CN104946736A - 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子PLW03和PLW04及其应用。具体地，本发明提供了能够用于产志贺毒素大肠杆菌PCR检测的多核苷酸以及与之相配合的引物对，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

Description

一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其构建方法、定量方法和应用。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌是一种与公共卫生密切相关的致病性大肠杆菌，可引起出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症等疾病。自1982年Riley等在美国首次分离该菌以来，英国、加拿大、日本和我国都相继有产志贺毒素大肠杆菌暴发的报道。产志贺毒素大肠杆菌作为一种人畜共患病原菌，可以在畜禽中流行和传播，并通过动物源性食品进行扩散。目前，国内诊断产志贺毒素大肠杆菌主要依靠细菌培养、生化反应(包括山梨醇一麦康凯琼脂筛选等)和血清学鉴定。同时，采用志贺样毒素检测进行确证试验。上述方法检测周期长，操作繁琐，往往达不到疫情控制的要求。而在分子水平方面，如PCR方法则可以快速、灵敏地检测产志贺毒素大肠杆菌大肠杆菌。本文研制的产志贺毒素大肠杆菌大肠杆菌定量检测用质粒分子是指一种含有产志贺毒素大肠杆菌的主要毒力因子stx1和stx2编码基因序列片段的重组质粒分子标准物质。质粒标准分子在大肠杆菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供稳定含量的标准物质，并且纯度较高；另外具有操作容易，稳定性高的优点。

在实际大肠杆菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种检测产志贺毒素大肠杆菌的试剂盒，所述试剂盒中包括：

标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO.:1和/SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸。

在另一优选例中，所述标准分子的序列如SEQ ID NO.:3或4所示。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ ID NO.:1所示的序列，所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ ID NO.:2所示的序列，所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括探针序列，所述探针序列分别针对产志贺毒素stx1基因和/或产志贺毒素stx2基因。

在另一优选例中，所述探针序列如SEQ ID NO.:21和/或SEQ ID NO.:22所示。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2的基因序列。

在另一优选例中，所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为50bp-400bp(较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列。

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述stx2的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO:2所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为50bp-400bp(较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列。

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述分离的多核苷酸其序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明第二方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物中的线性酶切位点位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:2所示序列的两端。

在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。

在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为产志贺毒素大肠杆菌检测的标准分子(质粒标准分子)。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体，并且所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptII SK和pGEM。

在另一优选例中，所述DNA构建物的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO.:4所示。

本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第二方面所述多核苷酸或者本发明第三方面所述DNA构建物。

在另一优选例中，所述试剂盒为检测产志贺毒素stx1基因的试剂盒，所述试剂盒中还包括选自下组的引物序列：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；和

(4)SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒为检测产志贺毒素stx2基因的试剂盒，所述试剂盒中还包括选自下组的引物序列：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列；和

(4)SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20所示的引物序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括分别针对产志贺毒素stx1基因的探针SEQ ID NO.:21和/或产志贺毒素stx2基因的探针SEQ ID NO.:22。

本发明的第五方面，提供了如本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的DNA构建物或本发明第四方面所述的试剂盒的用途，用于产志贺毒素大肠杆菌的检测。

在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。

在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。

本发明的第六方面，提供了一种产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法，所采用的标准物质是如本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的DNA构建物。

在另一优选例中，所述产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法中，使用的探针如SEQ ID NO.:21或SEQ ID NO.:22所示。

在另一优选例中，所述产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法中，使用的引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；和

(4)SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示的引物序列。

在另一优选例中，所述产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法中，使用的引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列；和

(4)SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20所示的引物序列。

本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸产品，所述产品包括：

(i)产志贺毒素大肠杆菌标准品，所述的标准品选自：本发明第二方面所述多核苷酸或本发明第三方面所述的DNA构建物；

(ii)特异性扩增本发明第二方面所述多核苷酸的引物对。

在另一优选例中，所述引物对特异性扩增SEQ ID NO.:1所示的基因序列，并且所述引物对选自下组：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的序列构成的引物对；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对；

