CN113621689A - 单增李斯特菌的cpa引物、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

单增李斯特菌的cpa引物、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法，该引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑NO.5所示。本发明针对单增李斯特菌特异性靶序列hlyA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决了现有的检测技术方法耗时长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列hlyA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统单增李斯特菌检测的周期。

Description

单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)属于革兰氏阳性菌，是最常见的人畜共患食源性致病菌之一，能够引起较严重的人畜共患病，如肠胃炎、脑膜炎、败血症等疾病。且对于孕妇、婴幼儿、老年人及免疫力低下者更容易被感染。单增李斯特菌广泛存在于各类乳制品、蔬菜、肉类等食品中，具有极强的生命力，能够在-4℃～45℃，pH值为4～9，甚至高盐(14％及以上)等恶劣环境条件下存在。对人的健康构成极大的威胁。食品中单增李斯特菌的检测成为食源性疾病预防与控制的关键。
目前微生物的检测鉴定方法主要可以分为三类：传统培养鉴定法、免疫学检测法和分子生物学检测法。传统的培养鉴定法存在操作繁琐、耗时长的缺点，而免疫学检测法存在对实验人员专业水平要求高、成本较高以及检测结果易出现假阳性的不足。分子生物学检测法目前有PCR检测法、实时定量PCR技术、环介导恒温扩增法，但均存在易出现假阳性且检测成本较高的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法，该引物和方法具有结果准确可靠，灵敏度高、特异性好，操作简便，成本低，适合于现场检测应用的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
单增李斯特菌的CPA引物，是针对其靶点hlyA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点hlyA剥离引物4s：5’-ccgtaagtgggaaatctg-3’(SEQ ID NO.1)
靶点hlyA剥离引物5a：5’-aggcaatgggaactcctg-3’(SEQ ID NO.2)
靶点hlyA交叉引物2a1s：5’-ctcgtaagtctccgaggttccttcaaagccgtaatt-3’(SEQID NO.3)
靶点hlyA特异引物2a：5’-ctcgtaagtctccgaggt-3’(SEQ ID NO.4)
靶点hlyA特异引物3a：5’-cccggttaaaagtagcacc-3’(SEQ ID NO.5)。
单增李斯特菌的检测试剂盒，包括上述的CPA引物；
所述试剂盒中，各CPA引物的浓度优选10μM；
所述的试剂盒还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
B、Bst DNA聚合酶：优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，制成1mM的氯化锰水溶液；
(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8)。
上述的试剂盒可以用于检测单增李斯特菌。
单增李斯特菌的CPA检测方法，步骤如下：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；
所述的模板DNA，其OD260/OD280值为1.8～2.0；
(2)建立检测hlyA的交叉引物恒温扩增反应体系，于59～68℃水浴中恒温反应至少60分钟，待反应完成后于75～85℃水浴中保温2分钟终止反应；
其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
(3)针对靶点hlyA的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色变为绿色，说明待检样品中含有单增李斯特菌；如颜色为黄色，说明待检样品中不含有单增李斯特菌；
步骤(3)优选地，终止反应后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果呈现梯形条带说明待检样品含有单增李斯特菌，无扩增条带说明待检样品不含有单增李斯特菌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对单增李斯特菌特异性靶序列hlyA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决了现有的检测技术方法耗时长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列hlyA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统单增李斯特菌检测的周期。
(2)目前，有文献报道采用交叉引物恒温扩增反应技术检测食源性致病菌,但是检测灵敏度不高，没有体现出交叉引物恒温扩增技术在灵敏度方面相较于普通PCR所具有的显著优越性。而本发明同时兼顾检测的可靠性、特异性和高灵敏度。这在提高重大群体疾病诊断率和早期的疾病诊断方面具有重大意义。
(3)本发明反应在恒温条件下进行，不会在改变温度上耗费时间，此外，该技术没有昂贵的仪器和试剂的限制，扩增产物不需要进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果直接用荧光染料显色，可凭肉眼判断，操作简便，技术成本与检测成本较低。本发明的试剂盒及方法尤其适用于现场检测。
附图说明
图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测单增李斯特菌的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，图A为凝胶电泳结果；图B为显色结果；
其中，1为单增李斯特菌ATCC19114，2为单增李斯特菌ATCC19115，NG为空白对照。
图2为检测靶点hlyA特异性实验显色结果；
图3为检测靶点hlyA特异性实验显色结果；
其中，1：单增李斯特ATCC19114；2：单增李斯特ATCC19115；3：铜绿假单胞菌ATCC27853；4：铜绿假单胞菌ATCC10145:；5：铜绿假单胞菌ATCC15442；6：铜绿假单胞菌ATCC17934；7：铜绿假单胞菌ATCC35032；8：沙门氏菌ATCC14028；9：大肠杆菌O157:H7ATCC43895；10：大肠杆菌O157:H7 ATCC43894；11：大肠杆菌O157:H7 E019；12：大肠杆菌O157:H7 E043:；13：大肠杆菌O157:H7 E044；14：副溶血性弧菌ATCC17802；15：副溶血性弧菌ATCC27969；16：干酪乳杆菌BM-LC14617；17：金黄色葡萄球菌ATCC27664；18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442；19：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315；20：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CA05；NG-阴性对照。
图4为检测靶hlyA灵敏度实验结果图；其中，图A为凝胶电泳结果；图B为显色结果；
其中，1为5.66ng/μL，2为566pg/μL，56.6pg/μL，3为5.66pg/μL，4为566fg/μL，5为56.6fg/μL，6为5.66fg/μL，7为566ag/μL NG为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
基于交叉引物恒温扩增反应技术检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：
本实施例以单增李斯特菌为例，所需试剂如下：
a.浓度均为10μM的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示；
b.2×反应储液：由浓度为40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)组成；
