CN112111607A - 一种covid-19病毒核酸质控品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种COVID‑19病毒核酸质控品及其应用。所述的COVID‑19病毒核酸质控品包括COVID‑19病毒全基因组RNA和人源细胞系RNA，经干燥工艺制得可常温保存的RNA干粉，性能稳定，无需低温保存或干冰运输。所述的COVID‑19病毒核酸质控品病毒拷贝数可精确定量，病毒基因组的拷贝数≥1000，可用于制备COVID‑19核酸检测试剂和/或试剂盒，也可用于对COVID‑19检测试剂的灵敏性、特异性、可重复性、可复制性、检测限等进行有效评估，准确性及重复性较好，能有效减少临床检测假阴性的发生。

Description

一种COVID-19病毒核酸质控品及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种COVID-19病毒核酸质控品及其应用。

背景技术

新型冠状病毒（COVID-19）是一种最新发现的冠状病毒，可引起人新型冠状病毒性肺炎，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。

新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多行性，直径60-140nm，其遗传物质是单条正义RNA链，接近3万个碱基的长度。新型冠状病毒与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-CoV）和中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERSr-CoV）同属于同一家族，目前最接近的是蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45），有85%以上的同源性。新型冠状病毒除RNA核心外，由蛋白质外壳包裹，表面突出的是刺突蛋白（S Protein），它是侵染宿主细胞关键。研究发现它跟SARS病毒一样，与人体细胞的ACE2受体作用从而入侵细胞，但它与ACE2的亲和力是SARS病毒的10-20倍，这很可能是新型冠状病毒高度传染性的原因。

目前，最常用的COVID-19病毒快速检测技术主要是两大类，一类是核酸RNA的检测（CN202010239896.4），主要包括逆转录定量PCR法（qRT-PCR）和测序法（mNGS）；另一类是抗原抗体的检测。从早期确诊的角度看，核酸RNA检测是最优选择：一方面是因为此时患者尚处于疾病的早期阶段，尽早检测对于疫情防控具有重要作用；另一方面是核酸检测可以定量检测病毒的拷贝数，进而动态监测病毒感染的程度和治疗的效果，因此核酸RNA检测也被认为是新冠病毒检测的金标准。理论上，核酸检测是能最早确诊新型冠状病毒感染的方法，但是如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对新型冠状病毒疫情防控具有非常重大的意义，也是现阶段新型冠状病毒疫情防控的难题。

目前存在一些针对COVID-19病毒基因组部分区段的核酸质控品，例如CN202010239896.4公开了包含COVID-19病毒的E基因全长、N基因全长和ORF1ab部分区段的RNA标准品或包含这些区段的假病毒标准品。但由于现有的核酸质控品中没有包含COVID-19病毒的全基因组，因此当使用qRT-PCR方法检测COVID-19病毒核酸时，若设计的检测探针位于这些区段之外，则无法使用这类质控品。此外，由于现有的这些核酸质控品只包含了COVID-19病毒基因组的部分区段，当使用mNGS方法检测COVID-19病毒核酸时，也无法使用这类质控品作为COVID-19病毒全基因的质控品。因此，亟需研发一种覆盖COVID-19病毒全基因组的核酸质控品以解决上述问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提高COVID-19核酸RNA检测的准确性，减少临床检测假阴性的发生。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种COVID-19病毒核酸质控品，COVID-19病毒全基因组RNA和人源细胞系RNA。

