CN109777818B

CN109777818B - 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组ev71疫苗外源基因拷贝数的方法及方法的应用

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Publication number: CN109777818B
Application number: CN201910032000.2A
Authority: CN
Inventors: 张改梅; 顾美荣; 刘建凯; 朱征宇; 甘建辉; 郑海发
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Xintaikang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Xintaikang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-01-14
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2039-01-14
Also published as: CN109777818A

Abstract

本发明属于肠道病毒71型的制备技术领域，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用。本发明的标准质粒主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，便于绘制出对应的标准曲线，以供重组EV71疫苗外源基因的拷贝数采用Taqman探针‑荧光定量PCR的方法进行测定，能够简便快速、绝对定量、准确地对插入外源基因拷贝数进行分析，从而有效缩短了重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定的检测时间，便于多次重复操作。

Description

标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及方法的应用

技术领域

本发明属于肠道病毒71型疫苗的制备技术领域，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及方法的应用。

背景技术

手足口病(HFMD)是肠道病毒引起的常见传染病之一。5岁以下婴幼儿发病率最高，每年6～8月为流行季节，传播途径主要是呼吸道和经口感染。本病传染性强，传播途径广，传播快，流行强度大，在短期内即可造成大流行。肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CVA16)是本病的主要致病原。较CVA16而言，EV71则凶险得多，90％以上的重症病例和死亡病例都是由EV71病毒引起。

现有一种重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)(简称重组EV71疫苗)，该重组EV71疫苗是基于汉逊酵母平台，将EV71的基因片段P1和基因片段3CD通过重组技术随机整合于汉逊酵母的基因组中，形成重组基因组，其对应的汉逊酵母为重组汉逊酵母菌株。EV71的基因片段P1和基因片段3CD作为外源基因在重组汉逊酵母菌株的细胞基质内大量表达P1前体蛋白和3CD酶，其中3CD酶能对P1前体蛋白进行切割得到结构蛋白VP1-VP4，随后自组装得到肠道病毒71型无核酸的病毒样颗粒，最后再经提取、纯化等操作将该病毒样颗粒从重组汉逊酵母菌株中分离出，以便于制成相应的病毒样颗粒疫苗，相对于传统的EV71疫苗具有更加优良的免疫原性和生物安全性。

在制备重组EV71疫苗过程中，确定重组EV71疫苗中外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数对于细胞株的遗传稳定性及后期生产具有非常重要的意义。

现有技术中，确定基因拷贝数的分析通常采用印迹杂交(Southern blot)，但该方法费时费力，所用DNA样品量很大，通过颜色深浅判断拷贝数，主观判断性强，不同的操作人员可能结果会有较大差异，并且探针是通过放射性标记的，对人体也有害。

另一种确定拷贝数变化的分析则采用荧光定量PCR，该方法是一种基于PCR反应体系加入非特异性染料(SYBR-Green)或者荧光标记的特异性探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，从而获得不同样品达到一定的荧光信号(荧光阈值)时所需要的循环数(Ct值)。采用该方法测定基因的拷贝数时，需要先其将已知浓度标准品的Ct值与其初始浓度的对数绘制标准曲线，再将待测样品的Ct值代入，便可计算待测样品模板的初始浓度，具体反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰的特点，相对于印迹杂交法，能够较好的确定外源基因的拷贝数。由此可知，标准品是准确测定基因拷贝数的关键因素。

然而，在实际操作过程中，由于EV71的基因片段P1和基因片段3CD插入汉逊酵母基因组的具体数量为不定值，而在标准品的构建过程中需要明确外源基因P1和外源基因3CD具体插入汉逊酵母基因组中的数量，由此难以直接使用外源基因P1和外源基因3CD制备成相应的标准品。因此，急需研发一种标准品，使得重组EV71疫苗外源基因的拷贝数能够使用荧光定量PCR加以测定，以此有效提高测定重组EV71疫苗外源基因拷贝数的检测效率和精确度。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种标准质粒，其选取汉逊酵母基因组中的结构基因MOX作为单拷贝对照基因，构建出含有内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的标准质粒，以此能够明确外源基因P1和外源基因3CD插入汉逊酵母基因组中的具体数量，进而便于绘制出对应的标准曲线，以供重组EV71疫苗外源基因的拷贝数采用荧光定量PCR的方法进行测定。

