CN112725528A - 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 - Google Patents
一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112725528A CN112725528A CN202011639537.4A CN202011639537A CN112725528A CN 112725528 A CN112725528 A CN 112725528A CN 202011639537 A CN202011639537 A CN 202011639537A CN 112725528 A CN112725528 A CN 112725528A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- probe
- nadc30
- respiratory syndrome
- porcine reproductive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 abstract description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 7
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 7
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 3
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 3
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001126326 Cyanea <Cnidaria> Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000117280 Naematelia aurantialba Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010803 Rapid Extraction Total RNA Kit Methods 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241001506047 Tremella Species 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000144068 Rice ragged stunt virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测猪蓝耳病NADC30‑like毒株的引物组、探针及试剂盒。本发明提供了一种检测猪蓝耳病NADC30‑like毒株的特异性引物组和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示，并基于该特异性引物和探针提供了一种检测NADC30‑like毒株的检测试剂盒和TapMan荧光定量PCR检测方法，该试剂盒和检测方法从样本核酸提取到出结果只需要3个小时，缩短了检测时间，可以快速检测并反馈检测结果，提高检测机构的效率，也帮助猪养殖场更快地了解猪的感染情况。同时，本发明不需要借助酶切、测序等技术，也没有使用试剂盒，节约检测成本，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及病毒分子生物学检测技术领域，更具体地，涉及一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome)又称为猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)种猪烈性传染病，其临床特征主要表现为母猪严重的繁殖障碍，断奶仔猪呼吸道疾病。该病传播快、传染性强，是世界动物卫生组织(Office international des épizooties，OIE)列入的93 法定报告的动物疫病之一。PRRSV是单链正股RNA病毒，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，该病毒家族的一个重要特征是高变异频率和病毒重组，因而能够快速的进化并产生异常多样的病毒。
2013年河南省率先报道发现NADC30类毒株，其后在东北吉林、黑龙江等省份也发现该类毒株，并在国内呈扩散态势。2014年以来NADC30-like毒株在我国流行呈现出加剧趋势，疫情涉及地区包括北京、天津、河北、山东、山两、河南、江苏、浙江、福建、四川、湖北、广东等地，临床检出率高，可能已成为P RRSV主要毒株；发病猪场临床症状主要为：母猪流产等繁殖障碍，流产率高达 30％-40％，保育及生长育肥猪严重的呼吸道症状，容易继发细菌性疾病，断奶仔猪会出现死亡现象，给我国生猪养殖带来了新的挑战。近些年来，NADC30-like 毒株已经成为市场上的优势毒株，流行率已经达到58％，个别省份如福建、河南已经接近70％，占据绝对流行优势。
PRRSV的RNA基因组含有9个开放型阅读框(ORFs)：ORFs 1a和1b编码非结构蛋白(NSPs)；ORFs 2a、2b、3、4和5编码囊膜蛋白；ORFs 6和7分别编码基质蛋白和核蛋白，基因序列在15kb左右。蓝耳病病毒变异率较高，自发现以来，国内流行着很多谱系的蓝耳病病毒，针对发现较早的毒株比如CH-1、Jxa -1等毒株早已经有了商品化的疫苗为生猪养殖保驾护航，但是目前市面上没有流通针对NADC30-like毒株的商品化疫苗。同时，NADC30-like毒株的危害性更持续，NADC30-like毒株在致病性上比经典毒株弱，但是同样持续感染，且主要造成母猪流产，流产率较高，对猪场的经济效应影响较大，同时仔猪感染后，免疫力受到抑制，导致条件性致病菌发病，造成较严重呼吸症状和继发感染，临床症状较严重且存在较高的死亡率。2020年，在中国经过非洲猪瘟疫情的大背景下，国内各大小养殖企业大量从国外引进后备母猪和猪苗，但因为目前检测手段的不足，导致弱毒株NADC30-like不易在临床上察觉，不能精准筛选到NADC3 0-like毒株，导致这种毒株大量进入国内市场，国内养殖企业在初期如不重视和注意，就会导致这种弱毒株在猪场大面积传播，等到造成母猪流产、仔猪发病时已经来不及进行控制了。
