JP6530198B2 - 乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具 - Google Patents
乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具 Download PDFInfo
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Description
本発明は、乳酸菌の検出技術に関し、特にラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスを同時に検出する乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具に関する。
従来から、酸性飲料や酸性食品に対して、特定の菌類が悪影響を及ぼすことが問題となっている。例えば、カビや酵母、特定の乳酸菌等が酸性飲料や酸性食品に混入すると、腐敗したり、風味を劣化させたりすることが知られている。一般に、カビや酵母と比べ乳酸菌は耐熱性が高く、低温殺菌で残存する事例があるため、酸性飲料や酸性食品における特定の乳酸菌の有無の検査は重要であった。
酸性飲料や酸性食品における特定の乳酸菌の有無の検査では、一般に、乳酸菌の菌種を判定するために、菌種毎に分離培養を行って、生理学的性質にもとづき１種類毎に判定が行われていた。
具体的には、例えば、菌種毎に菌液を調製して、それぞれの菌種毎に数十種類の炭素源へ接種し、２日間生育させた後の炭素源の色調変化にもとづいて菌種の判定を行う方法がある。この方法では、分離培養工程が必要であり、また一定以上の菌数が必要であった。このため、特定の乳酸菌の有無の判定に最低１週間を要し、また作業員の手間も非常に掛かるものであった。このような判定に時間がかかることは、迅速性が求められる飲食品の検査においては問題であった。
具体的には、例えば、菌種毎に菌液を調製して、それぞれの菌種毎に数十種類の炭素源へ接種し、２日間生育させた後の炭素源の色調変化にもとづいて菌種の判定を行う方法がある。この方法では、分離培養工程が必要であり、また一定以上の菌数が必要であった。このため、特定の乳酸菌の有無の判定に最低１週間を要し、また作業員の手間も非常に掛かるものであった。このような判定に時間がかかることは、迅速性が求められる飲食品の検査においては問題であった。
そこで、このような問題を解消するために、特定の乳酸菌が有する遺伝子の一定領域をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などによって増幅し、その増幅産物を電気泳動法やＤＮＡチップ等で検出することにより、飲食品に特定の乳酸菌が存在しているか否かの判定を行う手法が提案されている。
具体的には、特許文献１に記載の手法によれば、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）とラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を電気泳動法によって検出できるとされている。また、特許文献２に記載の手法によれば、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）とラクトバチルス・ブフネリを電気泳動法とＤＮＡチップによって検出できるとされている。さらに、特許文献３に記載の手法によれば、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）を電気泳動法などによって検出できるとされている。
具体的には、特許文献１に記載の手法によれば、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）とラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を電気泳動法によって検出できるとされている。また、特許文献２に記載の手法によれば、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）とラクトバチルス・ブフネリを電気泳動法とＤＮＡチップによって検出できるとされている。さらに、特許文献３に記載の手法によれば、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）を電気泳動法などによって検出できるとされている。
しかしながら、これら従来の手法では、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時に検出することはできなかった。
そこで、本発明者らは、特にラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として選択することによって当該乳酸菌を高い精度で検出可能にすると共に、上記４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することに成功し、本発明を完成させた。このようにＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として増幅して乳酸菌を検出することはこれまで見られず、また上記４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出可能な本発明におけるプローブもこれまで見られなかった。
そこで、本発明者らは、特にラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として選択することによって当該乳酸菌を高い精度で検出可能にすると共に、上記４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することに成功し、本発明を完成させた。このようにＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として増幅して乳酸菌を検出することはこれまで見られず、また上記４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出可能な本発明におけるプローブもこれまで見られなかった。
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムを、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時に検出可能な乳酸菌の検出方法、及び乳酸菌検出キットの提供を目的とする。
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムをＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出可能な乳酸菌検出器具の提供を目的とする。
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムをＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出可能な乳酸菌検出器具の提供を目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の乳酸菌の検出方法は、試料に含まれる細胞からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡと、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、及びラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の16SrRNA遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットと、を用いて前記ＰＣＲによる増幅反応を行い、得られた増幅産物にもとづき前記試料におけるラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの有無を同時に判定する方法としてある。
