CN103866028A - 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法 - Google Patents

一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103866028A
CN103866028A CN201410114789.3A CN201410114789A CN103866028A CN 103866028 A CN103866028 A CN 103866028A CN 201410114789 A CN201410114789 A CN 201410114789A CN 103866028 A CN103866028 A CN 103866028A
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
primer
stx2
vbnc
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410114789.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103866028B (zh
Inventor
刘静宇
凌莉
席静
邓翼惠
易敏英
胡科峰
陈碧玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority to CN201410114789.3A priority Critical patent/CN103866028B/zh
Publication of CN103866028A publication Critical patent/CN103866028A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103866028B publication Critical patent/CN103866028B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157荧光PCR引物组，该引物组检测的基因区域包括Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因。序列分别如SEQ ID NO:1-10。本发明还提供了一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR检测方法，包括：（1）大肠杆菌O157的菌株保藏；（2）大肠杆菌O157的复壮；（3）VBNC状态诱导；（4）细菌RNA制备；（5）逆转录；（6）实时荧光定量PCR检测。应用本发明的引物组对不可培养状态大肠杆菌O157进行检测，具有高度特异性和高灵敏度，能更全面的检测活的不可培养状态大肠杆菌O157及其毒力基因表达，更全面精确进行其致病风险评估。

Description

一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR引物组及其检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR引物组及其检测方法。
背景技术
大肠杆菌O157是大肠杆菌其中的一个类型，可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是主要致病因子。能引起出血性结肠炎(HC)，并可发展为溶血性尿毒综合症(HUS)或血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，直至死亡。
因此，快速准确的检测方法对预防和控制大肠杆菌O157的感染十分重要。传统环境微生物的研究主要是依赖于平板培养，不仅耗时费力，而且不能精确地反映环境菌群的存活情况。
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前微生物检测常用的一种方法，该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，甚至可以肉眼直接观察显色，在大量筛选和现场检测中有独特的优势，现已广泛应用于环境监测等领域。间接免疫荧光法(indirectimmunofluorescence,IF)也是基于抗原抗体结合的方法，其具有直观、特异性强等优点，不仅可以鉴定细菌的种类，还可以在荧光显微镜下观察细菌的形态变化。目前，这两种方法在检测VBNC状态大肠杆菌的方面的研究还不够完善，也缺乏同步对比分析。
目前通过实验证明，提出了大肠杆菌O157在外界环境中存在活的非可培养状态(viablebut nonculturable,VBNC)，微生物在环境胁迫因子的刺激下，通过一系列类似分化的遗传程序而使自身处于一种抵抗压力的状态，处于VBNC状态下的细菌不能在普通平板培养基上生长和形成菌落，在适宜的环境下，可以复苏并恢复生长，并保持一定的致病力。
目前国内外用逆转录PCR检测活的不可培养状态的大肠杆菌O157的报道都很少，对活的不可培养状态大肠杆菌O157及其毒力基因表达检测并不全面，检测灵敏度也有一定的局限性，对其致病风险评估方面缺乏全面性和精确性。
发明内容
本发明目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种用于活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR检测引物组及其方法，以实现更全面的检测活的不可培养状态大肠杆菌O157及其毒力基因表达，提高检测灵敏度，可更全面精确进行其致病风险评估。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157荧光PCR引物组，该引物组中的引物检测的基因区域包括Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因。
所述引物的具体序列及其扩增片段长度分别如下：
Stx15’FP TGCAGATAAATCGCCATTCG
Stx13’RP AGTGAGGTTCCACTATGCGAC
扩增片段为53bp；
Stx2’FP GGGCAGTTATTTTGCTGTGG
Stx2’RP GGTCAAAACGCGCCTGATAG