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的序列构成的引物对，和

(4)SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示的序列构成的引物对；

在另一优选例中，所述引物对特异性扩增SEQ ID NO.:2所示的基因序列，并且所述引物对选自下组：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的序列构成的引物对；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的序列构成的引物对；

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的序列构成的引物对；和

(4)SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20所示的序列构成的引物对。

在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合(combination)，较佳地所述组分(i)和(ii)是各自独立的。

在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。

本发明的第八方面，提供了一种产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：

①人工合成产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1和/或stx2基因序列，所述毒力因子stx1和stx2表达基因序列分别如SEQ ID NO：1和2所示；

②将步骤①所得产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1或stx2表达基因序列克隆至克隆载体上，得到产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子。

在另一优选例中，所述的产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的制备方法中，步骤②所述克隆载体为pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript IISK或pGEM。

在另一优选例中，所述的产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的制备方法中，步骤②所述克隆载体为pUC19。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1中A和B分别是本发明质粒标准分子PLW03和PLW04的图谱。

图2中A和B分别是本发明所得质粒标准分子PLW03和PLW04稳定性检测结果图。

图3中A和B分别是利用本发明质粒标准分子建立的实时荧光PCR标准曲线。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于产志贺毒素大肠杆菌PCR检测的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。

实时荧光PCR检测产志贺毒素大肠杆菌的原理

采用实时荧光PCR技术可特异性扩增产志贺毒素大肠杆菌基因组DNA中毒力因子stx1和stx2基因序列，设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)。PCR方法中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)。

标准物质

标准物质是具有很好确定了的一种或多种足够均匀的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。

质粒标准分子

本发明中，所述的产志贺毒素大肠杆菌的特异性序列是产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因的一部分，长度分别1227bp和1236bp。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子，质粒标准分子包含产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因序列，所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因序列如序列表中SEQ ID NO：1和NO：2所示。

本发明的质粒标准分子，较佳地分别含有产志贺毒素大肠杆菌的PCR检测的靶基因产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因序列。

本发明中所述的产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因，在DNA、RNA和蛋白质的合成中起作用，它可作为产志贺毒素大肠杆菌检测的一种靶基因，所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因的序列较佳的如SEQ IDNO：1和NO：2所示。

本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQ ID NO：3和NO：4所示，其中在NO：3的第417位到第1650位为stx1基因序列,在NO：4的第417位到第1659位为stx2基因序列。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种如上所述产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；

④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；

⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。

其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气流量较佳地为10L/min～25L/min，最佳地为16.86L/min，辅助气流量较佳地为0.5L/min～3.0L/min，最佳地为0.88L/min，雾化气流量为较佳地为0.5L/min～2.43L/min，更佳地为1.123L/min，功率较佳地为1200W～1400W，最佳地为1350W。

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

具体实施说明：

本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。

其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区域)，记录仪器读数。。

④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为ng/μL。

(2)HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：

①提取质粒标准分子；

②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素的含量；

③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线。

④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷含量。

⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准物质是如上所述的质粒标准分子。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：一种如上所述的产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：

①人工合成产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1和stx2基因序列，所述毒力因子stx1和stx2基因序列如序列表中SEQ ID NO：1和NO：2所示；

②将步骤①所得产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1和stx2基因序列克隆至克隆载体上，得到产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子。

其中步骤①所述的人工合成的方法较佳地为：全基因合成或者PCR引物扩增的方法获得该序列。

本发明所述质粒标准分子构建方法较佳地包括以下步骤：

①NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Genbank中查询产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1和stx2基因；

②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位点加至所选择序列的5’端和3’端。

③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子。

所述的质粒载体可以是任何常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19克隆载体。

④测序验证质粒标准分子的序列。

⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。

所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定质粒标准分子作为实时荧光PCR方法检测产志贺毒素大肠杆菌的标准物质的能力。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的主要优点在于：