また、本発明の乳酸菌検出キットは、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、及びラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の16SrRNA遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットとを含有する構成としてある。
さらに、本発明の乳酸菌検出器具は、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブとを固定化した構成としてある。
本発明の乳酸菌の検出方法、及び乳酸菌検出キットによれば、ラクトバチルス・プランタラムを、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時に検出することができる。
また、本発明の乳酸菌検出器具によれば、ラクトバチルス・プランタラムをＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することができる。
また、本発明の乳酸菌検出器具によれば、ラクトバチルス・プランタラムをＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を標的遺伝子として検出できると共に、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することができる。
以下、本発明の実施形態に係る乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具について、詳細に説明する。
［乳酸菌の検出方法］
本実施形態の乳酸菌の検出方法は、試料に含まれる細胞からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡと、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットとを用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、得られた増幅産物にもとづき試料におけるラクトバチルス・プランタラムの有無を判定することを特徴とする。
［乳酸菌の検出方法］
本実施形態の乳酸菌の検出方法は、試料に含まれる細胞からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡと、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットとを用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、得られた増幅産物にもとづき試料におけるラクトバチルス・プランタラムの有無を判定することを特徴とする。
また、本実施形態の乳酸菌の検出方法を、抽出されたＤＮＡと、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とするプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、及びラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットとを用いて、ＰＣＲによる増幅反応を行い、得られた増幅産物にもとづき試料におけるラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの有無を同時に判定するものとすることも好ましい。
さらに、本実施形態の乳酸菌の検出方法を、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブとを固定化した乳酸菌検出器具に、標識された増幅産物を接触させ、プローブと相補的に結合した増幅産物の標識を検出するものとすることも好ましい。
（ＤＮＡの抽出）
ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。
まず、培養液を1ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行う。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行う。さらに、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得ることができる。そして、このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用する試料として用いることができる。
ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。
まず、培養液を1ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行う。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行う。さらに、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得ることができる。そして、このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用する試料として用いることができる。
（ＰＣＲによる増幅反応）
抽出したＤＮＡとプライマーを用いて、増幅の標的とする遺伝子領域（増幅対象領域）をＰＣＲ法により増幅させる。
具体的には、図１に示すように、プライマーとして、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いることによって、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を増幅させることができる。
また、プライマーとして、配列番号３に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いることによって、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させることができる。
抽出したＤＮＡとプライマーを用いて、増幅の標的とする遺伝子領域（増幅対象領域）をＰＣＲ法により増幅させる。
具体的には、図１に示すように、プライマーとして、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いることによって、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）を増幅させることができる。
また、プライマーとして、配列番号３に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いることによって、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させることができる。
ＰＣＲ反応液としては、例えば、核酸合成基質、プライマーセット、核酸合成酵素、試料のＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むものを好適に使用することができる。
また、ＰＣＲによる増幅産物の有無をＤＮＡチップで特定する場合、ＰＣＲによって増幅産物に標識が付加される。標識の方法は特に限定されないが、蛍光標識を好適に用いることができる。
また、ＰＣＲによる増幅産物の有無をＤＮＡチップで特定する場合、ＰＣＲによって増幅産物に標識が付加される。標識の方法は特に限定されないが、蛍光標識を好適に用いることができる。
ＰＣＲで蛍光標識を行う場合、蛍光標識されたプライマーを用いて、末端のみが標識された増幅産物を生成することができる。また、蛍光標識された核酸合成基質を用いて、内部に標識が含まれた増幅産物を生成することもできる。いずれの場合も蛍光標識成分として、Ｃｙ５やＣｙ３などを好適に用いることが可能である。
さらに、標識として、ジコキシゲニン、ビオチン、放射性同位体などの蛍光以外のその他の方式のものを用いることも可能である。
さらに、標識として、ジコキシゲニン、ビオチン、放射性同位体などの蛍光以外のその他の方式のものを用いることも可能である。
また、ＰＣＲ反応を行う装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
ＰＣＲの反応条件としては、例えば以下の通りに行うことができる。
（ａ）９４℃ ２分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ ３分
