CN104328175A - 用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法，是通过肺炎克雷伯氏菌tyrB基因序列设计LAMP引物，建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的肺炎克雷伯氏菌可视化检测方法；可通过观测绿色荧光的有无快速准确的检测出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低检测限为1.6拷贝数/反应。本发明设计和筛选的6条引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；环引物的加入扩增效率大大提高，耗时短，适合基层现场应用。

Description

用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于医学微生物检测技术领域，涉及一种检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物及检测方法。
背景技术
肺炎克雷伯氏菌为革兰氏阴性，不运动型，有荚膜，乳酸发酵，兼性厌氧的杆状细菌。肺炎克雷伯氏菌通常寄居在大小鼠和其他动物的肠道。作为机会致病菌，肺炎克雷伯氏菌一旦进入呼吸道，即可感染大小鼠，造成严重肺部损伤，并且该菌在耐抗生素裸鼠中有取代其他细菌的更强的生长趋势，为实验用啮齿动物的常见健康监控指标之一。
目前常用的肺炎克雷伯氏菌检测方法包括使用监测拭子直接铺板法及显色培养基法和常规PCR法/荧光定量PCR法，均可以有效地检测。但细菌培养法较其他方法存在难以标准化，耗时长，培养基，操作步骤或培养条件在不同实验室差别较大等缺点，故结果可能不一致或出现假阴/阳性。常规PCR法和荧光定量PCR法，需经过变性，退火，延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2～4个小时才能出结果，并且需要精密昂贵的仪器和试剂，对基层开展快速简便的分子诊断不利。
Notomi等人于2000年发明环介导等温扩增(LAMP)技术，经过逐步改进，该技术借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异和灵敏的扩增靶序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物，包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括40μmol.L-1的FIP 1.0μL，40μmol.L-1的BIP 1.0μL，10μmol.L-1的F30.5μL，10μmol.L-1的B30.5μL，40μmol.L-1的LF 0.5μL以及40μmol.L-1的LB 0.5μL；F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB为环介导等温扩增引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
所述试剂盒还包括2×反应缓冲液12.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mMdNTP 1.5μL以及荧光染料1μL。
所述荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。
用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，包括以下步骤：
1)提取待检测对象(例如大鼠、小鼠)的DNA；
2)将以下组份进行混合，构建包括3对引物F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB的25μL环介导等温扩增反应体系：
2×反应缓冲液12.5μL，40μmol.L-1的FIP 1.0μL，40μmol.L-1的BIP 1.0μL，10μmol.L-1的F30.5μL，10μmol.L-1的B30.5μL，40μmol.L-1的LF 0.5μL，40μmol.L-1的LB 0.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL，待检测对象的DNA 2μL，荧光染料1μL，超纯水补足至25μL；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
3)将环介导等温扩增反应体系在63℃加热40min，然后在85℃加热5min，反应完成；
4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：
反应完成后观察环介导等温扩增反应体系是否有颜色的变化，若环介导等温扩增反应体系颜色发生变化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若环介导等温扩增反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。
所述待检测对象的DNA的提取方法为：
将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37℃培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。
在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阳性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈绿色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阴性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作为检测目标并合成LAMP引物，实现了对肺炎克雷伯氏菌简便、快捷、准确的检测；该基因经NCBI BLAST搜索后，在肺炎克雷伯氏菌种属间变异率低且兼顾不同血清型之间的保守序列，与其他种属细菌的同源性非常低，因此可以作为通用性基因检测肺炎克雷伯氏菌。
本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特异性强：所检测的阴性对照和大小鼠基因组均无阳性结果。
本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其检测灵敏度高：常规PCR检测方法灵敏度为100pg/reaction(100copy number/reaction)数量级，采用本发明检测方法，检测下限为1.25fg/reaction(1.6拷贝数/反应)。
本发明提供的检测鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其检测迅速、出结果方便：常规PCR整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR也需要1～1.5个小时，本发明提供的检测方法在约50分钟即可出现阳性结果。并且操作简便，对仪器要求低，仅需要普通水浴锅，并可以通过染料直接观测结果，省去了电泳的步骤，可在基层检测鼠肺炎克雷伯氏菌的实践中有广泛的应用前景。
附图说明
图1为阳性反应和阴性反应的颜色特异性示意图；
图2为LAMP特异性实验结果示意图；
图3为梯度稀释后的LAMP检测结果示意图；
图中：PC表示待检测对象(感染肺炎克雷伯氏菌)的检测结果，Mouse表示小鼠基因组DNA的检测结果，Rat表示大鼠基因组的检测结果，H2O表示阴性对照的检测结果，K.pneumoniae表示肺炎克雷伯氏菌基因组DNA的检测结果，P.aeroginosa表示绿脓杆菌基因组DNA的检测结果，S.aureus表示金黄色葡萄球菌基因组DNA的检测结果，S.reading表示沙门里丁氏菌基因组DNA的检测结果，NC表示阴性对照的检测结果，a表示1.6×104copies/μL的检测结果，b表示1.6×103copies/μL的检测结果，c表示1.6×102copies/μL的检测结果，d表示1.6×10copies/μL的检测结果，e表示1.6copies/μL的检测结果，f表示1.6×10-1copies/μL的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开了一种检测实验用鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，该检测方法基于环介导等温扩增来进行的。
本发明针对肺炎克雷伯氏菌tyrB基因(基因登录号AF074934)，设计了包括外引物，内引物，环引物的特异性引物。只需在建立的LAMP反应体系加入样品即可通过观测绿色荧光的有无快速准确的检测出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低检测限为1.6拷贝数/反应，为快速检测大小鼠肺炎克雷伯氏菌提供了一个适合基层的便捷方法。
1、引物设计与合成：
考虑到检测的特异性和准确性，采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作为检测目标并合成LAMP引物，这是由于tyrB基因经NCBI BLAST搜索后在肺炎克雷伯氏菌种属间变异率低且兼顾不同血清型之间的保守序列，与其他种属细菌的同源性非常低，因此可以作为通用性基因检测肺炎克雷伯氏菌。
采用引物设计软件Primer Explorer 4.0，针对肺炎克雷伯氏菌tyrB基因的保守区设计了6条LAMP引物，包括正向/反向内引物FIP/BIP，正向/反向外引物F3/B3，正向/反向环引物LF/LB，所述引物与tyrB(基因登录号：AF074934)基因175～375位的核酸序列的一部分或其互补链互补。具体的引物序列见表1。
表1 LAMP方法检测鼠肺炎克雷伯氏菌用引物序列
2.1、待检测的细菌基因组DNA模板的提取
为了便于对检测方法的说明，具体使用细菌基因组提取试剂盒提取肺炎克雷伯氏菌及作为对照的(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门里丁氏菌)菌株基因组DNA，经核酸蛋白定量仪定量后备用。
2.2、待检小鼠采用剪尾的方法先获得血液样本，接种于新鲜的肉汤培养基中，37℃条件下培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清利用基因组纯化试剂盒按照说明书的方法提取DNA。
3、构建LAMP反应体系(25μL)
荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。模板为提取到的DNA。2×反应缓冲液以及Bst聚合酶购自New England Biolabs.。
4、肺炎克雷伯氏菌LAMP检测方法的建立和引物可用性检测
将提取自所述待检小鼠的DNA作为模板加入到反应体系中，反应过程如下：反应温度63℃，时间40分钟，然后85℃下加热5分钟，反应结束。
使用阳性对照(肺炎克雷伯氏菌基因组DNA)和阴性对照(超纯水)按上述反应体系和条件进行。
5、肺炎克雷伯氏菌LAMP反应产物的鉴定
由于反应前在LAMP反应体系中加入1μL的荧光染料，用肉眼观察LAMP反应体系颜色变化，并与阴阳对照比较，反应体系呈绿色为阳性反应(参见图1中PC以及K.pneumoniae)，呈橘黄色为阴性反应(参见图1中H2O)。
核酸扩增过程中会形成大量的焦磷酸根离子。荧光染料中的锰离子与钙黄绿素结合导致荧光淬灭，同时染料颜色为橘黄色。当扩增反应形成焦磷酸根离子时，锰离子与焦磷酸根离子结合形成焦磷酸锰，引起荧光信号的产生，同时染料颜色变为绿色。即LAMP反应后扩增了大量目标DNA，加入钙黄绿素即可与之反应呈现绿色。
6、LAMP的特异性实验
将肺炎克雷伯氏菌与实验鼠常发的非肺炎克雷伯氏菌(绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门里丁氏菌)的基因组DNA以及大小鼠基因组DNA，按照上述反应体系和条件建立LAMP检测方法，进行特异性试验。设置肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，超纯水为阴性对照。结果表明，只有肺炎克雷伯氏菌基因组的反应体系出现阳性反应，其余均呈阴性反应(参见图1、图2)。
7、LAMP敏感性试验
将肺炎克雷伯氏菌基因组DNA进行10倍梯度稀释后，设置阴性对照(超纯水)，按照上述反应体系和条件建立LAMP检测方法，以确定检测方法的敏感性。
参见图3，结果表明：建立的鼠肺炎克雷伯氏菌LAMP检测方法可检测样品中1.6拷贝数/反应的肺炎克雷伯氏菌DNA。
从本发明来看，LAMP扩增方法较常规PCR和荧光PCR方法具有：
特异性强：仅通过是否扩增即可判定目的基因的存在与否，从而完成细菌和病毒的定性检测。
灵敏度高：常规PCR检测方法灵敏度为100pg/反应(100拷贝数/反应)数量级，采用本发明检测方法，检测下限为1.25fg/反应(1.6拷贝数/反应)
操作和鉴定简便快捷：常规PCR整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR也需要1～1.5个小时，本发明提供的检测方法在50分钟即可出现阳性结果。并且操作简便，对仪器要求低，仅需要普通水浴锅，并可以通过染料直接观测结果，省去了电泳的步骤，在基层检测鼠肺炎克雷伯的实践中有广泛的应用前景。

