CN111876504A - 一种大肠杆菌o157核酸检测质粒dna参考样品、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于不同大肠杆菌O157菌株的uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因的片段插入质粒中形成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，各基因以1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的udiA、rf bE、flicH7、Stx1、Stx2、eaeA六种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用。
背景技术
大肠杆菌O157在世界范围内引起广泛的食物中毒，而大肠杆菌O157的诊断需要多种信息，例如基因型，侵袭和毒力等。但是，诸多检测需要的靶基因并不是均匀的分布在单一菌株中。在实际操作中，如果需要同时检测多个基因，或者就多个基因的检测能力在不同的实验室之间进行能力评价，则需要使用多个菌株的基因组分别制备多条标准曲线进行定量分析。鉴于生物检测受到质量控制和数量可追溯性的总体水平的限制，能够涵盖广泛的检测靶标，并且具有量值和序列可追溯性的参考品符合实际需求。
rfbE基因编码大肠杆菌O157的表面抗原。flicH7是编码H7型抗原的特定基因，H7型抗原是大肠杆菌的鞭毛抗原的53种类型之一。靶向rfbE基因可以确定测试菌株是否为O157，而检测flicH7可以确定该菌株是否携带H7型鞭毛抗原。eaeA，stx1和stx2基因是大肠杆菌O157的重要毒力基因，并且是判断菌株致病性的重要依据。Schmidt等人根据不同的毒力基因将大肠埃希氏菌eO157血清群分为三个不同的病原体组：1.具有stx和eaeA的O157：H7和O157：H菌株组；2.具有几种不同的H抗原的O157大肠菌表达K88菌毛并产生肠毒素；3.Stx阴性，与eaeA基因和EPEC粘附因子(EPEC粘附因子，EAF)有关，与婴儿腹泻有关。通过一系列毒力，鞭毛和H表面抗原基因的检测，可以对大肠杆菌O157进行致病性分类。
目前，试剂盒中包含的用作实时定量PCR的质量控制品有临床阳性样本、提取的基因组、自行开发的DNA分子或阳性参考品等。临床阳性样品不容易获得，并且缺乏稳定性和安全性。从单一菌株提取的基因组参考品(gDNA)通常不能均匀覆盖所有检测目标，在量值上也不能稳定溯源。自行开发的DNA参考仅包含单个基因的小片段，并且不具有不同试剂盒的兼容性。
质粒DNA参考品(pDNA)是一种新兴的生物参考品，具有纯度高，稳定性好，开发成本低的优点。它不仅可以用作核酸检测的定性阳性对照，还可以用作定量标准。质粒DNA标准在核酸检测的可追溯性过程中也起着关键作用。依靠发达的合成平台，可以容易地从生物技术公司设计和制备各种长度的双链DNA片段，并应用于广泛的基因工程研究。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品，采用包含来源于不同大肠杆菌O157菌株的uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7全长基因的片段插入质粒中形成；
所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因以1:1比例串联；
所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因间以不相关的基因片段进行隔开。
进一步地，所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。
进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。
本发明还提供一种所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：
人工合成大肠杆菌O157基因udia、rfbE、flicH7、stx1、stx2、eaeA，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；
合成后克隆插入质粒中，经大肠杆菌扩增后，提取并提纯质粒；
测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品。
进一步地，所述质粒为pUC57载体质粒。
进一步地，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。
本发明还提供一种所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品在检测大肠杆菌O157中的应用。
进一步地，在进行大肠杆菌O157检测时，所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明的用于检测大肠杆菌O157的参考品针对生物制品成品、中间品及其原料中大肠杆菌O157 udia、rfbE、flicH7、stx1、stx2、eaeA六种检测基因的检测，提供统一参考品。
(2)相对于现有的大肠杆菌基因组参考品，所有遗传信息只来源于单一菌株，而单一菌株往往未能包含所有的待检测靶标，所包含的检测靶标无法进行定量分析的情况，本参考品所包含明确的udia、rfbE、flicH7、stx1、stx2、eaeA六种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价的参考品。
(3)本发明的用于检测大肠杆菌O157的参考品经测序检测其基因序列，明确物种是大肠杆菌O157，而后经三家以上实验室协作标定确定参考品的量值，并研究其均一性，稳定性等信息；参考品序列、均一性稳定性等信息均有明确信息。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157的图谱；
