CN111549165A - 腐皮镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了腐皮镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地腐皮镰刀菌进行检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
腐皮镰刀菌(Fusarium solani)是植物根腐病的主要致病菌，主要对黄芪、丹参、甘草、板蓝根等产生危害。根腐病是一种真菌引起的植物病，该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。腐皮镰刀菌根据其形状、厚垣孢子和长管瓶的存在确定其为大分生孢子，然而形态学鉴定不能区分不同的生物物种和具有共同形态特征而基因多样的有丝分裂菌株，如若采用传统的鉴定方法，容易出现偏差，且耗时较长。
现有技术中，多重PCR检测腐皮镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其 PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR(实时荧光定量PCR)已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但腐皮镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如燕麦镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌。因此提供一种用于腐皮镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。
本发明的目的之二在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。
本发明的目的之三在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。
本发明的目的之四在于，提供一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明通过对NCBI数据库中腐皮镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用 Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测腐皮镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。
本发明所述的腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'。
本发明所述的腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如 SEQ IDNO:3所示：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。
ITS基因广泛存在于腐皮镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用腐皮镰刀菌ITS基因作为靶序列，合成了引物及探针。
本发明所述的腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物及探针组合，包括：
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
探针：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'。
本发明所述的一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，包括上述的引物、及探针。
本发明的技术方案中，该试剂盒还包括QPCR模板，该QPCR模板如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。
本发明的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 所示，具体为：
5’-GCCCTGTAACAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTTTT TATAATGTTTTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT GTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG-3’。
本发明的实施例中，该试剂盒还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
本发明的实施例中，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。
本发明所述的腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其包括：
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
探针：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；
模板：如SEQ ID NO:4所示；
优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
本发明所述的检测植物腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1.提取待测样品总DNA；
步骤2.制备反应体系，所述反应体系如上所述；
步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；
步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；
优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为 3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、 3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、 3.1×101copies/μL；
优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.1×1010copies/μL。
本发明的实施例中，PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性 10min，95℃15s、60℃1min并收集荧光信号，40个循环。
作为本发明的一个实施例，PCR反应体系为：
本发明的技术方案中，采用PCR技术扩增腐皮镰刀菌ITS基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-ITS，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为本发明方法的ITS基因标准品。
本发明中ITS基因标准品的制备方法包括：
S1.提取腐皮镰刀菌(标准菌株)基因组DNA，得到DNA样本，用作ITS 基因PCR扩增的模板；
S2.ITS基因片段的PCR扩增：选取扩增序列，设计PCR引物和探针，
S3.以S1得到的DNA样本为模板进行PCR扩增；而后对所得PCR扩增产物进行纯化；
S4.将S3得到的纯化后的PCR扩增产物与质粒载体PUC57进行连接；再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；
S5.挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒PUC57-ITS，用于菌液PCR鉴定和测序分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明选择包含高度保守、特异序列的腐皮镰刀菌ITS基因，构建出重组质粒PUC57-ITS，作为标准品；再进一步筛选出用于检测腐皮镰刀菌的荧光定量 PCR引物和探针。本发明的腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地腐皮镰刀菌进行检测。
附图说明
附图1为ITS基因扩增序列NCBI数据库blast比对结果图。
附图2为本发明上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果图。
附图3为标准品的标准曲线图。
附图4为本发明灵敏度实验结果图；其中a、b、c、d、e、f、g、h、i分别为不同质粒浓度的相对荧光值曲线。其中，a代表质粒浓度为3.1×109copies/μL、 b代表质粒浓度为3.1×108copies/μL、c代表质粒浓度为3.1×107copies/μL、d代表质粒浓度为3.1×106copies/μL、e代表质粒浓度为3.1×105copies/μL、f代表质粒浓度为3.1×104copies/μL、g代表质粒浓度为3.1×103copies/μL、h代表质粒浓度为3.1×102copies/μL、i代表质粒浓度为3.1×101copies/μL和阴性对照。