(1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的优点，同时本发明解决了产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR方法检测提供质量控制；

(2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实时荧光PCR检测产志贺毒素大肠杆菌时，特异性强，灵敏度高，线性稳定。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1 质粒标准分子的构建

实验试剂和实验仪器：

质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯生化试剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。

实验方法包括以下步骤：

1、在GenBank中搜索产志贺毒素大肠杆菌的基因毒力因子stx1和stx2基因序列，

2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，基因毒力因子stx1和stx2基因序列长度分别为1227bp和1236bp，两端加上BamHI酶切位点；

3、将处理后的序列送至宝生物工程(大连)有限公司，由其负责进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得基因毒力因子stx1和stx2基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1和NO：2所示，将所得全长基因克隆至质粒载体pUC19(购自TAKARA公司)中，构建获得分别包含stx1和stx2基因序列的质粒标准分子PLW03和PLW04(其序列如序列表中SEQ ID NO:2所示)，构建所得质粒标准分子PLW03和PLW04的质粒图谱如图1所示。

4、大量培养含有包含所得质粒标准分子PLW03和PLW04的重组大肠杆菌，利用质粒大量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子PLW03和PLW04。经过紫外分光光度计以及电泳进行纯度分析，之后质粒DNA标准分子置于-20℃保存，抽提质粒的方法包括以下步骤：

a、将100～200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上清；

b、加入12mL Solution Ⅰ(含有RNase A)，振荡充分混匀；

c、加入12mL Solution Ⅱ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体充分裂解；

d、加入16mL Solution Ⅲ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的白色沉淀；

e、≥12000×g，4℃离心10分钟；

f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL收集管中)，5000×g室温离心5分钟；

g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室温离心5分钟；

h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释)清洗吸附柱；

i、重复上述清洗步骤；

j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；

k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3mLTE缓冲液，室温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的质粒标准分子溶液，保存在-20℃。

5、测序验证质粒标准分子PLW03和PLW04

将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分别为北京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍捷基(上海)贸易有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术有限公司、上海生工生物技术有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来说，序列长度与定量有直接关系，8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于定值的要求。详见ISO导则35，标准物质定值部分的具体要求。

序列考察公式：序列正确率＝正确碱基数目/碱基总数

测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100％。

实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取等步骤得到高纯度的质粒标准分子PLW03和PLW04经测序验证，质粒标准分子插入片段序列与设计完全相符。

实施例2 质粒标准分子PLW03和PLW04的均匀性检验

均匀性是表征物质中一种或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通过测量取自不同包装单元(如瓶、包等)或取自同一包装单元不同位置的规定大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其量值不会受到分装等因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，从各质粒DNA标准物质中随机抽取15瓶。

2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值。

3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为：抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著性差异，则应满足下式的统计要求。

$F=\frac{\frac{Q_1}{v_1}}{\frac{Q_2}{v_2}}\≤F_{\mathrm{\α}}(v_1,v_2)$

其中组间差方和计算公式为：

$Q_1=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{n}_i{(\stackrel{\‾}{x_i}-\stackrel{=}{x})}^2$

组内差方和计算见公式为：

$Q_2=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=1}{\overset{\mathrm{nj}}{\mathrm{\Σ}}}{(x_{\mathrm{ij}}-{\stackrel{\‾}{x}}_i)}^2$

ν₁＝m-1(组间自由度)

ν₂＝N-m(组内自由度)。

实验结果：

1、质粒标准分子PLW03和PLW04均匀性检验结果如表1所示

表1 质粒标准分子PLW03均匀性检验数据(单位：ng/μL)