本发明的第二个目的在于提供一种标准质粒的制备方法，其采用PCR扩增、双酶切以及转化培养的操作，便于标准质粒稳定的进行产业化，从而降低标准品的生产成本。

本发明的第三个目的在于提供一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法，其将本发明构建的标准质粒作为标准品，再采用荧光定量PCR法，以此绝对定量插入汉逊酵母基因组内的外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数，有效节省了测定重组EV71疫苗外源基因拷贝数的检测时间，具有操作简单，重复性好的特点。

本发明的第四个目的在于提供一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法的应用，其能够为菌株遗传稳定性研究和后续工艺研究提供有力的数据支撑，在基于汉逊酵母平台构建的重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传中得到良好的应用。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种标准质粒，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中构建而成，其涉及的引物对如下：

引物对1，

MOX-F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCT

MOX-R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA

引物对2，

EV71-P1-F1：GAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTC

EV71-P1-R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3，

EV71-3CD-F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGA

EV71-3CD-R1：AATGTCGACCTTACCAGACAGGTTCAGG。

进一步地，所述内源基因MOX如SEQ ID No.1所示，所示外源基因P1如SEQ ID No.2所示，所示外源基因3CD如SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述克隆载体包括pUC系列载体、pET系列载体和pGEX系载体中的一种。

进一步地，所述克隆载体为pUC18载体、pUC19载体、pET22b载体、pET28b载体、pET30a载体、pET32a载体、pGEX6P1载体中的一种。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种标准质粒的制备方法，包括以下步骤：

①、采用PCR扩增技术，以重组EV71疫苗基因组为模板，分别制备出内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD，再以扩增出的内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD为模板，扩增出依次串联的基因片段EV71-MOX-P1-3CD；

②、采用双酶切技术，对克隆载体和步骤①扩增得到的基因片段EV71-MOX-P1-3CD进行酶切，分别得到载体片段和目的片段；

③、将步骤②制得的载体片段和目的片段进行连接，得到重组质粒；

④、将步骤③得到的重组质粒转化至感受态细胞内，再将该感受态细胞涂布于对应的培养基中，于37℃恒温培养箱内培养，得到含有重组质粒的单克隆菌株；

⑤、采用PCR/双酶切及测序手段对步骤④得到的单克隆菌株加以鉴定；

⑥、对经步骤⑤鉴定通过的单克隆菌株进行扩增，随后用质粒提取试剂盒对该单克隆菌株中的重组质粒加以提纯，得到标准质粒；

⑦、将步骤⑥中提纯后的重组质粒进行浓度测定和质量控制，通过公式计算分别得到内源基因MOX、外源基因P1以及外源基因3CD的拷贝数。

进一步地，步骤④中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞，其对应的培养基为LB培养基。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法，包括以下步骤：

A、设计内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD对应的引物对和探针；

B、建立如下所示的Taqman-荧光定量PCR反应体系：

反应条件为：95℃5min；95℃10s；58℃15s循环45次；72℃20s；

C、建立标准曲线：

将所述的标准质粒作为模板，以等梯度倍数进行稀释，再按步骤②中的Taqman-荧光定量PCR反应体系测定各标准质粒的扩增曲线的CT值，以标准质粒的拷贝数作为横坐标，以标准质粒的CT值作为纵坐标，建立标准曲线；

D、待测样品的检测：

将待测样品用步骤B中建立的Taqman-荧光定量PCR反应体系进行检测，记录CT值，带入步骤C中建立的标准曲线中，计算得到内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD对应的拷贝数，再将外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数与内源基因MOX的拷贝数加以比较，得到外源基因P1和外源基因3CD在该待测样品基因组中的拷贝数。

进一步地，步骤A中，内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的引物对和探针的序列如下：

引物对1，pMOX-F：CTTCCTGTTGTGGACGACCT

pMOX-R：TGCTTGTTTCTCATAGTTGGG

引物对2，pEV71-P1-F：CTGGTGGTGCCAATCTC

pEV71-P1-R：GGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3，pEV71-3CD-F：CAACGAGAAGTTCAGAGACA

pEV71-3CD-R：CTTACCAGACAGGTTCAGG

探针1，pMOX：ACATCGCATGGTGCAGAGCACTGGC

探针2，pEV71-P1：CTGAGACAGGCCGTGACCCAGGGTT

探针3，pEV71-3CD：AGAACATCTCTACCGCCTCTGACGCCA。

进一步地，步骤C中，所述等梯度倍数依次为10⁸倍、10⁷倍、10⁶倍、10⁵倍、10⁴倍、10³倍、10²倍以及10倍。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法的应用，所述检测方法适用于基于汉逊酵母平台构建的重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过构建标准质粒，采用Taqman探针-荧光定量PCR法，简便快速、绝对定量、准确地对插入外源基因拷贝数进行分析，从而有效缩短了重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定的检测时间，便于多次重复操作。另外，该拷贝数的检测方法能够为菌株遗传稳定性研究和后续工艺研究提供有力的数据支撑，在基于汉逊酵母平台构建的重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传中得到良好的应用。

