CN108796104B - 一种CelB基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CelB基因的用途，所述基因的Genbank登陆号为CP003785.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了两种鉴定体系，优化了反应体系及流程，并进行灵敏度和特异性实验，证明该基因能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，特异性好，操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种CelB基因的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种CelB基因的用途。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia，K.pneumonia)，属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，革兰氏染色阴性，无鞭毛和芽孢，但有明显的荚膜和菌毛，绝大多数K.pneumonia还具有菌毛抗原、菌体抗原、荚膜抗原等多种主要抗原成分，其为兼性厌氧菌，对营养需求低，一般的LB平板培养基上过夜培养即可形成凸起、较大、灰白色的粘液型菌落，最适生长温度为37℃，肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，在健康人的呼吸道和肠道正常菌丛中、自然界水和谷物中均能分离到克雷伯氏菌，外界环境中存在的肺炎克雷伯氏菌对免疫低下人群具有较大的健康威胁，受到肺炎克雷伯氏菌污染的食物与正常食物在外形与味觉上没有区别，因此准确、快速地检测肺炎克雷伯氏菌具有十分重要的意义。

CN101892300A提供一种肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，所述的肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒包括以肺炎克雷伯氏菌的oppA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。CN103642910A采用基因克隆技术，将肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有RecA基因片段的重组质粒，以此作为标准品，根据肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行有效性评估试验，但上述现有技术实验步骤繁琐，检测基因特异性差，周期漫长，准确度不高。

作为最常见的条件致病菌之一，肺炎克雷伯菌在环境中的存在情况也是值得重视的课题，目前常用的检测肺炎克雷伯氏菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，操作繁琐，费时耗力；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序列，在此基础上建立了众多的检测技术，其中主要有核酸探针检测技术、实时荧光PCR检测技术、LAMP和PCR技术，这些方法因其特异性强、灵敏度高、省时等特点已越来越多的被应用于微生物鉴定中，但是这些方法用于对自然环境尤其是医院环境的检测和监测罕见报道。

因此，研发一种特异性良好、灵敏度较好、检测快速可靠、操作简单的肺炎克雷伯氏菌的鉴定体系对于提供公共环境的卫生水平具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种CelB基因的用途，本发明通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了两种鉴定体系，并进行灵敏度和特异性实验，证明该基因能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，特异性好，操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种CelB基因用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的用途，所述基因的Genbank登陆号为CP003785.1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1:

ATGCAAAGCATTGGTCAAAATACCTACCTTAAGTCAATCATGAGCGGTATGATGCTCATATTGCCAGTAACGATCATGAGTTCTGTGGCGACTTTGGTTAAAGTGTTTCCGTTTGCTCCATATCAGGATTTTTTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTCTTTGATATCCCGATTACCTTCACGAATAATTTTTTGGCCGTGATTGTCGCTTTCTCCGTTGCCTATACGCTAGCGAAAAATTTCGATGTTGATGGCTTCATGTCAGGCCTGATTTCAATGATCTCTTTCTTTATTTTAACGCCGTATGATCTCGGTGAAATAGGGCCGTTAGCTCTTTGA.

在本发明中，发明人通过生物信息学手段，经由基于基因组的本地BLAST及筛选，并进行在线BLAST分析重确认而获得用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的基因，该基因为cellobiose-specific PTS family enzyme IIC component，基因名CelB，Genbank登陆号为CP003785.1(2559834..2560172)，发现该基因为肺炎克雷伯氏菌特有，且可以用于检测和鉴定克雷伯氏菌。

第二方面，本发明提供一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，根据第一方面所述的基因进行设计，所述引物包括一对外游引物和一对内游引物；

所述外游引物为B3和F3，所述内游引物为BIP和FIP。

其中，所述外游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述内游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

外游引物B3(SEQ ID NO.2):TCATGAGCGGTATGATGC；

外游引物F3(SEQ ID NO.3):CGGAGAAAGCGACAATCA；

内游引物BIP(SEQ ID NO.4):

CTGATATGGAGCAAACGGAAACACTTTTGCCAGTAACGATCATGAGT；

内游引物FIP(SEQ ID NO.5):

TTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTTTCCAAAAAATTATTCGTGAAGGT.

