CN113527522A

CN113527522A - 一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗

Info

Publication number: CN113527522A
Application number: CN202111065565.4A
Authority: CN
Inventors: 胡勇; 洪丹; 胡迅
Original assignee: Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-09-13
Also published as: CN113527522B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗。本发明提供了一种SARS‑CoV‑2病毒抗原NTD‑RBD的三聚体重组蛋白，可将其用于合成编码病毒抗原片段的mRNA，以实现对新型冠状病毒的免疫。本发明所述三聚体重组蛋白，可实现抗原表位的充分暴露以及人源细胞高效表达增加免疫源性；并通过体外转录方法合成编码病毒抗原片段的mRNA，以实现对新型冠状病毒的免疫。整个mRNA疫苗生产周期短、工艺操作简单、生产成本低，保存时间久，不需要冷链，便于运输。

Description

一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗。

背景技术

冠状病毒属病毒广泛存在于自然界，宿主广泛，可感染人及多种动物，分为α、β、γ和δ四个群。根据已有基因组序列进化分析，SARS-CoV-2属于β冠状病毒属病毒。与其他冠状病毒一样，其基因组大小约30kb，为单股正链RNA，包含6个开放式阅读框（open readingframe，ORF），分别编码病毒的非结构蛋白、结构蛋白及一些辅助蛋白。病毒的结构蛋白由刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）蛋白组成。SARS-CoV-2的病毒基因组与SARS-CoV有79.5%的序列同源性，具有典型冠状病毒基因组结构。

针对新冠病毒的预防，疫苗研发至关重要，目前新冠病毒的疫苗以灭活疫苗为主，但是灭活疫苗研发和安全评价周期长、获批准上市较慢，不足以应对突发、急性病毒病的防控需求，目前针对新冠病毒的mRNA疫苗均是针对S蛋白序列全长设计的mRNA产品，翻译成S蛋白后抗原表位暴露不充分，影响免疫原性。

SARS-CoV-2中，S蛋白能够诱导中和抗体的产生。S蛋白由宿主蛋白酶切割形成S1和S2两个亚基，其中S1亚基由受体结合结构域（Receptor binding domain, RBD）和N结构域、C结构域组成。S2亚基包含融合肽、七肽重复序列（HR1和HR2）结构域，S1与细胞受体结合后，S2亚基中的融合肽插入宿主细胞膜中，引起病毒和宿主细胞膜的融合，使病毒基因组释放到细胞中。RBD为病毒与细胞表面受体结合的区域，负责病毒吸附在宿主细胞表面，是决定病毒的宿主范围及跨种传播的主要因素。NTD即N-terminal domain，为新型冠状病毒S抗原N端的一段序列，多种冠状病毒的NTD可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，帮助病毒对宿主细胞的粘附和入侵，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。此外，S蛋白的NTD和RBD在结构上相邻，因此NTD也有望作为一个靶点开发中和抗体或者是疫苗研发。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗，使抗原稳定在其三聚体构象中，防止结构重排，并暴露出抗原性较佳的抗原表位可引起更高的中和抗体应答，其对应mRNA可用于标准化生产预防疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种SARS-CoV-2中维持三聚体构象的重组蛋白，自然条件下，由三个NTD-RBD蛋白单体通过共价键构成三聚体，在本发明中，功能序列1和2编码T4噬菌体的两种三聚体蛋白结构域，分别与目标抗原序列融合，从而构建出稳定的抗原三聚体编码序列，通过细胞内翻译获得三聚体化的抗原蛋白，诱导体液免疫反应和中和反应抗体。所述三聚体重组蛋白的氨基酸序列包括（a）中任一条抗原氨基酸序列和（b）中任一条信号肽氨基酸序列的组合：

（a）SEQ ID No.1~SEQ ID No.5所示氨基酸序列；

（b）SEQ ID No.6~SEQ ID No.10所示氨基酸序列。

优选的，所述三聚体重组蛋白的氨基酸序列还包括（c）中任一条功能肽氨基酸序列：

（c）SEQ ID No.11~SEQ ID No.12所示氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述三聚体重组蛋白的DNA。

本发明还提供了编码上述三聚体重组蛋白的mRNA。

本发明还提供了上述mRNA的制备方法，对上述DNA进行体外转录，得所述mRNA。

本发明还提供了一种体外转录上述mRNA的表达载体模板，所述表达载体模板的基因组中包括上述DNA。

本发明还提供了上述三聚体重组蛋白或上述mRNA在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用。

优选的，所述SARS-CoV-2疫苗包括预防性mRNA疫苗。

本发明还提供了一种预防性SARS-CoV-2疫苗，包括上述mRNA。

优选的，还包括生理盐水。

有益效果：本发明提供了一种SARS-CoV-2维持三聚体构象的三聚体重组蛋白，通过基因工程学方法，在野生型S蛋白的基础上对其氨基酸序列进行改造，提供了mRNA编码的病毒抗原片段，然后合成编码病毒抗原片段的mRNA，以实现对新型冠状病毒的免疫（图2）。本发明采用基因工程技术使抗原稳定在其三聚体构象中，防止结构重排，并暴露出抗原性较佳的抗原表位可引起更高的中和抗体应答。本发明所述三聚体重组蛋白的编码序列通过基因工程技术克隆到质粒中用于mRNA合成。

本发明所述三聚体构象的三聚体重组蛋白，可实现人源细胞高效表达增加免疫源性；然后通过体外转录方法合成编码病毒抗原片段的mRNA，以实现对新型冠状病毒的免疫。

目前公开的mRNA疫苗所编码的抗原均为S蛋白全长序列，然而针对新冠病毒感染康复患者血清的抗体分析表明，中和抗体结合表位集中在S蛋白的NTD和RBD区域，因此，设计NTD-RBD为抗原的疫苗，能在相同接种量的条件下，引起更强的中和抗体效应。

附图说明

图1为本发明的mRNA结构示意图；

图2为本发明的mRNA疫苗抗原来源示意图；

图3为NTD-RBD mRNA和S蛋白全长mRNA免疫效果对比；

图4为实施例1中经序列优化后的编码三聚体构型NTD-RBD蛋白抗原片段的不同mRNA疫苗表达结果；

图5为mRNA疫苗（1）~（15）接种小鼠后S特异性抗体滴度结果；其中， CK：control，1~15为优选的编码的三聚体构型NTD-RBD蛋白：（1）SEQ ID No. 1+6+11；（2）：SEQ SEQ IDNo. 1+6+12；（3）：SEQ ID No. 1+7+11；（4）：SEQ ID No. 1+7+12；（5）：SEQ ID No. 1+8+11；（6）：SEQ ID No. 1+8+12；（7）：SEQ ID No. 1+9+11；（8）：SEQ ID No.1+9+12；（9）：SEQ IDNo. 1+10+11；（10）：SEQ ID No. 1+10+12；（11）SEQ ID No. 2+6+11；（12）：SEQ ID No. 2+7+11；（13）：SEQ ID No.2+8+11；（14）：SEQ ID No. 2+9+11；（15）：SEQ ID No. 2+10+11；

