JP6623572B2 - 微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイ - Google Patents
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Description
一方、植物組織または土壌や水に存在する土壌伝染性病害に係る病原菌には、食品検査や環境検査等における検出対象菌とは界が異なるものが存在し、これらの検出対象菌のプライマーを用いてPCRを行っても、土壌伝染性病害菌のDNAを増幅させることは、困難であった。
そして、本発明者らは、鋭意研究し、これらの検出対象菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子を標的領域として好適に増幅させることができるプライマーセットと、rDNA遺伝子(リボソームRNA遺伝子)ITS領域を標的領域として好適に増幅させることができるプライマーセットを開発すると共に、それぞれの増副産物を特定可能なプローブ(DNAチップ基板上の1本鎖オリゴDNA)を備えたマイクロアレイを開発し、これらの病原菌を特異的に検出することに成功した。
しかしながら、これらの技術では、プラズモディオフォラ属菌を検出することはできなかった。また、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌をより好適にそれぞれ特異的に同時に検出可能にすることが望ましい。
本実施形態の微生物の検査方法は、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、試料に含まれる微生物群からDNAを抽出し、抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき試料における微生物の有無を判定する微生物の検査方法であって、プラズモディオフォラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRによる増幅の標的とする配列番号1〜3に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号4,5に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットと、抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるプラズモディオフォラ属菌の有無を判定することを特徴とする。
プラズモディオフォラ属菌は、土壌伝染性病原菌であり、ハクサイ、キャベツ類等のアブラナ科野菜などに寄生して、根こぶ病を引き起こす。生きた植物細胞だけに寄生して病気を起こす絶対寄生菌である。
本明細書において、塩基配列は、全て5’末端から3’末端方向に把握するものとする。
また、上記の第一のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
ピシウム属菌は、多犯性の土壌伝染性病原菌であり、ウリ科野菜やナス科野菜などをはじめ多くの野菜類に対して、苗立枯病や腐敗病等を起こす。
フィトフトラ属菌は、土壌中や植物体内で生息する病原菌であり、19世紀の中頃にヨーロッパにおいてジャガイモ飢饉を引き起こしたフィトフトラ・インフェスタンスが有名である。
また、上記の第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能であり、上記の第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及び例えばアスペルギルス・バージカラーなどのその他の微生物を検出することが可能となっている。
なお、その他の微生物はアスペルギルス・バージカラーに限定されず、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを、真菌共通用として利用しても良い。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌のDNAと第二のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第五の増幅産物に相補的に結合する配列番号18に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブを固定化したマイクロアレイに、第五の増幅産物を接触させ、第五のプローブと相補的に結合した第五の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
また、上記の第五のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌のDNAと第三のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第六の増幅産物に相補的に結合する配列番号19に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブを固定化したマイクロアレイに、第六の増幅産物を接触させ、第六のプローブと相補的に結合した第六の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
また、上記の第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAと第四のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第七の増幅産物に相補的に結合する配列番号20または21に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブを固定化したマイクロアレイに、第七の増幅産物を接触させ、第七のプローブと相補的に結合した第七の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
また、上記の第七のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌を検出することが可能となっている。
まず、第六のプローブと第七のプローブの両方について増幅産物の標識が検出された場合、ピシウム属菌が存在し、フィトフトラ属菌の存否は、不明であることが分かる。また、第六のプローブについて増幅産物の標識が検出されず、第七のプローブについて増幅産物の標識が検出された場合、ピシウム属菌が存在せず、フィトフトラ属菌が存在することが分かる。また、第六のプローブと第7のプローブの両方について増幅産物の標識が検出されない場合、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌のいずれも存在しないことが分かる。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてPCRを行うことによって、プラズモディオフォラ属のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてPCRを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてPCRを行うことによって、ピシウム属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてPCRを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属、及びピシウム属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてPCRを行うことによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてPCRを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
まず、微生物のコロニーを採取して、液体窒素などによりコロニーを凍結し、コロニーに含まれる微生物の細胞を破砕する。次に、得られた微生物の細胞の破砕物からゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAの抽出は、CTAB法(Cetyl trimethyl ammonium bromide)による方法やDNA抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。また、土壌中から直接カビのDNAを抽出することもできる。この場合も、DNAの抽出は、直接溶菌法(Direct Lysis Method)による方法や土壌DNA抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
(a)95℃ 10分、(b)95℃(DNA変性工程) 30秒、(c)56℃(アニーリング工程) 30秒、(d)72℃(DNA合成工程) 60秒((b)〜(d)を40サイクル)、(e)72℃ 10分
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第一のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第一のプローブと第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、フィトフトラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第一のプローブ、第二のプローブ、及び第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及び例えばアスペルギルス・バージカラーなどのその他の微生物を検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第五のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第五のプローブと第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第七のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌を検出することが可能となっている。
例えば、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイとして貼り付け型のDNAチップを作成する場合は、DNAスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型DNAチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴDNAを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のBIOSHOT(R)を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、S/N比値(Signal to Noise ratio)値として得ることが好ましい。S/N比値は、(メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値)÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するための試験を行った。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にPCRにより増幅した。
そして、配列番号12、配列番号13、配列番号15、及び配列番号17に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のPCRによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