附图5为本发明特异性实验结果图。
附图6为本发明特异性实验凝胶成像验证图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例公开了本发明的ITS基因标准品的制备方法。
要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。ITS基因广泛存在于腐皮镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用腐皮镰刀菌ITS基因作为靶序列。本实施例主要采用PCR技术扩增腐皮镰刀菌ITS基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-ITS，并进行相应的PCR 鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板DNA的制备
提取腐皮镰刀菌(标准菌株)基因组DNA，用作ITS基因PCR扩增的模板。采用北京百泰克公司生产的真菌基因组提取试剂盒来提取，具体提取方法如下：
①取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液；
②加入550μL 65℃预热Buffer FP1和4μL RNaseA剧烈涡旋震荡混匀菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴1h，期间激烈涡旋震荡5-6次；
③加入130μL Buffer P2，充分混匀，12000rmp离心3min；
④小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要吸到界面物质，12000rmp离心 1min，收集下液；
⑤加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀；
⑥将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中，12000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液；
⑦加入700μL漂洗液WB，12000rmp离心1min，弃掉废液；
⑧加入500μL漂洗液WB，12000rmp离心1min，弃掉废液；
⑨将吸附柱AC放回空收集管中，12000rmp离心3-5min；
⑩取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL 洗脱缓冲液EB(在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rmp离心1min 收集DNA。
二、ITS基因片段的PCR扩增
1、引物的设计与合成
ITS鉴定是利用真菌ITS序列测序的方法对真菌进行种属鉴定。是一种快速获得真菌种属信息的方法。本发明利用实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌ITS 基因表达水平，明确ITS在腐皮镰刀菌检测中的意义及特异性。
本发明通过对NCBI数据库中腐皮镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR 引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
本发明选取的扩增序列SEQ ID NO:4所示，具体为：
>NR_163531.1Fusarium solani CBS 140079ITS region；from TYPE material
5’-TGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGG GATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTAAAAC GTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCTGTAACAACGGGCCGCCCCCGCCA GAGGACCCCTAACTCTGTTTTTATAATGTTTTTCTGAGTAAACAAGCAAAT AAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGG CAGAAGCCCCCTGTGGGCACACGCCGTCCCTCAAATACAGTGGCGGTCCC GCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGC GCGGCCATGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGG TAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAA CCAACAGGGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAA-3’
此序列通过对NCBI数据库blast结果显示见图1。
图1为NCBI数据库blast比对结果。
由图1可知：此序列对腐皮镰刀菌具有特异性。
该外围引物序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，具体为：
上游引物：Fusarium solani-43F 5'-CGGAGGGATCATTACCGAGTT-3'；
下游引物：Fusarium solani-437R 5'-TATTTGAGGGACGGCGTGTGC-3'。
扩增片段大小为：395bp。
2、PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述外围引物Fusarium solani-43F/Fusarium solani-437R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
其中引物采用Fusarium solani-43F/Fusarium solani-437R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为苏州百源基因技术有限公司ASA-4800PCR仪。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。取5μL扩增产物进行1％琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用上海生工公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
三、重组质粒PUC57-ITS的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与PUC57(武汉金开瑞生物工程有限公司)进行连接，采用如下连接体系进行配制：
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
2、PUC57-ITS质粒的转化以及PCR鉴定
①从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；
②取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中；
③42℃水浴中热休克90s，热休克后立即置冰上冷却30min；
④向1.5ml EP管中加入预冷的800μL的LB液体培养基(不含氨苄青霉素) 混匀后，37℃140rpm轻摇培养1h；
⑤将上述培养液8000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬吸收剩余涂布于含0.1ngAmp的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
⑥次日观察，从平板上挑取单克隆菌落于100μL LB液体培养基(含氨苄青霉素)的PCR管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
⑦用腐皮镰刀菌特异性引物Fusarium solani1F/Fusarium solani1R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
引物Fusarium solani1F/Fusarium solani1R序列如下：
上游引物；Fusarium solani1F 5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'
下游引物；Fusarium solani1R 5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'
扩增片段大小为：170bp。