本发明中，发明人以基因cellobiose-specific PTS family enzyme IICcomponent，基因名CelB，Genbank登陆号为CP003785.1(2559834..2560172)设计特异引物，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于LAMP技术检测，其中外游引物还用作PCR反应的上、下游引物，用于肺炎克雷伯氏菌的鉴定。

第三方面，本发明提供一种鉴定肺炎克雷伯氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)针对基因CelB设计特异性引物，包括一对外游引物和一对内游引物；

(2)采集样本并进行增菌培养，提取DNA，得到待测模板；

(3)建立PCR鉴定体系和/或LAMP鉴定体系，对待测模板进行检测。

优选地，在步骤(1)之前还包括BLAST筛选步骤。

优选地，所述BLAST筛选包括本地BLAST和在线BLAST。

优选地，所述本地BLAST的步骤包括：从NCBI下载非冗余核酸数据库并构建靶数据库，将肺炎克雷伯氏菌全基因组序列作为检索数据，与靶数据库进行比对筛选，得到潜在特异序列。

优选地，所述在线BLAST的步骤包括：BLAST时排除肺炎克雷伯菌，相似序列覆盖度小于30％或无相似序列，且BLAST时选择肺炎克雷伯菌，得到目的菌种的不同菌株共有序列的大量相似序列，该相似序列即为特异性靶基因；

优选地，步骤(1)所述外游引物用作PCR鉴定体系。

优选地，步骤(3)所述PCR鉴定体系的反应体系为：10-15μL 2×PCR预混液，8-12μM的外游引物，40-60ng待测样品DNA。

优选地，所述预混液包含1-3U DNA聚合酶、1-3mM MgCl₂和180-220μM dNTP。

优选地，所述预混液的体积为10-15μL，例如可以是10μL、11μL、12μL、13μL、14μL或15μL，优选为12.5μL。

优选地，所述外游引物的浓度为8-12μM，例如可以是8μM、9μM、10μM、11μM或12μM，优选为10μM。

优选地，所述待测样品DNA的添加量为40-60ng，例如可以是40ng、45ng、50ng、55ng或60ng，优选为50ng。

优选地，所述DNA聚合酶的酶活力单位为1-3U，例如可以是1U、1.5U、2U或3U，优选为1.5U。

优选地，所述MgCl2的浓度为1-3mM，例如可以是1mM、1.5mM、2mM或3mM，优选为1.5mM。

优选地，所述dNTP的浓度为180-220μM，例如可以是180μM、190μM、200μM、210μM或220μM。

优选地，步骤(3)所PCR鉴定体系的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环；最后72℃延伸2min。

优选地，步骤(1)所述内游引物和外游引物用作LAMP鉴定体系。

优选地，步骤(3)所述LAMP鉴定体系的反应体系为：13-17μL 2×等温预混液，6-10μM内游引物，1-3μM外游引物，80-120ng待测样品DNA，最后加去核酸酶水补足至25μL。

优选地，所述等温预混液的体积为13-17μL，例如可以是13μL、14μL、15μL、16μL或17μL，优选为15μL。

优选地，所述内游引物的浓度为6-10μM，例如可以是6μM、7μM、8μM、9μM或10μM，优选为8μM。

优选地，所述外游引物的浓度为1-3μM，例如可以是1μM、2μM或3μM，优选为1μM。

优选地，所述待测样品DNA的添加量为80-120ng，例如可以是80ng、90ng、100ng、110ng或120ng，优选为100ng。

优选地，步骤(3)所述LAMP鉴定体系的反应条件为：63-68℃温育30min，80-98℃退火。

优选地，所述温育的温度为63-68℃，例如可以是63℃、64℃、65℃、66℃、67℃或68℃，优选为65℃。

优选地，所述退火的温度为80-98℃，例如可以是80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、94℃或98℃。

第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包含第二方面所述的引物。

第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的引物和/或第四方面所述的试剂盒用于检测和/或鉴定肺炎克雷伯氏菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的基因为发明人利用生物信息学手段，通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了PCR和LAMP两种鉴定体系，并优化了反应条件和流程，能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，菌液浓度为10⁰个拷贝时也可检测到目的序列，特异性好，操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。

附图说明

图1是本发明PCR鉴定体系的特异性检测结果，自左向右，泳道1至泳道6的反应模板为肺炎克雷伯氏菌的基因，泳道7至泳道10依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、藤黄微球菌；