具体地，所述的COVID-19病毒核酸质控品的制备方法包括以下步骤：

S1.对COVID-19病毒基因组序列进行分析，得到病毒基因组RNA序列对应的DNA序列，通过化学合成得到DNA片段；

S2.将步骤S1中得到的DNA片段克隆至克隆载体上；

S3.以克隆载体为模板，进行扩增纯化，得到DNA转录模板；

S4.通过体外转录，得到体外转录的病毒RNA片段，确定其拷贝数和浓度；

S5.将人源细胞系RNA与病毒RNA片段按照一定的浓度混合，得到有一定病毒RNA片段拷贝数的混合RNA溶液，确定其拷贝数和浓度；

S6.将混合RNA溶液通过干燥工艺得到RNA干粉。

具体地，步骤S1中所述的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10所示的序列。

优选地，步骤S2中所述的克隆载体为pUC57质粒。

优选地，步骤S5中所述的人源细胞系为HEK293细胞。

具体地，步骤S5中所述的混合RNA溶液中人源细胞系RNA的终浓度为0.1-100ng/μL。

优选地，步骤S5中所述的混合RNA溶液中人源细胞系RNA的终浓度为1-20ng/μL。

更优选地，步骤S5中所述的混合RNA溶液中人源细胞系RNA的终浓度为10ng/μL。

具体地，步骤S6所述的RNA干粉的病毒基因组拷贝数≥1000。

另一方面，本发明还提供了所述的COVID-19病毒核酸质控品制备在COVID-19核酸检测试剂和/或试剂盒中的应用。

所述的COVID-19病毒核酸质控品特异性、重复性较好，可用于对COVID-19检测试剂进行有效的质量评估，有效减少检测假阴性的发生。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明所提供的针对常用的qRT-PCR核酸检测方法的COVID-19病毒核酸质控品病毒拷贝数可精确定量，病毒基因组的拷贝数≥1000，可用于制备COVID-19核酸检测试剂和/或试剂盒，也可用于对COVID-19检测试剂的灵敏性、特异性、可重复性、可复制性、检测限等进行有效评估，准确性及重复性较好，能有效减少临床检测假阴性的发生。

（2）本发明所提供的质控品涵盖了COVID-19病毒的全基因组序列，因此适用于所有qRT-PCR方法的质控，不受检测探针的位置影响；也适用于mNGS方法的质控。

（3）本发明所提供的COVID-19病毒核酸质控品性能稳定，无需低温保存或干冰运输，可在常温下保存，成本低。

附图说明

图1为数字PCR检测病毒RNA片段（SEQ ID NO:1所示序列转录得到的RNA）的1D散点图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 COVID-19病毒核酸质控品病毒RNA片段的制备

按照如下步骤制备COVID-19病毒核酸质控品病毒RNA片段：

1.将全长为29903nt的COVID-19病毒核酸序列（Genbank号：MN908947.3）进行分析，得到病毒基因组RNA序列对应的DNA序列，拆分为10条3K左右的DNA片段。

在每条DNA片段序列的5’端增加T7启动子的序列，然后得到的10条DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10所示的序列。

通过化学合成的方式，合成SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10这10条DNA片段。

2.将所得的DNA片段克隆至pUC57载体上，挑选阳性克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行扩大培养，提取质粒。

3.以质粒为模板，选取载体上的M13-F和M13-R引物进行PCR扩增及纯化得到DNA转录模板。

4.体外转录：以步骤3中的纯化DNA为模板，以T7启动子进行RNA的转录，具体如下（以mMESSAGEmMACHINE™ T7 ULTRA Transcription Kit，Invitrogen，货号：AM1345和MEGAclear™ Transcription Clean-Up Kit，Invitrogen，货号：AM1908为例）：

a.从冰箱中取出各试剂，解冻，漩涡震荡后简短离心，按下表1配制反应体系：

表1反应体系

体外转录	体系
		T7 2× NTP/ARCA	10µL
10× T7 reaction buffer	2µL
		DNA纯化产物	0.2µg
T7 Enzyme Mix	2µL
		Nuclease-free water	补加至20µL

b.震荡混匀，37℃孵育2h后向体系中加入1µL TURBO DNase，震荡混匀后，37℃孵育15min，消化掉DNA模板；

c.将转录后的RNA样品转移至1.5mL离心管，向其中加入350uL Binding SolutionConcentrate，使用移液器轻柔吹打混匀；

d.加入100µL无水乙醇，使用移液器轻柔吹打混匀；

e.组装纯化柱，将RNA溶液转移至纯化柱中，12000g离心30s，弃掉流穿液；

f.向纯化柱中加入500µL Wash Solution，12000g离心30s，弃掉流穿液；

g.重复步骤f一次；

h.将纯化柱在12000g的条件下离心30s，以去掉残留的液体；

i.提前10min将无酶水加热至95℃，将纯化柱取出，放到一个新的收集管中，取50µL预热的无酶水加到纯化柱中，12000g离心1min；

j.再次向纯化柱中加入50µL预热的无酶水，12000g离心1min；

k.使用Qubit™ RNA BR Assay Kit（Invitrogen，货号：Q10210）试剂盒测定转录的RNA的浓度，并使用Tape Station 4150的RNA芯片对RNA的完整性和片段大小进行确认。