图2为质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157电泳分析结果，其中，Marker为DNAmarker DL15000；Lane 1为质粒DNA标准物质hindⅢ酶切后的产物；
图3为质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157建立的实时荧光PCR标准曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
发明历程
为了鉴定Ecoli O157细菌，发明人发现，除了对uidA、rfbE和flicH7检测来确定大肠杆菌的型别外，还需要检测多个毒力基因，例如Stx1、Stx2、escV和eaeA，但有些菌株仅携带Stx1基因，有些菌株仅携带Stx2基因，或eaeA缺陷。由于制备过程复杂且评估的不确定性，含有多种侵入性和毒性基因的致病核酸参考材料(定量和定性检测)基本上是空白的。在实际的检测和实验室能力评估中，经常需要使用几种不同菌株的基因组作为参考材料，这增加了操作的难度和强度，因此，期望包含上述所有成分的核酸参考材料基因将用作检测参考。
人工DNA合成技术为参考物质的制备提供了新思路。在这项研究中，通过人工合成获得了完整的基因，模拟了这些基因在自然条件下的完整形态，并将结构基因串联起来以实现涵盖多个检测目标基因的质量标准参考。以期获得具有广泛的适用性(涵盖基因型、毒力和侵袭性鉴定)的检测核酸参考品。
本发明旨在制备一个质粒DNA参考样品，其中包含大肠杆菌O157的6个代表性的全长结构基因序列(udiA，rfbE，flicH7，Stx1，Stx2和eaeA)，提高大肠杆菌qPCR检测的质量控制和实验室之间结果的可比性，以期通过提供可追溯有效的参考材料来解决病原核酸检测能力快速发展与缺乏参考材料之间的矛盾。
实施例1质粒的合成、片段设计和克隆
1.片段设计
序列来源大肠杆菌O157的uidA(GenBank：JQ068101.1)，eaeA(Gen Bank：AJ579305.1)，Stx1(GenBank：FR875155.1)，Stx2(GenBank：AB030484.1)，rfbE(GenBank：JQ907523.1)，flicH7(GenBank：LT717488.1)。单个基因的核酸序列可从NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nihgov/nucleotide))下载，并通过序列比对保证选取基因具有明确的代表性和通用性；
2.质粒的构建
将六个基因以1：1的比例串联在一起(以不相关的基因片段aagtcg隔开)，通过全基因人工合成的方法(由上海吉玛生物科技工程有限公司负责进行)并克隆到pUC57中以形成重组质粒(化学合成的双链DNA片段的长度为5691bp，整个质粒的长度酶切和测序鉴定重组质粒，扩增纯化后用于进一步实验，如图1所示。
3.质粒的鉴定：
质粒提取纯化后(质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，经酶切鉴定和测序证实，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，重组质粒中插入片段的序列准确度为100％，符合预期，命名为pDNA Ecoli O157。由此，获得了高纯度的质粒DNA标准物质。
4.质粒的纯化
琼脂糖凝胶电泳鉴定pDNA的纯度：将获得的质粒DNA标准物质pDNAEcoli O157用限制性内切酶HindⅢ消化成线性片段后，进行琼脂糖凝胶电泳分析(参见《分子克隆实验指南》第4版第5章，萨姆布鲁克，2013，科学出版社)。取10μL酶切液上样，用1％(w/w)琼脂糖胶电泳，电压80～120V，20min，电泳后凝胶成像分析DNA条带，结果如图2所示。结果显示条带清晰，无RNA、蛋白质污染，证明质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157纯度优良。
紫外分光光度法鉴别质粒DNA标准物质纯度：将获得的质粒DNA标准物质pDNAEcoli O157进行紫外光谱扫描，结果表明，pDNA的A260/A280比例为1.872±0.26，超过1.8，A260/A230的比例为2.16±0.31，超过2.0，表明pDNA溶液中无乙醇，蛋白质或RNA污染，符合核酸参考物质的标准。
实施例2均一度、定值和保存期的测定
1.pDNA均一性的判定
均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。均匀性良好的质粒DNA标准物质，其量值不会受到分装等因素的影响，才能保证了检测结果的可靠性。为了满足国家标准材料技术规范的要求，本发明使用紫外法(最小采样量为1μL)分析pNDA的瓶间均匀度和瓶内均匀度，并通过F检验对数据进行了分析。
1)瓶间均匀度取样方法：为了进行瓶间均质性测试，随机选择10管pDNA，并用UV重复测量每管中提取的1μL样品3次，取平均值。
2)瓶内均匀度取样方法：随机选择9管pDNA，并从每管样品的上层，中层和下层提取1μL测试样品，根据方差分析(F-检验)。
3)检测方法：紫外分光光度法用于定量样品DNA含量。
4)检测结果：通过方差分析(F-检验法)分析测量结果并进行判断。统计分析结果表明，在95％置信水平下，F检验在此基础上，判断pDNA的性质值在瓶内和瓶间均质性上无显着差异，表明该pDNA满足qPCR的参考材料。具体的统计数据在表1中示出。
表1 pDNA Ecoli O157均质性统计分析结果
2.pDNA的稳定性
