JP6672760B2 - 病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法 - Google Patents
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TOP7の定義は、1個体で、O抗原合成遺伝子領域の遺伝子(血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157のいずれかのもの)、インチミン遺伝子(eae)、及び志賀毒素遺伝子(stx)の3因子を全て保有している病原性大腸菌とされている。このため、これらの病原性大腸菌の検査は、これら3因子を分析することにより行うことができる。
また、公知技術2は、電気泳動で解析する方法であることから、判定の客観性に乏しく、上記の通り、TOP7の全てを検出できないという問題もあった。
しかしながら、この方法では、TOP7のいずれの病原性大腸菌も検出対象とされておらず、TOP7の病原性大腸菌を検出することはできなかった。
すなわち、本発明は、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている7つの血清型(O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157)の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能な病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の提供を目的とする。
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、図1に示すプローブ(配列番号1〜10)を、基板上に固定化したものであれば特に限定されない。この病原性大腸菌検出用担体は、例えばスポット型又は合成型のDNAチップやDNAマイクロアレイなどとして製造することができる。
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体により検出する対象の病原性大腸菌は、O抗原合成遺伝子領域の遺伝子がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157の7つの血清型(serotype)のいずれかであり、病原性大腸菌のTOP7と呼ばれるものである。
ここで、血清型とは、特異抗体を用いて細菌表面抗原の相違を検出することにより同種の細菌をより細かく分類する時に用いられる型を意味する。大腸菌のO抗原は、184種類が知られている。
インチミン遺伝子は、腸管付着性因子というタンパク質をコードする遺伝子である。また、志賀毒素遺伝子(stx)は、「志賀毒素(Shiga toxin)」というタンパク質をコードする遺伝子であり、志賀毒素1型遺伝子(stx1)と、志賀毒素2型遺伝子(stx2)の2種類が知られている。
本実施形態における病原性大腸菌を検出するためのプローブは、配列番号1〜10によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
このうち、配列番号1に示す塩基配列からなるものがO26のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号2に示す塩基配列からなるものがO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号3に示す塩基配列からなるものがO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号4に示す塩基配列からなるものがO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号5に示す塩基配列からなるものがO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号6に示す塩基配列からなるものがO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号7に示す塩基配列からなるものがO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブである。また、配列番号8に示す塩基配列からなるものがeaeから選択されたプローブであり、配列番号9に示す塩基配列からなるものがstx1から選択されたプローブであり、配列番号10に示す塩基配列からなるものがstx2から選択されたプローブである。
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号1〜10に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体として貼り付け型のDNAチップを作成する場合は、DNAスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型DNAチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴDNAを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号1〜10に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることも、配列番号1〜10に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号1〜10に示す塩基配列からなるプローブに対して、相補的な塩基配列からなるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもできる。
本実施形態の病原性大腸菌検出用キットには、病原性大腸菌のDNAにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された病原性大腸菌検出用担体とが含まれる。
具体的には、プライマーセットとしては、配列番号11に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO26のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号13に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号14に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号15に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号17に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号19に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号20に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号21に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号22に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号23に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号24に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号25に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるeaeを増幅させるためのプライマーセット、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるstx1を増幅させるためのプライマーセット、配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるstx2を増幅させるためのプライマーセットが含まれる。
本実施形態の病原性大腸菌の検出方法は、検出対象の病原性大腸菌のDNAにおける標的領域を増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、PCR用反応液に、配列番号11に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号13に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号14に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号15に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号17に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号19に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号20に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号21に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号22に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号23に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号24に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号25に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に、病原性大腸菌のDNAが含有されている場合、上記のPCR用反応液を使用して、病原性大腸菌のDNAにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、病原性大腸菌を検出する方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば以下のような方法とすることができる。
次に、抽出したゲノムDNAにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムDNAにおける標的領域を含むDNA断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、PCR法を好適に用いることができる。PCR法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するPCR反応液を用いて、標的領域を増幅させる。PCR装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
(a)95℃ 2分、(b)95℃(DNA変性工程) 10秒、(c)60℃(アニーリング工程) 20秒、(d)72℃(DNA合成工程) 30秒((b)〜(d)を40サイクル)、(e)72℃ 2分
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のBIOSHOT(登録商標)を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、S/N比値(Signal to Noise ratio)値として得ることが好ましい。S/N比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にS/N比値が3以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のS/N比値は、(メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値)÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
これによって、病原性大腸菌の検出の省力化が可能となり、また検体取り違えによる誤判定を防止することが可能となる。
No.1 RIMD 05091877(血清型O26)、No.2 RIMD 5091905(血清型O26)、No.3 RIMD 05091933(血清型O26)、No.4 RIMD 05091932(血清型O26)、No.5 RIMD 05091858(血清型O45)、No.6 GTC 03590(血清型O45)、No.7 RIMD 05091878(血清型O103)、No.8 RIMD 0509463(血清型O103)、No.9 RIMD 05092051(血清型O103)、No.10 RIMD 05092043(血清型O103)、No.11 RIMD 05092050(血清型O103)、No.12 RIMD 05092015(血清型O111)、No.13 RIMD 05091865(血清型O111)、No.14 RIMD 05091866(血清型O111)、No.15 RIMD 05092026(血清型O111)、No.16 RIMD 05092027(血清型O111)、No.17 RIMD 05091875(血清型O121)、No.18 RIMD 05091859(血清型O121)、No.19 RIMD 0509481(血清型O121)、No.20 RIMD 05092058(血清型O121)、No.21 RIMD 05092061(血清型O121)、No.22 RIMD 05091870(血清型O145)、No.23 RIMD 05092063(血清型O145)、No.24 RIMD 05091860(血清型O157)、No.25 RIMD 05091868(血清型O157)、No.26 RIMD 05091906(血清型O157)、No.27 RIMD 05091904(血清型O157)、No.28 RIMD 0509516(血清型O157)
このうち、No.6 GTC 03590(血清型O45)、No.8 RIMD 0509463(血清型O103)、No.19 RIMD 0509481(血清型O121)、及びNo.28 RIMD 0509516(血清型O157)は病原性を有さない菌株であり、残りは病原性を有するものである。
次に、DNeasy Blood&Tissue Kit(株式会社キアゲン)を用い、マニュアルに記載のグラム陰性菌の抽出方法に従って、上記各DNA抽出用菌体からDNAを抽出した。このDNA抽出液をPCRにおいて使用するテンプレートとした。
プライマーセットとしては、図2に示す10組のプライマーセットを使用し、各PCR反応液には、これらの全てのプライマーセット(Primer mix)を含有させた。これらのプライマーセットは、シグマアルドリッチジャパン合同会社により合成したものを使用した。なお、図2において、「F/R」は、フォワードプライマー(F)とリバースプライマー(R)の区別を示している。また、「修飾」は、蛍光標識のCy5を用いて、フォワードプライマーとリバースプライマーのどちらの5’末端に標識を行ったかを示している。
1.10x Ex Taq buffer 2.5μl
2.dNTPmix 2.0μl
3.Primer mix 1.0μl
4.Template DNA 5.0μl(20pg/μl)
5.Ex Taq HotStart DNA polymerase 0.125μl
6.水(全体が25.0μlになるまで加水)
(a)95℃ 2分
(b)95℃ 10秒
(c)60℃ 20秒
(d)72℃ 30秒((b)〜(d)を40サイクル)
(e)72℃ 2分
そして、標識検出装置(BIOSHOT)を用いて、病原性大腸菌検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度(プローブに結合した増幅産物の蛍光強度)を測定して、各プローブにおけるS/N比値を取得した。その結果を図3、図4に示す。