5.体外转录RNA的拷贝数确定：

将体外转录的病毒RNA进行适当稀释，稀释后的病毒RNA在 BIORAD QX200数字PCR平台（BIORAD One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂）上进行拷贝数确认。用于检测病毒RNA片段的引物与探针序列如下表2所示：

表2引物与探针

位点	正向引物序列 (5’-3’)	反向引物序列 (5’-3’)	探针序列 (5’-3’)
				位点1	GTGTTTTAAGCGGACACAATCTT（SEQ ID NO:11）	CCAGCTGATAATAATGGTGCAAGT（SEQ ID NO:12）	CACTGTCTTCATGTTGTCGG（SEQ ID NO:13）
位点2	CAGTCATAACAAGAGAAGTGGGTT（SEQ ID NO:14）	GGTAAGAAATGCAAAAAGTCACCAT（SEQ ID NO:15）	TTTGCCTGGCACGATATTACGCACAAC（SEQ ID NO:16）
				位点3	GGACCTTTTGTTGACAGGCAA（SEQ ID NO:17）	CGTACAACCAAGCTAAAACATTAACTG（SEQ ID NO:18）	CACAAGCAGCTGGTACGGACACAAC（SEQ ID NO:19）
位点4	CCCTGTGGGTTTTACACTTAA（SEQ ID NO:20）	ACGATTGTGCATCAGCTGA（SEQ ID NO:21）	CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG（SEQ ID NO:22）
				位点5	TGTGTGGCGGTTCACTATATGTT（SEQ ID NO:23）	CCGTGACAGCTTGACAAATGTT（SEQ ID NO:24）	AACCTCATCAGGAGATGCCACAACT（SEQ ID NO:25）
位点6	TGATGGTGGCAGTTTGTATGTAAA（SEQ ID NO:26）	ACTCACATGGACTGTCAGAGTAATA（SEQ ID NO:27）	AACATGCATTCCACACACCAGCTTT（SEQ ID NO:28）
				位点7	CCGCATCATTTTCCACTTTTAAG（SEQ ID NO:29）	GCAGCCTGTAAAATCATCTGGTAA（SEQ ID NO:30）	AAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAA（SEQ ID NO:31）
位点8	ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT（SEQ ID NO:32）	ATATTGCAGCAGTACGCACACA（SEQ ID NO:33）	ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG（SEQ ID NO:34）
				位点9	GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT（SEQ ID NO:35）	CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG（SEQ ID NO:36）	TTGCTGCTGCTTGACAGATTA（SEQ ID NO:37）
位点10	GTGTTTTAAGCGGACACAATCTT（SEQ ID NO:38）	CCAGCTGATAATAATGGTGCAAGT（SEQ ID NO:39）	CACTGTCTTCATGTTGTCGG（SEQ ID NO:40）

数字PCR检测第一条体外转录RNA片段（SEQ ID NO:1所示序列转录得到的RNA）的1D散点图如图1所示，检测其它体外转录RNA片段的1D散点图类似，不再赘述，表明针对每条病毒RNA片段的引物探针能够很好的检测RNA片段的拷贝数。

实施例2 COVID-19病毒核酸质控品的制备

1.人源RNA的制备

采用TRIzol^@ Plus RNA Purification Kit试剂盒（Invitrogen，货号12183555）进行人源RNA的提取操作，步骤如下：

a.收集单层HEK293细胞，将培养基尽量去除干净，直接加入1mL TRIzol试剂混匀（1-10cm²培养皿表面加1mL TRIzol）。

b.室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全解离，将裂解液转移至无菌无酶的1.5mL离心管中。

c.每1mL TRIzol裂解液添加0.2mL氯仿，剧烈混匀15s，高速离心15min。

d.离心后，混合物分离为红色下层（酚-氯仿相）、中间相和上层无色水相，转移含有RNA 的上层无色水相约500-550µL到新的离心管中，避免吸入中间相物质。

e.加入等体积70%乙醇，涡旋混匀。上下颠倒离心管，使加入乙醇后的可见沉淀消散。

f. RNA结合上柱，洗涤，洗脱。

g.使用Qubit™ RNA BR Assay Kit（Invitrogen，货号：Q10210）试剂盒对提取的人源RNA进行浓度测定，测定3个重复，取平均值。

2.人源RNA和体外转录病毒RNA混合

根据每条体外转录病毒RNA的拷贝数浓度和人源RNA的浓度，将人源RNA和病毒RNA混合，使每条体外转录病毒RNA拷贝数终浓度≥100拷贝/µL，人源RNA终浓度为10 ng/µL。