专利CN110885900A公开了一种蓝耳病毒经典株和NADC30-like毒株的冻干微芯片的试剂盒和方法，专利CN109762932A公开了一种鉴别HP-PRRSV和 NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用。前者的试剂盒的优点在于准确特异性的检测蓝耳病毒经典株和NADC30-like毒株，且便于携带，但是制作工艺较为复杂，成本较高；而后者的引物和探针只能从其他非蓝耳病毒株中检测出蓝耳病毒经典株HP-PRRSV和NADC30-like毒株，无法确定能否从感染蓝耳病混合毒株的猪中准确单独检测出NADC30-like毒株。且现在生猪养殖处于非洲猪瘟防疫阶段和复产关键阶段，而目前华南地区养殖厂针对蓝耳病的反馈大部分感染的是NADC30-like毒株，对NADC30-like毒株感染尤其需要进行前期的监控，所以以上试剂盒和方法都不适合养殖场和实验机构大批量、低成本地检测蓝耳阳性样本。
发明内容
本发明的目的在于解决现在临床、养殖场和实验机构等遇到的检测猪蓝耳病的问题，提供一种精准独立地从猪蓝耳病混合毒株中检测出NADC30-like毒株的检测方法，通过设计出的特异性引物和探针可以精准地检测出感染猪蓝耳病的病料样本是否感染NADC-30-like毒株，从而与其他流行蓝耳病毒准确区分开。
本发明的第一个目的是提供一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性引物组。
本发明的第二个目的是提供一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性探针。
本发明的第三个目的是提供所述特异性引物组和/或探针在检测猪蓝耳病NADC30-like毒株中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述特异性引物组和/或探针在制备猪蓝耳病NADC30-like毒株检测试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种猪蓝耳病NADC30-like毒株的检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性引物组，所述引物组包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物。
一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述探针的5′端修饰有荧光基团；3′端修饰有荧光淬灭基团。
更优选地，所述探针的5′端修饰FAM，3′端修饰MGB。
本发明要求保护以上所述特异性引物组和/或所述探针在检测猪蓝耳病 NADC30-like毒株中的应用。
进一步本发明还要求保护以上所述特异性引物组和/或所述探针在制备猪蓝耳病NADC30-like毒株检测试剂盒中的应用。
本发明还要求保护一种猪蓝耳病NADC30-like毒株的检测试剂盒，包含以上所述特异性引物组和/或所述探针。
优选地，还包括PCR反应的试剂。
更优选地，所述PCR反应的试剂包括Premix Ex Tap、cDNA模板和ddH2O。
进一步优选地，所述检测试剂盒的PCR反应的体系为：Premix Ex Tap 10μL， 0.1μM以上所述上、下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，ddH2O 6.4μL，以上所述探针0.4μL，共20μL。
PCR反应的条件为：95℃预变性30秒，再以40个循环进行qPCR反应，反应条件为95℃5秒，60℃30秒。
一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的TapMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备猪蓝耳病阳性毒株样本；
S2.以毒株样本的cDNA为模板，利用以上所述特异性引物组和探针进行荧光定量PCR扩增；
S3.根据PCR扩增结果进行阳性判断：Cq值在30以下判断为NADC30-like 阳性。
优选地，步骤S1中的样本为临床上疑似感染的组织样品及血清，匀浆后，离心取上清备用。
优选地，步骤S2中PCR反应体系为：Premix Ex Tap 10μL，0.1μM以上所述上、下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，ddH2O 6.4μL，上述探针0.4μL，共20μL。
优选地，步骤S2中PCR的反应条件为：95℃预变性30秒，再以40个循环进行qPCR反应，反应条件为95℃5秒，60℃30秒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明针对华南地区流行的四种蓝耳毒株NADC30-like、Jxa-1、GM2、 XHGD的共有保守区域进行序列分析，获得NADC30-like特有的一小段序列，针对该序列进行特异性分析，设计得到检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性引物和探针，利用该特异性引物和探针建立了一种检测NADC30-like毒株的 TapMan荧光定量PCR检测方法，该方法从样本核酸提取到出结果只需要3个小时，缩短了检测时间，可以快速检测并反馈检测结果，提高检测机构的效率，也帮助猪养殖场更快地了解猪的感染情况。
2、本发明的引物和探针不需要借助酶切、测序等技术，可以直接使用TapMan 探针荧光定量PCR方法检测出感染猪蓝耳病的病料样本是否感染猪蓝耳 NADC-30-like毒株，节约检测成本，且不会与其他蓝耳病阳性毒株样本混淆，从而与其他流行蓝耳病毒准确区分开。并且结合现在检测机构与教学实验机构大批量的检测和实验需求，通过配合核酸提取仪，可在短时间内大批量的验证感染的NADC-30-like毒株阳性样本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为PCR引物和探针的设计与合成流程图。
图2为普通PCR胶图，左起第二泳道为Mark(2000)，第三泳道为 NADC30-like毒株，四、五、六泳道分别为Jxa-1、GM2、XH-GD毒株。
图3为NADC30-like阳性样本检测结果图。
图4为NADC30-like毒株与其他蓝耳阳性毒株(Jxa-1毒株、GM2毒株、 XH-GD毒株)混合毒液的qPCR结果图。
图5为蓝耳阳性毒株(Jxa-1毒株、GM2毒株、XH-GD毒株)混合毒液的 qPCR结果图。
图6为DEPC超纯水阴性对照的qPCR结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 NADC30-like毒株特异性引物、探针的设计与合成
1、qPCR引物、探针的设计与合成
引物和探针的合成设计流程图如图1所示。根据一株本实验室分离并保存的NADC30-like毒株与三株华南地区流行的经典蓝耳毒株Jxa-1、GM2、XH-GD，针对其共有的缺失序列部分和NADC30-like毒株特有部分序列设计qPCR特异性引物和探针。