扩增片段为59bp；
Flic5’FP GCTGCAACGGTAAGTGATTTAAC
Flic3’RP CTGTCGTGGTGTTTAACTTCG
扩增片段为55bp；
Rfb5’FP TACTACAGGTGAAGGTGGAATGG
Rfb3’RP TGCCTATGTACAGCTAATCCTTG
扩增片段为96bp；
Eae5’FP ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTC
Eae3’RP GTCAGTTTATTCGTGTGACCAGC
扩增片段为76bp。
上述引物设计方法如下：从GenBank上获得大肠杆菌O157的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因的DNA序列，采用DNAStar软件中的Seqman进行同源性分析，确定在大肠杆菌O157菌株内保守、其他菌株间特异的片段,利用生物软件Primer Express2.0对该保守片段设计引物。通过对GenBank数据库中所有生物核苷酸序列进行BLAST同源性比较分析，证实所选设计的引物对大肠杆菌O157具有高度特异性。
本发明还提供了一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR检测方法，包括
（1）大肠杆菌O157的菌株保藏：将选择平板上的单菌落接种血平板于36℃±1℃下培养16-18小时，然后挑取3-4环接种环菌苔到液体保存剂中，使用的菌种保存管是购自加拿大Prolab公司的MicrobankTM菌种保存管；盖好瓶盖并颠倒4-5次让冷冻保存小珠充分吸附微生物，然后将保存剂尽可能吸掉，盖上瓶盖并置于-70℃长期贮存。使用时无菌条件下挑取一颗小珠于液体培养基中复苏培养即可待用，液体培养基可以是普通营养肉汤和肠道菌增菌液都可以。
（2）大肠杆菌O157的复壮：将菌种置于肠道菌增菌肉汤中36℃±1℃下培养16-18小时，在EMB平板上分离划线，然后挑取单个菌落接种于血平板，并置36℃±1℃纯培养16-18小时，备用。
（3）VBNC状态诱导：将复壮后的大肠杆菌分别划线接种于EMB平板，挑取平板上的单个菌落于10mL营养肉汤中36±1℃纯培养24小时后，4500rpm4℃离心10min，弃去上清液。用5mL4℃灭菌纯水清洗沉淀，再以4500rpm4℃离心10min，弃去上清液，同样操作重复3次，然后将沉淀加入200mL的无菌纯水中，置于4℃冰箱保存。新制样本当天立即取1mL于9mL生理盐水作10倍梯度稀释，选择合适的稀释度吸取1mL菌液计算平板菌落数。此菌落数为样本的原始接种量。之后每隔7天以同样的操作对样本进行平板菌落计数。直至常规培养条件下平板菌落计数为0，表明细菌已经进入VBNC(viablebutnon-culture,有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养)状态。
（4）细菌RNA制备：细菌RNA提取通过RNA提取试剂盒在核酸提取仪自动完成，RNA提取试剂盒的产品型号为Magtration-MagaZorb RNA Common Kit。
（5）逆转录：逆转录使用商品化试剂盒进行体系配制，试剂盒产品型号为RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit，购自Thermo公司。
Figure BDA0000481590740000031
充分混合均匀后，在PCR仪上进行反应：25℃5min；42℃60min；70℃5min。反应完成后样品置于-20℃冰箱保存备用。
（6）实时荧光定量PCR检测：
用逆转录cDNA作为荧光RT-PCR扩增的模板，使用两步法进行，按如下扩增程序反应：95℃10min；95℃15s→58℃60s，40次循环。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0000481590740000032
Figure BDA0000481590740000041
引物使用浓度如下：Stx1的引物浓度为200nM，Stx2的引物浓度为300nM，Flic的引物浓度为300nM，Rfb的引物浓度为300nM，Eae的引物浓度为200nM。
在退火阶段收集荧光。扩增和检测在ABI-7300实时荧光定量PCR仪器上进行。
与现有技术相比，应用本发明的引物组对不可培养状态大肠杆菌O157进行检测，具有高度特异性和高灵敏度，能更全面的检测活的不可培养状态大肠杆菌O157及其毒力基因表达，更全面精确进行其致病风险评估。
附图说明
图1为4株大肠杆菌O157的stx1基因的PCR扩增结果图，从左至右分别为分子标记和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；
图2为4株大肠杆菌O157的stx2基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；
图3为4株大肠杆菌O157的flic基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；
图4为4株大肠杆菌O157的rfb基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；
图5为4株大肠杆菌O157的eae基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；
图6为大肠杆菌CCTCCAB200051的生长曲线；
图7为最佳扩增程序的确定实验结果图；
图7A为菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因在58℃的退火和延伸温度下的扩增曲线结果图；
图7B为菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因在60℃的退火和延伸温度下的扩增曲线结果图；
图7C为菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因在62℃的退火和延伸温度下的扩增曲线结果图；
图8为最佳浓度引物的实时荧光RT-PCR实验结果图；
图8A为菌株CCTCCAB200051的Stx1基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；