样品	重复1	重复2	重复3	平均值
					1	59.8	60.4	62	60.7
2	59.7	60.1	60.3	60.0

4	60.1	61.5	61.9	61.2
					5	60.4	60.5	60.6	60.5
6	60.1	60.2	60.7	60.3
					7	62	59.7	60.5	60.7
8	60.9	60.5	60.9	60.8
					9	59.4	59	62	60.1
10	60.8	62	60.6	61.1
					11	59.3	59.1	59.6	59.3
12	60.3	61.8	59.7	60.6
					13	60.5	60.7	60.6	60.6
14	59.5	59.7	61.3	60.2
					15	60.9	59.9	61.4	60.7

表2 质粒标准分子PLW03的均匀性统计结果

质粒DNA标准物质	Q1	Q2	F值	F0.05(14，30)
					PLW03	13.72	27.31	1.08	2.04

表3 质粒标准分子PLW04均匀性检验数据(单位：ng/μL)

样品	重复1	重复2	重复3	平均值
					1	68.9	70.7	69.1	69.6
2	68.8	65.8	69	67.9
					4	67.7	68.2	69.3	68.4
5	67.2	67.2	69.7	68.0
					6	66.8	69.7	69.8	68.8
7	69.4	67.8	70.4	69.2
					8	66.7	68.5	68.4	67.9
9	68	66.1	68.3	67.5
					10	66.8	67.6	68.8	67.7
11	67.8	67.8	68.7	68.1
					12	65.7	66.7	67.8	66.7
13	67.8	68.5	68.7	68.3
					14	68.9	68	70.8	69.2
15	68.8	68	66.1	67.6

表4 质粒标准分子pLW04的均匀性统计结果

质粒DNA标准物质	Q1	Q2	F值	F0.05(14，30)
					PLW04	23.73	49.20	1.03	2.04

均匀性统计结果见表3和表4，在95％置信水平下，F值小于F_0.05(14，30)，证明质粒标准分子PLW03和PLW04是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》均匀检验合格要求。

实施例3 质粒标准分子PLW03和PLW04的稳定性考察

稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规定范围内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。稳定性良好的质粒标准分子，其特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推移而改变，检测结果不会受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法：

采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。

1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、4个月、6个月、12个月对制备的质粒标准分子(-20℃保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法对质粒标准分子进行了跟踪考察。

2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如下：

直线斜率可用下式计算：

${\mathrm{\β}}_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；——所有时间点的平均值；——所有观测值的平均值。

截距可由下式计算：

${\mathrm{\β}}_0=\stackrel{\‾}{Y}-{\mathrm{\β}}_1\stackrel{\‾}{X}$

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

$s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(Y_i-{\mathrm{\β}}_0-{\mathrm{\β}}_1{X}_i)}^2}{n-2}$

式中：X_i——第i个时间点；Y_i——第i个时间点的观测值；β₁，β₀——回归系数；n——测量系数。

β₁的标准偏差由下式给出：

$s\left({\mathrm{\β}}_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}$

基于β₁的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β₁|＜t_0.95,n-2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。

实验结果：

1、质粒标准分子PLW03和PLW04稳定性考察结果如表3和图2所示，：

表5 质粒标准分子PLW03的稳定性监测数据(单位：ng/μL)

时间(月)	重复1	重复2	重复3	平均值	SD
						0	62	61.8	62.45	62.08	0.33
0.5	62.9	62	62.4	62.43	0.45
						1	60.1	58.2	59.8	59.37	1.02
2	60.7	61.2	60.3	60.73	0.45
						4	58.2	58.1	57.3	57.87	0.49
6	58.4	58.7	57.9	58.33	0.40
						9	62.7	56.2	61.1	59.98	3.37
12	58.0	59.0	58.4	58.48	0.47

统计结果如表5所示。

表6 质粒标准分子PLW03的稳定性统计结果

质粒DNA标准物质	β1	β0	s(β1)	t0.95,n-2·s(β1)
					PLW03	0.116	59.9	0.088	0.216

表7 质粒标准分子PLW04的稳定性监测数据(单位：ng/μL)