图6为实施例4与实施例2中利用mRNA（15）：SEQ ID No. 2+10+11接种小鼠后中和抗体滴度结果，图中每条曲线代表一只小鼠。

具体实施方式

本发明提供了一种SARS-CoV-2中维持三聚体构象的三聚体重组蛋白，所述三聚体重组蛋白的氨基酸序列包括（a）中任一条氨基酸序列和（b）、（c）中任一条氨基酸序列的组合：

（a）SEQ ID No.1~SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，和由SEQ ID No. 1~SEQ IDNo.5所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加若干个氨基酸并保持相同功能的蛋白序列；

（b）SEQ ID No.6~SEQ ID No.10所示的信号肽序列。

（c）SEQ ID No.11~SEQ ID No.12所示的功能肽序列。

本发明（a）中所述蛋白序列为在野生型S蛋白的部分结构域基础上修饰改进后的蛋白序列。在本发明中，S蛋白可被宿主蛋白酶切割形成S1和S2两个亚基，其中S1亚基由受体结合结构域（Receptor binding domain，RBD）和N结构域、C结构域组成。RBD为病毒与细胞表面受体结合的区域，负责病毒吸附在宿主细胞表面，是决定病毒的宿主范围及跨种传播的主要因素。NTD即N-terminal domain，为新型冠状病毒S抗原N端的一段序列，多种冠状病毒的NTD可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，帮助病毒对宿主细胞的粘附和入侵，介导病毒入侵宿主细胞。

本发明将（a）所述蛋白序列中的任一条序列与（b）所述信号肽序列以及(c)所述功能肽的任一条序列进行组合，使得所表达出的三聚体重组蛋白处于三聚体构型，以实现人源细胞高效表达增加免疫源性，与野生型氨基酸序列相比，所述三聚体重组蛋白更易诱导中和抗体的产生。

在本发明中，所述组合优选包括自N端至C端依次连接，如（a）+（b）。

本发明所述三聚体重组蛋白的序列中，优选还可以与（c）所示氨基酸序列的任一条功能肽进行结合：（c）SEQ ID No.11~SEQ ID No.12所示氨基酸序列的功能肽。

本发明所述三聚体重组蛋白的结构如图1所示。在本发明中，所述三聚体重组蛋白的组合优选包括50种，分别为：（1）SEQ ID No.1、SEQ ID No.6和SEQ ID No.11的结合（简写为SEQ ID No. 1+6+11）；（2）：SEQ ID No.1、SEQ ID No.6和SEQ ID NO.12的组合（简写为SEQ ID No. 1+6+12）；（3）：SEQ ID No. 1+7+11；（4）：SEQ ID No. 1+7+12；（5）：SEQ ID No.1+8+11；（6）：SEQ ID No. 1+8+12；（7）：SEQ ID No. 1+9+11；（8）：SEQ ID No.1+9+12；（9）：SEQ ID No. 1+10+11；（10）：SEQ ID No. 1+10+12；（11）SEQ ID No. 2+6+11；（12）：SEQ IDNo. 2+6+12；（13）：SEQ ID No. 2+7+11；（14）：SEQ ID No. 2+7+12；（15）：SEQ ID No.2+8+11；（16）：SEQ ID No.3+8+12；（17）：SEQ ID No. 2+9+11；（18）：SEQ ID No.2+9+12；（19）：SEQ ID No. 2+10+11；（20）：SEQ ID No. 2+10+12；（21）SEQ ID No. 3+6+11；（22）：SEQ IDNo. 3+6+12；（23）：SEQ ID No. 3+7+11；（24）：SEQ ID No. 3+7+12；（25）：SEQ ID No.3+8+11；（26）：SEQ ID No.3+8+12；（27）：SEQ ID No. 3+9+11；（28）：SEQ ID No.3+9+12；（29）：SEQ ID No. 3+10+11；（30）：SEQ ID No. 3+10+12；（31）SEQ ID No. 4+6+11；（32）：SEQ IDNo. 4+6+12；（33）：SEQ ID No. 4+7+11；（34）：SEQ ID No. 4+7+12；（35）：SEQ ID No.4+8+11；（36）：SEQ ID No.4+8+12；（37）：SEQ ID No. 4+9+11；（38）：SEQ ID No.4+9+12；（39）：SEQ ID No. 4+10+11；（40）：SEQ ID No. 4+10+12；（41）SEQ ID No. 5+6+11；（42）：SEQ IDNo. 5+6+12；（43）：SEQ ID No. 5+7+11；（44）：SEQ ID No. 5+7+12；（45）：SEQ ID No.5+8+11；（46）：SEQ ID No.5+8+12；（47）：SEQ ID No. 5+9+11；（48）：SEQ ID No.5+9+12；（49）：SEQ ID No. 5+10+11；（50）：SEQ ID No. 5+10+12。

本发明还提供了编码上述三聚体重组蛋白的DNA。本发明对所述DNA的来源和制备方法并没有特殊限定，可自行或商业化合成。

本发明可将所述DNA克隆到质粒作为模板进行体外转录（in vitrotranscription，IVT），用于制备mRNA。本发明所述质粒特征在于其序列依次包含一个或多个启动子序列、5’UTR序列、蛋白编码序列、3’UTR序列（可能存在poly(A)序列）以及限制性内切酶位点，同时包含质粒复制原件和抗生素抗性基因。优选包括pGEM-3Zf(+)、pVAX1 等。

本发明还提供了编码上述三聚体重组蛋白的mRNA。

本发明还提供了上述mRNA的制备方法，对上述DNA进行体外转录，得所述mRNA。本发明所述述mRNA的核苷酸序列包括（a）中任意一条核苷酸序列和（b）中任意一条核苷酸序列；其中