图8B为菌株CCTCCAB200051的Stx2基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；
图8C为菌株CCTCCAB200051的Flic基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；
图8D为菌株CCTCCAB200051的Rfb基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；
图8E为菌株CCTCCAB200051的Eae基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；
图9为菌株CCTCC AB200051的Flic基因扩增曲线，1-5分别代表含有3.7×104CFU/ml、3.7×103CFU/ml、3.7×102CFU/ml、3.7×101CFU/ml、3.7×100CFU/ml模板量时的扩增曲线；
图10为菌株CCTCC AB200051的Rfb基因扩增曲线,1-5分别代表含有3.7×104CFU/ml、3.7×103CFU/ml、3.7×102CFU/ml、3.7×101CFU/ml、3.7×100CFU/ml模板量时的扩增曲线；
图11为以不同时间收集的cDNA为模板进行实时荧光RT-PCR扩增，得到的扩增曲线；
图11A为菌株CCTCCAB200051的Stx1基因的实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图11B为菌株CCTCCAB200051的Stx2基因的实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图11C为菌株CCTCCAB200051的Flic基因的实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图11D为菌株CCTCCAB200051的Rfb基因的实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图11E为菌株CCTCCAB200051的Eae基因的实时荧光RT-PCR扩增曲线；
图12为菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb基因表达相对定量结果；
图13为本方法检测Stx1、Stx2、Flic、Rfb基因的溶解曲线图；
图13A为本方法检测Stx1基因的溶解峰；
图13B为本方法检测Stx2基因的溶解峰；
图13C为本方法检测Flic基因的溶解峰；
图13D为本方法检测Rfb基因的溶解峰；
图13E为本方法检测Eae基因的溶解峰。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实验材料
菌株：
大肠杆菌O157菌株CCTCCAB200051由珠海出入境检验检疫局技术中心提供；大肠杆菌O157菌株IQIC10102由中国检验检疫科学研究提供；大肠杆菌O157菌株ATCC43889和一株野生O157菌株及其他7株相近菌株：阪崎肠杆菌ATCC12868、小肠耶尔森氏菌CMCC52207、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、志贺氏菌CMCC51334、绿脓杆菌ATCC9027、金黄色葡萄球菌CMCC26003、副溶血性弧菌菌株VPL4由本申请人实验室保藏。
培养基：
肠道菌增菌肉汤、EMB平板、营养肉汤均购于北京陆桥技术有限责任公司；血平板购于广州环凯生物科技有限公司；菌种保存管MicrobankTM购自加拿大Prolab公司。
试剂盒：
LIVE/
Figure BDA0000481590740000061
BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit(L34856)购自Invitrogen公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司，荧光RT-PCR试剂盒购自上海生工生物工程公司。
其它试剂
Taq酶和dNTP购自TAKARA公司；DNA Marker购自北京全式金公司。
缓冲液
50×TAE buffer(1L)：242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，17g EDTA；
0.85%NaCl：0.85g NaCl，100mL ddH2O。
实施例1：引物设计及其特异性检测
从GenBank上获得大肠杆菌O157的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因的DNA序列,采用DNAStar软件中的Seqman进行同源性分析,确定在大肠杆菌O157菌株内保守、其他菌株间特异的片段,利用生物软件Primer Express2.0对该保守片段设计引物。通过对GenBank数据库中所有生物核苷酸序列进行BLAST同源性比较分析,证实所选设计的引物对大肠杆菌O157具有高度特异性,其序列如下见表1，表1为实时荧光RT-PCR检测的引物序列。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
表1
Figure BDA0000481590740000071
利用设计的大肠杆菌O157的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因的扩增引物，对4株大肠杆菌O157：ATCC43889、O157野生株、CCTCCAB200051、IQIC10102和7株相近菌株：阪崎肠杆菌ATCC12868、小肠耶尔森氏菌CMCC52207、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、志贺氏菌CMCC51334、绿脓杆菌ATCC9027、金黄色葡萄球菌CMCC26003、副溶血性弧菌菌株VPL4分别进行PCR扩增检测，具体方法如下：