附图说明

图1为基因片段EV71-MOX-P1-3CD的设计思路图；

图2为标准质粒中MOX的扩增曲线；

图3为标准质粒中MOX的标准曲线、方程及相关系数R²；

图4为标准质粒中EV71-P1的扩增曲线；

图5为标准质粒中EV71-P1的标准曲线、方程及相关系数R²；

图6为标准质粒中EV71-3CD的扩增曲线；

图7为标准质粒中EV71-3CD的标准曲线、方程及相关系数R²。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明，需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件进行。

1、实施例1

1.1、内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的选择、PCR引物的设计以及重组质粒的构建

内源基因MOX为汉逊酵母基因组中的一个片段，具体为甲醇氧化酶基因，Genebank序列号：X02425，全长4235bp。由于其单拷贝的特点，在本发明中选用内源基因MOX作为外源基因P1和外源基因CD的内参物，本实施例具体选择内源基因MOX中的136bp(如SEQ ID No.1所示)作为标准质粒插入的片段，以此在保证该基因片段良好的特异性的同时，缩短标准质粒的长度。

外源基因P1和外源基因3CD分别为EV71基因组中的一个片段，外源基因P1全长为2586bp，外源基因3CD全长为1935bp，均为保持氨基酸序列不变的前提下，经过了偏爱密码子优化(具体详见专利“一种EV71病毒样颗粒及其制备方法与应用”公告号为CN103255163B)。本实施例分别选取外源基因P1中的214bp(如SEQ ID No.2所示)和外源基因3CD中的154bp(如SEQ ID No.3所示)作为标准质粒插入的片段，以便于对外源基因P1和外源基因3CD构建其对应的标准曲线。

为将内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD三个基因片段通过PCR串联在一起，设计如下引物对：

引物对1：

MOX-F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCT

MOX-R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA

引物对2：

EV71-P1-F1：TGAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTC

EV71-P1-R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3：

EV71-3CD-F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGA

EV71-3CD-R1：AATGTCGACCTTACCAGACAGGTTCAGG。

其中，MOX-R1、EV71-P1-F1、EV71-P1-R1、EV71-3CD-F1引物分别选取内源基因MOX与外源基因P1连接处的15bp基因片段以及外援基因P1与外源基因3CD连接处的15bp基因片段，得到依次串联的基因片段EV71-MOX-P1-3CD，设计思路图如图1所示。

另外，为基因片段EV71-MOX-P1-3CD与克隆载体进行双酶切连接，故在MOX-F1和EV71-3CD-R1分别添加相应的酶切位点。其中，本实施例中的克隆载体选用pGEX6P1载体，双酶切的酶使用EcoR I和Sal I，进而构建出重组质粒。

1.2、重组质粒的制备

1.2.1、PCR获得串联EV71-MOX-P1-3CD产物

①、以汉逊酵母基因组为模板，分别以MOX-F1和MOX-R1为引物，进行PCR扩增，获得内源基因MOX(SEQ ID No.1)；

②、以重组EV71基因组为模板，分别以EV71-P1-F1和EV71-P1-R1、EV71-3CD-F1和EV71-3CD-R1为引物，进行PCR扩增，获得外源基因P1(SEQ ID No.2)和外源基因3CD(SEQ IDNo.3)；

③、建立如下表一所示的PCR反应体系，步骤①和步骤②中的PCR扩增按表一中的PCR反应体系进行操作；

表一 PCR反应体系

④、将PCR扩增内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD以1％琼脂糖电泳进行检测，内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD对应PCR产物的大小分别为136bp、247bp和175bp；

⑤、将经步骤④检测通过的内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD用PCR产物纯化试剂盒(购自北京金螺旋生物科技中心)进行纯化；