实施例3 COVID-19病毒核酸质控品的干粉制备工艺

1.取10µL实施例2中制备的质控品溶液加入到20µL RNA保存剂中，充分混匀。

2.将混匀的RNA溶液开盖置于吉艾姆真空浓缩仪CV200中，设置浓缩时间为1小时，开启浓缩。

3.浓缩程序结束后，RNA溶液应已完全干燥，盖上管盖。

4.将样品管和一袋干燥剂装在铝箔袋中，加热密封以保持干燥。

实施例4 COVID-19病毒核酸质控品的病毒基因组拷贝数确定

1.取3支制得的COVID-19质控品的干粉，分别加入40µL无酶水，复溶10min。

2.表2中的10个探针均匀的分布于COVID-19病毒全基因组序列上，采用这10个探针检测COVID-19病毒基因组拷贝数。使用BIORAD One-Step RT-ddPCR Advanced Kit forProbes试剂在BIORAD QX200数字PCR仪上进行一步法RT-ddPCR，对复溶后的RNA溶液进行精确定量。每个RT-ddPCR反应吸取1µL复溶后的RNA溶液，每个探针进行3个重复，取平均值。再根据RNA体积计算出该探针检测的每管质控品干粉包含的拷贝数。结果详见下表3。

表3 COVID-19病毒核酸质控品的病毒基因组拷贝数

检测位点	样品管1 所含拷贝数	样品管2 所含拷贝数	样品管3 所含拷贝数
				位点1	1489	1501	1382
位点2	1582	1508	1414
				位点3	1466	1549	1506
位点4	1378	1461	1535
				位点5	1685	1699	1576
位点6	1419	1495	1532
				位点7	1387	1513	1467
位点8	1581	1544	1660
				位点9	1371	1266	1337
位点10	1536	1583	1628
				平均	1489	1512	1504

检测结果表明，每管样品COVID-19病毒基因组的拷贝数≥1000，准确性及重复性较好，可用于对COVID-19病毒核酸检测试剂进行有效的质量评估，减少检测假阴性的发生。

实施例5COVID-19病毒核酸质控品的适用性检测

1.选取新型冠状病毒核酸检测试剂盒（圣湘生物），新型冠状病毒核酸检测试剂盒（华大基因），新型冠状病毒核酸检测试剂盒（伯杰生物），新型冠状病毒核酸检测试剂盒（之江生物），新型冠状病毒核酸检测试剂盒（迈克），新型冠状病毒核酸检测试剂盒（达安基因）对质控品进行检测。

2.用无酶水复溶制备的COVID-19病毒核酸质控品干粉10分钟。使用BIORAD CFXCONNECT荧光定量PCR仪，按照各个检测试剂盒说明书的方法进行病毒核酸检测。结果均为阳性，表明该质控品对测试的检测试剂盒均适用，适用性较好。

实施例6COVID-19病毒核酸质控品的稳定性检测

在室温保存1天、15天、30天、60天后各取一支实施例3制得的COVID-19病毒核酸质控品的干粉，分别加入40µL无酶水，复溶10分钟。使用BIORAD One-Step RT-ddPCR AdvancedKit for Probes试剂在BIORAD QX200数字PCR仪上进行一步法RT-ddPCR，对复溶后的RNA溶液进行精确定量，检测病毒基因拷贝数，详见下表4。

表4 COVID-19病毒核酸质控品的病毒基因组拷贝数

检测位点	室温保存1天	室温保存15天	室温保存30天	室温保存60天
					位点1	1521	1618	1369	1494
位点2	1375	1379	1435	1448
					位点3	1578	1600	1437	1360
位点4	1375	1465	1384	1522
					位点5	1562	1421	1528	1390
位点6	1555	1433	1502	1445
					位点7	1531	1522	1587	1463
位点8	1624	1407	1555	1409
					位点9	1481	1492	1487	1318
位点10	1618	1542	1406	1439
					平均	1522	1488	1469	1429