最常见的长期稳定保存条件之一是在-20℃的温度下作为核酸参考物质的特异保存条件。因此，pDNA Ecoli O157样品在保存条件下的紫外光谱监测时间长达12个月。
1.为了进行稳定性研究，制备了以下的批量DNA制剂：
将pDNA Ecoli O157(在TE缓冲液中：10mM Tris–HCl[pH 8.0]和1mM乙二胺四乙酸[EDTA])储存在-20℃以便长期保存。每个样品都包含足够的DNA，浓度为30μg/ml(由260nm的UV吸光度确定)。使用260nm处的吸光度对所有DNA制备物进行定量，并使用260/280和260/230nm处的吸光度比率对可能的污染物进行表征。
2.取样：在实施例1制备的质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157制备完成后的一年内每月一次对制备的质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157(在-20℃下保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。
3.统计分析：根据ISO指南35(https：//www.iso.org/standard/60281.html)使用该数据评估长时间保存的稳定性。直线斜率可用下式计算：
式中：Xi-第i个时间点；Yi-第i个时间点的观测值；
-所有时间点的平均值；
-所有观测值的平均值。
截距可由下式计算：
直线上每点的标准偏差可用下式计算：
式中：Xi-第i个时间点；Yi-第i个时间点的观测值；β1，β0-回归系数；n-测量系数。β1的标准偏差由下式给出：
基于β1的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β1|<t0.95,n-2·s(β1)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。
经统计学分析，结果表明|β1|＜t0.95，n－2·S(β1)，结果显示斜率不显著，如表2所示，表明质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157在规定时间内无明显的上升或下降趋势，且变化范围均在特性量值及其不确定度的范围内。
表2 pDNA Ecoli O157长期保存稳定性分析结果
3.pDNA的定值
1)8个实验室用UV方法共同测定pDNA Ecoli O157量值；
2)通过统计检查确认每组数据没有异常值和显着差异：汇总全部原始数据，用偏态系数和峰态系数法检验得知全部原始数据符合正态分布；
3)将8个平均值再次计算平均值，求出质粒DNA标准物质pDNA Ecoli O157的总平均值为30.27μg/ml，即为质粒DNA标准物质pDNA EcoliO157的标准值(单位：μg/ml)。
4)根据各质粒分子的分子量，计算得出质粒DNA标准物质，下式用于计算每微升pDNA Ecoli O157的拷贝数。
pDNA Ecoli O157的拷贝数为3.29×109copies/μl。
4.pDNA的不确定性分析
pDNA的不确定度包括来自于分装引入的不确定度(uh)、长期保存稳定性引入的不确定度(us)、定值时引入的不确定度(uq)。
1)分装引入不确定度(uh)的计算：利用瓶间均匀性数据进行分装引入的不确定度的计算；
根据以下公式计算pDNA Ecoli O157的分装引起的不确定性(uh)：
Q1(组间方差之和)是22.72；Q2(组内方差之和)是139.98；v1是9组之间的自由度；v2是20组内的自由度；
最终计算得出的分装引入的不确定度为1.22μg/mL，相对不确定度为4.03％。
2)长期保存稳定性引入的不确定度(us)根据以下公式计算pDNA Ecoli O157在12个月内的长期稳定性引起的不确定性(us)：
us＝S(β1)×N；
S(β1)是稳定性线性模型中斜率的标准偏差，S(β1)＝0.055；N是稳定性评估的时间，N＝12个月；
最终计算得出的稳定性不确定度为0.673μg/mL，相对不确定度为2.23％。
3)定值时引入的不确定度(uq)的计算：
参考ISO指南35，对pDNA的不确定度进行评估。
因此，根据统计公式计算出的不确定度(uq)根据以下公式计算：
s为2.11μg/mL的总平均值的标准偏差；p为实验数量8。
最终统计方法计算出的不确定度为0.169μg/mL,相对不确定度为0.55％。
4)综合不确定度的计算：
质粒DNA参考物质的不确定度主要来源于三部分，第一部分是由不均匀性带来的不确定度(uh)，第二部分是长期保存稳定性引入的不确定度(us)，第三部分即定值时由定值方法和仪器引入的不确定度(uq)。经统计计算，质粒DNA参考材料的相对不确定度成分为：均质性(urh)引起的相对不确定度4.03％，有效期内变异性引起的相对不确定度(urs)2.23％，定量过程引入的相对不确定度(urq)0.55％。然后按照以下公式计算参考物质的标准不确定度(Ucrm)：
计算扩展不确定度时，应将标准不确定度乘以包含因子(k)。所以，扩展相对不确定度计按以下公式计算：
U＝Ucrm*k
结果表明：标准不确定度1.4023μg/ml。扩展不确定度为2.8046μg/ml实施例3荧光定量标准曲线的制备
1.对pDNA进行倍比稀释
通过A260提取pDNA参考品并进行定量，基于8401bp估算pDNA Ecoli O157的拷贝数。
定量后，使用pDNA Ecoli O157制备10倍稀释系列制备2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和2×101copies/ml稀释的样品。
2.qPCR反应条件
qPCR的五点标准曲线是使用从pDNA提取的1μl样品的10倍系列稀释液生成的。引物序列和扩增子大小见表3。PCR分析使用ABI SYBR FASTqPCR Master Mix(2X)(NEWEngland Biolabs，UK)，在八联管中以25μl体积进行PCR反应，每个反应均含10pM引物。PCR方案如下：分别在94℃下10分钟和94℃下30s，在58℃下45s进行40个循环。