（1）大肠杆菌O157的菌株保藏：将选择平板上的单菌落接种血平板于36℃±1℃下培养16-18小时，然后挑取3-4环接种环菌苔到液体保存剂中，使用的菌种保存管是购自加拿大Prolab公司的MicrobankTM菌种保存管，盖好瓶盖并颠倒4-5次让冷冻保存小珠充分吸附微生物，然后将保存剂尽可能吸掉，盖上瓶盖并置于-70℃长期贮存。使用时无菌条件下挑取一颗小珠于液体培养基中复苏培养即可待用，液体培养基可以是普通营养肉汤和肠道菌增菌液都可以。
（2）大肠杆菌复壮：将菌种置于肠道菌增菌肉汤中36℃±1℃下培养16-18小时，在EMB平板上分离划线，然后挑取单个菌落接种于血平板，并置36℃±1℃纯培养16-18小时，备用。
（3）VBNC状态诱导：将复壮后的大肠杆菌分别划线接种于EMB平板，挑取平板上的单个菌落于10mL营养肉汤中36±1℃纯培养24小时后，4500rpm4℃离心10min，弃去上清液。用5mL4℃灭菌纯水清洗沉淀，再以4500rpm4℃离心10min，弃去上清液，同样操作重复3次，然后将沉淀加入200mL的无菌纯水中，置于4℃冰箱保存。新制样本当天立即取1mL于9mL生理盐水作10倍梯度稀释，选择合适的稀释度吸取1mL菌液计算平板菌落数。此菌落数为样本的原始接种量。之后每隔7天以同样的操作对样本进行平板菌落计数。直至常规培养条件下平板菌落计数为0，表明细菌已经进入VBNC(viablebutnon-culture,是有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养)状态。
（4）细菌RNA制备：细菌RNA提取由RNA提取试剂盒在核酸提取仪上自动完成，提取试剂盒产品型号为Magtration-MagaZorb RNA Common Kit。
（5）逆转录：逆转录使用试剂盒进行体系配制，试剂盒型号为RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit。
Figure BDA0000481590740000081
充分混合均匀后，在PCR仪上进行反应：25℃5min；42℃60min；70℃5min。反应完成后样品置于-20℃冰箱保存备用。
（6）实时荧光定量PCR检测
用逆转录cDNA作为荧光RT-PCR扩增的模板，使用两步法进行，按如下扩增程序进行：95℃10min；95℃15s→58℃60s，40次循环。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0000481590740000082
使用的引物浓度如下：Stx1的引物浓度为200nM，Stx2的引物浓度为300nM，Flic的引物浓度为300nM，Rfb的引物浓度为300nM，Eae的引物浓度为200nM。
在退火阶段收集荧光。扩增和检测在ABI-7300实时荧光定量PCR仪器上进行。
结果见图1-图5，图1为4株大肠杆菌O157的stx1基因的PCR扩增结果图，从左至右分别为分子标记和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；图2为4株大肠杆菌O157的stx2基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；图3为4株大肠杆菌O157的flic基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；图4为4株大肠杆菌O157的rfb基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；图5为4株大肠杆菌O157的eae基因的PCR扩增结果，从左至右分别为Ladder Marker和大肠杆菌O157：ATCC43889、O157、CCTCCAB200051、IQIC10102；由图1-图5的结果显示，只有大肠杆菌O157出现典型的扩增条带，而其它菌株均没有扩增产物，表明设计的引物特异性针对大肠杆菌O157的相应基因。说明，本实施例的引物具有较好的特异性。
实施例2：细菌计数结果
死/活细胞计数采用LIVE/
Figure BDA0000481590740000091
BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit进行。取1mL样品，10,000xg离心5分钟，弃上清获得细胞沉淀；加1mL0.85%的NaCl洗涤细胞，10,000xg离心5分钟，弃上清获得细胞沉淀；加1mL0.85%的NaCl重新悬浮细胞，备用。在流式管中加入977uL0.85%的NaCl溶液，然后分别加入1.5uL3.34mM的SYTO9和1.5uL30mM的PI染料，加入10uL的细胞样品，室温避光孵育15分钟。最后，加入10uL含有荧光标记的微球，充分悬浮混匀后在流式细胞仪上检测。
图6为大肠杆菌CCTCCAB200051的生长曲线；将接种到纯水中的大肠杆菌O157静置于4℃的冰箱中，由于纯水中的有机物含量很低，又处于低温条件下,细菌不能正常地生长繁殖，可培养的菌数逐渐下降，由图6可见，在第61天的时候到达零，说明此时细菌已经进入VBNC状态。
实施例3：大肠杆菌实时荧光RT-PCR检测体系的优化
1、最佳扩增程序的确定
用逆转录cDNA作为荧光RT-PCR扩增的模板，以300nM浓度的引物，使用两步法进行实时荧光RT-PCR将退火和延伸温度设定为同一温度扩增。在反应程序的退火延伸条件选择3个不同的温度，结果显示在58℃、60℃和62℃三个退火延伸温度的扩增程序下，Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae五个基因均可见阳性扩增曲线，随着退火和延伸温度的提高，扩增时间延长。图7为最佳扩增程序的确定实验结果图，其中（A）-（C）分别表示菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因在不同的退火和延伸温度下的扩增曲线；为得到较好的扩增曲线图，最后确定扩增程序为：95℃10min；95℃15s→58℃60s，40次循环。
2、最佳引物浓度的确定