图2为本发明PCR鉴定体系的灵敏度检测结果，其中，图2(A)为阳性质粒的灵敏度结果，图2(B)为菌液的灵敏度结果；

图3为本发明LAMP鉴定体系的特异性检测结果，其中，图3(A)为LAMP反应的扩增曲线，图3(B)为LAMP反应在紫外检测系统下的检测结果，自左向右，管1到管4的反应模板为肺炎克雷伯氏菌的基因组，管5到管8的模板依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌；

图4为本发明LAMP鉴定体系的灵敏度检测结果，其中，图4(A)为LAMP反应的扩增曲线，图4(B)为LAMP反应在紫外检测系统下的检测结果，自左向右，管1为阳性质粒作为模板的阳性对照，管2到管7的反应模板是直接裂解梯度稀释后菌液，其浓度依次为10⁵个拷贝、10⁴个拷贝、10³个拷贝、10²个拷贝、10¹个拷贝、10⁰个拷贝，管8为去核酸酶税作为模板的阴性对照。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1特异性靶基因筛选及引物设计

1、本地BLAST分析

于NCBI下载非冗余核酸数据库(约60G)，构建靶数据库；

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载的肺炎克雷伯氏菌全基因组序列，作为检索数据；

将全基因组与靶数据库进行本地BLAST检索，获得菌种各序列片段与数据库比对结果；

将检索结果进行筛选获得潜在的特异序列，并进行后续筛选。

2、特异性靶基因筛选

使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性；

第一种策略为BLAST时排除肺炎克雷伯氏菌，结果显示无任何相似序列者或相似序列覆盖度小于30％的潜在特异基因为目的菌种特异基因；

第二种策略为BLAST时选择在肺炎克雷伯氏菌内进行检索，结果返回大量相似序列的潜在特异基因为目的菌种的不同菌株共有序列；

结合两种策略，找出符合两种策略标准的目的基因CelB；

该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1:

ATGCAAAGCATTGGTCAAAATACCTACCTTAAGTCAATCATGAGCGGTATGATGCTCATATTGCCAGTAACGATCATGAGTTCTGTGGCGACTTTGGTTAAAGTGTTTCCGTTTGCTCCATATCAGGATTTTTTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTCTTTGATATCCCGATTACCTTCACGAATAATTTTTTGGCCGTGATTGTCGCTTTCTCCGTTGCCTATACGCTAGCGAAAAATTTCGATGTTGATGGCTTCATGTCAGGCCTGATTTCAATGATCTCTTTCTTTATTTTAACGCCGTATGATCTCGGTGAAATAGGGCCGTTAGCTCTTTGA.

3、引物设计

针对基因cellobiose-specific PTS family enzyme IIC component，基因名CelB，Genbank登陆号为CP003785.1(2559834..2560172)设计特异引物；

特异性引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具Primer Explorer V5software(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.htmL)设计完成，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于LAMP技术检测，其中外游引物还用作PCR反应的上、下游引物，用于肺炎克雷伯氏菌的鉴定；

其中，所述外游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述内游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

外游引物B3(SEQ ID NO.2):TCATGAGCGGTATGATGC；

外游引物F3(SEQ ID NO.3):CGGAGAAAGCGACAATCA；

内游引物BIP(SEQ ID NO.4):

CTGATATGGAGCAAACGGAAACACTTTTGCCAGTAACGATCATGAGT；

内游引物FIP(SEQ ID NO.5):

TTGTTACGACACAACTTAACTCGCTTTTCCAAAAAATTATTCGTGAAGGT.

实施例2环境样本的采集及前处理

1、环境样本的采集

以无菌生理盐水润湿无菌棉签，擦拭待检样本表面(3cm×5cm左右)，浸入装有1mL增菌培养基的无菌离心管中，轻轻搅动后，弃去棉签，将无菌离心管带回实验室进行实验，如为水体样本，直接以无菌吸头或吸管吸取水体，滴入装有1mL增菌培养基的无菌离心管中，进行增菌。