c.浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶(大片段，NEB公司)水溶液；
d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先分别配制浓度为50μM的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜作溶剂)与浓度为1mM的氯化锰水溶液；然后取25μL 50μM的钙黄绿素溶液，与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，使得钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8。
2、使用上述试剂利用交叉引物恒温扩增反应技术检测单增李斯特菌，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA：
本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为两株单增李斯特菌ATCC19114，ATCC19115由公开途径获得；
采用DNA提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD260/OD280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
(2)建立检测hlyA的交叉引物恒温扩增反应：
在反应管中配制总体积为26μL的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2×反应储液12.5μL，剥离引物4s与5a各1.5μL，交叉引物2a1s 2.5μL，特异引物2a与3a各1.25μL，BstDNA聚合酶1μL，DNA模板1.0μL，用去核酸水补充体积至25μL，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μL，混匀即可。此时各物质浓度为：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7M，dNTPs(each)1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，剥离引物4s、5a各0.6μM，交叉引物2a1s 1.0μM，特异引物2a及3a各0.5μM。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
(3)显色检测：
待反应结束后，用肉眼观察反应体系颜色变化。
结果如图1所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色(图1B)，说明不含有单增李斯特菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有单增李斯特菌。随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果为实验组呈现梯形条带(图1A)，空白对照组无扩增条带，与显色结果一致。
实施例2
交叉恒温扩增反应检测单增李斯特菌特异性试验，包括以下步骤：
分别将单增李斯特菌与非单增李斯特菌的基因组DNA按照实施例1中的反应体系和条件进行交叉恒温扩增试验；其中，实验所用非单增李斯特菌分别为：铜绿假单胞菌ATCC27853；铜绿假单胞菌ATCC10145；铜绿假单胞菌ATCC15442；铜绿假单胞菌ATCC17934；铜绿假单胞菌ATCC35032；沙门氏菌ATCC14028；大肠杆菌O157:H7 ATCC43895；大肠杆菌O157:H7 ATCC43894；大肠杆菌O157:H7 E019；大肠杆菌O157:H7 E043；大肠杆菌O157:H7E044；副溶血性弧菌ATCC17802；副溶血性弧菌ATCC27969；干酪乳杆菌BM-LC14617；金黄色葡萄球菌ATCC27664；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CA05；
本发明所涉及的菌株均可由公开途径获取；
其中的大肠杆菌O157:H7 E019、大肠杆菌O157:H7 E043和大肠杆菌O157:H7 E044已在文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌VBNC状态的诱导及毒素表达量的影响研究[D].华南理工大学,2015.)中公开；
干酪乳杆菌BM-LC14617已在文献(Junyan Liu,Lin Li,Bing Li,BrianM.Peters,Yang Deng*,Zhenbo Xu*,Mark E.Shirtliff.The viable but nonculturablestate induction and genomic analyses of Lactobacillus casei BM-LC14617,abeer-spoilage bacterium[J].Microbiologyopen,2017,6(5):e00506)中公开。
设置单增李斯特菌基因组为阳性对照，去核酸水为空白对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2和图3所示。
阳性对照组的颜色变为绿色，说明含有单增李斯特菌；非单增李斯特菌和空白对照组的颜色为黄色，说明不含有单增李斯特菌(图2)。
阳性对照组基因组DNA的反应体系呈现梯形条带，非单增李斯特菌基因组DNA与去核酸水的反应体系均无扩增条带(图3)。
结果表明，本发明基于交叉引物恒温扩增反应检测单增李斯特菌的检测方法具有较高的特异性。
实施例3
交叉恒温扩增反应检测单增李斯特菌的灵敏度试验，包括以下步骤：
将单增李斯特菌ATCC19115的基因组进行10倍浓度梯度稀释，浓度分别为5.66ng/μL，566pg/μL，56.6pg/μL，5.66pg/μL，566fg/μL，56.6fg/μL，5.66fg/μL，566ag/μL
同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例1中的交叉恒温扩增方法构建反应体系进行反应并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。
结果如图4所示，样品中单增李斯特菌DNA的浓度高于5.66pg/μL的均出现了梯形条带，呈现阳性结果。结果表明：建立的单增李斯特菌交叉恒温扩增反应方法可检测样品中5.66pg/μL反应的单增李斯特菌DNA。
结论：从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法相比与常规PCR和实时荧光定量PCR具有以下优点：
快速、简便：常规PCR总共需要2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR需要2～3小时，而本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。不需要昂贵的仪器，仅需要一个普通水浴锅，并且不需要进行凝胶电泳检测结果，可以通过荧光染料的显色反应来直接观测检测结果，节省了大量的时间。因此，在快速检测及现场检测的实践领域具有广泛的应用前景。
特异性强：通过扩增反应检测目的基因，从而完成了细菌的定性检测。
灵敏度高：针对单增李斯特菌的检测限为5.66pg/μL，是常规PCR反应10-100倍左右，具有较高的灵敏度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 单增李斯特菌的CPA引物、检测试剂盒和检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点hlyA剥离引物4s
<400> 1
ccgtaagtgg gaaatctg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点hlyA剥离引物5a
<400> 2
aggcaatggg aactcctg 18
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点hlyA交叉引物2a1s
<400> 3
ctcgtaagtc tccgaggttc cttcaaagcc gtaatt 36
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点hlyA特异引物2a
<400> 4
ctcgtaagtc tccgaggt 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点hlyA特异引物3a
<400> 5
cccggttaaa agtagcacc 19