⑥、分别取步骤⑤中纯化好的外源基因P1和外源基因3CD各1μL作为模板，以引物EV71-P1-F1和EV71-3CD-R1进行PCR扩增获得基因片段EV71-P1-3CD(SEQ ID No.4)，该PCR扩增按步骤③中的PCR反应体系进行操作；

⑦、分别取步骤⑤中纯化好的内源基因MOX和步骤⑥中制得基因片段EV71-P1-3CD各1μL作为模板，以引物MOX-F1和EV71-3CD-R1进行PCR扩增获得基因片段EV71-MOX-P1-3CD(SEQ ID No.5)，该PCR扩增按步骤③中的PCR反应体系进行操作；

⑧、将步骤⑦制得的基因片段EV71-MOX-P1-3CD用DNA片段纯化试剂盒(购自北京金螺旋生物科技中心)进行纯化。

1.2.2、双酶切反应

将步骤1.2.1⑦中纯化好的基因片段EV71-MOX-P1-3CD以及pGEX6P1载体分别按下表二中的双酶切反应体系进行双酶切(EcoR I和Sal I)，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，用DNA片段纯化试剂盒(购自北京金螺旋生物科技中心)纯化得到pGEX6P1载体片段以及内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD三个目的片段。

表二双酶切反应体系

1.2.3、载体片段和目的片段的连接反应

将步骤1.2.2中制得的pGEX6P1载体片段以及内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD三个目的片段用Solution I连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，再用DNA片段纯化试剂盒(购自北京金螺旋生物科技中心)纯化后得到重组质粒，连接反应体系如下表三所示。

表三连接反应体系

1.2.4、重组质粒转化

将步骤1.2.3中得到的重组质粒转化到100μL的大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中，随后将该感受态细胞涂布在LB+Amp(100μg/mL)固体培养基中，于37℃培养箱过夜培养，得到含有重组质粒的单克隆菌株。

1.2.5、鉴定重组质粒

①、挑取步骤1.2.4的LB+Amp(100μg/mL)固体培养基上的单克隆菌株作为模板，分别以引物MOX-F1、EV71-3CD-R1进行PCR鉴定转化克隆，PCR反应体系如下表四；

表四 PCR反应体系

②、将PCR扩增的DNA片段以1％琼脂糖电泳进行检测，PCR产物大小约应为560bp左右；

③、选取3-5个经步骤②PCR鉴定正确的单克隆菌株，将其接种到10mL的LB+Amp(100μg/mL)液体培养基中，于37℃摇床200rpm/min过夜培养，得到单克隆菌种液；

④、将步骤③得到的单克隆菌种液委托测序(引物为通用引物T7)；将测序正确的单克隆菌种添加10-30％的甘油，按1.0mL/支，分装后保存于-60℃以下，将该单克隆菌种命名为pEV71-MOX-P1-3CD-5。

1.3、荧光定量PCR方法的建立

1.3.1、引物对和探针的设计与合成

以步骤1.1中筛选得到的内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD为参照物，设计其对应的荧光定量PCR用的引物对和探针。其中，探针位于普通引物(本实施例中为通用引物T7)之间，5’端添加FAM标记。内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的引物对和探针的序列如下：

引物对1，pMOX-F：CTTCCTGTTGTGGACGACCT

pMOX-R：TGCTTGTTTCTCATAGTTGGG

引物对2，pEV71-P1-F：CTGGTGGTGCCAATCTC

pEV71-P1-R：GGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3：pEV71-3CD-F：CAACGAGAAGTTCAGAGACA

pEV71-3CD-R：CTTACCAGACAGGTTCAGG

探针1，pMOX：ACATCGCATGGTGCAGAGCACTGGC

探针2，pEV71-P1：CTGAGACAGGCCGTGACCCAGGGTT

探针3，pEV71-3CD：AGAACATCTCTACCGCCTCTGACGCCA。

1.3.2、标准曲线的建立

1.3.2.1、重组质粒的浓度测定、质量控制及拷贝数确定

①、将步骤1.2.5④中冻存的单克隆菌种接种至LB+Amp(100μg/mL)液体培养基中活化后，于37℃培养箱中150rpm/min培养过夜，以此进行扩增；

②、收集步骤①中扩增的单克隆菌种液，用质粒提取试剂盒(购自sigma-aldrich)提纯质粒，得到重组质粒，即为标准质粒；

③、用Thermofisher微量核酸浓度测定仪将步骤②中制得的标准质粒进行浓度测定及质量控制，测得该标准质粒的浓度为98ng/μL；

④、根据公式分别计算出标准质粒的拷贝数，公式如下：

每μL质粒拷贝数＝(质量/分子量)×(6.02×10²³)＝[质粒浓度(ng/μL)×1μL]×10^-9/[(质粒分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×10²³)；