ＰＣＲの反応条件としては、例えば以下の通りに行うことができる。
（ａ）９４℃ ２分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ ３分
（乳酸菌の有無の判定）
乳酸菌の有無の判定方法としては、例えば電気泳動法により行うことができる。電気泳動法は、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミド電気泳動、マイクロチップ電気泳動等の一般的な方法により行うことができる。電気泳動法では増幅産物の大きさにもとづいて、乳酸菌の有無の判定が行われる。
乳酸菌の有無の判定方法としては、例えば電気泳動法により行うことができる。電気泳動法は、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミド電気泳動、マイクロチップ電気泳動等の一般的な方法により行うことができる。電気泳動法では増幅産物の大きさにもとづいて、乳酸菌の有無の判定が行われる。
電気泳動法のように増幅産物の大きさにもとづき対象菌の有無を判定する場合、複数の種類の対象菌における標的とする遺伝子領域のサイズがあまり違わないときは、これらの対象菌を一つの系で同時に識別することは困難である。
したがって、複数の種類の乳酸菌を一つの系で同時にそれぞれ特異的に識別するためには、ＤＮＡチップを用いることが好ましい。
したがって、複数の種類の乳酸菌を一つの系で同時にそれぞれ特異的に識別するためには、ＤＮＡチップを用いることが好ましい。
具体的には、図１に示すように、プローブとして、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリ（L.buchneri）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランス（L.fructivorans）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブとを固定化したＤＮＡチップを用いることが好ましい。
これらのプローブは、上記乳酸菌毎にそれぞれ特異的な配列を有しており、かつ対応する遺伝子領域の増幅産物とのみハイブリダイズできるため、検査対象の上記各乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出可能にすることが可能となっている。
ＤＮＡチップは、上記のプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
例えば、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
このようにして得られたＤＮＡチップに増幅産物を滴下して、増幅産物をＤＮＡチップに固定化されたプローブにハイブリダイズさせる。そして、ハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、検査対象の乳酸菌の種類を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置などの一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物における蛍光標識の蛍光強度を測定することにより行うことができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置などの一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物における蛍光標識の蛍光強度を測定することにより行うことができる。
また、測定結果として、蛍光強度値の他、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio，（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を算出することも好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合、陽性と判定することができる。
また、本実施形態におけるプライマー及びプローブは、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１〜１５で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１〜１５で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
［乳酸菌検出キット］
本実施形態の乳酸菌検出キットは、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットとを含有することを特徴とする。
本実施形態の乳酸菌検出キットは、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットとを含有することを特徴とする。
このような乳酸菌検出キットは、ＰＣＲ反応液を作成するためのプライマーの混合液として用いることにより、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子と、上記４種類の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をそれぞれ好適に増幅させることが可能である。
［乳酸菌検出器具］
本実施形態の乳酸菌検出器具は、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブとを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の乳酸菌検出器具は、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブとを固定化したことを特徴とする。
このような乳酸菌検出器具は、上記乳酸菌検出キットを加えたＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲにより得られた増幅産物を滴下することにより、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスを同時にそれぞれ特異的に検出することが可能である。
以上説明した通り、本実施形態の乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具によれば、上記４種類の乳酸菌を優れた特異性で識別でき、偽陽性判定を低減させることができる。
また、従来法に比較して検出感度に優れ、低濃度の汚染サンプルを試料とする場合でも乳酸菌の検出を好適に行うことが可能である。
さらに、本実施形態によれば、一回の操作で検査対象の４種類の乳酸菌の有無を同時に判定できるため、１菌種のみを判定する場合に比較して、ＰＣＲなどの試薬量を削減でき、作業を省力化することも可能である。
また、従来法に比較して検出感度に優れ、低濃度の汚染サンプルを試料とする場合でも乳酸菌の検出を好適に行うことが可能である。
さらに、本実施形態によれば、一回の操作で検査対象の４種類の乳酸菌の有無を同時に判定できるため、１菌種のみを判定する場合に比較して、ＰＣＲなどの試薬量を削減でき、作業を省力化することも可能である。
（試験１）
本実施形態の乳酸菌の検出方法、及び乳酸菌検出キットを用いて、特定の乳酸菌の標的遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物にもとづき乳酸菌を検出できるかを確認するための検証試験を行った。
乳酸菌としては、以下の４種類について、合計５つの試料を準備した。これらの供試菌株は、独立行政法人製品評価基盤機構から分譲されたものである。
本実施形態の乳酸菌の検出方法、及び乳酸菌検出キットを用いて、特定の乳酸菌の標的遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物にもとづき乳酸菌を検出できるかを確認するための検証試験を行った。
乳酸菌としては、以下の４種類について、合計５つの試料を準備した。これらの供試菌株は、独立行政法人製品評価基盤機構から分譲されたものである。