ピシウム・アファニデルマタム(Pythium aphanidermatum) NBRC7030
ピシウム・ウルティマム(Pythium ultimum) NBRC100125
ピシウム・ジンジベリス(Pythium zingiberis) NBRC30818
フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans) NBRC9174
・Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
・Ampdirect(addition-4) 4.0μl
・dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM) 1.0μl
・Cy-5 dCTP 0.2μl
・EX Taq Hot Start DNA polymerase (5U/μl) 0.2μl
・フォワードプライマー(10μM) 1.0μl
・リバースプライマー (10μM) 1.0μl
・試料のDNA (100pg/μl) 1.0μl
・水(全体が20.0μlになるまで加水)
(a)95℃ 10分
(b)95℃ 30秒
(c)56℃ 30秒
(d)72℃ 60秒((b)〜(d)を40サイクル)
(e)72℃ 10分
そして、標識検出装置(BIOSHOT(R),東洋鋼鈑株式会社製)を用いて、上記マイクロアレイに固定化された各プローブにおける蛍光強度(プローブに結合した増幅産物の蛍光強度)を測定して、各プローブにおけるS/N比値を取得した。その結果を図3に示す。
また、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・アファニデルマタムとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号13と17、配列番号15と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号13と17、配列番号15と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するためのさらに試験を行った。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にPCRにより増幅した。
そして、配列番号12、配列番号14、配列番号16、及び配列番号17に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のPCRによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図4に示す。
また、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・アファニデルマタムとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号14と17、配列番号16と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号14と17、配列番号16と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するためのさらに試験を行った。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら4種類の微生物のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にPCRにより増幅した。
そして、配列番号12、配列番号14、配列番号16、及び配列番号17に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のPCRによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図5に示す。
また、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号14と17、配列番号16と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号14と17、配列番号16と17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験を行った。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのPCR反応液を用いて、PCRにより同時に増幅した。
そして、配列番号12、配列番号13、配列番号15、及び配列番号17に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のPCRによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図6に示す。
また、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
また、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験をさらに行った。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのPCR反応液を用いて、PCRにより同時に増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら4種類の微生物のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのPCR反応液を用いて、PCRにより同時に増幅した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図7に示す。
また、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
また、配列番号2に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
また、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号4に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
また、配列番号3に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号5に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号17に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、rDNA遺伝子ITS領域を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するための試験を行った。
また、rDNA遺伝子ITS領域を標的とする配列番号7に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら3種類の微生物のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をそれぞれ個別にPCRにより増幅した。
また、rDNA遺伝子ITS領域を標的とする配列番号8に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号11に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら3種類の微生物のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をそれぞれ個別にPCRにより増幅した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図9に示す。
また、配列番号7に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムのDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号19に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号8に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムのDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRにより増幅して得られた増幅産物も、配列番号19に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、rDNA遺伝子ITS領域を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験を行った。
そして、配列番号18、配列番号19、配列番号20、及び配列番号21に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のPCRによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
そして、試験1と同様にPCR増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、S/N比値を取得した。その結果を図10に示す。
Claims (20)
- 植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からDNAを抽出し、抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物の検査方法であって、
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRによる増幅の標的とする配列番号1〜3に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号4,5に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットと、前記抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるプラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする微生物の検査方法。 - プラズモディオフォラ属菌のDNAと前記第一のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第一の増幅産物に相補的に結合する配列番号12に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第一の増幅産物を接触させ、
前記第一のプローブと相補的に結合した前記第一の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項1記載の微生物の検査方法。 - ピシウム属菌のDNAと前記第一のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第二の増幅産物に相補的に結合する配列番号13または14に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第二の増幅産物を接触させ、
前記第二のプローブと相補的に結合した前記第二の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項1または2記載の微生物の検査方法。 - フィトフトラ属菌のDNAと前記第一のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第三の増幅産物に相補的に結合する配列番号15または16に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第三の増幅産物を接触させ、