上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果见图2
图2为上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果。
由图2可知：此对引物对腐皮镰刀菌具有特异性。
PCR反应体系如下：
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、67℃30s、72℃20s，30 个循环；72℃5min。
采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒PUC57-ITS，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
四、标准品的获取和定量
1、取步骤三得到的含有重组质PUC57-ITS的大肠杆菌DH5α100μL转种于 5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；
2、取1ml培养过夜的菌液转种于10ml LB液体培养基，200rpm增菌培养 2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；
3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计(ND5000) 对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度；
4、质粒PUC57-ITS浓度(拷贝数)计算
(1)质粒的分子量＝2930bp×660(每对碱基的平均分子量)
(2)测得质粒浓度为98ng/μL，质粒纯度A260/A280＝1.84，因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/μL。
质粒copies/μL＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数＝6.02×1023copies/mol。
因此提取的质粒浓copies/μL＝100×10-9ng/μL×6.02×1023copies/mol÷(2930bp×660g/bp·mol)＝3.1×1010copies/μL
10μL质粒加90μL的无菌水就得到浓度为3.1×109copies/μL的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
实施例2
本实施例公开了本发明的荧光定量PCR试剂盒包括以下组分：
预混液2×Probe Mix(为南京诺唯赞生物科技有限公司生产，全称为AceQ U+Probe Master Mix)。
终浓度为10μM的上游引物、终浓度为10μM的下游引物；
终浓度为10μM的探针；
实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为：3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、 3.1×106copies/μL、3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、 3.1×102copies/μL 3.1×101copies/μL)；
阳性对照：浓度为3.1×1010copies/μL的实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS；
ddH2O，ddH2O作为试剂和阴性对照使用。
上游引物：Fusarium solani1F 5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'
下游引物：Fusarium solani1R 5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'
探针：ITS 5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'。
所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为 BHQ。
本发明的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 所示，具体为：
5’-GCCCTGTAACAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTTTT TATAATGTTTTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT GTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG-3’；
试剂盒的使用方法如下：
1)提取待测样品总DNA；
2)将待测样品、系列浓度标准品样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
3)绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果。
实施例3
本实施例公开了采用实施例2的试剂盒绘制标准品的标准曲线。
以ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为： 3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、 3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、 3.1×101copies/μL)为模板，使用试剂盒中的引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照：浓度为3.1×1010copies/μL的实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS；
阴性对照：ddH2O。
PCR反应体系如下：
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃1min 并收集荧光信号，40个循环。
标准曲线的获得方法：以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以ct值为纵坐标得到标准曲线。标准曲线原始方程为y＝ax+b，本次标准曲线的方程为y＝-3.784x+44.87，标准曲线图如附图3所示。
由图3可知，标准品标准曲线光滑，相关系数高，具体为R2＝0.998，满足实时荧光定量PCR检测的要求。
实施例4
本实施例公开了本发明的实时荧光定量PCR试剂盒的性能实验
1、灵敏度实验
将实施例1制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、 3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、 3.1×101copies/μL和阴性对照为模板。反应体系如下：
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃1min 并收集荧光信号，40个循环。
根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果如附图4所示：数据显示当质粒浓度达到3.1×102copies/μL时依然有荧光信号，当质粒浓度达到3.1×101copies/μL时没有荧光信号。因此本发明方法的灵敏度为3.1×102copies/μL。
图4为本发明灵敏度实验结果。其中，a代表质粒浓度分别为3.1×109copies/uL、b代表质粒浓度为3.1×108copies/uL、c代表质粒浓度为3.1×107copies/uL、d代表质粒浓度为3.1×106copies/uL、e代表质粒浓度为3.1×105copies/uL、f代表质粒浓度为3.1×104copies/uL、g代表质粒浓度为3.1×103copies/uL、h代表质粒浓度为 3.1×102copies/uL、i代表质粒浓度为3.1×101copies/uL和阴性对照。
2、特异性实验
为了证实本发明对腐皮镰刀菌检测的特异性，我们选取了其他常见临床感染微生物特异性实验，选取的微生物包括：禾谷镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌。
该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA为模板进行的试验。上述微生物的DNA提取均采用北京百泰克生物技术有限公司DNA快速提取试剂盒，采用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的AceQ U+Probe Master Mix实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下：
其中的引物和探针为本发明实施例2中的引物和探针。
