CN112725480B

CN112725480B - 一种利用lamp技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒

Info

Publication number: CN112725480B
Application number: CN202110070992.5A
Authority: CN
Inventors: 刘洪涛; 叶诚; 曹亚楠; 郑军平; 胡海明; 杨化冰; 张志刚; 殷明珠
Original assignee: Wuhan Customs Technical Center
Current assignee: Wuhan Customs Technical Center
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112725480A

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒。本发明选用沙门菌毒力基因SirA(U88651.1)，该基因作为控制鼠伤寒沙门氏菌肠道致病毒力功能的主要调节基因，具有增强沙门菌致病岛中的hilA和prgH毒力基因表达的功能，所以选择其作为特异性靶标，设计了4条能在62‑68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过HNB染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测沙门菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规PCR高。

Description

一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒。

背景技术

伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的食源性致病菌，包含多种常见血清型，属于沙门氏菌中毒力最强的致病菌。伤寒沙门氏菌中毒的症状主要以急性肠胃炎为主，潜伏期一般为四至四十八小时，短期是数小时，长期是两天至三天；前期症状有恶心、头疼，全身乏力和发冷等，主要症状有呕吐、腹泻、腹疼，粪便以黄绿色水样便，有时带脓血和黏液，一般发热的温度在三十八摄氏度至四十摄氏度，重病人出现打寒战、惊厥、抽搐和昏迷的症状。伤寒发病率在我国食源性疾病中占比较高，每年近十万人感染此病菌，对食品中伤寒沙门氏菌进行精准检测是保障食品安全和指导细菌治疗的重要手段。

目前针对食源性致病菌的检测主要有培养鉴定法、酶联免疫吸附法、PCR分析法。细菌培养法是病原菌检测的金标准，但需4-7天出结果，操作繁琐、耗时费力，在敏感性与特异性方面存在局限性，只能检测活细菌，且需要熟练操作经验。酶联免疫吸附法(ELISA)在特异性方面较好，但依赖于酶标仪等专业设备。各种PCR技术主要通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察或者荧光曲线等分析病原菌，检测敏感、准确、迅速，但仍依赖昂贵的PCR仪，检测成本较高，对实验技术要求较高，难以胜任现场化便携式快速检测。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新的等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应。该技术具有PCR仪非依赖性、检测结果可视化、反应时间短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适合病原微生物的检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组，序列为：

SirA-3F3：CCCGATCGACAGCGGATA

SirA-3B3：CAATCTGACTGAGCGCCAT

SirA-3FIP：GAGATAGCCAGCTGCGCCAGCTGACCGTCCATACGGAGAA

SirA-3BIP：CTCAGGAGGTGGTGAGCGCTCTGTTGAGCGATATCGGAGG

所述引物组靶向序列为SirA(U88651.1)基因。

本发明还披露了一种伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测试剂盒，包括权利要求1中所述的引物组。

进一步地，还包括2×LAMP缓冲液、Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶，10mM dNTPs，5MPCR级甜菜碱，20×Eva Green，120μM HNB。

还可以包括阴性对照和/或阳性对照，所述阴性对照为PUC57空载体质粒，所述阳性对照为插入了伤寒沙门氏菌sirA基因的PUC57载体。所述阳性对照为沙门菌标准菌株ATCC13076，ATCC14028，D68-4。

进一步地，所述2×LAMP缓冲液包括40mM Tris无酶，20mM KCl，16mM的MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％(v:v)Tween 20，2.8mM dNTPs，0.6M甜菜碱，pH 8.8。

本发明还提供了一种非诊断目的的伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测方法，LAMP反应体系为25μL：2×LAMP缓冲液12.5μL，内引物SirA-FIP：1μL，SirA-BIP：1μL，外引物：SirA-F3：1μL，SirA-B3：1μL，HNB：1μL；Eva Green：1μL；Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶：1μL，无酶水：3.5μL，DNA样品：2μL。

进一步地，反应条件：65℃恒温45min，90℃ 2min灭活；样品呈现天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性。

进一步地，样品用2-3％琼脂糖凝胶电泳检测出现梯形条带的为阳性，没有梯形条带的为阴性。

本发明还披露了如上述的引物组或试剂盒或检测方法在食品中伤寒沙门氏菌的检测中的应用。

本发明选用沙门菌毒力基因SirA(U88651.1)，该基因作为控制鼠伤寒沙门氏菌肠道致病毒力功能的主要调节基因，具有增强沙门菌致病岛中的hilA和prgH毒力基因表达的功能，所以选择其作为特异性靶标，设计了4条能在62-68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过HNB染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测沙门菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规PCR高。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明试剂盒可以快速(45分钟内)，特异地检测沙门氏菌，最低检出限为10^-6ng/μL。其操作简单，结果易于判读，适合进出口检疫、食品卫生及临床样本检测。