应用上述反应程序，分别选择引物浓度100nM、200nM、300nM、400nM、500nM进行扩增。图8为最佳浓度引物的实时荧光RT-PCR实验结果图，其中（A）-（E）分别代表菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因在不同浓度引物条件下的扩增曲线，从左往右分别代表500nM、400nM、300nM、200nM、100nM引物浓度下的扩增曲线；以Ct值最小，扩增曲线也较明显的曲线所对应的引物浓度为最佳浓度。最终确定Stx1的引物浓度为200nM，Stx2的引物浓度为300nM，Flic的引物浓度为300nM,Rfb的引物浓度为300nM，Eae的引物浓度为200nM。
实施例4：灵敏度试验
用第85天进入VBNC状态的细菌为阳性模板，此时菌株CCTCCAB200051每毫升含有的VBNC细菌数为3.7×104CFU，用纯水进行10倍稀释，按照优化的反应体系和反应程序检测荧光RT-PCR方法的灵敏度。结果见图9和图10，图9为菌株CCTCC AB200051的Flic基因扩增曲线，1-5分别代表含有3.7×104CFU/ml～3.7×100CFU/ml模板量时的扩增曲线；图10为菌株CCTCC AB200051的Rfb基因扩增曲线，1-5分别代表含有3.7×104CFU/ml～3.7×100CFU/ml模板量时的扩增曲线；图9和图10的结果表明，Flic基因在菌株CCTCCAB200051中的最低检测限为3.7×101CFU；Rfb基因在菌株CCTCCAB200051中的最低检测限为3.7×102CFU，以Flic基因检测活的不可培养状态的大肠杆菌O157灵敏度更高。
实施例5：实时荧光RT-PCR检测大肠杆菌不同时期基因表达
根据以上优化的PCR扩增条件，分别以不同时间收集的cDNA为模板进行实时荧光RT-PCR扩增。得到Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因的扩增曲线，结果见图11，图11为实时荧光RT-PCR扩增曲线，（A）-（E）分别代表菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae基因的扩增曲线。以Eae作为内参，对Stx1、Stx2、Flic、Rfb基因在不同时期的表达情况进行相对定量分析，结果见图12，图12为菌株CCTCCAB200051的Stx1、Stx2、Flic、Rfb基因表达相对定量结果，由结果表明，Stx1和Stx2基因表达水平持续下降，当进入VBNC状态时下降更为显著。Flic、Rfb基因一直处于比较高的表达量，呈现略微下降趋势，即使是进入VBNC状态以后，他们的表达量也比较恒定。
为了进一步证明反应体系中扩增片段的特异性，在PCR反应结束后进行溶解曲线分析。溶解曲线结果见图13，其中，（A）-（E）分别代表Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae的溶解峰，结果表明，Stx1、Stx2、Flic、Rfb、Eae都只有单一的溶解峰，说明三个基因在建立的反应体系中特异扩增。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式中的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<120>一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR引物组及其检测方法
<160>10
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列Stx15’FP
<222>(1)...(20)
<400>1
tgcagataaa tcgccattcg                        20
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列Stx13’RP
<222>(1)...(21)
<400>2
agtgaggttc cactatgcga c                        21
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列Stx2’FP
<222>(1)...(20)
<400>3
gggcagttat tttgctgtgg                        20
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列Stx2’RP
<222>(1)...(20)
<400>4
ggtcaaaacg cgcctgatag                        20
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列Flic5’FP
<222>(1)...(23)
<400>5
gctgcaacgg taagtgattt aac23
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列Flic3’RP
<222>(1)...(21)
<400>6
ctgtcgtggt gtttaacttc g                        21
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列Rfb5’FP
<222>(1)...(23)
<400>7
tactacaggt gaaggtggaa tgg                        23
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列Rfb3’RP
<222>(1)...(23)
<400>8
tgcctatgta cagctaatcc ttg                        23
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列Eae5’FP
<222>(1)...(25)
<400>9
acagtgcact accactttta ggttc                        25
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列Eae3’RP
<222>(1)...(23)
<400>10
gtcagtttat tcgtgtgacc agc                        23
