
  9. 如請求項8之方法，其中該標記可為一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射標記、一放射不透標記、一含有一酵素、一胜肽或一配體之蛋白質。
  10. 一種探針，其係包含下列探針之至少一者：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13，其係用於偵測H5病毒之前驅蛋白CS位置以鑑定該H5病毒之高或低致病性。
TW103125474A 2014-05-23 2014-07-25 用於鑑別ｈ５禽流感病毒病原性之寡核酸探針、含其之套組及方法 TWI531654B (zh)

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US14/286,402 US10017830B2 (en) 2014-05-23 2014-05-23 Oligonucleotide probes, kit containing the same and method for pathotyping of H5 avian influenza viruses

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