CN107663545A

CN107663545A - 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组及应用

Info

Publication number: CN107663545A
Application number: CN201710852246.5A
Authority: CN
Inventors: 温和心; 龙英全; 蒋荣华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-02-06

Abstract

发明涉及生物技术领域，具体涉及一种验检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组，内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，检测方法包括以下步骤：首先提取待测菌的基因组DNA，再以提取的基因组DNA为模板进行LAMP扩增，然后对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森氏菌，试剂盒包括还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine，所述快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的LAMP引物组具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

Description

检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组及应用。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌能致人和其它多种动物发生胃肠炎、关节炎、败血症及结节性红斑等病，是非常重要的人畜共患病病原。该细菌在我国的分布非常广泛，从人群、动物、外环境和食品都可以分离出病原菌。该病与人们日常生活关系密切，流行病学研究表明，小肠结肠炎耶尔森氏菌能在冷藏温度下生长繁殖，故冰箱是耶尔森氏菌小肠结肠炎重要的传染源，俗称“冰箱菌”。

传统的分离鉴定方法检验小肠结肠炎耶尔森氏菌，从中温增菌到确定细菌的血清型、生物型大约需要1周的时间，不仅费力而且需要时间长。环介导等温扩增（LAMP）技术优点是一是设备简单，只需要水浴锅温育即可，不需要复杂或贵重仪器。二是快速高效，核酸扩增在l小时内即可完成。三是特异性高，要求4 种特异性引物，引物不匹配不能进行核酸扩增。四是高灵敏度，荧光PCR 的灵敏度相当，比PCR 高10～100倍。五是成本低廉，特别适合现场检疫和基层单位如防疫站检疫或养殖场检疫。LAMP技术的核心要素是引物，引物的优劣决定着各种形式LAMP试验性能，LAMP引物共有内引物对和外引物对4条，设计要求较高，要求引物组对靶DNA扩增性能好，对小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性反应，还要求4条引物之间或自身不能发生退火情况发生，否则容易产生假阳性。但扩增效率高、特异性强、无假阳性LAMP引物的设计成功率不高，需要从大量的引物中去测试，最后选择出符合要求的引物组。所以小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP引物组是经过实践检验的科研成果，对小肠结肠炎耶尔森氏菌检验有较高的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源（截至2013年8月5日数据）进行小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP引物的设计，提供了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组及应用。

本发明的一个目的在于提供2组引物，各含1对上下游内引物和1对上下游外引物，引物DNA序列信息如下：

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-TAAGGCGTACAGCGCACA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-ACCTTACCGACGCTTTTCG-3’(SEQ ID NO：2)；

上游内引物FIP_A：5’-CGAACACACTCTGCGTCGTTGT-CCGGAGTGAACGCTACGT-3’(SEQ IDNO：3)；

下游内引物BIP_A：5’-AAGCGACTAAGCGTACACGGTG-GATTAGCACGCCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO：4)；

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-AGTACTGAGATAAGGATTAACCT-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-AGATGTTTCTTCTTTATTGGTGT-3’(SEQ ID NO：6)；

上游内引物FIP_B：5’-CGCTCACACTGCAACAATGAT-GTATTAGAGTCTCTCAAATAATCGC-3’(SEQID NO：7)；

下游内引物BIP_B：5’-GCAACCGGAGTGAACGCTAC-CTACGAACACACTCTGCG-3’(SEQ ID NO：8)；

本发明的另一个目的在于，提供一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，包括能检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组特异碱基序列的环介导恒温扩增试验引物组，还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine；

本发明的另一个目的在于，提供了一种小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测菌的基因组DNA；

（2）以提取的基因组DNA为模板，使用本发明的引物组进行环介导恒温扩增；

（3）对扩增产物进行检测，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在肠结肠炎耶尔森氏菌；

其中，所述LAMP扩增的反应程序为：

（1）90~98℃热水浴0.5~3min；

（2）50℃水浴反应0.5~3min;