将本专利靶基因序列与已公布沙门菌LAMP专利中靶序列在NCBI进行相似性分析，结果如下表，其具体的比对信息见图8。

通过上表可知该靶序列特异性很好，完全区别于现有专利技术。

1、快速高效：从样品到结果在一小时内完成，扩增产物理论上是10⁸-10¹⁰个靶序列的拷贝。

2、操作简单，实用性强：反应体系被冻干只需加入对应体积的无酶水和DNA样品即可，不需要专业生物技术人员，反应不需要PCR仪器，简单的恒温装置即可比如水浴锅。

3、特异性强：根据LAMP反应原理只有当4条引物完全与靶序列匹配时才能快速高效进行扩增，使用上述引物组只能扩增沙门氏菌，对其他致病菌比如金黄色葡萄球菌，志贺杆菌等结果均为阴性。

4、高灵敏度：对沙门氏菌菌液的最低检测限是：10^-6ng/μL。

5、在检测条件有限的地区，利用本申请试剂盒可较为便捷地通过肉眼观察而判定检测结果，操作相对简单、设备依赖度低。

附图说明

图1是4组SirA引物扩增效率比较；

图2是LAMP反应特异性扩增曲线；

图3是LAMP反应产物琼脂糖胶电泳；

图4是LAMP反应后颜色变化；其中，1-11分别代表沙门菌ATCC 13076、沙门菌ATCC14028、沙门菌D68-4、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、肠出血性大肠杆菌(O157：H7)、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、空白对照组)；

图5是LAMP灵敏度测试结果；左侧为不同浓度模板所得扩增曲线，从左往右依次为1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL；右侧为模板浓度与检出时间的线性关系；

图6是镁离子浓度实验结果；(A，不同镁离子浓度对应的扩增曲线；B，镁离子浓度与检出时间的关系；C，镁离子浓度与最终荧光强度关系)；

图7是优选甜菜碱浓度实验结果；(A，不同甜菜碱浓度对应的扩增曲线；B，甜菜碱浓度与检出时间的关系；C，甜菜碱浓度与最终荧光强度关系)；

图8是本申请靶序列与现有技术的比对结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒。本发明所用菌种：沙门菌ATCC 13076、沙门菌ATCC 14028、沙门菌D68-4、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、肠出血性大肠杆菌(O157：H7)来自湖北海关，肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌均为本实验室保存。具体如下实施例所示。

实施例1沙门菌特异性LAMP检测方法的建立

1、纯培养细菌DNA提取

将3种沙门菌接种于LB液体培养基，37℃有氧条件下过夜。取菌液1mL用商品化细菌基因组提取试剂盒严格按照步骤进行提取基因组DNA，样品存于-20℃。

2、粪便模拟样品制备及DNA提取

取新鲜培养细菌300μL与2g无菌正常饲养小鼠粪便用PBS缓冲液混均，取100μL混悬液接种于LB液体培养基37℃过夜，取培养液1mL按照1中方法提取基因组DNA，样品存于-20℃。

3、SirA基因4组引物特异性比较

沙门菌靶基因SirA(U88651.1)，其基因序列见SEQ ID NO.1；LAMP引物扩增序列见SEQ ID NO.2。

SirA基因序列中引物位点较多，为了筛选出特异性最佳的引物组(检测时间最短，无假阳性扩增)设计了4组引物并对其进行测试。以沙门菌ATCC 13076基因组为模板，引物分别命名为SirA-1，SirA-2，SirA-3，SirA-4，序列信息如下，其对应扩增曲线如图1所示，SirA-1引物组扩增所得信号最强，但SirA-3引物最早出现扩增对数期，且SirA-3引物扩增的信号强度均高于SirA-1和SirA-2引物组，故从快速检测方面考虑SirA-3为最佳LAMP引物组。