拷贝数结果如下表五。

表五标准质粒中内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数

基因名称	拷贝数
		外源基因P1	1.60*10<sup>19</sup>
外源基因3CD	1.60*10<sup>19</sup>
		内源基因MOX	1.60*10<sup>19</sup>

1.3.2.2、Taqman-荧光定量PCR反应体系的建立

采用宝生物工程(大连)生产试剂盒Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)，Bulk内反应体系配置，以内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD作为DNA模板，分别对DNA模板浓度、探针浓度进行优化研究，经优化后的反应体系如下表六。

表六 Taqman-荧光定量PCR反应体系

1.3.2.3、标准曲线的建立

将步骤1.3.2.1②中得到的标准质粒作为模板，以10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10倍梯度稀释，按步骤1.3.2.2中优化后的Taqman-荧光定量PCR反应体系在ABI7500荧光定量PCR仪上扩增检测，每份模板重复三次，根据所得的扩增曲线的CT值建立相应的标准曲线。

其中，质粒标准品中内源基因MOX的扩增曲线如图2所示，其对应的标准曲线、方程及相关系数R²如图3所示；质粒标准品中外源基因P1的扩增曲线如图4所示，其对应的标准曲线、方程及相关系数R²如图5所示；质粒标准品中外源基因3CD的扩增曲线如图6所示，其对应的标准曲线、方程及相关系数R²如图7所示。

1.4、重组EV71疫苗(汉逊酵母)菌种外源基因拷贝数的测定

1.4.1、基因组提取

①、取本公司自行研发的重组EV71疫苗(汉逊酵母)的原始种子批菌种、主种子批菌种、工作种子批菌种以及原始种子批菌种传20代菌种，将各菌种分别接种于10mL的YPD液体培养基中，于37℃200rpm/min过夜培养，6000rpm/min离心，收集原始种子批菌种、主种子批菌种、工作种子批菌种以及原始种子批菌种传20代菌种对应的菌体；

其中，本发明中的重组EV71疫苗(汉逊酵母)的原始种子批菌种的制备方法具体详见专利“一种EV71病毒样颗粒及其制备方法与应用”公告号为CN103255163B，主种子批菌种、工作种子批菌种以及原始种子批菌种传20代菌种均在该原始种子批的基础上按常规技术手段获得；

②、通过玻璃珠破碎法分别提取步骤①收集的原始种子批菌种、主种子批菌种、工作种子批菌种以及原始种子批菌种传20代菌种的基因组，得到对应菌种的待测样品基因组，使用Thermofisher微量核酸浓度测定仪对各菌种的待测样品基因组进行浓度测定和质量控制，要求核酸浓度大于20ng/μL，且260/280nm比值在1.7-1.9之间，各菌种的浓度和质量控制情况参见下表七；

表七不同菌种的浓度和质量控制情况

③、取适量步骤②检测合格的一定浓度的待测样品基因组，将其稀释到同等浓度20ng/μL，于-20℃以下保存。

1.4.2、荧光定量PCR法测定外源基因P1和3CD的拷贝数

①、以步骤1.4.1③制得的原始种子批菌种、主种子批菌种、工作种子批菌种以及原始种子批菌种传20代菌种的待测样品基因组作为模板，每个样品DNA设置3个重复，采用步骤1.3.2.2优化的Taqman-荧光定量PCR反应体系，进行拷贝数测定，记录CT值；

②、将步骤①测得的CT值带入步骤1.3.2.3建立的标准曲线中，计算得到内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD对应的拷贝数；

③、将步骤②检测得到的拷贝数代入如下计算公式中，计算外源基因P1和外源基因3CD在该待测样品基因组中的拷贝数，外源基因P1拷贝数和外源基因3CD拷贝数的结果参见下表八，具体计算公式如下：

外源基因P1的拷贝数＝检测得到的外源基因P1的拷贝数/检测得到的内源基因MOX的拷贝数；

外源基因3CD的拷贝数＝检测得到的外源基因3CD的拷贝数/检测得到的内源基因MOX的拷贝数。

表八不同菌种的外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数

名称	P1	3CD
			原始菌种	10.08±0.66	3.42±0.35
主种子批	10.50±0.83	3.28±0.39
			工作种子批	10.18±1.08	2.90±0.36
原始菌种传20代菌种	11.07±0.54	3.28±0.27
			平均值	10.46	3.22
CV(％)	7.6	9.6