由表4可知，该质控品在室温长时间保存后，COVID-19病毒基因组的拷贝数仍≥1000，具有良好的稳定性，满足长期存放的需要，可保证质控结果的准确性。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 菁良基因科技（深圳）有限公司

<120> 一种COVID-19病毒核酸质控品及其应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatacgact cactataggg agataaaatt aattttagta gtgctatccc catgtgattt 60

taatagcttc ttaggagaat gacattaaag gtttatacct tcccaggtaa caaaccaacc 120

aactttcgat ctcttgtaga tctgttctct aaacgaactt taaaatctgt gtggctgtca 180

ctcggctgca tgcttagtgc actcacgcag tataattaat aactaattac tgtcgttgac 240

aggacacgag taactcgtct atcttctgca ggctgcttac ggtttcgtcc gtgttgcagc 300

cgatcatcag cacatctagg tttcgtccgg gtgtgaccga aaggtaagat ggagagcctt 360

gtccctggtt tcaacgagaa aacacacgtc caactcagtt tgcctgtttt acaggttcgc 420

gacgtgctcg tacgtggctt tggagactcc gtggaggagg tcttatcaga ggcacgtcaa 480

catcttaaag atggcacttg tggcttagta gaagttgaaa aaggcgtttt gcctcaactt 540

gaacagccct atgtgttcat caaacgttcg gatgctcgaa ctgcacctca tggtcatgtt 600

atggttgagc tggtagcaga actcgaaggc attcagtacg gtcgtagtgg tgagacactt 660

ggtgtccttg tccctcatgt gggcgaaata ccagtggctt accgcaaggt tcttcttcgt 720

aagaacggta ataaaggagc tggtggccat agttacggcg ccgatctaaa gtcatttgac 780

ttaggcgacg agcttggcac tgatccttat gaagattttc aagaaaactg gaacactaaa 840

catagcagtg gtgttacccg tgaactcatg cgtgagctta acggaggggc atacactcgc 900

tatgtcgata acaacttctg tggccctgat ggctaccctc ttgagtgcat taaagacctt 960

ctagcacgtg ctggtaaagc ttcatgcact ttgtccgaac aactggactt tattgacact 1020

aagaggggtg tatactgctg ccgtgaacat gagcatgaaa ttgcttggta cacggaacgt 1080

tctgaaaaga gctatgaatt gcagacacct tttgaaatta aattggcaaa gaaatttgac 1140

accttcaatg gggaatgtcc aaattttgta tttcccttaa attccataat caagactatt 1200

caaccaaggg ttgaaaagaa aaagcttgat ggctttatgg gtagaattcg atctgtctat 1260

ccagttgcgt caccaaatga atgcaaccaa atgtgccttt caactctcat gaagtgtgat 1320

cattgtggtg aaacttcatg gcagacgggc gattttgtta aagccacttg cgaattttgt 1380

ggcactgaga atttgactaa agaaggtgcc actacttgtg gttacttacc ccaaaatgct 1440

gttgttaaaa tttattgtcc agcatgtcac aattcagaag taggacctga gcatagtctt 1500

gccgaatacc ataatgaatc tggcttgaaa accattcttc gtaagggtgg tcgcactatt 1560

gcctttggag gctgtgtgtt ctcttatgtt ggttgccata acaagtgtgc ctattgggtt 1620

ccacgtgcta gcgctaacat aggttgtaac catacaggtg ttgttggaga aggttccgaa 1680

ggtcttaatg acaaccttct tgaaatactc caaaaagaga aagtcaacat caatattgtt 1740

ggtgacttta aacttaatga agagatcgcc attattttgg catctttttc tgcttccaca 1800

agtgcttttg tggaaactgt gaaaggtttg gattataaag cattcaaaca aattgttgaa 1860

tcctgtggta attttaaagt tacaaaagga aaagctaaaa aaggtgcctg gaatattggt 1920

gaacagaaat caatactgag tcctctttat gcatttgcat cagaggctgc tcgtgttgta 1980

cgatcaattt tctcccgcac tcttgaaact gctcaaaatt ctgtgcgtgt tttacagaag 2040

gccgctataa caatactaga tggaatttca cagtattcac tgagactcat tgatgctatg 2100

atgttcacat ctgatttggc tactaacaat ctagttgtaa tggcctacat tacaggtggt 2160