时间(月)	重复1	重复2	重复3	平均值	SD
						0	69.6	67.9	68.4	68.61	0.87
0.5	69.8	70.1	69.1	69.67	0.51
						1	68.1	68.2	66.7	67.67	0.84
2	70.5	67.5	69.9	69.30	1.59
						4	66.9	67.4	67.7	67.33	0.40
6	68.2	66.6	66.9	67.23	0.85
						9	68.9	69.4	69.5	69.27	0.32
12	70.8	68.3	70.3	69.82	1.34

统计结果如表7所示。

表8 质粒标准分子PLW03的稳定性统计结果

质粒DNA标准物质	β1	β0	s(β1)	t0.95,n-2·s(β1)
					PLW04	0.060	68.4	0.096	0.24

由统计结果可知，质粒标准分子PLW03和PLW04在-20度条件下保存12个月是稳定的。

实验例4 用紫外分光光度法对质粒标准分子PLW03和PLW04进行定量

实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。

实验方法包括以下步骤：

1、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；

2、取实施例制备所得DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；

3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。

4、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果为：经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子PLW03和PLW04的浓度如表9所示：

表9 紫外分光光度法定值结果(单位：ng/μL)

质粒

重复1

2

3

4

5

6

7

8

平均值

SD

PLW03	59.8	59.7	60.1	60.4	60.1	62	60.9	59.4	60.3	0.82
											PLW04	68.9	68.8	67.7	67.2	66.8	69.4	66.7	68	67.94	0.95

实施例5 用HR-ICP-MS对质粒标准分子PLW03和PLW04进行定量

实验试剂为P标准溶液(NIST，SRM3139a)。实验仪器为：电感耦合等离子体发射质谱仪(Thermofisher element2)。

实验方法包括以下步骤：

1、根据质粒标准分子PLW03和PLW04的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元素的含量；

2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。

3、配制梯度浓度的磷标准溶液(0、1、2、3、4、5μg/L)，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；

4、将质粒标准分子PLW03和PLW04稀释3000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标准分子，并根据标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；

5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子PLW03和PLW04的浓度；

6、每个样品测试八次，取平均值。

实验结果为：经计算，质粒标准分子PLW03和PLW04的磷元素的含量为10.22％。经过HR-ICP-MS定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表10所示，稀释倍数为3000，换算得到质粒分子的质量浓度，如表7所示。

表10 质粒标准分子PLW03和PLW04的磷元素含量(单位：μg/L)

质粒	重复1	2	3	4	5	6	7	8	平均值	SD
											PLW03	2.11	2.21	2.21	2.04	2.21	2.03	2.12	1.96	2.11	0.10
PLW04	2.24	2.35	2.22	2.27	2.33	2.20	2.17	2.25	2.25	0.06

表11 质粒标准分子PLW03和PLW04的质量浓度结果(单位：ng/μL)

实施例6 研制的质粒标准分子PLW03和PLW04在实时荧光PCR检测中的应用

实验试剂：所用引物及探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，MasterMix购自Life technology公司。实验仪器包括：实时荧光定量PCR扩增仪(Lifetechnology)离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。

实验中采用的引物和探针序列序列表中SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:22所示，详见表12所示。

表12 实验中采用的引物和探针序列

质粒标准分子PLW03和PLW04在实时荧光PCR检测中的应用

引物(分别使用表12中所示引物)、探针、PCR检测体系

PCR加样体系：

反应条件PCR程序：

95℃   10分钟；

95℃   15秒，60℃1分钟，40个循环。

将实施例1制备所得的质粒标准分子PLW03稀释为不同浓度的质粒标准分子PLW03(1.5×10⁶copies/μL、1.5×10⁵copies/μL、1.5×10⁴copies/μL、1.5×10³copies/μL、1.5×10²copies/μL、1.5×10¹copies/μL、1.5×10⁰copies/μL),将PLW04稀释为不同浓度的质粒标准分子PLW04(2.05×10⁶copies/μL、2.05×10⁵copies/μL、2.05×10⁴copies/μL、2.05×10³copies/μL、2.05×10²copies/μL、2.05×10¹copies/μL、2.05×10⁰copies/μL)，将不同浓度的质粒标准分子PLW03和PLW04分别作为模板，按照文献中的方法进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线。