SirA-1F3：GTATTGGCGGCCTTGAGG，SEQ ID NO.3；

SirA-1B3：CGCCATCTGTTGAGCGATA，SEQ ID NO.4；

SirA-1FIP：CCGTATGGACGGTCAGCATGATGACGCGTAAAATTGCCCGA，SEQ ID NO.5；

SirA-1BIP：AGCTGGCTATCTCAGCAAAGGCTCCGGAATACACCGAACGAA，SEQ ID NO.6；

SirA-2F3：CCCGATCGACAGCGGATA，SEQ ID NO.7；

SirA-2B3：CTGTTGAGCGATATCGGAGG，SEQ ID NO.8；

SirA-2FIP：CAGCCTGCATCACTTTGGCGAAAGTGATCATGCTGACCGT，SEQ ID NO.9；

SirA-2BIP：AGCTGGCTATCTCAGCAAAGGCTCCGGAATACACCGAACGAA，SEQ ID NO.10；

SirA-3F3：CCCGATCGACAGCGGATA，SEQ ID NO.11；

SirA-3B3：CAATCTGACTGAGCGCCAT，SEQ ID NO.12；

SirA-3FIP：GAGATAGCCAGCTGCGCCAGCTGACCGTCCATACGGAGAA，SEQ ID NO.13；

SirA-3BIP：CTCAGGAGGTGGTGAGCGCTCTGTTGAGCGATATCGGAGG，SEQ ID NO.14；

SirA-4F3：GCTGGCTATCTCAGCAAAGG，SEQ ID NO.15；

SirA-4B3：CCCTTGGTGATCATCAGCAT，SEQ ID NO.16；

SirA-4FIP：CTGTTGAGCGATATCGGAGGCGGTGGTGAGCGCTATTCGTT，SEQ ID NO.17；

SirA-4BIP：GCTCAGTCAGATTGAGCCTGCAACTCGCGTTCAGACAAACTG，SEQ ID NO.18。

5、LAMP反应

标准LAMP反应体系25μL组成如下：2×LAMP缓冲液12.5μL，内引物SirA-3FIP：1μL，SirA-3BIP：1μL，外引物：SirA-3F3：1μL，SirA-3B3：1μL，HNB：1μL；Eva Green：1μL；Bst2.0Warmstart DNA聚合酶：1μL，无酶水：3.5μL，DNA样品：2μL。一个检测样品设置2孔，其中沙门菌基因组DNA为阳性对照组，无酶水为空白对照组，金黄色葡萄球菌CMCC 26003、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、肠出血性大肠杆菌(O157：H7)、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌为阴性对照组，无酶水为空白对照组。在伯乐实时荧光定量PCR仪上进行恒温扩增，扩增条件：65℃ 45min，90℃ 2min灭活终止反应。

其扩增曲线如图2所示，仅有沙门氏菌属的三株细菌出现扩增曲线，而其他8种细菌属均未出现扩增，表明所选引物特异性较强。琼脂糖电泳对扩增产物进行分析，其结果与扩增曲线保持一致(图3中有梯形条带为阳性，无梯形条带为阴性)，反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性(图4)。为近一步验证引物特异性，选取细菌种类极为丰富的粪便作为基质添加纯菌液进行特异性实验重复3次结果一致，结果表1所示，表明本申请说述引物具有优越的特异性。

表1.LAMP引物组的特异性验证

注：“+”：阳性反应为天蓝色；“-”：阴性反应为紫罗兰色

实施例2试剂盒灵敏度测试

以沙门菌ATCC 14028基因组为模板，以SirA-3F3、SirA-3B3引物进行PCR扩增，所得产物用商业化回收，测浓度后用无酶水进行梯度稀释，从1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL。以此为模板用SirA-3F3、SirA-3B3、SirA-3FIP、SirA-3BIP等引物进行LAMP反应灵敏度测试，实时荧光扩增曲线图及颜色变化见图5。其结果显示本申请引物的LAMP检测灵敏度是10^-6ng/μL，检出时间为50min。

实施例3优选Mg²⁺浓度

镁离子是对DNA聚合酶活性影响较为重要的成分，必须对它的浓度进行优化。以2mM为一个梯度设置6mM到20mM七个镁离子浓度，考察不同镁离子浓度对反应Ct值的影响(镁离子浓度为2×buffer中浓度)。结果如下图6所示。优选镁离子浓度为6-8mM。

实施例4优选甜菜碱浓度

甜菜碱作为恒温条件下解旋DNA双链的重要物质，必须对它的浓度进行优化。在其它条件不变情况下以0.2M为一个梯度设置0.6M到2.0M(甜菜碱在2×buffer中浓度)考察不同浓度甜菜碱对反应的影响。结果如下图7所示。优选甜菜碱浓度为0.6M。

本发明可视化LAMP快速检测试剂盒使用简单，储存方便，检测条件要求低，可以在45min内完成对沙门氏菌准确快速检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉海关技术中心