（a）：编码氨基酸序列SEQ ID No.1的核苷酸序列优选为SEQ ID No.13~SEQ IDNo.15中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.2的核苷酸序列优选为SEQ ID No.16~SEQ IDNo.18中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.3的核苷酸序列优选为SEQ ID No.19~SEQ IDNo.21中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.4的核苷酸序列优选为SEQ ID No.22~SEQ IDNo.24中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.5的核苷酸序列优选为SEQ ID No.25~SEQ IDNo.27中的一种。（b）：编码氨基酸序列SEQ ID No.6的核苷酸序列优选为SEQ ID No.28~SEQID No.30中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.7的核苷酸序列优选为SEQ ID No.31~SEQID No.33中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.8的核苷酸序列优选为SEQ ID No.34~SEQID No.36中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.9的核苷酸序列优选为SEQ ID No.37~SEQID No.39中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.10的核苷酸序列优选为SEQ ID No.40~SEQID No.42中的一种。

在本发明中，上述mRNA的核苷酸序列优选还包括（c）中任一条核苷酸序列：（c）：编码氨基酸序列SEQ ID No.11的核苷酸序列优选为SEQ ID No.43~SEQ ID No.44中的一种；编码氨基酸序列SEQ ID No.12的核苷酸序列优选为SEQ ID No.45~SEQ ID No.46中的一种。

本发明所述制备方法，优选包括：1）合成所述的mRNA对应的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒；2）将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，并进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板；3）构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。

在本发明中，合成转录所述的mRNA的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒。本发明对合成所述的mRNA对应的DNA片段的方法没有特殊限定，采用本领域常规的DNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，优选的委托生物技术公司合成。在本发明中，所述DNA片段的具体序列根据碱基互补配对原则确定。

本发明提供的mRNA（图1所示结构），可合成编码新冠病毒的抗原片段，用以实现对新型冠状病毒的免疫。

本发明还提供了一种体外转录上述mRNA的表达载体模板，所述表达载体模板的基因组中包括上述DNA。本发明所述表达载体模板优选为将上述DNA克隆到质粒的5’UTR和3’UTR之间作为模板，所述质粒优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明所述SARS-CoV-2疫苗包括预防性疫苗。

本发明还提供了一种预防性SARS-CoV-2疫苗，包括上述mRNA。

本发明所述预防性SARS-CoV-2疫苗中所述活性成分mRNA的溶剂优选为生理盐水。本发明对所述生理盐水的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的生理盐水即可。本发明对所述注射制剂的制备方法没有特殊限定，满足本领域常规注射制剂的要求即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

下述各实施例中，所用DNA片段为委托合成。

实施例1 mRNA疫苗制备方法

1、构建好的表达质粒按如下反应体系进行DNA模板的扩增：

反应体积，50μl（为单个管的反应体积，一次同时反应多管）

Premix（2×）所述PCR扩增的体系（50μl）：PrimeSTAR Max 25μl、物F（SEQ IDNo.5，10μmol/L） 1.2μl、引物R （SEQ ID No.5，10μmol/L）1.2μl、DNA模板（1ng/μl） 1μl和水21.6μl。

所述PCR的扩增程序如下：预变性 98℃ 3min；变性98℃ 10s，退火 60℃ 5s，延伸72℃ 2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。

反应结束后，将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳（1.5%琼脂糖，5V/min，40min）。根据电泳目的条带的大小对反应成功与否进行确认。

合格标准：电泳检测出现单一的条带，且大小正确。

测定结果：条带大小单一，大小符合要求。

2、DNA模板超滤

利用Millipore 30Kd超滤管浓缩上述获得的DNA模板。

3、DNA模板FPLC纯化

将上述超滤得到的DNA，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚/氯仿/异戊醇=25/24/1），充分震荡后，12000g离心15min。

去掉沉淀，转移上清至新的离心管中，加入上清体积的1/10 3M NaAc（PH5.2），混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀，至于-20℃静置30min。

4℃，12000g离心10min，弃上清。

用70%乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，取上清，于超净台晾干5min。

用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。

用NanoDrop检测纯化后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1.5%琼脂糖，5V/min，40min）。

合格标准：260/280介于1.8至2.1之间，260/230在1.6至2.2之间。

测定结果：浓度为500ng/μl，260/280=1.90，260/230= 1.7

4、FPLC纯化后模板超滤

Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板，用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop检测超滤后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。

测定结果：浓度为150ng/μl，260/280=1.95，260/230= 1.85

5、mRNA的体外合成

在恒温反应器中，进行mRNA的体外合成。

按照如下合成体系进行（反应试剂按照从上至下添加）：

反应体积，1600μl（置于2ml RNase-free Tube管中，为单个管的反应体积，一次同时反应多管）：RNA-free水 440μl、7.5mM的ATP 160μl、7.5mM的UTP 160μl、7.5mM的CTP 160μl、7.5mM的GTP 160μl、7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl、150ng/μl的DNA模板 40μl、10×Buffer 160μl和Enzyme Mix 160μl。

所述RNA体外合成的程序为37℃，10h。

6、DNase I消化去除DNA模板

向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。

上下颠倒10次混匀，1000rpm离心10s。

重新置于恒温反应器中，37℃，1h。

反应结束后，将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中，检测DNA片段的残留。三次测量结果为0.013ng，0.016ng，0.017ng每100ug mRNA。

7、mRNA沉淀回收

向上一步骤中的每个50ml Tube管中，加入等体积的醋酸铵溶液。

上下颠倒10次混匀。

置于-20℃ 2h，沉淀。

17000g，4℃离心，30min。

去掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀。

17000g，4℃离心，10min。

去掉70%乙醇，于超净台中蒸干，每管加入RNase-free水20ml。

静置10min后，用枪头轻吹混匀。

用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度为5μg/μl，A260/A280为1.90、A260/A230为2.0。

取1μl，稀释10倍，进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。

检测结果为：条带符合大小，片段完整。

8、LiCl沉淀纯化mRNA

将上一步骤中回收的mRNA按照其1.5倍体积加入Rnase-free水，混匀。

加入原mRNA 1.5倍体积-20预冷的LiCl溶液，混匀。

然后于-20℃静至2h。

16000g离心20min。

弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，16000g离心15min。

取上清，于超净台晾干5min。

用适当的RNase-free水溶解纯化后的mRNA。

纯化后的mRNA浓度为2μg/μl，A260/A280为1.95、A260/A230为1.9。

9、mRNA分装

将上一步骤中纯化后的mRNA分装至西林瓶。

实施例2 全长S蛋白mRNA疫苗和二代NTD-RBD mRNA疫苗的对比试验

选取6周龄balb/c小鼠，分别接种50ug、100ug和200ug的 NTD-RBD mRNA疫苗和S蛋白全长mRNA疫苗，分别在第1天和第14天两次注射接种，第35天取小鼠血清，检测血清中抗S蛋白特异性抗体的滴度。