实验结果

1、针对质粒标准分子PLW03的检测结果表明，引物对1的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测1.5×10¹copies/μL的目标序列；引物对2和3的灵敏度较低，能够检测到1.5×10³copies/μL的目标序列；引物对4的能够检测到1.5×10¹copies/μL的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。

针对质粒标准分子PLW04的检测结果表明，引物对5的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测2.05copies/μL的目标序列；引物对6的灵敏度较低，能够检测到2.05×10²copies/μL的目标序列；引物对7能够检测到2.05×10²copies/μL的目标序列，但是特异性较差，检测结果中有杂带出现；引物对8的能够检测到2.05×10¹copies/μL的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。

2、质粒标准分子PLW03和PLW04在实时荧光PCR检测中的应用

采用所述PCR检测体系及反应条件，分别以不同浓度的质粒标准分子PLW03和PLW04作为标准品分别使用引物对1和引物对5进行PCR检测，建立实时荧光PCR的标准曲线。建立的标准曲线见图3，PLW03标准曲线的相关系数达到0.9976，线性良好，空白对照无扩增峰，最低可检测15copies/μL的目标序列，PLW04标准曲线的相关系数达到0.9906，线性良好，空白对照无扩增峰，最低可检测2copies/μL的目标序列，灵敏度高，表明质粒标准分子PLW03和PLW04适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增产志贺毒素大肠杆菌的阳性标准物质。

在实际产志贺毒素大肠杆菌检测时，可利用该线性良好的标准曲线，通过实验荧光PCR方法检测出待测样品中产志贺毒素大肠杆菌特定基因的拷贝数，并可根据产志贺毒素大肠杆菌特定基因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出产志贺毒素大肠杆菌的具体个数。由于目前针对产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空白，在实际产志贺毒素大肠杆菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准分子可以解决实时荧光PCR检测产志贺毒素大肠杆菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和stx2基因的实时荧光PCR方法，保证检测结果的可比性，为产志贺毒素大肠杆菌实时荧光PCR方法检测提供生物计量技术支持。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测产志贺毒素大肠杆菌的试剂盒，其特在于，所述试剂盒中包括：

标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸；

优选地，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQID NO.:1所示的序列，所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；

和/或，

所述试剂盒中还包括用于特异性扩增SEQ ID NO.:2所示序列的引物序列，所述引物序列选自下组：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1和/或stx2的基因序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中，所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx1的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为50bp-400bp(较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；和/或

所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stx2的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO:2所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为50bp-400bp(较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

4.一种分离的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包含权利要求2所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。

5.如权利要求4所述的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO.:4所示。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求2所述多核苷酸或者权利要求4所述DNA构建物。

7.如权利要求2所述的多核苷酸、权利要求4所述的DNA构建物或权利要求6所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于产志贺毒素大肠杆菌的检测。

8.一种产志贺毒素大肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所采用的标准物质是如权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的DNA构建物。

9.一种多核苷酸产品，其特征在于，所述产品包括：

(i)产志贺毒素大肠杆菌标准品，所述的标准品选自：权利要求2所述多核苷酸或权利要求4所述的DNA构建物；

(ii)特异性扩增权利要求2所述多核苷酸的引物对。

10.一种产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①人工合成产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1和/或stx2基因序列，所述毒力因子stx1和stx2表达基因序列分别如SEQ ID NO：1和2所示；

②将步骤①所得产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子stx1或stx2表达基因序列克隆至克隆载体上，得到产志贺毒素大肠杆菌的质粒标准分子。