（１）ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）NBRC106468
（２）ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）NBRC15891
（３）ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）NBRC107147
（４）ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）NBRC107764
（５）ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）NBRC14747
（２）ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）NBRC15891
（３）ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）NBRC107147
（４）ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）NBRC107764
（５）ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）NBRC14747
試料に含まれる細胞からのＤＮＡの抽出は、次のように行った。
まず、培養液を1ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用する試料とした。
まず、培養液を1ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用する試料とした。
プライマーセットとして、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いた。その増幅対象領域は、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）であり、推定増幅産物長は２６６ｂｐである。
また、プライマーセットとして、配列番号３に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いた。その増幅対象領域は、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）であり、推定増幅産物長はそれぞれ約５００ｂｐである。
また、プライマーセットとして、配列番号３に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いた。その増幅対象領域は、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）であり、推定増幅産物長はそれぞれ約５００ｂｐである。
ＰＣＲ反応液としては、以下の組成のものを使用した。プライマーはライフテクノロジージャパン株式会社より合成した。それ以外は、タカラバイオ株式会社製である。
・緩衝液 10×Ex Taq buffer(20mM Mg 2＋ plus) 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM) 1.6μl
・16SrRNA検出用フォワードプライマー(10μM) 0.5μl
・16SrRNA検出用リバースプライマー (10μM) 0.5μl
・rpo検出用フォワードプライマー(10μM) 0.2μl
・rpo検出用リバースプライマー (10μM) 0.3μl
・核酸合成酵素 EX Taq(5U/μl) 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl
・滅菌水 13.8μl
（全量 20μl）
・緩衝液 10×Ex Taq buffer(20mM Mg 2＋ plus) 2.0μl
・核酸合成基質 dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM) 1.6μl
・16SrRNA検出用フォワードプライマー(10μM) 0.5μl
・16SrRNA検出用リバースプライマー (10μM) 0.5μl
・rpo検出用フォワードプライマー(10μM) 0.2μl
・rpo検出用リバースプライマー (10μM) 0.3μl
・核酸合成酵素 EX Taq(5U/μl) 0.1μl
・試料のＤＮＡ 1.0μl
・滅菌水 13.8μl
（全量 20μl）
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅には、ｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社製）を使用した。また、ＰＣＲの反応条件は、実施形態で説明したものと同一の次の条件で行った。
（ａ）９４℃ ２分
（ｂ）９４℃ ３０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（ｃ）６０℃ ３０秒（アニーリング工程）
（ｄ）７２℃ ６０秒（ＤＮＡ合成工程）
（ｅ）７２℃ ３分
（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル
（ａ）９４℃ ２分
（ｂ）９４℃ ３０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（ｃ）６０℃ ３０秒（アニーリング工程）
（ｄ）７２℃ ６０秒（ＤＮＡ合成工程）
（ｅ）７２℃ ３分
（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル
次に、ＰＣＲ法による増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。電気泳動は、ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）(株式会社島津製作所製)を用いて行った。その結果を図２に示す。
同図において、供試菌株（１）〜（５）のいずれについても、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）の増幅産物を示す５００ｂｐ付近にバンドが示された。また、供試菌株（１），（２）については、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）の増幅産物を示す２６６ｂｐ付近にバンドが示された。
同図において、供試菌株（１）〜（５）のいずれについても、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）の増幅産物を示す５００ｂｐ付近にバンドが示された。また、供試菌株（１），（２）については、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｒｐｏ）の増幅産物を示す２６６ｂｐ付近にバンドが示された。
このことから、本実施形態の乳酸菌検出キットによれば、ラクトバチルス・プランタラムを１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の増幅産物にもとづき検出できることが確認された。また、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスを１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物にもとづきそれぞれ検出できることが確認された。
（試験２）
本実施形態の乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具を用いて、特定の乳酸菌の標的遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物を乳酸菌検出器具に固定化されたプローブとハイブリダイズさせることによって、これらの乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出できるかを確認するための検証試験を行った。
本実施形態の乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具を用いて、特定の乳酸菌の標的遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物を乳酸菌検出器具に固定化されたプローブとハイブリダイズさせることによって、これらの乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出できるかを確認するための検証試験を行った。