Claims (10)

1.单增李斯特菌的CPA引物，其特征在于：包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
靶点hlyA剥离引物4s：5’-ccgtaagtgggaaatctg-3’(SEQ ID NO.1)
靶点hlyA剥离引物5a：5’-aggcaatgggaactcctg-3’(SEQ ID NO.2)
靶点hlyA交叉引物2a1s：5’-ctcgtaagtctccgaggttccttcaaagccgtaatt-3’(SEQ IDNO.3)
靶点hlyA特异引物2a：5’-ctcgtaagtctccgaggt-3’(SEQ ID NO.4)
靶点hlyA特异引物3a：5’-cccggttaaaagtagcacc-3’(SEQ ID NO.5)。
2.单增李斯特菌的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述CPA引物的浓度为10μM。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
B、Bst DNA聚合酶；
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，制成50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，制成1mM的氯化锰水溶液；
(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
7.权利要求2-6任一项所述的检测试剂盒在检测单增李斯特菌中的应用。
8.单增李斯特菌的CPA检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；
(2)建立检测hlyA的交叉引物恒温扩增反应体系，于59～68℃水浴中恒温反应至少60分钟，待反应完成后于75～85℃水浴中保温2分钟终止反应；
(3)针对靶点hlyA的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色变为绿色，说明待检样品中含有单增李斯特菌；如颜色为黄色，说明待检样品中不含有单增李斯特菌。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，终止反应后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果呈现梯形条带说明待检样品含有单增李斯特菌，无扩增条带说明待检样品不含有单增李斯特菌。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
步骤(1)所述的模板DNA，其OD260/OD280值为1.8～2.0；
步骤(2)交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。
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CN109355404A (zh) * 2018-08-30 2019-02-19 华南理工大学 基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法
CN109652574A (zh) * 2019-02-22 2019-04-19 华南理工大学 大肠杆菌o157:h7的cpa引物及试剂盒和检测方法

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