2、环境样本的预增菌培养

为提高检测率，120rpm 37℃振荡培养箱中培养4小时，进行预增菌培养，转速为120rpm。

3、细菌培养

取经过预增菌培养的培养液100μL加入至5mL含有LB培养基的玻璃试管中，37℃振荡培养箱中培养4小时，转速为120rpm。

实施例3提取待测样品DNA

(1)用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1)取2mL过夜培养的菌液，置于离心机中，使用12000rpm离心1.5min，弃上清后加入500μL的细胞悬浮液到上一步的离心管中，吹打混匀溶液，放入提前加热好的水浴锅，37℃水浴60min，期间上下颠倒3-4次，12000rpm离心2min，弃上清之后，于管正上方缓慢加入225μL缓冲液A，吹打混匀；

2)向上述管中加入10μL RNaseA溶液，振荡15s，室温放置5min后，加入10μL蛋白酶K，吹打混匀后，于离心管中加25μL裂解缓冲液S，待吹打混匀后，于离心管正上方滴入250μL缓冲液B，旋涡振荡10s，放入提前加热好的水浴锅，70℃水浴加热10min，置于离心机中，使用12000rpm离心1min；

3)取上清到一干净的管中，于管正上方缓慢加入250μL无水乙醇，振荡15s，使溶液充分混匀，快速离心，将贴在管盖和管壁上的水珠离心至管底，取上一步的溶液悬空缓慢加入到干净的吸附柱中，静置5min，使溶液中的核酸充分结合到吸附柱上，12000rpm离心30s，弃废液；

4)于吸附柱正上方缓慢加入500μL缓冲液C，静置2min，使缓冲液充分浸泡吸附柱，接着置于离心机中，12000rpm离心30s，弃废液，于吸附柱正上方缓慢加入700μL加有无水乙醇的漂洗液W2，静置2min，使漂洗液充分浸泡吸附柱，接着置于离心机中，使用12000rpm离心30s，弃废液；

5)于吸附柱正上方缓慢加入500μL加有无水乙醇的漂洗液W2，接着置于离心机中，12000rpm高速离心30s，弃废液。然后12000rpm离心2min，将吸附柱置于无菌通风橱，放置10min；

6)待吸附柱上的漂洗液充分晾干后，将其放入新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入100μL洗脱缓冲液TE，该TE需要提前使用60℃加热，60℃处理过的TE能更好的溶解核酸，接着室温放置3min，置于离心机中，12000rpm离心1min，收集并低温保存含有基因组的溶液以备后续使用，可作为PCR和LAMP反应的模板；

(2)使用化学试剂进行直接裂解以获得基因组，步骤如下：

1)加入2-10μL菌液到8μL溶液A(125mM NaOH，1mM EDTA，0.1％ Tween 20)中，混匀后65℃温育10min；

2)加入8μL溶液B(125mM HCl，10mM Tris HCl)，混匀后，取其上清液即可作为PCR和LAMP反应的模板。

实施例4阳性质粒载体构建及获得

(1)靶序列PCR扩增

以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，使用外游引物F3和B3，对特异基因进行PCR扩增，体系为12.5μL 2×TSINGKE Master Mix(包含DNA polymerase 1U，1.5mM MgCl2，200μM dNTP)，10μM的上下游引物，50ng基因组DNA。

PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环：最后72℃延伸2min，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。

(2)目的产物的回收

从脂糖凝胶中切下目的片段，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1)待琼脂糖凝胶电泳结束后，小心切下含目的片段的胶块，待称取重量之后，置于离心管中并加入相对胶块质量2倍体积的溶胶液，置于提前加热好的水浴锅中，55℃水浴10min，在此过程中温和翻转离心管1-2次；

2)待胶块充分溶解之后，将其转入到吸附柱中，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液，接着于吸附柱正上方缓慢滴加700μL漂洗液W2，静置3-5min，待漂洗液充分浸泡吸附柱之后，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液；

3)再次滴加500μL漂洗液W2，静置2min，置于离心机中并以12000rpm离心1min，弃废液，将只含吸附柱的离心管置于离心机中，再次使用12000rpm离心2min，使黏附在吸附柱上的漂洗液尽量被除去，接着将吸附柱置于无菌通风橱静置10min；

4)待吸附柱被彻底晾干之后，将其放入一个新的离心管中，于吸附柱正上方缓慢加入40μL的洗脱缓冲液TE，静置4min，使TE充分溶解吸附柱上的核酸。置于离心机中并以12000rpm离心1min，收集并低温保存含有DNA的溶液以供后续实验使用。

(3)连接及转化

1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

①挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mLLB培养基中，37℃振荡2小时，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；