表3荧光定量PCR引物序列
3.标准曲线的建立
每个反应重复3次，并根据Ct值与模板浓度之间的关系建立标准曲线以估计检测限(LOD)，扩增效率(e)和斜率(K)，如图3所示。各标准曲线的线性相关系数如表4所示。在本发明中，结果发现，这些标准曲线的相关系数均达到0.99，线性良好，表明pDNA Ecoli O157作为qPCR参考品的可靠性，可用于作为用于检测大肠杆菌O157的目标基因序列的QPCR扩增的阳性标准材料。
表4标准曲线的斜率、相关系数、扩增效率和检测下限
实施例4质粒DNA参考物质与大肠杆菌O157基因组DNA(gDNA)的可替代性研究
本实施例通过使用基因组标准品分别以梯度稀释的gDNA和质粒DNA参考物质为模板绘制标准曲线，每条标准曲线重复6次。根据统计学原理分析每个标准曲线的线性相关系数和斜率(t检验)。如表5所示，通过评估斜率和截距，在95％置信度下，可认为gDNA建立的标准曲线与质粒DNA参考物质建立的标准曲线之间没有显着差异(P<0.05)。结果表明，可以使用质粒DNA参考物质代替gDNA来进行大肠杆菌O157相关检测。
表5 pDNA Ecoli O157与基因组核酸参考品的可替代性分析
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5691
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaagtctc ttcatttagc tttgttagcg ttaggtatat cggaaggaga tgaagttatt 60
gttccaacac tgacatatat agcatcagtt aatgctataa aatacacagg agccaccccc 120
attttcgttg attcagataa tgaaacttgg caaatgtctg ttagtgacat agaacaaaaa 180
atcactaata aaactaaagc tattatgtgt gtccatttat acggacatcc atgtgatatg 240
gaacaaattg tagaactggc caaaagtaga aatttgtttg taattgaaga ttgcgctgaa 300
gcctttggtt ctaaatataa aggtaaatat gtgggaacat ttggagatat ttctactttt 360
agcttttttg gaaataaaac tattactaca ggtgaaggtg gaatggttgt cacgaatgac 420
aaaacacttt atgaccgttg tttacatttt aaaggccaag gattagctgt acataggcaa 480
tattggcatg acgttatagg ctacaattat aggatgacaa atatctgcgc tgctatagga 540
ttagcccagt tagaacaagc tgatgatttt atatcacgaa aacgtgaaat tgctgatatt 600
tataaaaaaa atatcaacag tcttgtacaa gtccacaagg aaagtaaaga tgtttttcac 660
acttattgga tggtctcaat tctaactagg accgcagagg aaagagagga attaaggaat 720
caccttgcag ataaactcat cgaaacaagg ccagtttttt accctgtcca cacgatgcca 780
atgtactcgg aaaaatatca aaagcaccct atagctgagg atcttgtggg ggggggaaag 840
tcgatgaaaa taataatttt tagagtgcta acttttttct ttgttatctt ttctgttaat 900
gtggttgcga aggaatttac cttagatttc tcgacagcaa agacgtatgt agattcgctg 960
aatgtcattc gctctgcaat aggtactcca ttacagacta tttcatcagg aggtacgtct 1020
ttactgatga ttgatagtgg cacaggggat aatttgtttg cagttgatgt cagagggata 1080
gatccagagg aagggcggtt taataatcta cggcttattg ttgaacgaaa taatttatat 1140
gtgacaggat ttgttaacag gacaaataat gttttttatc gctttgctga tttttcacat 1200
gttacctttc ctggtacaac tgcggttaca ttgtctggtg acagtagcta taccacgtta 1260
cagcgtgttg cggggatcag tcgtacgggg atgcagataa atcgccattc gttgactact 1320
tcttatctgg atttaatgtc gcatagcgga acctcactga cgcagtctgt ggcaagagcg 1380
atgttacggt ttgttactgt gacagctgaa gctttacgtt ttcggcaaat tcagagggga 1440
tttcgtacaa cacttgatga tctcagtgaa gtcgggaaca cctgtatatg aagtgtatat 1500
tatttaaatg ggtactgtgc ctgttactgg gtttttcttc ggtatcctat tcccgggagt 1560