gttgttcagt tgacttcgca gtggctaact aacatctttg gcactgttta tgaaaaactc 2220

aaacccgtcc ttgattggct tgaagagaag tttaaggaag gtgtagagtt tcttagagac 2280

ggttgggaaa ttgttaaatt tatctcaacc tgtgcttgtg aaattgtcgg tggacaaatt 2340

gtcacctgtg caaaggaaat taaggagagt gttcagacat tctttaagct tgtaaataaa 2400

tttttggctt tgtgtgctga ctctatcatt attggtggag ctaaacttaa agccttgaat 2460

ttaggtgaaa catttgtcac gcactcaaag ggattgtaca gaaagtgtgt taaatccaga 2520

gaagaaactg gcctactcat gcctctaaaa gccccaaaag aaattatctt cttagaggga 2580

gaaacacttc ccacagaagt gttaacagag gaagttgtct tgaaaactgg tgatttacaa 2640

ccattagaac aacctactag tgaagctgtt gaagctccat tggttggtac accagtttgt 2700

attaacgggc ttatgttgct cgaaatcaaa gacacagaaa agtactgtgc ccttgcacct 2760

aatatgatgg taacaaacaa taccttcaca ctcaaaggcg gtgcaccaac aaaggttact 2820

tttggtgatg acactgtgat agaagtgcaa ggttacaaga gtgtgaatat cacttttgaa 2880

cttgatgaaa ggattgataa agtacttaat gagaagtgct ctgcctatac agttgaactc 2940

ggtacagaag taaatgagtt cgcctgtgtt gtggcagatg ctgtcataaa aactttgcaa 3000

ccagtatctg aattacttac accactgggc attgatttag atgagtggag tatggctaca 3060

tactacttat ttg 3073

<210> 2

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg agatacttac accactgggc attgatttag atgagtggag 60

tatggctaca tactacttat ttgatgagtc tggtgagttt aaattggctt cacatatgta 120

ttgttctttc taccctccag atgaggatga agaagaaggt gattgtgaag aagaagagtt 180

tgagccatca actcaatatg agtatggtac tgaagatgat taccaaggta aacctttgga 240

atttggtgcc acttctgctg ctcttcaacc tgaagaagag caagaagaag attggttaga 300

tgatgatagt caacaaactg ttggtcaaca agacggcagt gaggacaatc agacaactac 360

tattcaaaca attgttgagg ttcaacctca attagagatg gaacttacac cagttgttca 420

gactattgaa gtgaatagtt ttagtggtta tttaaaactt actgacaatg tatacattaa 480

aaatgcagac attgtggaag aagctaaaaa ggtaaaacca acagtggttg ttaatgcagc 540

caatgtttac cttaaacatg gaggaggtgt tgcaggagcc ttaaataagg ctactaacaa 600

tgccatgcaa gttgaatctg atgattacat agctactaat ggaccactta aagtgggtgg 660

tagttgtgtt ttaagcggac acaatcttgc taaacactgt cttcatgttg tcggcccaaa 720

tgttaacaaa ggtgaagaca ttcaacttct taagagtgct tatgaaaatt ttaatcagca 780

cgaagttcta cttgcaccat tattatcagc tggtattttt ggtgctgacc ctatacattc 840

tttaagagtt tgtgtagata ctgttcgcac aaatgtctac ttagctgtct ttgataaaaa 900

tctctatgac aaacttgttt caagcttttt ggaaatgaag agtgaaaagc aagttgaaca 960

aaagatcgct gagattccta aagaggaagt taagccattt ataactgaaa gtaaaccttc 1020

agttgaacag agaaaacaag atgataagaa aatcaaagct tgtgttgaag aagttacaac 1080

aactctggaa gaaactaagt tcctcacaga aaacttgtta ctttatattg acattaatgg 1140

caatcttcat ccagattctg ccactcttgt tagtgacatt gacatcactt tcttaaagaa 1200

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<210> 3

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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aaccagcaaa taatagttta aaaattacag aagaggttgg ccacacagat ctaatggctg 660