<120> 一种利用LAMP技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium

<400> 1

ttgatcaacg ttcttcttgt tgatgaccac gaactggtgc gcgcagggat acgacgcatt 60

cttgaagata taaagggcat taaagttgtc ggtgaagcgt gctgcggaga ggatgcggta 120

aaatggtgcc gtactaacgc cgttgacgtc gtgctgatgg atatgaacat gcccggtatt 180

ggcggccttg aggcgacgcg taaaattgcc cgctcgacag cggatatcaa agtgatcatg 240

ctgaccgtcc atacggagaa cccgttgccc gccaaagtga tgcaggctgg cgcagctggc 300

tatctcagca aaggcgctgc gcctcaggag gtggtgagcg ctattcgttc ggtgtattcc 360

ggacaacgtt atatcgcctc cgatatcgct cagcagatgg cgctcagtca gattgagcct 420

gcaaaaacgg aaacgccgtt cgccagtttg tctgaacgcg agttgcagat tatgctgatg 480

atcaccaagg gtcagaaggt caatgagatt tcagaacagc tgaatctcag tcctaaaacg 540

gtgaacagct atcgctatcg tatgttcagt aaattaaaca ttcatggtga tgttgagctg 600

actcacctgg caatccgcca tggcctgtgt aatgcggaga cgttaacaag ccagtga 657

<210> 2

<211> 207

<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium

<400> 2

cccgctcgac agcggatatc aaagtgatca tgctgaccgt ccatacggag aacccgttgc 60

ccgccaaagt gatgcaggct ggcgcagctg gctatctcag caaaggcgct gcgcctcagg 120

aggtggtgag cgctattcgt tcggtgtatt ccggacaacg ttatatcgcc tccgatatcg 180

ctcagcagat ggcgctcagt cagattg 207

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> SirA-1 F3

<400> 3

gtattggcgg ccttgagg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> SirA-1 B3

<400> 4

cgccatctgt tgagcgata 19

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> SirA-1 FIP

<400> 5

ccgtatggac ggtcagcatg atgacgcgta aaattgcccg a 41

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> SirA-1 BIP

<400> 6

agctggctat ctcagcaaag gctccggaat acaccgaacg aa 42

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> SirA-2 F3

<400> 7

cccgatcgac agcggata 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> SirA-2 B3

<400> 8

ctgttgagcg atatcggagg 20

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> SirA-2 FIP

<400> 9

cagcctgcat cactttggcg aaagtgatca tgctgaccgt 40

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> SirA-2 BIP

<400> 10

agctggctat ctcagcaaag gctccggaat acaccgaacg aa 42

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> SirA-3 F3

<400> 11

cccgatcgac agcggata 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> SirA-3 B3

<400> 12

caatctgact gagcgccat 19

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> SirA-3 FIP

<400> 13

gagatagcca gctgcgccag ctgaccgtcc atacggagaa 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> SirA-3 BIP

<400> 14

ctcaggaggt ggtgagcgct ctgttgagcg atatcggagg 40

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> SirA-4 F3

<400> 15

gctggctatc tcagcaaagg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> SirA-4 B3

<400> 16

cccttggtga tcatcagcat 20

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> SirA-4 FIP

<400> 17

ctgttgagcg atatcggagg cggtggtgag cgctattcgt t 41

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> SirA-4 BIP

<400> 18

gctcagtcag attgagcctg caactcgcgt tcagacaaac tg 42

Claims

1.一种伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于，包括引物组，序列为：SirA-3 F3：CCCGATCGACAGCGGATA

SirA-3 B3：CAATCTGACTGAGCGCCAT

SirA-3 FIP：GAGATAGCCAGCTGCGCCAGCTGACCGTCCATACGGAGAA

SirA-3 BIP：CTCAGGAGGTGGTGAGCGCTCTGTTGAGCGATATCGGAGG

所述引物组靶向序列为SirA基因，U88651.1；

还包括2×LAMP 缓冲液、Bst 2.0 Warmstart DNA聚合酶，10 mM dNTPs，5 M PCR级甜菜碱，20×Eva Green，120 µM HNB；

所述2×LAMP 缓冲液包括40 mM Tris 无酶，20 mM KCl，16 mM的MgSO₄，20 mM (NH₄)₂SO₄，0.2% v:v Tween 20，2.8 mM dNTPs，0.6 M甜菜碱，pH 8.8。

2.一种非诊断目的的伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应体系为25 µL：2×LAMP 缓冲液 12.5 µL，内引物SirA-3 FIP：1 µL，SirA-3 BIP：1 µL，外引物：SirA-3 F3：1 µL，SirA-3 B3：1 µL，HNB：1 µL；Eva Green：1 µL；Bst 2.0 WarmstartDNA聚合酶：1 µL，无酶水：3.5 µL，DNA样品：2 µL；

序列为：

SirA-3 F3：CCCGATCGACAGCGGATA

SirA-3 B3：CAATCTGACTGAGCGCCAT

SirA-3 FIP：GAGATAGCCAGCTGCGCCAGCTGACCGTCCATACGGAGAA

SirA-3 BIP：CTCAGGAGGTGGTGAGCGCTCTGTTGAGCGATATCGGAGG。

3.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测方法，其特征在于：反应条件：65 °C恒温 45 min，90 °C 2 min 灭活；样品呈现天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性。

4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的伤寒沙门氏菌特异性LAMP可视化检测方法，其特征在于：样品用2-3% 琼脂糖凝胶电泳检测出现梯形条带的为阳性，没有梯形条带的为阴性。

5.如权利要求1所述的试剂盒或权利要求2-4任一所述的检测方法在食品中伤寒沙门氏菌的检测中的应用。