首先，使用SnapGene软件分析测序得到的全基因组序列，通过比对四株蓝耳毒株得到NADC30-like毒株的一段独有序列，该序列为420bp左右，针对该段序列，使用Oligo7设计一对可跑出NADC30-like毒株阳性引物，之后针对这一段420bp的序列，设计探针，再重新设计引物，探针序列在上下游引物之间，再使用普通PCR验证新的引物是否可以仅NADC30-like毒株阳性，普通PCR结果如图2所示，泳道3为所设计的引物的扩增结果，确定引物后，将探针序列发给合成公司合成，其中，探针的5’端修饰FAM，3’端修饰MGB。
合成公司为北京擎科新业生物技术有限公司。本发明中的NADC30-like特异性引物与探针的核苷酸序列表1所示：
表1 NADC30-like毒株特异性引物与探针
2、标准质粒的构建
为了实验的可靠性，本发明还构建了标准质粒，构建步骤如下：
(1)取通过测序确定为NADC30-like的稳定毒株，提取RNA反转录为 cDNA，之后将反转录得到的cDNA进行扩增和纯化；
(2)用TAKARA公司的试剂盒将纯化后的cDNA扩增产物连接到 PCLONE007载体上，载体连接反应体系(10μL)如下：
反应时间：16℃4h以上。
(3)转化：使用擎科生物TreliefTM 5α感受态细胞，取100μL冰上融化的感受态细胞，加入步骤(2)的连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入500μL无抗性LB 培养液，37℃/200rpm复苏60min。取合适体积的复苏液均匀涂布在氨苄培养基上，37℃培养箱倒置过夜，挑取单菌落阳性样本，摇菌后收集保存。
(4)抽提质粒测序，经测序结果显示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2 检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的试剂盒
一种精准独立地从猪蓝耳病混合毒株中检测出NADC30-like毒株的检测试剂盒，由以下成分组成：
实施例1中序列如SEQ ID NO.1～3所示的特异性引物和探针；Premix Ex Tap、cDNA模板和ddH2O，具体如表2所示。
表2 试剂盒各成分及含量
其中，qPCR的反应条件为：95℃预变性30秒，再以40个循环进行qPCR 反应，反应条件为95℃5秒，60℃30秒。
实施例3 检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的TapMan荧光定量PCR方法
一、实验方法
1、毒株样本的制备
取本实验室猪病检测室所提供的各猪场送检感染猪蓝耳病样本，送检样本包括肺部组织块与血清(注：猪场采集发病猪前腔静脉血液，放置后血清析出，抽取后离心冷冻保存)，所有样本均保证冷链运输。样本送到后妥善保管，针对肺脏组织，裁剪后放入2mL EP管中，加入3粒研磨专用钢珠，使用液氮冷冻研磨机进行研磨后离心收上清。
所有血清及组织液使用上海飞捷生物技术有限公司的RNAfast200总RNA 极速抽提试剂盒提取总RNA，确定RNA纯度浓度是否合格之后，使用北京康润诚业生物科技有限公司的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix试剂盒进行反转录实验，得到cDNA后使用检测蓝耳病通用基因的引物进行PCR扩增后测序，通过反馈基因序列与NCBI数据库进行比对，以区分NADC30-like毒株与其他蓝耳毒株(如Jxa-1、GM2、XH-GD等)样本，保存样本毒株以备用。
2、qPCR模板的制备
采用Mark-145细胞接种样本毒株(Mark-145细胞由西班牙海博莱公司惠赠)。待Mark-145细胞长到单层约90％密度时，将培养基弃去，并用PBS溶液洗涤2次，同时将已经稀释好的毒株液加入不同的T25培养瓶中，一共四种毒株液，分别是NADC-30like毒株、Jxa-1毒株、GM2毒株、XH-GD毒株，这四种病毒均为上述从临床样本上分离培养得到的可以稳定在Mark-145细胞系上传代的阳性毒株；为防止交叉污染，在生物安全柜中操作时应分开操作。将稀释好的毒液在细胞培养箱中孵育1h后补液至5mL，继续培养3～4天，然后放入-80℃冰箱，反复冻融3次后将毒液取出，5000rpm离心5min，取上清放入-80℃备用。
病毒RNA的提取按照上海飞捷生物技术有限公司的RNAfast 200总RNA极速抽提试剂盒说明书，取100μL已离心的病毒液上清进行总RNA提取；按照北京康润诚业生物科技有限公司的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix试剂盒说明书进行反转录，得到总cDNA样品，保存至-20℃备用。
3、qPCR扩增
使用实施例2的检测试剂盒，以上述得到的总cDNA为模板，按照Takara Premix ExTap(Probe qPCR)反应体系说明书实验，使用CFX96 Real-Time PCR Detection System对样本进行qPCR扩增。
每个样本反应设置三个统计学重复孔位，结果在排除异常数值后取平均值 (异常结果过多或过于异常需要重复试验步骤)。
二、实验结果
qPCR反应完成后，记录反应数据，阳性结果判断：综合几种荧光定量仪器分析仪及重复数据源，数据反馈Ct值在32以下为NADC30-like阳性。
检测结果如图4所示，NADC30-like毒株阳性样本的Ct值为23.39；图5显示NADC30-like毒株与其他蓝耳阳性毒株(Jxa-1毒株、GM2毒株、XH-GD毒株)混合毒液样本的Ct值为23.17；图6显示蓝耳阳性毒株(Jxa-1毒株、GM2 毒株、XH-GD毒株)混合毒液样本及阴性对照皆无荧光信号。结果说明本发明方法只对NADC30-like毒株具有检测阳性，证明特异性好，针对猪蓝耳病 NADC30-like毒株具有很好的检测效果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccggagaac aggcctctt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgcaccca aacttgatct 20
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgccccacg cagg 14
<210> 4
<211> 898
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagtggtac gacggcagtt gatctgactc aggatcactc gtgttacact gcaatcgcgt 60
gtcgcccttc tgtcgtggcc caaaggtctt cgccggattt ccagcctcga aaagcggagt 120