②将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10min，使培养物冷却，于4℃下4100rpm离心10min，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽；

③每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶(80mmol/LMgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重悬细胞沉淀，于4℃下4100rpm离心10min，吸出上清液，并将管倒置lmin以使残留的液体流尽，每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用；

2)连接到PMD19-T Simple

在微量离心管中加入1μL Takara pMD19-T simple载体、4μL目的基因基因PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物，16℃反应过夜。

3)转化DH5α

①全量(10μL)加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min，42℃加热90s后，再在冰中放置1min，加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60min；

②取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16h以形成单菌落。

(4)阳性克隆的筛选

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，以M13F和M13R为引物进行菌落PCR扩增，对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经PCR验证正确的阳性克隆送昆明硕擎生物科技有限公司进行测序；

所述M13F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

SEQ ID NO.6：TGTAAAACGACGGCCAGT.

M13R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

SEQ ID NO.7：CAGGAAACAGCTATGACC.

(5)阳性质粒提取

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行PCR扩增，扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件，将经PCR确证的阳性克隆，接种于LB液体培养基，37℃，160rpm培养过夜；取每个菌株过夜培养液5mL，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，具体操作步骤如下：

1)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

2)向离心管中加入250μL溶液2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，向离心管中加入350μL溶液3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀；

3)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

4)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

5)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12000rpm离心1min将质粒溶液收集到离心管中；

(6)阳性质粒浓度测定

打开Thermo Scientific BioMate 3S紫外分光光度计，预热15min，选定Mode方式为dsDNA，将比色杯用超纯水反复洗几次后加入60μL TE缓冲液调零；将TE缓冲液完全吸出，然后加入待测样品(2μL样品加入58μL TE缓冲液)，选定稀释倍数为30倍进行测定，读取质粒DNA浓度。

(7)质粒数目换算及梯度稀释

阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒数目，质粒数目换算公式为

(注：X为质粒浓度ng/μL；Y为目的产物碱基对数；NA为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)，取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释到底。

(8)菌落计数

1)菌液的培养

配制LB固体培养基，用高压蒸汽灭菌锅灭菌121℃，20min，将在-80℃冰箱中保藏的菌种接种于新鲜的MH液体培养基，37℃震荡培养12小时。

2)稀释平板计数法计数及其步骤

熔化培养基，倒平皿，梯度稀释法稀释原菌样品，涂平皿；

选取1/10⁶，1/10⁷，1/10⁸三个稀释度计数，每皿取菌液0.1mL，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一个重复，37℃倒置培养2天，计数；

每mL原菌样品中微生物的活细胞数(菌落形成数，CFU＝(同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数)/原菌样品体积(mL)。

实施例5建立PCR鉴定体系

(1)PCR条件优化

设置退火温度为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃共6个梯度对退火温度进行优化；

具体反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE预混液(包含1U DNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP)，10μM的外游引物，50ng基因组DNA；

(2)在PCR仪中按以下程序扩增：

95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环；最后72℃延伸2min；

(3)特异性检测

收集肺炎克雷伯氏菌临床分离株36株，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、藤黄微球菌各一株，使用试剂盒提取该41株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测，结果见图1；

由图1可知，本发明建立的PCR体系能够准确鉴定肺炎克雷伯氏菌，与其他菌株形成区别，有较好的特异性。

(4)灵敏度检测

1)肺炎克雷伯氏菌阳性质粒灵敏度

用上述稀释好的阳性质粒作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5μL 2×TSINGKE预混液(包含DNA聚合酶1U，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP)，10μM的外游引物，50ng基因组DNA；

PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环；最后72℃延伸2min；

2)肺炎克雷伯氏菌菌液灵敏度

利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释后并与小鼠血液按1:1体积混合，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行PCR扩增，其反应体系为：12.5μL2×TSINGKE预混液(包含1U DNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP)，10μM的外有引物，50ng基因组DNA；

PCR反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环；最后72℃延伸2min；

PCR鉴定体系的灵敏度检测结果如图2(A)和图2(B)所示，其中图2(A)为阳性质粒的灵敏度结果，图2(B)为菌液的灵敏度结果；

由图2(A)和图2(B)可知，本发明建立的PCR体系能够精确检测到低浓度的肺炎克雷伯氏菌的菌液和质粒，具有较高的灵敏度。

实施例6建立LAMP鉴定体系

(1)LAMP反应

反应体系：15μL2×等温预混液，8μM内游引物，1μM外游引物，100ng基因组DNA，最后加去核酸酶水补足25μL，该反应在仪器等温扩增荧光检测系统Genie II(OptiGene，UK)中进行，其过程为：65℃温育30min，98℃到80℃退火；