Figure IDA0000481590820000011

Claims (4)

1.一种检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR引物组，其特征在于，所述引物组检测的基因区域为Stx1、Stx2、Flic、Rfb和Eae基因区域。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的引物序列如下：
Stx15’FP TGCAGATAAATCGCCATTCG
Stx13’RP AGTGAGGTTCCACTATGCGAC
Stx2’FP GGGCAGTTATTTTGCTGTGG
Stx2’RP GGTCAAAACGCGCCTGATAG
Flic5’FP GCTGCAACGGTAAGTGATTTAAC
Flic3’RP CTGTCGTGGTGTTTAACTTCG
Rfb5’FP TACTACAGGTGAAGGTGGAATGG
Rfb3’RP TGCCTATGTACAGCTAATCCTTG
Eae5’FP ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTC
Eae3’RP GTCAGTTTATTCGTGTGACCAGC。
3.一种应用权利要求1或2所述的引物组检测活的不可培养状态大肠杆菌O157的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）大肠杆菌O157的菌株保藏；
（2）大肠杆菌O157的复壮；
（3）活的不可培养状态诱导；
（4）细菌RNA制备；
（5）逆转录；
（6）实时荧光定量PCR检测：
扩增程序：95℃10min；95℃15s→58℃60s，40次循环；
PCR反应体系如下：
Figure FDA0000481590730000011
Figure FDA0000481590730000021
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述引物组中的引物的使用浓度为：Stx1引物的浓度为200nM，Stx2引物的浓度为300nM，Flic引物的浓度为300nM，Rfb引物的浓度为300nM，Eae引物的浓度为200nM。
CN201410114789.3A 2014-03-25 2014-03-25 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法 Expired - Fee Related CN103866028B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410114789.3A CN103866028B (zh) 2014-03-25 2014-03-25 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410114789.3A CN103866028B (zh) 2014-03-25 2014-03-25 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103866028A true CN103866028A (zh) 2014-06-18
CN103866028B CN103866028B (zh) 2016-06-15

Family

ID=50905029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410114789.3A Expired - Fee Related CN103866028B (zh) 2014-03-25 2014-03-25 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103866028B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946736A (zh) * 2014-10-31 2015-09-30 上海市计量测试技术研究院 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用
CN105779585A (zh) * 2015-12-18 2016-07-20 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组、试剂盒及pcr检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1661113A (zh) * 2005-01-21 2005-08-31 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针
CN1844924A (zh) * 2006-02-28 2006-10-11 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 产志贺毒素大肠杆菌核酸纯化血清鉴定试剂盒
CN101760514A (zh) * 2008-12-25 2010-06-30 天津生物芯片技术有限责任公司 检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1661113A (zh) * 2005-01-21 2005-08-31 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针
CN1844924A (zh) * 2006-02-28 2006-10-11 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 产志贺毒素大肠杆菌核酸纯化血清鉴定试剂盒
CN101760514A (zh) * 2008-12-25 2010-06-30 天津生物芯片技术有限责任公司 检测食品和临床样品中致泻性大肠杆菌的基因芯片和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAI J.等: "A multiplex PCR procedure for the detection of six major virulence genes in Escherichia coli O157:H7", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》, vol. 82, no. 1, 31 July 2010 (2010-07-31), pages 85 - 89, XP027072082, DOI: 10.1016/j.mimet.2010.05.003 *