ctgtcaagaa ccttccggag aacaggcctc ttcctgcccc acgcaggaag atcaagtttg 180
ggtgcggtag tttggtttca ttgggcggcg aaagggcgac acgcgattgc agtcttgagt 240
ccacctgaag gatgtcaaac ttggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctt 300
ccatagacac aacatacgag ccggaacaga aagtcaaaag cctccgaccg gaggcttttg 360
acttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg 420
cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatga gtattcaaca 480
tttccgtgtc gcacttattc cgttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 540
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 600
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 660
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 720
acaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 780
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 840
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaag 898
Claims (10)
1.一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物。
2.一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的特异性探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述特异性探针，其特征在于，所述探针的5′端修饰有荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。
4.权利要求1所述特异性引物组和/或权利要求2所述探针在检测猪蓝耳病NADC30-like毒株中的应用。
5.权利要求1所述特异性引物组和/或权利要求2所述探针在制备猪蓝耳病NADC30-like毒株检测试剂盒中的应用。
6.一种猪蓝耳病NADC30-like毒株的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述特异性引物组和/或权利要求2所述探针。
7.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应的试剂。
8.根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应的试剂包括Premix ExTap、cDNA模板和ddH2O。
9.根据权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，PCR反应的体系为：Premix Ex Tap 10μL，0.1μM权利要求1所述上、下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，ddH2O 6.4μL，权利要求2所述探针0.4μL，共20μL。
10.根据权利要求6～9任一所述检测试剂盒，其特征在于，PCR反应的条件为：95℃预变性30秒，再以40个循环进行qPCR反应，反应条件为95℃5秒，60℃30秒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011639537.4A CN112725528A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011639537.4A CN112725528A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112725528A true CN112725528A (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=75609000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011639537.4A Pending CN112725528A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112725528A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114292961A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-08 | 龙岩学院 | 鉴定类nadc-30毒株的实时荧光rt-pcr检测引物和探针组 |
| CN114717361A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-07-08 | 漳州傲农现代农业开发有限公司 | 一种猪蓝耳类nadc30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105603127A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-05-25 | 天津市畜牧兽医研究所 | 一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒 |
| CN109762932A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-17 | 河北科技师范学院 | 鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用 |