(2)特异性检测

利用肺炎克雷伯氏菌临床分离株36株，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌各一株，使用试剂盒提取该40株菌的基因组进行特异性检测，结果见图3(A)和图3(B)所示；

由图3(A)和图3(B)可知，本发明建立的LAMP体系能够准确鉴定肺炎克雷伯氏菌，与其他菌株形成区别，有良好的特异性。

(3)灵敏度检测

利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释后并与小鼠血液按1:1体积混合，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行LAMP扩增反应，结果见图4(A)和图4(B)所示；

由图4(A)和图4(B)可知，本发明建立的LAMP体系能够精确检测到低浓度的肺炎克雷伯氏菌的菌液，菌液浓度为10⁰个拷贝时也可检测到目的序列，具有较高的灵敏度。

综上所述，本发明通过多重BLAST筛选分析发现基因名为CelB的肺炎克雷伯氏菌特异性基因，针对该基因设计内外游引物，构建了两种鉴定体系，优化了反应体系及流程，并进行灵敏度和特异性实验，证明该基因能有效鉴定或检测肺炎克雷伯氏菌，灵敏度高，特异性好，鉴定方法操作简便，具有广阔的应用前景和市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南科耀生物科技有限公司

<120> 一种CelB基因的用途

<130> 2018年

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgcaaagca ttggtcaaaa tacctacctt aagtcaatca tgagcggtat gatgctcata 60

ttgccagtaa cgatcatgag ttctgtggcg actttggtta aagtgtttcc gtttgctcca 120

tatcaggatt ttttgttacg acacaactta actcgcttct ttgatatccc gattaccttc 180

acgaataatt ttttggccgt gattgtcgct ttctccgttg cctatacgct agcgaaaaat 240

ttcgatgttg atggcttcat gtcaggcctg atttcaatga tctctttctt tattttaacg 300

ccgtatgatc tcggtgaaat agggccgtta gctctttga 339

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcatgagcgg tatgatgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cggagaaagc gacaatca 18

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctgatatgga gcaaacggaa acacttttgc cagtaacgat catgagt 47

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ttgttacgac acaacttaac tcgcttttcc aaaaaattat tcgtgaaggt 50

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

caggaaacag ctatgacc 18

Claims (10)

1.一种CelB基因用于非疾病的诊断和治疗目的的鉴定肺炎克雷伯氏菌的用途，其特征在于，所述CelB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，根据所述CelB基因设计特异性引物，所述特异性引物包括一对外游引物和一对内游引物；

其中，所述外游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，所述内游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述鉴定肺炎克雷伯氏菌包括如下步骤：

(1)针对基因CelB设计特异性引物，包括一对外游引物；

(2)采集样本并进行增菌培养，提取DNA，得到待测模板；

(3)建立PCR鉴定体系，对待测模板进行检测；

或者，所述鉴定肺炎克雷伯氏菌包括如下步骤：

(1')针对基因CelB设计特异性引物，包括一对外游引物和一对内游引物；

(2')采集样本并进行增菌培养，提取DNA，得到待测模板；

(3')建立LAMP鉴定体系，对待测模板进行检测。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，在步骤(1)和步骤(1')之前还包括BLAST筛选步骤。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述BLAST筛选包括本地BLAST和在线BLAST。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3)所述PCR鉴定体系的反应体系为：10-15μL 2×PCR预混液，8-12μM的外游引物，40-60ng待测样品DNA。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述预混液包含1-3U DNA聚合酶、1-3mMMgCl₂和180-220μM dNTP。

8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3)所述PCR鉴定体系的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸，35个循环；72℃延伸2min。

9.如权利要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3')所述LAMP鉴定体系的反应体系为：13-17μL 2×等温预混液，6-10μM内游引物，1-3μM外游引物，80-120ng待测样品DNA。

10.如权利要求3所述的用途，其特征在于，步骤(3')所述LAMP鉴定体系的反应条件为：63-68℃温育30min，80-98℃进行退火。

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