ttacgataga cttttcgacc caacaaagtt atgtctcttc gttaaatagt atacggacag 1620
agatatcgac ccctcttgaa catatatctc aggggaccac atcggtgtct gttattaacc 1680
acaccccacc gggcagttat tttgctgtgg atatacgagg gcttgatgtc tatcaggcgc 1740
gttttgacca tcttcgtctg attattgagc aaaataattt atatgtggcc gggttcgtta 1800
atacggcaac aaatactttc taccgttttt cagattttac acatatatca gtgcccggtg 1860
tgacaacggt ttccatgaca acggacagca gttataccac tctgcaacgt gtcgcagcgc 1920
tggaacgttc cggaatgcaa atcagtcgtc actcactggt ttcatcatat ctggcgttaa 1980
tggagttcag tggtaataca atgaccagag atgcatccag agcagttctg cgttttgtca 2040
ctgtcacagc agaagcctta cgcttcaggc agatacagag agaatttcgt caggcactgt 2100
ctgaaactgc tcctgtgtat acgatgacgc cgggagacgt ggacctcact ctgaactggg 2160
ggcgaatcag caatgtgctt ccggagtatc ggggagagga tggtgtcaga gtggggagaa 2220
tatcctttaa taatatatca gcgatactgg ggactgtggc cgttatactg aattgccatc 2280
atcagggggc gcgttctgtt cgcgccgtga atgaagagag tcaaccagaa tgtcagataa 2340
ctggcgacag gcccgttata aaaataaaca atacattatg ggaaagtaat acagctgcag 2400
cgtttctgaa cagaaagtca cagtttttat atacaacggg taaataaagg agttaagcat 2460
gaagaagatg tttatggcgg ttttatttgc attagcttct gttaatgcaa tggcggcgga 2520
ttgtgctaaa ggtaaaattg agttttccaa gtataatgag gatgacacat ttacagtgaa 2580
ggttgacggg aaagaatact ggaccagtcg ctggaatctg caaccgttac tgcaaagtgc 2640
tcagttgaca ggaatgactg tcacaatcaa atccagtacc tgtgaatcag gctccggatt 2700
tgctgaagtg cagtttaata atgactgaaa gtcgaccacg gcagtagcaa atggtcagga 2760
tgctattaca tacactgtta aagtgatgaa agatggtcag ccagtgcagg gacactccgt 2820
tacattctca acaaactttg ggatattcaa cggtaagtct cagacacaaa atgcaaccac 2880
gggaaatgat ggtcgtgcga cgataacgct gacttccagt tccgcaggta aagcgactgt 2940
tagtgcgaca gttagtggtg gaactgatgt taaagcgact gaggttactt tttttgatga 3000
actgaaaatt gacaacaagg ttgacattat tggtaacaat gtcagtggcg aattgcctga 3060
tatctggttg caatatggtc agtttaaatt gaaggcaagt ggtggtaacg gtacatattc 3120
atggtattca gaaaatacca gtatcgcgac tgttgatgca tcggggaaag tcaccttgaa 3180
tggtaaaggc agtgtcgtaa ttaaagccac ttctggtgat aagcaaacag taagctacac 3240
tgttaaaact ccaaaatata tgataaaggt aggccaaaaa gcttattatg atgagtccat 3300
gactatttgt aaaggctctc tgccatcctc acagactgta ttatctgaca tcttaaaagt 3360
cggcgatttc cttttatctt tcgacacgta aaacgaatac cggggttatc ggcctgaatt 3420
gcgcaaagtt tacgtttaat tgtttttttt aatagcggga ataaggggca gagaaaagag 3480
tatttcgtcg actaacaaaa aatggctgtt tgtgaaaaaa attctaaagg ttgttttacg 3540
acagacgata acagggttga cggcgattga gccgacgggt ggaaacccaa aacgtaatca 3600
acgacttgca atataggata acgaatcatg gcacaagtca ttaataccaa cagcctctcg 3660
ctgatcactc aaaataatat caacaagaac cagtctgcgc tgtcgagttc tatcgagcgt 3720