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃40s、 72℃20s并收集荧光信号，40个循环。
根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图5：以基因组DNA为模板仅腐皮镰刀菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表1所示。
表1
图5为本发明特异性实验结果。其中a标准扩增曲线为腐皮镰刀菌基因组， b代表未出现标准扩增曲线分别为禾谷镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌。
3、特异性实验凝胶成像验证图
为了证实本发明对腐皮镰刀菌检测的特异性，我们选取了其他常见植物感染微生物进行特异性实验，选取的微生物包括：禾谷镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌。
配制1％的琼脂糖胶检测腐皮镰刀菌特异性引物探针荧光定量结果。以特异性实验的扩增产物为模板。
结果如附图6所示：其中泳道DL2000的Marker、1-8依次为1：空白对照 (水)、2：阳性对照(腐皮镰刀菌)、阴性对照(3：链格孢菌、4：尖孢镰刀菌、 5：禾谷镰孢菌、6：拟枝孢镰刀菌、7：燕麦镰刀菌、8：灰葡萄孢)。
结果表明，采用本发明方法对腐皮镰刀菌检测具有特异性。
实施例5
本实施例公开了本发明的植物腐皮镰刀菌实时荧光定量PCR的定量检测方法：
分别以待测样品DNA和实施例1制备的ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为：3.1×109copies/uL、3.1×108copies/uL、3.1×107copies/uL、 3.1×106copies/uL、3.1×105copies/uL、3.1×104copies/uL、3.1×103copies/uL、 3.1×102copies/uL 3.1×101copies/uL)为模板，使用试剂盒中的引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。
PCR反应体系如下：
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃1min 并收集荧光信号，40个循环。绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值进行快速定量检测。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州百源基因技术有限公司
<120> 腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法
<130> 20200420
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaggacccc taactctgt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtgcgttc aaagattcga t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctcttggct ctggcatcg 19
<210> 4
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaagtaaa aagtcgtaac aaggtctccg ttggtgaacc agcggaggga tcattaccga 60
gttatacaac tcatcaaccc tgtgaacata cctaaaacgt tgcttcggcg ggaacagacg 120
gccctgtaac aacgggccgc ccccgccaga ggacccctaa ctctgttttt ataatgtttt 180
tctgagtaaa caagcaaata aattaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctggcatc 240
gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 300
aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca 360
ttacaaccct caggcccccg ggcctggcgt tggggatcgg cagaagcccc ctgtgggcac 420
acgccgtccc tcaaatacag tggcggtccc gccgcagctt ccattgcgta gtagctaaca 480
cctcgcaact ggagagcggc gcggccatgc cgtaaaacac ccaacttctg aatgttgacc 540
tcgaatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaaaagaaac 600
caacagggat tgccccagta acggcgagtg aa 632
<210> 5
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccctgtaac aacgggccgc ccccgccaga ggacccctaa ctctgttttt ataatgtttt 60
tctgagtaaa caagcaaata aattaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctggcatc 120
gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 180
aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg 220
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggagggatc attaccgagt t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tatttgaggg acggcgtgtg c 21
Claims (10)
1.腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'。
2.腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。
3.腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的引物及探针组合，其特征在于，包括：
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
探针：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'。
4.一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、及权利要求2所述的探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQID NO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。
8.一种腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
上游引物：5'-AGAGGACCCCTAACTCTGT-3'；
下游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
探针：5'-TCTCTTGGCTCTGGCATCG-3'；
模板：如SEQ ID NO:4所示；
优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
9.一种检测植物腐皮镰刀菌的RT-QPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.提取待测样品总DNA；
步骤2.制备反应体系，所述反应体系如权利要求8所述；
步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；
步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；
优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、3.1×101copies/μL；
优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.1×1010copies/μL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃1min并收集荧光信号，40个循环。
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