1、包被：将S1蛋白（北京义翘神州科技股份有限公司，40591-MM43）用coatingbuffer稀释成200ng/ml的溶液，加入到酶标板中，每孔加入的体积为100μl，每个稀释度重复3个孔，盖上封板膜，4℃过夜包被。

2、洗板：包被好的96孔板，倒出包被液，到扣吸水纸上，使劲扣板，直到孔中无残留为止。配制洗脱液，用去离子水稀释50×的Washing buffer，加入到洗板机的进液瓶中，设置程序，每孔洗板体积设为300μl，重复洗4次。

3、封闭：洗好的板，扣干里面的溶液，按每孔250μl的体积加入Blocking buffer，随后封上封板膜，室温封闭2h。

4、洗板：封闭好的酶标板按照步骤3完成洗板。

5、血清孵育：用dilution buffer将小鼠血清稀释成40×，400×，4000×，40000×，400000×，4000000×，40000000×，按照每孔100μl的体积加入洗好的96孔板中，随后封上封板膜室温下孵育1.5h。

6、洗板：按照步骤3完成洗板其中洗板次数增加为6次。

7、加入二抗：用Dilution buffer 稀释HRP标记山羊抗小鼠IgG，稀释倍数为10000×，稀释好的抗体按照每孔100ul的体积加入酶标板中，封上封板膜，室温下避光孵育1h。

8、洗板：按照步骤8完成洗板，此步骤务必洗干净板，扣干溶液。

9、显色：加入TMB buffer 100μl，避光显色20~30分钟，此时阳性样品显蓝色。

10、终止：加入Stop buffer 100μl，10分钟内在酶标板上读数，设置吸收波长450nm。

根据供试品吸光度的大小计算样品中S蛋白特异性抗体的滴度。

实验结果表1、图3所示，相同剂量的NTD-RBD mRNA疫苗比S蛋白全长mRNA疫苗产生了更高的特异性抗体滴度。

实施例3

293T细胞传代后约24小时，观察6孔板内的细胞状态，汇合度在90%左右即可进行转染。取200μl opti-MEM，加入10μg经密码子优化后编码NTD-RBD蛋白抗原片段的不同mRNA（编码序列分别为SEQ ID No.28+13+43和SEQ ID No.28+13），用枪头轻轻吹打混匀，再加入60μl PEI（浓度1mg/ml），立即置于漩涡振荡器上振荡10次，每次1s，充分混匀，静置10min。将配制好的转染体系，直接均匀滴加进入培养的细胞中，再前后左右摇匀，使得转染体系均匀分布于细胞上。转染后6h换液，吸掉旧的培养基，每孔换为2ml新鲜培养基（90%DMEM+10%FBS）。转染后30h收获。吸掉旧的培养基，用1ml PBS清洗一遍。吸掉PBS，继续用1ml PBS将细胞吹打下来，收集于1.5ml 离心管中，300g离心5min。将离心后的上清尽量吸去干净，沉淀的细胞进行裂解，提取总蛋白进行Western blot检测。

电泳转膜后进行抗体孵育，S蛋白一抗孵育：取3μL SARS-CoV-2 (2019-nCoV)Spike Antibody（北京义翘神州科技股份有限公司，P/N 40591-MM42）稀释到3ml 5%脱脂牛奶中（稀释比1:1000），置于4℃摇床过夜孵育，内参蛋白抗体为GAPDH（proteintech，P/N60004-1-Ig）；二抗孵育：S蛋白和GAPDH蛋白的抗体均是Mouse来源的，因此用相同的二抗：取1μL HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)（proteintech，P/NSA00001-1）稀释到5ml 5%脱脂牛奶中（稀释比1:5000），常温孵育1h；

实验结果如图4所示，编码序列为SEQ ID No.28+13的mRNA疫苗转染细胞后，表达产物为单体结构（monocer），而编码序列为SEQ ID No.28+13+43的mRNA疫苗因为携带三聚体信号，因此表达产物为三聚体结构（trimer）。

实施例4

将下列15种序列组合：（1）SEQ ID No. 1+6+11；（2）：SEQ SEQ ID No. 1+6+12；（3）：SEQ ID No. 1+7+11；（4）：SEQ ID No. 1+7+12；（5）：SEQ ID No. 1+8+11；（6）：SEQ IDNo. 1+8+12；（7）：SEQ ID No. 1+9+11；（8）：SEQ ID No.1+9+12；（9）：SEQ ID No. 1+10+11；（10）：SEQ ID No. 1+10+12；（11）SEQ ID No. 2+6+11；（12）：SEQ ID No. 2+7+11；（13）：SEQID No.2+8+11；（14）：SEQ ID No. 2+9+11；（15）：SEQ ID No. 2+10+11；

接种量为100ug，分别在第1天和第14天两次皮内注射接种6周龄balb/c小鼠，第35天取小鼠血清，检测血清中抗S蛋白特异性抗体的滴度。

4、洗板：封闭好的酶标板按照步骤3完成洗板。

6、洗板：按照步骤3完成洗板其中洗板次数增加为6次。

实验结果如表2、图5所示，其中Control：注射生理盐水的对照组mRNA，1-15分别对应为mRNA的序列组合，带有（15）号序列的mRNA候选疫苗产生了最高滴度的特异性抗体，具有最优的免疫原性，引起了最强的针对NTD-RBD的特异性抗体。

实施例5

将（15）号序列的mRNA分别以30μg/只的剂量在第1天和第14天两次注射接种6周龄balb/c小鼠，在第35天取小鼠血清，通过focus reduction neutralization tests (FRNT)实验检测中和抗体滴度。通过将标准剂量的新冠病毒SARS-CoV-2与56℃灭活血清的两倍连续稀释液混合在37℃下孵育1小时。然后将病毒-血清混合物（100μl）接种到培养的293TACE2过表达细胞。孵育3天后，通过与生物素偶联的S蛋白单克隆抗体，抗生蛋白链菌素-HRP和TrueBlue过氧化物酶底物（KPL）进行连续孵育，将板进行福尔马林固定，透化，封闭和染色。未加血清的阳性对照组焦点数目最高，实验组焦点计数≤50％时做为中和临界值，并且计算了几何平均值作为技术重复。

结果如表3、图6所示，其中带有（15）号序列的mRNA产生了对新冠病毒具有显著中和作用的体液免疫。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司

<120> 一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr

1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser

145 150 155 160

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165 170 175

Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr

260 265 270

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275 280 285

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305 310 315 320

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

325 330 335

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

355 360 365

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Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

420 425 430

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

450 455 460

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

465 470 475 480

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

485 490 495

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

500 505 510

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

515 520 525

Phe

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Ser Gln Cys Val Asn Phe Thr Asn Arg Thr Gln Leu Pro Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg

20 25 30

Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

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Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr

100 105 110

Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Tyr Pro Phe

115 120 125

Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser

145 150 155 160

Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn

165 170 175

Leu Ser Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

180 185 190

Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe

195 200 205

Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr

210 215 220

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225 230 235 240

Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly

245 250 255

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr

260 265 270

Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys

275 280 285

Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser

290 295 300

Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

305 310 315 320

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

325 330 335

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

355 360 365

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

370 375 380

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

385 390 395 400

Gly Gln Thr Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

420 425 430

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

450 455 460

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

465 470 475 480

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

485 490 495

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

500 505 510

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

515 520 525

Phe

<210> 3

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

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Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

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Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe

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Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn

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Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

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385 390 395 400

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405 410 415

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

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<210> 4

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe

145 150 155 160

Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

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225 230 235 240

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Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

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515 520 525

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<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

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1 5 10 15

Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg

20 25 30

Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

35 40 45

Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr

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Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe

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165 170 175

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275 280 285

Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser

290 295 300

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305 310 315 320

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

325 330 335

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

355 360 365

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

370 375 380

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

385 390 395 400

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

420 425 430

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

450 455 460

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Gln Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

465 470 475 480

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

485 490 495

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

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Phe

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<213> 人工序列(artificial sequence)

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Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Asp

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

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1 5 10 15

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20

<210> 9

<211> 23

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<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

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1 5 10 15

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20

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu

1 5 10 15

Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser

20 25

<210> 11

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg

1 5 10 15

Lys Asp Gly Glu Trp Val Phe Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Ala Asp Ile Val Leu Asn Asp Leu Pro Phe Val Asp Gly Pro Pro Ala

1 5 10 15

Glu Gly Gln Ser Arg Ile Ser Trp Ile Lys Asn Gly Glu Glu Ile Leu

20 25 30

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100 105 110

<210> 13

<211> 1587

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tcgcagtgtg ttaatctaac gactcgtaca caattaccgc cggcgtatac aaactctttc 60

actcgcggtg tgtactatcc agataaggtt ttccgaagta gtgtcttaca ttccacgcaa 120

gacttatttc ttcccttctt ttccaacgtg acttgatttc acgctatcca tgtttcgggc 180

actaacggca ctaagcgctt cgataaccct gtcttgccct tcaatgacgg agtctatttc 240

gcgtctacgg agaagtcgaa catcattcgg ggctgaatct ttgggactac actggattct 300

aaaactcaga gtctcctcat cgtcaacaat gccacaaatg tcgtaatcaa ggtatgcgaa 360

tttcagttct gcaatgaccc gtttcttggg gtttactacc ataaaaataa caaaagttga 420

atggagtcgg agtttcgtgt atactcaagt gccaataact gcacgttcga gtatgtatcg 480

caaccttttc tcatagattt ggaggggaag caagggaact tcaagaatct tcgcgagttc 540

gttttcaaga acatcgacgg ttatttcaaa atttactcaa agcatacacc tattaacctt 600

gtacgggatc taccacaggg tttcagcgcc cttgaacctt tggttgacct acctatcggt 660

atcaatatta cccgcttcca gactctcctt gcattacatc gtagttactt gacccccggg 720

gattcgtcgt cgggctgaac agcaggggca gcggcatact atgtcgggta cctccagcct 780

cgtactttcc tactaaagta caacgagaac ggtacaatta cagacgccgt agattgcgcg 840

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tatcagactt caaactttcg ggtacaaccc acggagagta tcgtacgttt tccgaatatc 960

acgaatctct gtccgtttgg cgaggtcttc aacgcgacac gatttgccag cgtctatgcc 1020

tggaatcgta agcggattag caactgtgtg gctgattaca gcgttctata taattcagcc 1080

tcgttttcga cattcaaatg ttacggggtt tcgccgacaa aactcaatga cctctgtttc 1140

accaacgtgt acgccgacag tttcgttatc cgcggcgacg aggtgcgcca aatcgctccc 1200

gggcaaaccg gaaagatcgc cgattacaat tacaaattac cagacgattt cactggatgt 1260

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tatcaggccg gatctacgcc gtgtaatggt gtggaggggt tcaactgtta tttcccgtta 1440

caaagttacg gatttcagcc tactaacggc gtcggctatc agccttatcg ggtcgtcgta 1500

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ttagtgaaga ataagtgtgt caatttt 1587

<210> 14

<211> 1587

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> DNA/RNA

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<400> 15

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ttgtcggaaa cgaaatgcac cttaaagagt tttactgttg agaaggggat ctaccagacg 900

tccaacttcc gggtgcaacc aactgagtct atcgtacggt ttccgaatat taccaatctt 960

tgcccgttcg gggaggtttt caacgccact cgattcgcga gtgtatatgc gtgaaatcgc 1020

aagcggatct ctaattgcgt cgcagattac tcggttttat acaactcggc cagtttttcg 1080

acctttaagt gttacggcgt ttcgcccact aagctgaatg atctttgctt cactaatgtg 1140

tatgcggact cattcgtcat tcgcggtgac gaggtacggc aaatcgcacc gggacaaaca 1200

ggtaagattg cagattacaa ctataagttg cccgacgatt ttactggctg cgtaatcgca 1260

tggaattcca ataatctcga tagtaaagtc gggggcaatt ataattacct ataccggctt 1320

tttcgaaaga gtaatttaaa accatttgag cgggatattt ctacggaaat ctaccaggca 1380

ggcagcactc cgtgtaatgg tgttgaaggg tttaactgtt actttccgct acaatcctat 1440

gggttccaac cgacctacgg agttggatat caaccctacc gggtcgtggt gctcagtttt 1500

gaacttttac acgctccagc aactgtctgc ggccctaaaa aaagcacaaa tctagtgaaa 1560

aataagtgcg tcaactttta a 1581

<210> 23

<211> 1581

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

agccaatgtg taaaccttac tactagaacc cagttaccgc cagcttatac aaacagtttt 60

acgagaggcg tatactaccc agataaggtt tttaggagta gtgtactaca ctctactcaa 120

gatctctttc tgccattctt ctctaacgtg acatggtttc acgcaatttc cggaacaaat 180

gggactaagc gttttgacaa cccggtccta ccgtttaatg atggcgtata cttcgcctca 240

accgagaaat ccaacatcat ccgggggtgg atatttggaa cgacattaga ttcaaagacc 300

caaagcctcc ttattgtgaa taatgcaaca aacgtagtta tcaaagtttg cgagttccag 360

ttctgcaatg atcccttcct cggcgtatac cataagaaca acaaatcctg gatggagagt 420

gagtttcgtg tctacagtag cgcaaacaac tgcacctttg agtatgtaag ccagccgttc 480

cttatggacc ttgagggaaa acaaggcaac tttaaaaatc tccgggagtt cgtttttaaa 540

aatatcgatg gatactttaa gatctactca aaacacacac ctattaactt ggttcgtgac 600

ttgccccagg gcttctcagc tttggaaccg ctcgtagacc tacccatagg gataaatatc 660

acacgatttc aaactcttct agcacttcac cggagttatc taacccctgg tgacagttct 720

tcggggtgga cagcgggagc agccgcttat tacgtgggtt acttacaacc acgaactttt 780

ctgctaaagt ataacgaaaa cggtacaata accgatgccg tcgattgcgc ccttgatcca 840

ctgtctgaga caaagtgtac gctaaaaagt tttactgttg aaaaaggtat ttatcaaacc 900

tctaattttc gtgtacagcc gacggagtca atcgtgcgtt tccccaatat aacaaatctc 960

tgcccttttg gcgaagtttt caatgccact cggttcgcgt cggtatatgc atggaataga 1020

aaaagaatat caaattgtgt agccgactac tcagtcttat ataactccgc ctcatttagc 1080

acttttaagt gttatggtgt aagccccacc aaattgaatg acttgtgttt taccaatgtg 1140

tatgccgata gcttcgtaat acgcggcgat gaagtaagac aaatcgcacc tggtcagacc 1200

ggcaagatcg ctgactataa ttacaaatta cccgatgact ttacgggatg cgttatagca 1260

tggaattcaa acaaccttga ttcgaaggtc ggcggcaatt ataactacct ctaccggctt 1320

ttcaggaaaa gcaacctgaa gccttttgag cgagatattt ctaccgagat ttatcaagcg 1380

gggagtacac cttgtaatgg tgtcgaaggc ttcaactgtt actttccatt acagtcgtat 1440

ggtttccagc ccacttacgg tgttggctac cagccgtata gggttgttgt attaagtttt 1500

gaattactcc atgcccccgc cactgtctgt ggtccgaaaa agtccactaa tctggttaag 1560

aacaagtgcg tgaactttta g 1581

<210> 24

<211> 1581

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

tcccagtgtg tcaatttgac gctaagactt caattgcccc cggcctatct taattcattc 60

acacgcggcg tctattatcc ggacaaggtg tttcgatctt cagtgttgca ttctacgcaa 120

gatttgtttt taccgttttt ctcaaacgta acttggttcc acgcgatctc tggactaaat 180

gggctgaaac gatttgataa tcctgtatta ccgttcaacg atggtgtcta cttcgcaagt 240

ctggagaaaa gtaatatcat ccgtggctga atttttgggc tgaccttaga tagcaagacc 300

caatcattgt taattgtaaa caatgctact aatgtagtga ttaaagtctg tgagtttcaa 360

ttttgcaacg acccgttttt gggcgtgtac cataagaata acaagtcgtg gatagagtcg 420

gaatttcgtg tctacagttc ggcgaataat tgtcttttcg agtatgtctc gcaacccttt 480

ttgatggatt tagagggcaa acagggaaac tttaaaaatt tgcgtgagtt cgtattcaaa 540

aatatcgatg ggtatttcaa aatttattca aagcacacac caatcaactt agttagggac 600

ttgccccaag gattttccgc attggaacct ttagtggatt taccgattgg tattaatatt 660

accagatttc agaccttgtt ggctttacat aggagctact tgcttcctgg agactcatca 720

agcgggtgga ccgcaggcgc cgctgcctat tatgttggtt atttgcaacc tcggctgttc 780

ttgttgaagt ataatgaaaa cggcctaatc ctcgacgcag tggattgtgc attagatcct 840

ttgtctgagc ttaaatgtac tttaaagagt ttcctcgttg aaaagggtat ttatcaaacg 900

tccaatttta gggttcagcc gctcgagtct atcgtacgct tccccaatat tctgaactta 960

tgtccattcg gtgaagtgtt taacgccctt cgcttcgcgt ccgtttacgc gtgaaaccgt 1020

aaacggatct ccaattgtgt cgctgactat tctgtattat ataacagcgc aagtttctcg 1080

acgttcaaat gttatggagt ctctcctctt aagttaaatg atttatgctt tctgaatgtt 1140

tacgcagact ctttcgtaat tcgtggtgac gaggtccgac agattgcccc cggccaaacg 1200

ggtaagatcg cagattacaa ctacaaattg cccgatgatt tcactgggtg tgtaattgcg 1260

tgaaattcaa acaatttaga ctctaaagtt ggggggaatt ataattattt atatcgcttg 1320

ttccgaaaaa gtaatttaaa gccatttgag agggacatct caaccgaaat ttaccaggca 1380

ggtagcacgc cgtgcaacgg cgtagaaggt tttaattgct atttcccttt gcagtcgtac 1440

gggttccaac cgctctacgg cgtcggctac cagccttatc gagtcgttgt attgtctttc 1500

gaattattac acgccccagc gactgtatgc ggacctaaaa agtcactgaa cttggtcaaa 1560

aacaagtgtg tcaactttta a 1581

<210> 25

<211> 1590

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

agccagtgcg tgaacctgac caccagaacc cagctgcccc ccgcctacac caacagcttc 60

accagaggcg tgtactaccc cgacaaggtg ttcagaagca gcgtgctgca cagcacccag 120

gacctgttcc tgcccttctt cagcaacgtg acctggttcc acgccatcca cgtgagcggc 180

accaacggca ccaagagatt cgacaacccc gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc 240

gccagcaccg agaagagcaa catcatcaga ggctggatct tcggcaccac cctggacagc 300

aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac gccaccaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag 360

ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc gtgtactacc acaagaacaa caagagctgg 420

atggagagcg agttcagagt gtacagcagc gccaacaact gcaccttcga gtacgtgagc 480

cagcccttcc tgatggacct ggagggcaag cagggcaact tcaagaacct gagagagttc 540

gtgttcaaga acatcgacgg ctacttcaag atctacagca agcacacccc catcaacctg 600

gtgagagacc tgccccaggg cttcagcgcc ctggagcccc tggtggacct gcccatcggc 660

atcaacatca ccagattcca gaccctgctg gccctgcaca gaagctacct gacccccggc 720

gacagcagca gcggctggac cgccggcgcc gccgcctact acgtgggcta cctgcagccc 780

agaaccttcc tgctgaagta caacgagaac ggcaccatca ccgacgccgt ggactgcgcc 840

ctggaccccc tgagcgagac caagtgcacc ctgaagagct tcaccgtgga gaagggcatc 900

taccagacca gcaacttcag agtgcagccc accgagagca tcgtgagatt ccccaacatc 960

accaacctgt gccccttcgg cgaggtgttc aacgccacca gattcgccag cgtgtacgcc 1020

tggaacagaa agagaatcag caactgcgtg gccgactaca gcgtgctgta caacagcgcc 1080

agcttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg agccccacca agctgaacga cctgtgcttc 1140

accaacgtgt acgccgacag cttcgtgatc agaggcgacg aggtgagaca gatcgccccc 1200

ggccagaccg gcaagatcgc cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt caccggctgc 1260