ctgtcttctg gcttgcgtat taacagcgcg aaggatgacg ccgcgggtca ggcgattgct 3780
aaccgtttta cttctaacat taaaggcctg actcaggctg cacgtaacgc caacgacggt 3840
atttctgttg cacagaccac cgaaggcgcg ctgtctgaaa tcaacaacaa cttacagcgt 3900
atccgtgagc tgacggttca ggcttctacc ggaactaact ctgattcgga tctggactcc 3960
attcaggacg aaatcaaatc ccgtcttgat gaaattgacc gcgtatccgg ccagacccag 4020
ttcaacggcg tgaacgtact ggcaaaagac ggttcgatga aaattcaggt tggtgcgaat 4080
gacggtgaaa ctatcactat cgacctgaag aaaatcgatt ctgatactct gggtctgaat 4140
ggttttaacg taaatggtaa aggtactatt accaacaaag ctgcaacggt aagtgattta 4200
acttctgctg gcgcgaagtt aaacaccacg acaggtcttt atgatctgaa aaccgaaaat 4260
accttgttaa ctaccgatgc tgcattcgat aaattaggga atggcgataa agtcaccgtt 4320
ggcggcgtag attatactta caacgctaaa tctggtgatt ttactaccac caaatctact 4380
gctggtacgg gtgtagacgc cgcggcgcag gctactgatt cagctaaaaa acgtgatgcg 4440
ttagctgcca cccttcatgc tgatgtgggt aaatctgtta atggttctta caccacaaaa 4500
gatggtactg tttctttcga aacggattca gcaggtaata tcaccatcgg tggaagccag 4560
gcatacgtag acgatgcagg caacttgacg actaacaacg ctggtagcgc agctaaagct 4620
gatatgaaag cgctgcttaa agccgcgagc gaaggtagtg acggtgcttc tctgacattc 4680
aatggcactg aatatactat cgcaaaagca actcctgcga caacctctcc agtagctccg 4740
ttaatccctg gtgggattac ttatcaggct acagtgagta aagatgtagt attgagcgaa 4800
accaaagcgg ctgccgcgac atcttcaatt acctttaatt ccggtgtact gagcaaaact 4860
attgggttta ccgcgggtga atccagtgat gctgcgaagt cttatgtgga tgataaaggt 4920
ggtattacta acgttgccga ctatacagtc tcttacagcg ttaacaagga taacggctct 4980
gtgactgttg ccgggtatgc ttcagcgact gataccaata aagattatgc tccagcaatt 5040
ggtactgctg taaatgtgaa ctccgcgggt aaaatcacta ctgagactac cagtgctggt 5100
tctgcaacga ccaacccgct tgctgccctg gacgacgcta tcagctccat cgacaaattc 5160
cgttcttccc tgggtgctat ccagaaccgt ttggattccg cagtcaccaa cctgaacaac 5220
accactacca acctgtctga agcgcagtcc cgtattcagg acgccgacta tgcgaccgaa 5280
gtgtccaaca tgtcgaaagc gcagattatc cagcaggccg gtaactccgt gctggcaaaa 5340
gccaaccagg taccgcagca ggttctgtct ctgctgcagg gttaatcgcc gtaacctgat 5400
taactgagac tgacggcaac gccaaattgc ctggtgcgct gtgcttatca ggcctacaag 5460
gtgaattgca atttatttaa tttgcagatt tttgtaggcc ggataaggcg ttacgccgca 5520
tccggcaaca tgaagcgtaa tttgtcagca atgtgcttcc ccgccaacgg cggggttttt 5580
ttctgcccgc aatttaccgg taacccccaa ataacccctc atttcaccca ctaatcgccc 5640
gattaaaaac cctgcagaaa cggataatca tgccgataac tcatataacg c 5691
Claims (8)
1.一种大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，采用包含来源于不同大肠杆菌O157菌株的uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7全长基因的片段插入质粒中形成；
所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因以1:1比例串联；