许龙岩等: "MPCR-DHPLC检测大肠杆菌O157研究", 《中国卫生检验杂志》, vol. 22, no. 5, 30 May 2012 (2012-05-30), pages 1057 - 1059 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946736A (zh) * 2014-10-31 2015-09-30 上海市计量测试技术研究院 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用
CN104946736B (zh) * 2014-10-31 2018-12-28 上海市计量测试技术研究院 一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其应用
CN105779585A (zh) * 2015-12-18 2016-07-20 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组、试剂盒及pcr检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103866028B (zh) 2016-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Development and application of a simple loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection of Listeria monocytogenes strains
CN105112519A (zh) 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
CN103642910B (zh) 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
Li et al. Formation and control of the viable but non-culturable state of foodborne pathogen Escherichia coli O157: H7
CN102127592B (zh) 快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的pcr方法及试剂盒
CN102851385A (zh) 利用lamp检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒
Azap et al. Value of automatized blood culture systems in the diagnosis of continuous ambulatory peritoneal dialysis peritonitis
CN102363815A (zh) 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
CN101144775A (zh) 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒及其应用
EP3902929A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella&#39;s classical culture method
CN102337344B (zh) 一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒
CN102154472A (zh) 一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法
CN108728559A (zh) 检测大肠埃希氏菌o157的rpa引物、探针、试剂盒和方法
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN103866028A (zh) 一种检测活的不可培养状态大肠杆菌o157的荧光pcr引物组及其检测方法
CN104946754A (zh) 一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒
CN103667271B (zh) 定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用
CN102226215B (zh) 用于检测a、c、g群溶血性链球菌的荧光pcr引物、探针及方法
CN104726550A (zh) 一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒
CN102220426B (zh) 副猪嗜血杆菌pcr检测试剂盒
CN103602727B (zh) 一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
CN101906487A (zh) 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法
CN102605069B (zh) 肠出血性大肠杆菌o104︰h4检测试剂盒
CN106755411A (zh) 海产品副溶血性弧菌toxR基因的实时荧光定量PCR快速检测引物及其试剂盒
CN104611459A (zh) 一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重pcr快速检测的试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160615

Termination date: 20200325