したがって、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法によれば、7つの血清型(O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157)の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出できることが明らかとなった。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体において、各プローブを1スポットずつ、又は複数スポットずつ固定化することができる。また、本実施形態における病原性大腸菌以外の細菌を検出するためのその他のプローブを、本実施形態におけるプローブと共に固定化することもでき、適宜変更することが可能である。
Claims (7)
- 配列番号1〜10に示す塩基配列からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
- 配列番号1〜10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
- 配列番号1に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO26のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号2に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号3に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号4に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号5に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号6に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号7に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号8に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、
配列番号9に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素1型遺伝子を検出するプローブ、
配列番号10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素2型遺伝子を検出するプローブ、
を固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。 - 配列番号1に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO26のO抗原合成遺伝子領域を検出するプローブ、
配列番号2に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号3に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号4に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号5に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号6に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号7に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号8に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、
配列番号9に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素1型遺伝子を検出するプローブ、
配列番号10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素2型遺伝子を検出するプローブ、
を固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。 - 配列番号1に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号1に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号1に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO26のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号1に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO26のO抗原合成遺伝子領域を検出するプローブからなる第一のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号2に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号2に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号2に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号2に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO45のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第二のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号3に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号3に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号3に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号3に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO103のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第三のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号4に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号4に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号4に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号4に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO111のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第四のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号5に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号5に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号5に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号5に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO121のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第五のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号6に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号6に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号6に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号6に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO145のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第六のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号7に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号7に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号7に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号7に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO157のO抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第七のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号8に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号8に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号8に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号8に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつインチミン遺伝子を検出するプローブからなる第八のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号9に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号9に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号9に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素1型遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号9に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素1型遺伝子を検出するプローブからなる第九のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、及び、
配列番号10に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素2型遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号10に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素2型遺伝子を検出するプローブからなる第十のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。 - 病原性大腸菌のDNAにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含む病原性大腸菌検出用キットであって、
前記プライマーセットが、配列番号11に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号13に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号14に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号15に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号17に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号19に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号20に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号21に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号22に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号23に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号24に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号25に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項1〜5のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体である
ことを特徴とする病原性大腸菌検出用キット。 - 病原性大腸菌のDNAにおける標的領域をPCRにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、
PCR用反応液に、配列番号11に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号12に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号13に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号14に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号15に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号17に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号19に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号20に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号21に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号22に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号23に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号24に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号25に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号26に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、病原性大腸菌のDNAが含有されている場合、
前記PCR用反応液を使用して、前記病原性大腸菌のDNAにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項1〜5のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、前記病原性大腸菌を検出する
ことを特徴とする病原性大腸菌の検出方法。
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