所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因间以不相关的基因片段进行隔开。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。
4.一种权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，其特征在于，包括：
人工合成大肠杆菌O157基因udia、rfbE、flicH7、stx1、stx2、eaeA，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；
合成后克隆插入质粒中，经大肠杆菌扩增后，提取并提纯质粒；
测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pUC57载体质粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。
7.一种权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品在检测大肠杆菌O157中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在进行大肠杆菌O157检测时，所述大肠杆菌O157核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1661113A (zh) * | 2005-01-21 | 2005-08-31 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针 |
| CN102242192A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-11-16 | 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 | 用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒、试剂盒及该质粒的构建方法 |
| CN104946736A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-09-30 | 上海市计量测试技术研究院 | 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用 |
| CN107586776A (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-16 | 上海市计量测试技术研究院 | 适用于h7n9禽流感病毒实时荧光定量pcr检测的质粒标准物质 |
| CN109777818A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-05-21 | 深圳鑫泰康生物科技有限公司 | 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组ev71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用 |
-
2020
- 2020-08-06 CN CN202010781186.4A patent/CN111876504A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1661113A (zh) * | 2005-01-21 | 2005-08-31 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针 |
| CN102242192A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-11-16 | 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 | 用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒、试剂盒及该质粒的构建方法 |
| CN104946736A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-09-30 | 上海市计量测试技术研究院 | 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用 |
| CN107586776A (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-16 | 上海市计量测试技术研究院 | 适用于h7n9禽流感病毒实时荧光定量pcr检测的质粒标准物质 |
| CN109777818A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-05-21 | 深圳鑫泰康生物科技有限公司 | 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组ev71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 史智扬等: "寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O157：H7初步研究", vol. 6, no. 12 * |
| 周云龙: "转基因生物标准物质研制与应用", 中国质检出版社, pages: 128 - 134 * |
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