| CN110885900A (zh) * | 2018-09-10 | 2020-03-17 | 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） | 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011639537.4A patent/CN112725528A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105603127A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-05-25 | 天津市畜牧兽医研究所 | 一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒 |
| CN110885900A (zh) * | 2018-09-10 | 2020-03-17 | 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） | 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法 |
| CN109762932A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-17 | 河北科技师范学院 | 鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHI-QING YU等: "Ginsenoside Rg1 Suppresses Type 2 PRRSV Infection via NF-κB Signaling Pathway In Vitro, and Provides Partial Protection against HP-PRRSV in Piglet", VIRUSES * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114292961A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-08 | 龙岩学院 | 鉴定类nadc-30毒株的实时荧光rt-pcr检测引物和探针组 |
| CN114717361A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-07-08 | 漳州傲农现代农业开发有限公司 | 一种猪蓝耳类nadc30毒株的荧光探针引物、试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110747175B (zh) | 一株猪δ冠状病毒及其应用 | |
| CN103131798A (zh) | 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN112725528A (zh) | 一种检测猪蓝耳病NADC30-like毒株的引物组、探针及试剂盒 | |
| CN112111607A (zh) | 一种covid-19病毒核酸质控品及其应用 | |
| CN112029803A (zh) | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 | |
| CN116426487A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用 | |
| CN113564133A (zh) | 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用 | |
| CN111041128B (zh) | 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法 | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| CN113174446A (zh) | 一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重rt-pcr检测方法 | |
| CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
| CN115786587A (zh) | 一种用于同时检测4种病原体的多重pcr的引物组及其检测方法、试剂盒 | |
| CN112094854B (zh) | 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒 | |
| CN112941240B (zh) | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN115612753A (zh) | 一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法 | |
| Li et al. | Establishment of a multiplex RT-PCR assay for identification of atmospheric virus contamination in pig farms | |
| CN114540546A (zh) | 用于prrsv和csfv二重荧光定量pcr检测的引物探针组、试剂盒及检测方法 | |
| CN110904056B (zh) | 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用 | |
| CN113215154A (zh) | TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用 | |
| CN106834282A (zh) | 一种分段扩增猪流行性腹泻病毒全基因组的引物组及方法 | |
| CN108676900B (zh) | 一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合pcr分型试剂盒及其应用 | |
| CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
| Si et al. | Adaptation of genotype 3 hepatitis E virus in Eastern China and inverse correlation with genotype 4 hepatitis E virus | |
| CN110878379A (zh) | 一种类nadc30 prrsv减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用 | |
| CN116219075B (zh) | 可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210430 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |