具体实施方式
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的,术语“COVID-19”的含义为新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDisease 2019),简称“新冠肺炎”,是指2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的肺炎。
如本公开所使用的,术语“SARS-CoV-2”,也被称为“2019-nCoV”,其含义为2019新型冠状病毒。SARS-CoV-2与2003年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acuterespiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)同为β属冠状病毒B亚群冠状病毒。本公开中的“SARS-CoV-2”涉及SARS-CoV-2或其突变体。在一些实施方式中,SARS-CoV-2突变体与Genome Reference Sequence为NC_045512的核苷酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
如本公开所使用的,术语“RBD”,是指是指冠状病毒S蛋白受体结合域(receptorbinding domain,RBD)。RBD在病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合、进入宿主细胞过程中发挥重要作用。RBD对于新型冠状病毒具有良好的准确性和特异性,能够用于SARS-CoV-2的检测;与此同时,RBD在SARS-CoV-2入侵细胞的过程中发挥作用,识别并特异性结合RBD能够用于SARS-CoV-2所导致的疾病的治疗。
如本公开所使用的,术语“SARS-CoV-2的受体结合域”是指在SARS-CoV-2的表达的S蛋白中,介导与宿主细胞膜上受体结合的受体结合域。在一些实施方式中,本公开的SARS-CoV-2的受体结合域为RBD结构域。在一些实施方式中,本公开的SARS-CoV-2的受体结合域为RBD结构域保持其蛋白活性的突变体、同系物、片段。
如本公开所使用的,术语“Foldon结构域”是T4噬菌体fibritin蛋白质的结构域,位于蛋白的C末端,能够辅助fibritin蛋白质正确组装与折叠形成三聚体,并通过氢键、疏水相互作用和盐桥的方式来稳定天然三聚体构象。
如本公开所使用的,术语“ACE2”又称血管紧张素转化酶2,是在呼吸道上皮细胞表面表达的一种膜受体,被证明是SARS-CoV和SARS-CoV-2的功能性受体,在冠状病毒RBD结构域介导的病毒外模与细胞进行膜融合的过程中发挥关键作用。ACE2蛋白为含有信号肽的跨膜蛋白,该蛋白90%以上的结构位于细胞膜外。
如本公开所使用的,术语“受体蛋白的结构域”是指ACE2蛋白中与RBD结构域结合的结构域。在一些实施方式中,本公开的受体蛋白的结构域为ACE2的胞外结构域。在一些实施方式中,本公开的受体蛋白的结构域为ACE2的胞外结构域保持其蛋白活性的突变体、同系物、片段。
如本公开所使用的,术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。在一些实施方式中,本公开的Fc结构域为RFc结构域,或保持其蛋白活性的突变体、同系物、片段。在一些实施方式中,本公开的Fc结构域为FFc结构域,或保持其蛋白活性的突变体、同系物、片段。
如本公开所使用的,术语“三聚体蛋白”是指空间结构呈现三聚体构象的蛋白质。
如本公开所使用的,术语“二聚体蛋白”是指空间结构呈现二聚体构象的蛋白质。
如本公开所使用的,术语“重组蛋白”是利用重组DNA或重组RNA技术从而获得的蛋白质,其可以在体内或体外获得。
如本公开所使用的,术语“多肽”是指任何包含有经肽键连接的三个或更多个氨基酸残基的分子。根据本申请的多肽包含肽(例如,三肽、寡肽等),以及可能包含化学修饰(例如糖化(糖聚肽)、磷酸化、羟化、磺化、棕榈酰化和二硫键形成)的肽。多肽也可以指蛋白。
如本公开所使用的,术语“信号肽”是指连接于目标蛋白上,可促进目标蛋白表达或转移的多肽。示例性的,信号肽可连接于目标蛋白的N端,且通常可以被切割而除去,因此不存在于细胞分泌的成熟蛋白中。
如本公开所使用的,术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”,包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中,术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一些实施方案中,本公开的“突变”可以选自“保守突变”、“半保守突变”“非保守突变”。在本公开中,术语“非保守突变”或“半保守突变”可以是引起蛋白功能丧失或部分丧失的突变。术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的,“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换,具体而言,可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外,保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定:将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分,且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言,可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的,在本公开中,当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时,两个或多个序列或子序列具有至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸或氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如,长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域,至少约200个残基的区域,至少约400个残基的区域,或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中,所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的,术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式,也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分,其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的,能够通过标准分子生物学方法(例如,使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时,这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C),其中“U”取代“T”。换句话说,“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物,或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分,如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”、“重组核酸分子”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的,术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中,且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。
如本公开所使用的,术语“载体”指的是DNA构建体,其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列,从而在合适的宿主中表达目的基因。
如本公开所使用的,术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括,例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合,例如启动子和增强子;ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列;以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要,并可以使用任何载体,包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的基因编辑元件、核酸构建体或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入基因编辑元件、核酸构建体或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞,重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,只要是能够导入本公开的重组核酸分子或重组表达载体的细胞即可。
本公开中的术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思,即将40外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法,这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
如本公开所使用的,术语“待测样品”涉及需要确定其中是否含有新冠病毒中和抗体的任意种类的样品。示例性的,待测样品可以是受试者产生的任何产物、或源自于受试者产生产物的任何产物。样品可以取自任何组织或体液,例如血液样品(包括得自血液的样品)、血清样品、淋巴样品、唾液样品、关节滑液。得自血液的样品可以是患者血液或疫苗接种者血液的所选部分,例如所选的含有细胞的部分、或血浆或血清部分。在一些实施方式中,样品可以是含有体液免疫反应的抗体产物的任何样品。
如本公开所使用的,术语“受试者”可以被怀疑感染有SARS-CoV-2,或者可以被怀疑患有由SARS-CoV-2感染引起的疾病,或是接种有针对SARS-CoV-2的疫苗。在一些实施方式中,受试者是哺乳动物(例如,兽亚纲、真哺乳亚纲、真兽亚纲、原兽亚纲、统兽总目、灵长目(猴、非人灵长类、或人))。在一些实施方式中,受试者是人、蝙蝠、穿山甲、麝猫、或猪。受试者可以是非人哺乳动物,但是更优选为人。受试者可以是雄性/男性或雌性/女性。受试者可以是患者或者疫苗接种者。
本文公开的方法可以在体外、离体、或体内进行,或者产品可以以体外、离体、或体内形式存在。术语“体外”是指在实验室条件或培养液中使用材料、生物物质、细胞和/或组织的实验;而术语“体内”是指使用完整多细胞有机体的实验和工序。在一些实施方式中,体内进行的方法可以在非人动物上进行。“离体”是指存在于有机体外或发生在有机体外,例如在人或动物体外的事件,例如可以在取自有机体的组织(例如整个器官)或细胞上存在或发生的事件。
技术方案
在本公开的技术方案中,说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示:
SEQ ID NO:1所示的序列是RBD结构域的氨基酸序列,
SEQ ID NO:2所示的序列是编码RBD结构域的核苷酸序列,
SEQ ID NO:3所示的序列是Foldon结构域的氨基酸序列,
SEQ ID NO:4所示的序列是编码Foldon结构域的核苷酸序列,
SEQ ID NO:5所示的序列是野生型Thrombin连接子的氨基酸序列,
SEQ ID NO:6所示的序列是编码野生型Thrombin连接子的核苷酸序列,
SEQ ID NO:7所示的序列是突变型Thrombin连接子氨基酸序列,
SEQ ID NO:8所示的序列是编码突变型Thrombin连接子的核苷酸序列,
SEQ ID NO:9所示的序列是SecreconAAA信号肽氨基酸序列,
SEQ ID NO:10所示的序列是编码SecreconAAA信号肽的核苷酸序列,
SEQ ID NO:11所示的序列是ACE2的氨基酸序列,
SEQ ID NO:12所示的序列是编码ACE2的核苷酸序列,
SEQ ID NO:13所示的序列是FFc结构域氨基酸序列,
SEQ ID NO:14所示的序列是编码FFc结构域的核苷酸序列,
SEQ ID NO:15所示的序列是RFc结构域氨基酸序列,
SEQ ID NO:16所示的序列是编码RFc结构域的核苷酸序列,
SEQ ID NO:17所示的序列是第二连接子(柔性)氨基酸序列,
SEQ ID NO:18所示的序列是编码第二连接子(柔性)的核苷酸序列,
SEQ ID NO:19所示的序列是第二连接子(刚性)氨基酸序列,
SEQ ID NO:20所示的序列是编码第二连接子(刚性)的核苷酸序列。
重组的受体结合蛋白
在一些实施方式中,本公开提供的重组的受体结合蛋白为三聚体蛋白,如图12所示,其包含SARS-CoV-2的受体结合域,和与所述SARS-CoV-2的受体结合域融合的Foldon结构域。本公开的重组的受体结合蛋白具有优化的三聚体空间构象,其与ACE2受体结合的亲和力提高,能够与ACE2受体组合用于新型冠状病毒感染或疫苗接种产生的中和抗体检测,具有更高的诊断灵敏度和特异性。或者作为新型冠状病毒的预防性疫苗,利用其高的免疫原性激发基体产生免疫应答反应。
在一些优选的实施方式中,Foldon结构域融合于SARS-CoV-2的受体结合域的C端,以利于三聚体空间结构的形成。
在一些实施方式中,SARS-CoV-2的受体结合域为包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽活性的多肽。
SARS-CoV-2的受体结合域由与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,Foldon结构域为包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:3所示序列的多肽活性的多肽。SARS-CoV-2的受体结合域连接Foldon结构域后可自发形成三聚体蛋白的空间构象,并且,本公开发现具有上述空间结构的RBD三聚体蛋白表现出更高的免疫原性,对ACE2受体的亲和力增强。
Foldon结构域由与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,本公开的重组的受体结合蛋白还包含位于Foldon结构域与SARS-CoV-2的受体结合域之间的第一连接子。示例性的,第一连接子为凝血酶(Thrombin)连接子。以Thrombin连接子增加SARS-CoV-2的受体结合域与Foldon结构域之间连接的空间位点,使两者能够在空间结构上进行折叠,得到RBD三聚体蛋白结构。
在本公开中,凝血酶(Thrombin)连接子包括野生型Thrombin连接子和突变型Thrombin连接子。在一些优选的实施方式中,第一连接子为丧失活性的突变型Thrombin连接子。丧失活性的突变型Thrombin连接子能够避免被检测环境中存在凝血酶对于Thrombin连接子的凝血酶位点进行切割,避免重组的受体结合蛋白丧失其三维空间构型。
进一步的,第一连接子包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的多肽的突变体,所述突变体在SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的一个或多个位置处包含取代、重复、缺失或添加的氨基酸。作为优选,突变体为丧失活性的凝血酶连接子的突变体,其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
第一连接子由与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码。作为优选,第一连接子由SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中,重组的受体结合蛋白还包括信号肽,信号肽融合于SARS-CoV-2的受体结合域的N端。示例性的,信号肽为SecreconAAA,SecreconAAA可以促进重组蛋白的表达、转移,并在重组的受体结合蛋白由细胞内分泌出后被切除,因此不呈现于成熟的重组的受体结合蛋白中。
在一些实施方式中,信号肽包含如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽,或如SEQID NO:9所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:9所示序列的多肽活性的多肽。
信号肽由与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,重组的受体结合蛋白还偶联有标记分子。标记分子产生可用于免疫检测的信号。例如,标记分子为荧光标记、冷光标记、化学标记、核酸标记或多肽标记等。在一些更为具体的实施方式中,标记分子是具有酶活性的标记分子,具有酶活性的标记分子可作用于特定的底物,产生可被检测到的光学信号。示例性的,标记分子为辣根过氧化物酶(HRP),其作用底物为TMB。
在一些实施方式中,重组的受体结合蛋白还包括标签多肽,标签多肽可在分离、纯化重组的受体结合蛋白的过程中发挥作用。进一步的,标签多肽中可以包含TEV酶切位点,在得到纯化的重组的受体结合蛋白后,通过TEV酶切位点将标签多肽切除,使其不存在于成熟的重组的受体结合蛋白中。示例性的,标签多肽可以是连接于Foldon结构域的C端的His标签多肽。
在本公开中,重组的受体结合蛋白可以具有如下所示结构的任一种:
(1)N-信号肽-SARS-CoV-2的受体结合域-Foldon结构域-标签多肽-C,
(2)N-SARS-CoV-2的受体结合域-Foldon结构域-标签多肽-C,
(3)N-信号肽-SARS-CoV-2的受体结合域-Foldon结构域-C,
(4)N-SARS-CoV-2的受体结合域-Foldon结构域-C。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组核酸分子,包含编码上述任一种的重组的受体结合蛋白的核苷酸序列,重组的核酸分子可以是DNA、RNA或其组合。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组表达载体,其包含上述的重组核酸分子,可用于将重组核酸分子向细胞内的转移。在一些实施方式中,重组表达载体包含一个或多个调控元件,调控元件可以是本领域中普遍使用的启动子、增强子、沉默子、绝缘子等元件。调控元件与重组核酸分子可操作的连接,以介导重组核酸分子的转录和翻译。
术语“可操作地连接”可以包括所选核酸分子序列与调控元件序列(例如启动子和/或增强子)共价连接以将核酸序列的表达置于调控元件的影响或控制下(从而形成表达盒)的情况。因此,如果调控元件能够作用于核酸分子的转录,则调控元件可操作地连接所述核酸分子。所得的转录子可以翻译成所需的多肽、蛋白。
在本公开中,适于构建重组表达载体的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒(例如,得自鼠白血病病毒(MLV)的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘苗病毒载体和孢疹病毒载体)、转座子类载体,和人工染色体(例如,酵母人工染色体)等。
在一些实施方式中,载体为真核载体,其包含在真核细胞中表达的各类元件。例如,载体为pcDNA3.1(+),pcDNA3.1(-),pcDNA3.4等。作为优选,载体为pcDNA3.1(+)。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组宿主细胞,其包含上述的重组核酸分子或重组表达载体。重组宿主细胞通过向宿主细胞中转化、转染、转导重组核酸分子或重组表达载体重组核酸分子或重组表达载体得到。本公开中的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞,只要是能够导入本公开的重组核酸分子或重组表达载体,实现重组的受体结合蛋白表达即可。
在一些实施方式中,宿主细胞为真核细胞,例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是灵长类(猴、非人灵长类或人)或非人哺乳动物(例如,兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括任何啮齿目的动物)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛(包括奶牛,例如乳牛和任何牛属的动物)、马(包括任何马科动物)、驴和非人灵长类)。在一些实施方式中,宿主细胞为293细胞,293T细胞或293F细胞。作为优选,宿主细胞为293F细胞。
在一些实施方式中,重组的受体结合蛋白可以通过在重组宿主细胞中表达而制备,重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中,重组宿主细胞为原核细胞,例如,重组宿主细胞由重组表达载体导入大肠杆菌中得到。在一些实施方式中,重组宿主细胞为真核细胞,例如,重组宿主细胞由重组表达载体导入293F细胞中得到。
重组宿主细胞在适于表达蛋白的条件下培养,培养结束后,从细胞培养液或发酵液中收集重组的受体结合蛋白,然后对重组的受体结合蛋白进行蛋白纯化处理。
在一些实施方式中,对重组的受体结合蛋白进行蛋白纯化处理的步骤包括Ni-NTA亲和层析和蛋白质透析。
重组的受体蛋白
在一些实施方式中,本公开提供的重组的受体蛋白为二聚体蛋白,如图12所示,其包含与重组的受体结合蛋白相结合的受体蛋白的结构域,和与受体蛋白的结构域融合的Fc结构域。本公开的重组的受体蛋白具有二聚体空间构象,能够模拟ACE2受体天然的空间构象,其与RBD结合的亲和力提高,能够与RBD组合用于新型冠状病毒感染或疫苗接种产生的中和抗体检测,具有更高的诊断灵敏度和特异性。且检测稳定性提高,能够实现对新型冠状病毒中和抗体的跟踪检测。
在一些优选的实施方式中,Fc结构域融合受体蛋白的结构域的C端,两者协同作用,形成二聚体的空间构象。进一步的,Fc结构域选自FFc结构域或RFc结构域。本公开发现,RFc结构域与受体蛋白的结构域融合后,得到的二聚体蛋白具有更高的亲和力,与RBD组合后对新冠病毒中和抗体的检测灵敏度、稳定性进一步提升。
在一些实施方式中,受体蛋白的结构域包含RBD结合的ACE2受体的结构域,或具有结合活性的片段、同系物、突变体。作为优选,受体蛋白的结构域是ACE2受体的胞外结构域。ACE2受体作为一种跨膜蛋白,其胞外结构域在结合RBD结构域,介导病毒外膜与细胞膜融合的过程中发挥重要作用。
受体蛋白的胞外结构域为包含如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽,或如SEQID NO:11所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:11所示序列的多肽活性的多肽。
受体蛋白的胞外结构域由与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,FFc结构域为包含如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:13所示序列的多肽活性的多肽。
FFc结构域由与SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,RFc结构域为包含如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:15所示序列的多肽活性的多肽。
RFc结构域由与SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,本公开的重组的受体蛋白还包含位于Fc结构域与受体蛋白的结构域之间的第二连接子。以第二连接子连接受体蛋白的结构域与Fc结构域,可增加两者之间连接的空间位点,使Fc结构域与受体蛋白的结构域经折叠后可形成二聚体的空间构象。
在本公开中,第二连接子包括连接于受体蛋白的结构域与FFc结构域之间的柔性连接子,或连接于受体蛋白的结构域与RFc结构域之间的刚性连接子。
柔性连接子包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的多肽的突变体,所述突变体在SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的一个或多个位置处包含取代、重复、缺失或添加的氨基酸。柔性连接子由与SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码。
刚性连接子包含如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽,或如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽的突变体,所述突变体在SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的一个或多个位置处包含取代、重复、缺失或添加的氨基酸。刚性连接子由与SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中,重组的受体蛋白还包括信号肽,信号肽融合于受体蛋白的结构域的N端。示例性的,信号肽为SecreconAAA,SecreconAAA可以促进重组蛋白的表达、转移,并在重组的受体蛋白由细胞内分泌出后被切除,因此不呈现于成熟的重组的受体蛋白中。
在一些实施方式中,信号肽包含如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽,或如SEQID NO:9所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸,且具有或部分具有SEQ ID NO:9所示序列的多肽活性的多肽。
信号肽由与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列编码,且所编码的多肽具有或部分具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽活性。
在一些实施方式中,重组的受体蛋白还包括标签多肽,标签多肽可在分离、纯化重组的受体蛋白的过程中发挥作用。进一步的,标签多肽中可以包含TEV酶切位点,在得到纯化的重组的受体蛋白后,通过TEV酶切位点将标签多肽切除,使其不存在于成熟的重组的受体蛋白中。示例性的,标签多肽可以是连接于Fc结构域的C端的His标签多肽。
在本公开中,重组的受体蛋白可以具有如下所示结构的任一种:
(1)N-信号肽-受体蛋白的结合域-柔性连接子-FFc结构域-标签多肽-C,
(2)N-受体蛋白的结合域-柔性连接子-FFc结构域-标签多肽-C,
(3)N-信号肽-受体蛋白的结合域-柔性连接子-FFc结构域-C,
(4)N-受体蛋白的结合域-柔性连接子-FFc结构域-C,
(5)N-信号肽-受体蛋白的结合域-刚性连接子-RFc结构域-标签多肽-C,
(6)N-受体蛋白的结合域-刚性连接子-RFc结构域-标签多肽-C,
(7)N-信号肽-受体蛋白的结合域-刚性连接子-RFc结构域-C,
(8)N-受体蛋白的结合域-刚性连接子-RFc结构域-C。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组核酸分子,包含编码上述任一种的重组的受体蛋白的核苷酸序列,重组的核酸分子可以是DNA、RNA或其组合。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组表达载体,其包含上述的重组核酸分子,可用于将重组核酸分子向细胞内的转移。在一些实施方式中,重组表达载体包含一个或多个调控元件,调控元件可以是本领域中普遍使用的启动子、增强子、沉默子、绝缘子等元件。调控元件与重组核酸分子可操作的连接,以介导重组核酸分子的转录和翻译。
术语“可操作地连接”可以包括所选核酸分子序列与调控元件序列(例如启动子和/或增强子)共价连接以将核酸序列的表达置于调控元件的影响或控制下(从而形成表达盒)的情况。因此,如果调控元件能够作用于核酸分子的转录,则调控元件可操作地连接所述核酸分子。所得的转录子可以翻译成所需的多肽、蛋白。