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<210> 7

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg agaaccactg aaacagctca ctcttgtaat gtaaacagat 60

ttaatgttgc tattaccaga gcaaaagtag gcatactttg cataatgtct gatagagacc 120

tttatgacaa gttgcaattt acaagtcttg aaattccacg taggaatgtg gcaactttac 180

aagctgaaaa tgtaacagga ctctttaaag attgtagtaa ggtaatcact gggttacatc 240

ctacacaggc acctacacac ctcagtgttg acactaaatt caaaactgaa ggtttatgtg 300

ttgacatacc tggcatacct aaggacatga cctatagaag actcatctct atgatgggtt 360

ttaaaatgaa ttatcaagtt aatggttacc ctaacatgtt tatcacccgc gaagaagcta 420

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gtggtgctgt ctgtagacat catgctaatg agtacagatt gtatctcgat gcttataaca 1680

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gactagctaa acgttttaag gaatcacctt ttgaattaga agattttatt cctatggaca 2580

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tagtttctaa ggttgtcaaa gtgactattg actatacaga aatttcattt atgctttggt 2760

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<210> 8

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg agatgctggt tctgataaag gagttgcacc aggtacagct 60

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atgggacact tcgcatggtg gacagccttt gttactaatg tgaatgcgtc atcatctgaa 420

gcatttttaa ttggatgtaa ttatcttggc aaaccacgcg aacaaataga tggttatgtc 480

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tgctttacat agaagttatt tgactcctgg tgattcttct tcaggttgga cagctggtgc 1500

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aacagaatct attgttagat ttcctaatat tacaaacttg tgcccttttg gtgaagtttt 1740

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<210> 9

<211> 3073

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg agattaactg gaatagctgt tgaacaagac aaaaacaccc 60

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gttttaattt ttcacaaata ttaccagatc catcaaaacc aagcaagagg tcatttattg 180

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aatttatgat gaaccgacga cgactactag cgtgcctttg taagcacaag ctgatgagta 2400

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<210> 10

<211> 3043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg agaggtcatt caatccagaa actaacattc ttctcaacgt 60

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cacaagcagc tggtacggac acaac 25

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<211> 21

<212> DNA

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ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccgtgacagc ttgacaaatg tt 22

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

actcacatgg actgtcagag taata 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aacatgcatt ccacacacca gcttt 25

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccgcatcatt ttccactttt aag 23

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcagcctgta aaatcatctg gtaa 24

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aagtcagaca aatcgctcca gggcaa 26

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acactagcca tccttactgc gcttc 25

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttgctgctgc ttgacagatt a 21

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtgttttaag cggacacaat ctt 23

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ccagctgata ataatggtgc aagt 24

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cactgtcttc atgttgtcgg 20

Claims (7)

1.一种COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，所述的COVID-19病毒核酸质控品包括COVID-19病毒全基因组RNA和人源细胞系RNA。

2.根据权利要求1所述的COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，所述的COVID-19病毒核酸质控品的制备方法包括以下步骤：

S1.对COVID-19病毒基因组序列进行分析，得到病毒基因组RNA序列对应的DNA序列，通过化学合成得到DNA片段；

S2.将步骤S1中得到的DNA片段克隆至克隆载体上；

S3.以克隆载体为模板，进行扩增纯化，得到DNA转录模板；

S4.通过体外转录，得到体外转录的病毒RNA片段，确定其拷贝数和浓度；

S5.将人源细胞系RNA与病毒RNA片段按照一定的浓度混合，得到有一定病毒RNA片段拷贝数的混合RNA溶液，确定其拷贝数和浓度；

S6.将混合RNA溶液通过干燥工艺得到RNA干粉。

3.根据权利要求2所述的COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，步骤S1中所述的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10所示的序列。

4.根据权利要求2所述的COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，步骤S5中所述的混合RNA溶液中人源细胞系RNA的终浓度为0.1-100ng/μL。

5.根据权利要求4所述的COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，步骤S5中所述的混合RNA溶液中人源细胞系RNA的终浓度为1-20ng/μL。

6.根据权利要求2所述的COVID-19病毒核酸质控品，其特征在于，步骤S6所述的RNA干粉的病毒基因组拷贝数≥1000。

7.权利要求1-6中任一项所述的COVID-19病毒核酸质控品制备在COVID-19核酸检测试剂和/或试剂盒中的应用。

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