参见表八，本发明使用的重组EV71疫苗(汉逊酵母)菌种中，外源基因P1的拷贝数在10个左右，不同待测样品基因组之间的变异系数(CV)为7.6％；外源基因3CD拷贝数在3个左右，不同待测样品基因组之间的变异系数(CV)为9.6％。由此，一方面能够表明本发明中的重组EV71疫苗(汉逊酵母)菌种具有良好的遗传稳定性；另一方面又能表明采用Taqman探针-荧光定量PCR适用于重组EV71疫苗(汉逊酵母)外源基因拷贝数的测定研究以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传的应用。

实施例2：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pUC18载体，感受态细胞为TOP10感受态细胞。

实施例3：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pUC18载体，感受态细胞为JM109感受态细胞。

实施例4：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pET22b载体，感受态细胞为Trans10感受态细胞。

实施例5：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pET28b载体，感受态细胞为DH5α感受态细胞。

实施例6：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pET30a载体，感受态细胞为DH5α感受态细胞。

实施例7：与实施例1的不同之处在于，本实施例中的克隆载体选用pET32a载体，感受态细胞为TOP10感受态细胞。

对实施例2-实施例7中各标准质粒对应的标准曲线如下表九所示；实施例2-实施例7使用该标准质粒测定与实施例1相同的重组EV71疫苗(汉逊酵母)的外源基因的拷贝数，其外源基因P1和外源基因3CD的检测结果如下表十所示。

表九实施例2-实施例7中标准质粒的标准曲线

表十实施例2-实施例7中外源基因的拷贝数平均值和变异系数

参见表九和表十，实施例2-实施例7中标准质粒的标准曲线和实施例1相近，其中实施例2-实施例7的标准曲线的R²＞0.997，因此具有良好的线性关系，而实施例1的R²＞0.999，因此实施例1的标准质粒具有更好的线性关系。另外，实施例2-实施例7中外源基因P1的拷贝数约为10，外源基因3CD的拷贝数约为3，与实施例1测定的结果一致，而实施例1中外源基因P1和外源基因3CD的变异系数(CV)小于实施例2-实施例7测定的结果，由此，在实施例1-实施例7中，实施例1为优选实施例。

综上，本发明通过构建标准质粒，采用Taqman探针-荧光定量PCR法，简便快速、绝对定量、准确地对插入外源基因拷贝数进行分析，从而有效缩短了重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定的检测时间，便于多次重复操作，能够较好的适用于基于汉逊酵母平台构建的重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传中的应用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 深圳鑫康泰生物科技有限公司

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

ttcctgttgt ggacgacctg gaggacttca agacatcgca tggtgcagag cactggctga 60

agtggattaa cagggacctg ggtagaagat ccgactctgc gcacgcctac atccacccaa 120

ctatgagaaa caagca 136

<210> 2

<211> 214

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ctggtggtgc caatctctcc actggactac gaccagggtg ccaccccagt gatcccaatc 60

accatcaccc tggccccaat gtgctctgag ttcgccggtc tgagacaggc cgtgacccag 120

ggtttcccaa ccgagctgaa gccaggtacc aaccagttcc tgaccaccga cgacggtgtg 180

tctgccccaa tcctgccaaa cttccaccca accc 214

<210> 3

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

caacgagaag ttcagagaca tcaccaagtt catcccagag aacatctcta ccgcctctga 60

cgccaccctg gtgatcaaca ccgagcacat gccatctatg ttcgtgccag tgggtgacgt 120

ggtgcagtac ggtttcctga acctgtctgg taag 154

<210> 4

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ctggtggtgc caatctctcc actggactac gaccagggtg ccaccccagt gatcccaatc 60