（3）63℃水浴反应0.5~2h；

（4）80℃水浴终止反应1~8min；

进一步的，所述LAMP扩增反应体系中MgSO₄的终浓度为 2.5~5 mM/L，dNTPs的终浓度为1mM~4mM/L，F3和B3引物的终浓度为0.05μM/L ~0.5μM/L，FIP和BIP引物的终浓度为0.5~1μM/L， Bst DNA聚合酶的终浓度为0.2~2 U/μL，Betaine的终浓度为0.5~3 M/L；

进一步的，所述LAMP扩增反应体系中MgSO₄的终浓度为3.2 mM/L，dNTPs的终浓度为1.4mM/L，F3和B3引物的终浓度为0.08μM/L，FIP和BIP引物的终浓度为0.64μM/L，Bst DNA聚合酶的终浓度为0.32 U/μL，Betaine的终浓度为0.8 M/L。

本发明快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法包括但不限于，电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测优选为凝胶电泳检测法，电泳检测结果中，如电泳图呈特征性梯状条带，则待测样品呈小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性，含有小肠结肠炎耶尔森氏菌；如电泳图不呈特征性梯状条带，则待测样品呈小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性。所述浊度检测，是肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显浑浊，则待测样品呈小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性，含有小肠结肠炎耶尔森氏菌；如未见浑浊，则待测样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性，含有小肠结肠炎耶尔森氏菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性。所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限定羟基萘酚兰，反应后颜色为蓝紫色，则待测样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性；如反应颜色为蓝绿色，则待测样品为小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性。

本发明的有益效果为：

本发明为食品安全检测技术、疾病诊断、动物检疫等领域提供了一种简单快速灵敏的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组，具有较大意义。本发明引物组可应用于各种形式的环介导恒温扩增检测小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA试验，引物组具有灵敏度高、特异性强等优点，可获得20cfu/反应（25uL反应体系）的敏感度，引物组仅对小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA反应，对常见肠道细菌无反应。操作简便、可重复性强，具有很好的实用性等优点。采用本发明的引物组检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

附图说明

图1、LAMP扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M是DNA分子量标准、泳道1~7是小肠结肠炎耶尔森氏菌的浓度梯度稀释液，其浓度分别为10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、10¹cfu/mL、泳道N为阴性对照；

图2、LAMP反应产物沉淀图，从左到右管中小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度分别为10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、10cfu/mL、管8为阴性对照；

图3、PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，泳道M是DNA分子标准、1～6小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度分别为10⁷cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、泳道N为阴性对照。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图。对本发明进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：

本实施例用来说明本发明引物组对不同形式LAMP检测的通用性，所述不同形式LAMP检测包括电泳法LAMP、沉淀法LAMP和显色法LAMP，其步骤如下：

（1）小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度配制

用于检测的小肠结肠炎耶尔森氏菌来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC21565。将36℃培养过夜的小肠结肠炎耶尔森氏菌纯培养物12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用0.9%生理盐水洗涤离心1次，沉淀物用ddH₂O重悬，用麦氏浊度法标定细菌浓度，即1MCF≈3×10⁸ cfu/mL。分别稀释成10⁶cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL、10¹cfu/mL、10⁰cfu/mL细菌浓度梯度。

（2）基因组DNA的提取

取各浓度梯度小肠结肠炎耶尔森氏菌液隔水煮沸15min，12000rpm 离心10min，取上清即为细菌DNA，冷冻备用。

（3）以提取的各浓度的小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA为模板，采用本发明的试剂盒，并按表1中所述条件配制反应体系，取7个反应管，向反应管中分别加入除Bst酶和矿物油外的试剂，以ddH2O为阴性对照；混匀后将反应管置于95℃热水浴1min，立即转入50℃水浴反应1min。打开反应管，加入Bst酶，混匀，再加入100μL矿物油覆盖液面，盖好管盖。移至63℃水浴反应1.5h，反应完毕移至80℃水浴，2min后终止反应。