前記第三のプローブと相補的に結合した前記第三の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の微生物の検査方法。 - プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのDNAと前記第一のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第四の増幅産物に相補的に結合する配列番号17に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第四の増幅産物を接触させ、
前記第四のプローブと相補的に結合した前記第四の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の微生物の検査方法。 - プラズモディオフォラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号6に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号9に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットと、前記抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるプラズモディオフォラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の微生物の検査方法。 - プラズモディオフォラ属菌のDNAと前記第二のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第五の増幅産物に相補的に結合する配列番号18に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第五の増幅産物を接触させ、
前記第五のプローブと相補的に結合した前記第五の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項6記載の微生物の検査方法。 - ピシウム属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号7または8に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットと、前記抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるピシウム属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の微生物の検査方法。 - ピシウム属菌のDNAと前記第三のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第六の増幅産物に相補的に結合する配列番号19に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第六の増幅産物を接触させ、
前記第六のプローブと相補的に結合した前記第六の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項8記載の微生物の検査方法。 - ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号8に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号11に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットと、前記抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるピシウム属菌またはフィトフトラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の微生物の検査方法。 - ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAと前記第四のプライマーセットを用いてPCRにより得られた第七の増幅産物に相補的に結合する配列番号20または21に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第七の増幅産物を接触させ、
前記第七のプローブと相補的に結合した前記第七の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項10記載の微生物の検査方法。 - 植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からDNAを抽出し、抽出されたDNAを用いてPCRを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定するために用いる微生物の検査キットであって、
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子をPCRによる増幅の標的とする配列番号1〜3に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号4,5に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを含む
ことを特徴とする微生物の検査キット。 - プラズモディオフォラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号6に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号9に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項12記載の微生物の検査キット。 - ピシウム属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号7または8に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項12または13記載の微生物の検査キット。 - ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域をPCRによる増幅の標的とする配列番号8に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号11に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項12〜14のいずれかに記載の微生物の検査キット。 - 請求項12〜15のいずれかに記載の微生物の検査キットによって得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物検査用マイクロアレイであって、
プラズモディオフォラ属菌のDNAと、プラズモディオフォラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子について、配列番号1〜3に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号4,5に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第一の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号12に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブと、
ピシウム属菌のDNAと、ピシウム属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第二の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号13または14に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブと、
フィトフトラ属菌のDNAと、フィトフトラ属菌のDNAにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第三の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号15または16に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブと、
を固定化したことを特徴とする微生物検査用マイクロアレイ。 - プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのDNAと、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのDNAについて、前記第一のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第四の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号17に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項16に記載の微生物検査用マイクロアレイ。 - プラズモディオフォラ属菌のDNAと、プラズモディオフォラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域について、配列番号6に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号9に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第五の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号18に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項16または17に記載の微生物検査用マイクロアレイ。 - ピシウム属菌のDNAと、ピシウム属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域について、配列番号7または8に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号10に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第六の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号19に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項16〜18のいずれかに記載の微生物検査用マイクロアレイ。 - ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAと、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のDNAにおけるrDNA遺伝子ITS領域について、配列番号8に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号11に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより得られる第七の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号20または21に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項16〜19のいずれかに記載の微生物検査用マイクロアレイ。
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