accatcaccc tggccccaat gtgctctgag ttcgccggtc tgagacaggc cgtgacccag 120

ggtttcccaa ccgagctgaa gccaggtacc aaccagttcc tgaccaccga cgacggtgtg 180

tctgccccaa tcctgccaaa cttccaccca accccaacga gaagttcaga gacatcacca 240

agttcatccc agagaacatc tctaccgcct ctgacgccac cctggtgatc aacaccgagc 300

acatgccatc tatgttcgtg ccagtgggtg acgtggtgca gtacggtttc ctgaacctgt 360

ctggtaag 368

<210> 5

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

ttcctgttgt ggacgacctg gaggacttca agacatcgca tggtgcagag cactggctga 60

agtggattaa cagggacctg ggtagaagat ccgactctgc gcacgcctac atccacccaa 120

ctatgagaaa caagcactgg tggtgccaat ctctccactg gactacgacc agggtgccac 180

cccagtgatc ccaatcacca tcaccctggc cccaatgtgc tctgagttcg ccggtctgag 240

acaggccgtg acccagggtt tcccaaccga gctgaagcca ggtaccaacc agttcctgac 300

caccgacgac ggtgtgtctg ccccaatcct gccaaacttc cacccaaccc caacgagaag 360

ttcagagaca tcaccaagtt catcccagag aacatctcta ccgcctctga cgccaccctg 420

gtgatcaaca ccgagcacat gccatctatg ttcgtgccag tgggtgacgt ggtgcagtac 480

ggtttcctga acctgtctgg taag 504

Claims

1.一种标准质粒，其特征在于，由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中构建而成，其涉及的引物对如下：

引物对1，

MOX-F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCT

MOX-R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA

引物对2，

EV71-P1-F1：TGAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTC

EV71-P1-R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3，

EV71-3CD-F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGA

EV71-3CD-R1：AATGTCGACCTTACCAGACAGGTTCAGG

所述内源基因MOX如SEQ ID No.1所示，所述外源基因P1如SEQ ID No.2所示，所示外源基因3CD如SEQ ID No.3所示；所述克隆载体选自pUC系列载体、pET系列载体和pGEX系载体中的一种。

2.根据权利要求1所述的标准质粒，其特征在于，所述克隆载体为pUC18载体、pUC19载体、pET22b载体、pET28b载体、pET30a载体、pET32a载体、pGEX6P1载体中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的标准质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的标准质粒的制备方法，其特征在于，步骤④中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞，其对应的培养基为LB培养基。

5.一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

B、建立如下所示的Taqman-荧光定量PCR反应体系：

Premix Ex Taq 2x 10 μL

ROX Reference Dye 50x 0.04 μL

probe 0.1 μL

引物F、R 10 μM 各0.2 μL

RNase-free water 8.96 μL

cDNA 0.5 μL

反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s；58℃ 15s 循环45次；72℃ 20s；

C、建立标准曲线：

将权利要求1-4中任意一项所述的标准质粒作为模板，以等梯度倍数进行稀释，再按步骤②中的Taqman-荧光定量PCR反应体系测定各标准质粒的扩增曲线的CT值，以标准质粒的拷贝数作为横坐标，以标准质粒的CT值作为纵坐标，建立标准曲线；

D、待测样品的检测：

将待测样品用步骤B中建立的Taqman-荧光定量PCR反应体系进行检测，记录CT值，代入步骤C中建立的标准曲线中，计算得到内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD对应的拷贝数，再将外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数与内源基因MOX的拷贝数加以比较，得到外源基因P1和外源基因3CD在该待测样品基因组中的拷贝数。

6.根据权利要求5所述的一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法，其特征在于，步骤A中，内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的引物对和探针的序列如下：

引物对1，pMOX-F：CTTCCTGTTGTGGACGACCT

pMOX-R：TGCTTGTTTCTCATAGTTGGG

引物对2，pEV71-P1-F：CTGGTGGTGCCAATCTC

pEV71-P1-R：GGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物对3，pEV71-3CD-F：CAACGAGAAGTTCAGAGACA

pEV71-3CD-R：CTTACCAGACAGGTTCAGG

探针1，pMOX：ACATCGCATGGTGCAGAGCACTGGC

探针2，pEV71-P1：CTGAGACAGGCCGTGACCCAGGGTT

探针3，pEV71-3CD：AGAACATCTCTACCGCCTCTGACGCCA。

7.根据权利要求5所述的一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法，其特征在于，步骤C中，所述等梯度倍数依次为10⁸倍、 10⁷倍、10⁶倍、10⁵倍、10⁴倍、10³倍、10²倍以及10倍。

8.根据权利要求5所述的一种检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法的应用，其特征在于，所述检测方法适用于基于汉逊酵母平台构建的重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定以及重组EV71疫苗外源基因稳定遗传的应用。