Claims (7)

1.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
2.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括40μmol.L-1的FIP1.0μL，40μmol.L-1的BIP1.0μL，10μmol.L-1的F30.5μL，10μmol.L-1的B30.5μL，40μmol.L-1的LF0.5μL以及40μmol.L-1的LB0.5μL；F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB为环介导等温扩增引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
3.如权利要求2所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括2×反应缓冲液12.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL以及荧光染料1μL。
4.如权利要求3所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。
5.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待检测对象的DNA；
2)将以下组份进行混合，构建包括3对引物F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB的25μL环介导等温扩增反应体系：
2×反应缓冲液12.5μL，40μmol.L-1的FIP1.0μL，40μmol.L-1的BIP1.0μL，10μmol.L-1的F30.5μL，10μmol.L-1的B30.5μL，40μmol.L-1的LF0.5μL，40μmol.L-1的LB0.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL，待检测对象的DNA2μL，荧光染料1μL，超纯水补足至25μL；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
3)将环介导等温扩增反应体系在63℃加热40min，然后在85℃加热5min，反应完成；
4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：
反应完成后观察环介导等温扩增反应体系是否有颜色的变化，若环介导等温扩增反应体系颜色发生变化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若环介导等温扩增反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。
6.如权利要求5所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述待检测对象的DNA的提取方法为：
将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37℃培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。
7.如权利要求5所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阳性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈绿色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阴性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。
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