（4）通过电泳检测、浊度检测和显色检测，进行扩增结果确认。

所述电泳检测是指取用4μL扩增产物，用2.5 %的琼脂糖凝胶进行检测，检测结果见表2和图1，浊度法LAMP用目测沉淀检测结果（图2），显色法LAMP根据由着色变化来检测结果。

表明本发明的引物组及反应体系能够很好的对小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性片段进行扩增并适用于多种检测方法。

表1 快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的LAMP的试剂盒及其主要成分

试剂	体积	终浓度
			Bst DNA聚合酶缓冲液（10×）	2.5μL	1×
BstDNA聚合酶（8U/μL）	1μL	0.32 U/μL
			dNTPs（10mM）	3.5μL	1.4 mM/L
MgSO₄	0.8μL	3.2 mM/L
			Betaine （5M）	4μL	0.8 M/L
F3（20μM）	0.1μL	0.08μM/L
			B3（20μM）	0.1μL	0.08μM/L
FIP（20μM）	0.8μL	0.64μM/L
			BIP（20μM）	0.8μL	0.64μM/L
total DNA	2μL
			ddH₂O	9.4μL
矿物油	100μL

表2 实施例1中本发明引物组对不同形式LAMP检测的通用性检测结果

引物组	电泳法LAMP	沉淀法LAMP	显色法LAMP
				引物组A	阳性电泳图呈现特征性阶梯条带，最低能检测10³cfu/mL，阴性对照无扩增条带。	阳性管反应液变混浊，离心后有沉淀，最低能检10³cfu/mL。阴性对照未见沉淀。	阳性管显示蓝绿色，最低能检测10³cfu/mL。阴性对照仍为蓝紫色。
引物组B	结果同上	结果同上	结果同上

注：所述电泳法LAMP是指通过琼脂糖凝胶电泳来检测扩增产物，阳性结果电泳图呈现特征性阶梯条带，阴性对照无扩增条带。所述沉淀法LAMP用目测浊度观察检测结果，阳性管反应液变混浊，离心后有沉淀，阴性对照未见沉淀。所述显色法LAMP用目测着色变化来观察检测结果，其反应体系在表1的基础上加入羟基萘酚兰，终浓度为120μM。

实施例2-5小肠结肠炎耶尔森氏菌反应体系和检测方法:

小肠结肠炎耶尔森氏菌的浓度梯度稀释及基因组DNA的提取步骤如实施例1中的步骤（1）、（2），反应体系见表3，其中，实施例2和3的引物采用引物组A，实施例4和5的引物采用引物组B，并通过浊度检测进行扩增结果确认。由表3可以看出，本发明引物组、检测方法及反应体系能够很好的对小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。

表3 实施例2~5各反应体系、反应条件及反应结果

实施例6：

本实施例用来比较本发明引物组环介导恒温试验与PCR和荧光PCR的灵敏度

小肠结肠炎耶尔森氏菌的稀释方法、DNA提取方法及反应体系同实施例1，将各稀释度的小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA分别加入PCR和荧光PCR和显色LAMP反应体系，显色LAMP应用引物组A，反应体系和反应条件参照实施例1方法进行。

所述PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环。

反应体系如下：PCR预混液12.5uL，上、下游引物p1、p2各1uL，DNA模板2uL，补去离子水至25uL。

所述上游引物p1序列为：（5’-AATGTTCAGATATCGCATC-3’）SEQ ID NO：9）；

所述下游引物p2列为：（5’-CCGTTATGACACTGTCGCCT-3’）（SEQ ID NO：10）；

PCR扩增S1序列如下：（5’-aatgttcagatatcgcgtcggtataatcaaatgccgcaacttgcgtattgttattaccggccgtcaggcggaaatgaccttcagaagtaaactgtgggcgcttggaagtcatcattactacgccaccagggatgctctggccatataacgcagaagatgggcctttgataacatcaatacgctcaaggaaccacgggtccacttgcagcacattataactgccaccatcactgagtaagcgcagcccatcaaggaaggtattgttcacatcaccgccgtggaaaccgcgcaaggcgacagtgtcataacgg-3’）（SEQ ID NO：11）