試験１と同様に、４種類の乳酸菌について合計５つの試料を準備し、ＤＮＡの抽出を行った。
また、プライマーセット及びＰＣＲ反応液として試験１と同様のものを使用し、試験１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲにおいては、蛍光標識された核酸合成基質を用いて、標識された増幅産物を生成した。
また、プライマーセット及びＰＣＲ反応液として試験１と同様のものを使用し、試験１と同様にＰＣＲ法による遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲにおいては、蛍光標識された核酸合成基質を用いて、標識された増幅産物を生成した。
さらに、乳酸菌検出器具として、ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７に示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９に示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４に示される塩基配列からなるプローブと、ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５に示される塩基配列からなるプローブとを固定化したＤＮＡチップを作製した。
このＤＮＡチップにＰＣＲの増幅産物を滴下して、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出した。具体的には、次のように行った。
まず、ＰＣＲ増幅産物に、緩衝液（３×ＳＳＣ クエン酸−生理食塩水）に０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加したものを混合し、ＤＮＡチップに滴下した。
次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
まず、ＰＣＲ増幅産物に、緩衝液（３×ＳＳＣ クエン酸−生理食塩水）に０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加したものを混合し、ＤＮＡチップに滴下した。
次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、ＤＮＡチップを標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）にかけて蛍光強度を測定した。蛍光強度は、レーザー光で励起して標識成分（Ｃｙ５）を発光させ、その光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度を得た。さらに、この蛍光強度にもとづきＳ／Ｎ比値を算出した。その結果を図３に示す。
同図に示されるように、供試菌株（１）〜（５）のいずれについても、それらの乳酸菌が、各プローブの検出対象菌である場合にのみ陽性反応（Ｓ／Ｎ比値≧３）が示されており、偽陽性反応が生じていないことが確認された。
同図に示されるように、供試菌株（１）〜（５）のいずれについても、それらの乳酸菌が、各プローブの検出対象菌である場合にのみ陽性反応（Ｓ／Ｎ比値≧３）が示されており、偽陽性反応が生じていないことが確認された。
なお、ＰＣＲの増幅産物には、配列番号５〜１５に示される塩基配列からなるプローブとハイブリダイズする増幅産物に対して相補的な塩基配列を有する増幅産物も含まれる。したがって、配列番号５〜１５に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブは、このような相補的な塩基配列を有する増幅産物とハイブリダイズすることができる。
よって、配列番号５〜１５に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブをＤＮＡチップに固定化した場合にも、上記の４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することが可能である。
よって、配列番号５〜１５に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブをＤＮＡチップに固定化した場合にも、上記の４種類の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出することが可能である。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態に係る乳酸菌検出器具に上記以外のプローブをさらに追加して固定化したり、あるいはＰＣＲ反応液にその他の成分を含有させたりするなど適宜変更することが可能である。
本発明は、食品検査、環境検査等において、特定の乳酸菌を同時にそれぞれ特異的に検出する場合に好適に利用することが可能である。
Claims (4)
- 試料に含まれる細胞からＤＮＡを抽出し、
抽出されたＤＮＡと、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、及びラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の16SrRNA遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットと、を用いて前記ＰＣＲによる増幅反応を行い、
得られた増幅産物にもとづき前記試料におけるラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、及びラクトバチルス・フルクチボランスの有無を同時に判定する
ことを特徴とする乳酸菌の検出方法。 - ラクトバチルス・プランタラムのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・ブフネリの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・フルクチボランスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、を固定化した乳酸菌検出器具に、標識された前記増幅産物を接触させ、
前記プローブと相補的に結合した前記増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１記載の乳酸菌の検出方法。 - ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を標的とする配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、
ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、及びラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とする配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーセットと、を含有する
ことを特徴とする乳酸菌検出キット。 - ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に相補的に結合する配列番号５〜７及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号８，９及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１０〜１４及びこれらの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、
ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的に結合する配列番号１５及びこれの相補的配列の少なくともいずれかに示される塩基配列からなるプローブと、を固定化した
ことを特徴とする乳酸菌検出器具。
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