gtgatcgcct ggaacagcaa caacctggac agcaaggtgg gcggcaacta caactacaga 1320

tacagactgt tcagaaagag caacctgaag cccttcgaga gagacatcag caccgagatc 1380

taccaggccg gcagcacccc ctgcaacggc gtgcagggct tcaactgcta cttccccctg 1440

cagagctacg gcttccagcc caccaacggc gtgggctacc agccctacag agtggtggtg 1500

ctgagcttcg agctgctgca cgcccccgcc accgtgtgcg gccccaagaa gagcaccaac 1560

ctggtgaaga acaagtgcgt gaacttctga 1590

<210> 26

<211> 1590

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

tctcaatgtg tcaacctcac cactcgcact cagctaccgc cagcctatac aaattctttc 60

acaagaggag tttattaccc agacaaggta tttcggagtt ccgttcttca tagtacccag 120

gacttgtttc tccccttttt tagcaatgtg acatggttcc atgcgatcca tgtgagtggt 180

actaacggca caaagagatt cgacaatccg gttttgccct tcaatgatgg agtatatttt 240

gcttccactg aaaagtccaa cataattcgc ggctggatct tcgggacaac acttgatagt 300

aagacccaat ccctgctcat tgttaacaac gcaaccaatg tagtaattaa agtgtgcgaa 360

tttcaatttt gcaatgaccc tttcctaggg gtatattatc acaagaacaa taagagctgg 420

atggagagtg agttccgagt ttacagttct gcgaacaatt gtacgtttga atacgtatcc 480

cagcctttct taatggatct agagggtaag cagggtaact ttaaaaatct ccgagagttt 540

gtgtttaaga atatcgacgg gtattttaaa atatatagca agcatacgcc aatcaatctt 600

gttcgtgact taccgcaagg tttctctgca ctggagccgc tagtcgatct acccatcggc 660

atcaacataa cccgatttca gacgcttctc gccttacaca ggtcttacct aacgccgggc 720

gactcctcct cggggtggac tgccggcgcg gcggcgtact acgtcggcta cctccagcct 780

cggaccttcc tgttgaagta caacgaaaac ggcacgatca ccgacgcagt ggactgcgcg 840

ctggacccgc tatccgagac aaaatgtacc cttaaatcct tcacagtcga aaaggggata 900

taccaaactt caaactttag ggtgcaacca actgagagca tcgtcagatt ccctaatatc 960

acgaacttat gccccttcgg cgaagtcttt aatgcaaccc gtttcgcgtc agtttatgct 1020

tggaatagaa aacgcataag caattgcgtc gcggattact ccgtcctcta taattccgct 1080

tcattttcga catttaaatg ttacggggtt tcacctacga agcttaacga tttgtgtttc 1140

actaacgtgt atgctgattc gtttgtgatc cggggtgacg aggtgaggca aatcgctccg 1200

ggccaaacag gaaagatcgc tgactataat tacaaactcc cggatgattt tacgggctgc 1260

gtaattgcgt ggaacagtaa taacttggac tcaaaggttg gaggtaatta taactatcga 1320

tatcgactct tccgcaagtc taatctcaaa ccgtttgaaa gagacatcag cacagagata 1380

tatcaagcag gatctacgcc gtgtaacggg gtacagggct ttaattgtta cttcccctta 1440

cagtcatacg gctttcaacc gacaaatggc gtcggctatc aaccatatcg agtggtagta 1500

ttaagtttcg aactccttca tgcgccagcc accgtttgtg ggccgaagaa gagcactaat 1560

ctggtaaaga acaagtgcgt taacttctaa 1590

<210> 27

<211> 1590

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

agccaatgcg ttaacttaac actgagaacc cagttaccac ccgcgtatac caacagtttt 60

cttcggggtg tctactatcc agataaggtg ttcagatcct cggtgttgca ctccactcag 120

gatttgtttt tgccattttt tagcaacgta ctctggtttc acgccattca tgtgtcgggt 180

ctcaacgggc tgaagcgatt tgataatcct gttttgccgt ttaacgacgg agtctacttc 240

gcgtccctgg agaaatcaaa catcatccgg gggtggatct ttggtaccct attagacagt 300

aaaacacaat cgttgttaat tgtaaataat gccacgaacg tagtcatcaa ggtgtgcgaa 360

tttcaatttt gcaacgatcc tttcttgggc gtttactatc acaaaaataa caaatcgtgg 420

atggagtcgg aattccgggt gtactcttcg gctaataatt gcacctttga gtatgtttcc 480

cagcccttct taatagattt ggagggtaaa caaggtaatt ttaagaactt aagagaattt 540

gtcttcaaaa acatcgacgg atactttaag atttactcta agcatcttcc aatcaatttg 600

gtgcgagatt tgccgcaagg cttttcagct ttggaacctt tagtggattt gccgatcggg 660

attaacatcc tccgattcca gacattatta gccttgcata gatcatactt gaccccaggt 720

gattcgagca gtggctggac ggccggagct gcagcatatt atgtcggcta tttgcaacct 780

cgcctttttt tgttgaaata taacgagaat gggcttatca cggatgccgt ggattgtgca 840

ttggacccct tatccgaaac caaatgcacc ttgaaaagct tcctcgtaga aaagggaatt 900

tatcagctaa gtaactttcg cgtgcagccg ctggagtcaa ttgtacgttt cccgaacatc 960

ctcaatttat gcccttttgg cgaggttttc aatgctctaa ggtttgctag cgtctacgct 1020

tggaacagaa aacgcattag caattgcgtt gcggactata gcgtattata taattccgct 1080

tcgtttagcc tctttaagtg ctacggtgtc tctcctctga agttaaatga tttgtgcttt 1140

actaatgtgt acgcggatag ttttgtgatt cgaggagatg aagttcgcca gattgcgcca 1200

ggccaacttg ggaagatcgc ggactacaat tataaattac cagacgactt tacaggttgc 1260

gtcattgcct ggaactcgaa taatttagac agcaaggttg gtggaaatta caattatcga 1320

tacagattgt tcagaaagtc taacttaaag ccattcgaga gagatatcag tacggaaatt 1380

tatcaagccg gcagtacgcc ctgtaacggg gtgcaggggt ttaattgtta tttccccttg 1440

cagtcatacg gctttcagcc ccttaacggc gtaggatatc aaccataccg agttgtcgta 1500

ttaagttttg agttgttaca cgcccccgct accgtatgtg ggcccaagaa gtcccttaac 1560

ttagtcaaga acaagtgtgt aaacttctaa 1590

<210> 28

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

atgtttgtgt ttctggtgct attaccgctt gtgtcc 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

atgttcgtgt tcctggtcct tctacccctc gtatcc 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

atatttgtct tcttagtgtt attgccttta gtaagc 36

<210> 31

<211> 57

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

atagactgga catggattct ctttcttgta gcagctgcaa cacgggtgca ttcggat 57

<210> 32

<211> 57

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

atggactgga cttggatttt attccttgtt gccgcagcta cgagggtcca ttcagac 57

<210> 33

<211> 57

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

atagactgga cgtggatctt atttttggtg gccgcggcac ttcgtgtaca ttcagat 57

<210> 34

<211> 63

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

atggaaacgg acacgctttt attatgggtc cttttgttat gggtacctgg gtcaacaggc 60

gac 63

<210> 35

<211> 63

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

atggagactg atactttatt attgtgggtc ctccttcttt gggtgcccgg tagcactggg 60

gac 63

<210> 36

<211> 63

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

atggaactgg atctgttgtt gttatgggtg ttgttgttgt gggtaccagg gtcgcttggc 60

gat 63

<210> 37

<211> 69

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

atagatgcca tgaaacgcgg cttgtgttgc gtattattgt tatgcggagc agtgttcgtg 60

tcggcccgg 69

<210> 38

<211> 69

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

atggacgcaa tgaaaagagg tttatgctgt gttcttttgc tgtgcggagc ggtcttcgta 60

tcagccagg 69

<210> 39

<211> 69

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

atggatgcca tgaagcgagg gttatgctgc gttttattgt tgtgtggagc cgtatttgtc 60

agcgctcgg 69

<210> 40

<211> 78

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

atagacttac ttcataagaa cataaagcac ttgtggttct ttctgttgct agtggcagcc 60

ccacgctgag ttttatct 78

<210> 41

<211> 78

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

atggatttgc tacacaagaa tatgaaacat ctctggtttt tccttctgtt ggtagcggcc 60

ccacgttggg tcttgtct 78

<210> 42

<211> 78

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

atggatttat tgcataagaa cataaaacac ttgtgatttt tcttgttatt agtcgccgct 60

ccacgctggg tgttgtct 78

<210> 43

<211> 84

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

gcaggctata ttccggaagc cccgcgtgac ggacaggctt acgtgcggaa agatggggaa 60

tgagtctttc ttagtacctt tcta 84

<210> 44

<211> 84

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

gctggttaca ttcccgaagc tccgagagat ggtcaagcct atgttagaaa agatggagag 60

tgggtgttct tgagcacatt ctta 84

<210> 45

<211> 336

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

gcagatatcg tactcaacga tttgcctttc gtcgacggac ctccggcgga ggggcagagt 60

cggatctcgt ggatcaagaa tggagaggag attcttgggg cagatacgca gtacgggtct 120

gaaggctcta tgaatcgtcc cactgtatca gtcttacgaa acgtggaggt cctcgacaag 180

aatatcggta tcttgaagac ttcgctcgag actgcgaact cggacatcaa gacgattcag 240

gaggcaggct atatccctga ggcgccccgt gacggtcaag cttatgtgcg gaaggacgga 300

gaatgggttt tgcttagtac gttcctgagc ccagct 336

<210> 46

<211> 336

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

gctgacatag ttttgaacga tctaccattt gtcgacgggc cgccagcgga gggccaaagc 60

cgaatatcct ggataaagaa cggtgaagag atactcggtg cagatacgca atacggtagt 120

gaaggctcca tgaacaggcc gactgtctcc gtgctaagga acgtggaggt attagacaag 180

aatattggaa tacttaaaac gtcactagag acagctaaca gcgacatcaa aaccatacaa 240

gaggctggat atattcctga agcaccgcga gatggccaag cttatgtacg gaaagacggg 300

gaatgggtat tactttctac ttttctgtcg ccagca 336

Claims

1.一种新冠病毒三聚体重组蛋白，所述三聚体重组蛋白的氨基酸序列包括（a）中任一条抗原氨基酸序列和（b）中任一条信号肽氨基酸序列的组合：

（a）SEQ ID No.1~SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；

（b）SEQ ID No.6~SEQ ID No.10所示氨基酸序列；

所述三聚体重组蛋白的氨基酸序列还包括（c）中任一条功能肽氨基酸序列：

（c）SEQ ID No.11~SEQ ID No.12所示氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述三聚体重组蛋白的DNA。

3.编码权利要求1所述三聚体重组蛋白的mRNA。

4.权利要求3所述mRNA的制备方法，其特征在于，对权利要求2所述DNA进行体外转录，得所述mRNA。

5.一种体外转录权利要求3所述mRNA的表达载体模板，其特征在于，所述表达载体模板的基因组中包括权利要求2所述DNA。

6.权利要求1所述三聚体重组蛋白或权利要求3所述mRNA在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述SARS-CoV-2疫苗包括预防性mRNA疫苗。

8.一种预防性SARS-CoV-2疫苗，其特征在于，包括权利要求3所述mRNA。

9.根据权利要求8所述预防性SARS-CoV-2疫苗，其特征在于，还包括生理盐水。