所述荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火、延伸34s，共40个循环。

所述反应体系如下：荧光定量PCR预混液10μL，20μm/L的上游引物P3、下游引物P4各1μL，TaqMan 探针1μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 5μL。

所述上游引物p3序列为：（5’-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3’）（SEQ ID NO：12）；

所述下游引物P4序列为：（5’-ATCCCAATCACTACTGACTTC-3’）（SEQ ID NO：13）；

所述TaqMan探针序列为：（5’-CAAGCAAGCTTGTGATCCTCCG-3’）（ SEQ ID NO：14）。

荧光PCR扩增序列S2如下：（5’-aatgctgtcttcatttggagcattcggccaagaaacagtttcagggcagttcagtgatgcattatcgacaccaataaccgctgaggtatacaagcaagcttgtgatcctccgctgccaccagccgaagtcagtagtgattgggat-3’）（ SEQ ID NO：15）；

PCR检测结果如图3所示，PCR扩增的灵敏度是10⁴cfu/mL（相当于200菌/反应），荧光定量PCR和显色LAMP的灵敏度都是10³cfu/mL（相当于20菌/反应），显色LAMP与荧光定量PCR灵敏度相当，比PCR高10倍。

实施例7：

本实施例用来说明小肠结肠炎耶尔森氏菌引物组环介导恒温试验的特异性。

收集试验方法：收集肠道常见菌（小肠结肠炎耶尔森氏菌除外）16株，将这些菌株与小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株分别进行培养，参照实施1方法进行细菌浓度配制和提取细菌DNA，并参照实施例2的反应体系和条件，选用引物组A进行显色LAMP扩增。

检测结果见表4，结果显示仅有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株扩增反应后的产物呈现为蓝绿色，为阳性结果。而其他非小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为蓝紫色，为阴性结果。本发明引物组具有良好的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株特异性，即只有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株扩增阳性，其他非小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株为阴性。

表4本发明引物组的特异性试验所用菌株及检测结果

菌株编号	拉丁名称	中文名称	菌株来源	扩增结果
					1	Yersinia pestis	鼠疫耶尔森氏菌疫苗株	EV76	-
2	Yersinia pseudotuberculosis	假结核耶尔森氏菌	CMCC(B) 53504	-
					3	Escherichoia coli EPEC O26:K60	致病性大肠埃希氏菌	CICC 10372	-
4	Salmonella typhi	伤寒沙门氏菌	CMCC50039	-
					5	Shigella dysenteriae	痢疾志贺氏菌	CGMCC 1.1869	-
6	Campylobacter jejuni	空肠弯曲杆菌	ATCC33291	-
					7	Streptococcus hemolytic	乙型溶血性链球菌	CICC 10373	-
8	Listeria monocytogenes	单核增生李斯特菌	CMCC(B) 54002	-
					9	Enterococcus faecalis	粪肠球菌	ATCC35667	-
10	Staphylococcus aureus	金黄色葡萄球菌	CICC21600	-
					11	Staphylococcus epidermidis	表皮葡萄球菌	CGMCC1.4260	-
12	Pseudomonas aeruginosa	铜绿假单孢菌	CMCC(B) 10104	-
					13	Clostridium perfringens	产气夹膜梭菌	ATCC13124	-
14	Klebsiella peneumoniae	肺炎克雷伯氏菌	CMCC(B) 46117	-
					15	Cronobacter sakazakii	阪崎杆菌	CICC 21560	-
16	Proteus mirabilis	奇异变形杆菌	ATCC25933	-
					17	Yersinia enterocolitica	小肠结肠炎耶尔森氏菌	CICC 21565	+
18	NTC	阴性对照		-

注：1、CGMCC：中国普通微生物菌种保藏中心，CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心，CMCC：中国医学细菌菌种保藏管理中心，ATCC：美国模式培养物集存库。

2、“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 温和心龙英全蒋荣华

<120> 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组及应用

<130> 10

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taaggcgtac agcgcaca 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accttaccga cgcttttcg 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaacacact ctgcgtcgtt gtccggagtg aacgctacgt 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcgactaa gcgtacacgg tggattagca cgcccttcat cg 42

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtactgaga taaggattaa cct 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agatgtttct tctttattgg tgt 23

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgctcacact gcaacaatga tgtattagag tctctcaaat aatcgc 46

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaaccggag tgaacgctac ctacgaacac actctgcg 38

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatgttcaga tatcgcatc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgttatgac actgtcgcct 20

<210> 11

<211> 311

<212> DNA

<213> Y.enterocolitica

<400> 11

aatgttcaga tatcgcgtcg gtataatcaa atgccgcaac ttgcgtattg ttattaccgg 60

ccgtcaggcg gaaatgacct tcagaagtaa actgtgggcg cttggaagtc atcattacta 120

cgccaccagg gatgctctgg ccatataacg cagaagatgg gcctttgata acatcaatac 180

gctcaaggaa ccacgggtcc acttgcagca cattataact gccaccatca ctgagtaagc 240

gcagcccatc aaggaaggta ttgttcacat caccgccgtg gaaaccgcgc aaggcgacag 300

tgtcataacg g 311

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatgctgtct tcatttggag c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcccaatca ctactgactt c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caagcaagct tgtgatcctc cg 22

<210> 15

<211> 145

<212> DNA

<213> Y.enterocolitica

<400> 15

aatgctgtct tcatttggag cattcggcca agaaacagtt tcagggcagt tcagtgatgc 60

attatcgaca ccaataaccg ctgaggtata caagcaagct tgtgatcctc cgctgccacc 120

agccgaagtc agtagtgatt gggat 145

Claims

1.检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列分别如下所示：

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-TAAGGCGTACAGCGCACA-3’

下游外引物B3_A：5’-ACCTTACCGACGCTTTTCG-3’

上游内引物FIP_A：5’-CGAACACACTCTGCGTCGTTGT-CCGGAGTGAACGCTACGT-3’

下游内引物BIP_A：5’-AAGCGACTAAGCGTACACGGTG-GATTAGCACGCCCTTCATCG-3’

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-AGTACTGAGATAAGGATTAACCT-3’；

下游外引物B3_B：5’-AGATGTTTCTTCTTTATTGGTGT-3’ ；

上游内引物FIP_B：5’-CGCTCACACTGCAACAATGAT-GTATTAGAGTCTCTCAAATAATCGC-3’；

下游内引物BIP_B：5’-GCAACCGGAGTGAACGCTAC-CTACGAACACACTCTGCG-3’。

2.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括作为阳性对照的小肠结肠炎耶尔森氏菌的基因组DNA，作为阴性对照的不含DNA的环介导恒温扩增体系，如ddH₂O。

4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，包括BstDNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄和Betaine。

5.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测菌的基因组DNA；

（2）以提取的基因组DNA为模板，使用如权利要求1所述引物组进行环介导恒温扩增；

（3）通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在小肠结肠炎耶尔森氏菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的环介导恒温扩增的反应程序为：

（1）90~98℃热水浴0.5~3min；

（2）50℃水浴反应0.5~3min；

（3）63℃水浴反应0.5~2h；

（4）80℃水浴终止反应1~8min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中环介导恒温扩增的反应体系中MgSO₄的终浓度2.5~5 mM/L，dNTPs的终浓度为1mM~4mM/L，F3和B3引物的终浓度为0.05μM/L ~0.5μM/L，FIP和BIP引物的终浓度为0.5~1μM/L，Bst DNA聚合酶的终浓度为0.2~2 U/μL，Betaine的终浓度为0.5~3 M/L。