在本公开中,适于构建重组表达载体的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒(例如,得自鼠白血病病毒(MLV)的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘苗病毒载体和孢疹病毒载体)、转座子类载体,和人工染色体(例如,酵母人工染色体)等。
在一些实施方式中,载体为真核载体,其包含在真核细胞中表达的各类元件。例如,载体为pcDNA3.1(+),pcDNA3.1(-),pcDNA3.4等。作为优选,载体为pcDNA3.1(+)。
在一些实施方式中,本公开提供了一种重组宿主细胞,其包含上述的重组核酸分子或重组表达载体。重组宿主细胞通过向宿主细胞中转化、转染、转导重组核酸分子或重组表达载体重组核酸分子或重组表达载体得到。本公开中的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞,只要是能够导入本公开的重组核酸分子或重组表达载体,实现重组的受体蛋白表达即可。
在一些实施方式中,宿主细胞为真核细胞,例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是灵长类(猴、非人灵长类或人)或非人哺乳动物(例如,兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括任何啮齿目的动物)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛(包括奶牛,例如乳牛和任何牛属的动物)、马(包括任何马科动物)、驴和非人灵长类)。在一些实施方式中,宿主细胞为293细胞,293T细胞或293F细胞。作为优选,宿主细胞为293F细胞。
在一些实施方式中,重组的受体蛋白可以通过在重组宿主细胞中表达而制备,重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中,重组宿主细胞为原核细胞,例如,重组宿主细胞由重组表达载体导入大肠杆菌中得到。在一些实施方式中,重组宿主细胞为真核细胞,例如,重组宿主细胞由重组表达载体导入293F细胞中得到。
重组宿主细胞在适于表达蛋白的条件下培养,培养结束后,从细胞培养液或发酵液中收集重组的受体蛋白,然后对重组的受体蛋白进行蛋白纯化处理。
在一些实施方式中,对重组的受体蛋白进行蛋白纯化处理的步骤包括Protein-A亲和层析和蛋白质透析。
试剂组合组
在一些实施方式中,本公开提供了一种试剂组合物,包括重组的受体结合蛋白和重组的受体蛋白。本公开发现,以RBD三聚体蛋白结合ACE2二聚体蛋白,两种蛋白相互结合的亲和力最高。当两者组合用于新冠病毒感染或疫苗接种产生的中和抗体时,中和抗体与RBD三聚体蛋白特异性结合,从而竞争性阻断RBD三聚体蛋白与ACE2二聚体蛋白的相互结合,利用这种竞争性结合的方法,可以实现对中和抗体滴度的检测。由于RBD三聚体蛋白结合ACE2二聚体蛋白的亲和力高,试剂组合物对中和抗体检测具有高的灵敏度、特异性和稳定性,能够实现对中和抗体的长期动态跟踪检测(时间可达7d以上)。
在一些实施方式中,重组的受体蛋白包被于固相载体上,重组的受体蛋白与中和抗体竞争性结合重组的受体结合蛋白,利用酶联免疫吸附的方法实现对中和抗体的检测。
在一些实施方式中,重组的受体结合蛋白偶联有信号分子,能够产生检测信号。示例性的。信号分子为辣根过氧化物酶(HRP),HRP以TMB为底物,可催化TMB产生化学发光信号,通过检测固相载体上的化学发光信号能够实现对未与中和抗体结合的RBD三聚体蛋白的检测。
在一些实施方式中,试剂组合物还包括如下的至少一种:
(h1)包被液,
(h2)封闭液,
(h3)样品稀释液,
(h4)显色液,
(h5)阳性对照品,
(h6)阴性对照品
其中,包被液是以1×PBS缓冲液,使用该溶液将重组的受体蛋白稀释至1-8μg/mL。将该包被液稀释后的蛋白溶液与固相载体进行孵育,可在固相载体上包被重组的受体蛋白。作为优选,用于包被的该蛋白溶液包含2μg/mL的重组的受体蛋白,可获得包被均匀、结合度牢的包被有ACE2二聚体蛋白的固相载体。
封闭液中包含质量份数为1%的BSA,固相载体包被完成后,以封闭液对固相载体进行封闭,以减少非特异性结合。
样品稀释液包含氯化钠,氯化钾,磷酸氢二钠,磷酸二氢钾,其pH值为7.4±0.2。示例性的,10×样品稀释液的配制方法:称取81.82g氯化钠,2.01g氯化钾,14.2g磷酸氢二钠,2.45g磷酸二氢钾,调节PH至7.4±0.2,定容于1L纯化水中得到。样品稀释液用前稀释至1×使用,可用于对待检血样,阴性对照或阳性对照的稀释。偶联信号分子的重组的受体结合蛋白的浓度为1-2mg/mL,采用标记抗原稀释液(0.01M PBS,1% BSA,pH=7.8±0.2)对重组的受体结合蛋白以1:500~1:5000的体积比稀释后使用。例如,重组的受体结合蛋白的稀释比例为1:500、1:1000、1:2500或1:5000等等。作为优选,重组的受体结合蛋白的稀释比例为1:1000。重组的受体结合蛋白的浓度为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL等等。作为优选,重组的受体结合蛋白的浓度为1mg/mL。
显色液包含TMB底物,可被重组的受体结合蛋白偶联的HRP催化而显色。
在一些实施方式中,本公开提供了一种试剂盒,包括上述的试剂组合物。以试剂盒对新冠病毒中和抗体的检测流程图如6所示:
(1)以重组的受体蛋白(ACE2二聚体蛋白)对固相载体进行包被,包被结束后对固相载体进行冲洗,以洗去未结合的ACE2二聚体蛋白;
(2)向固相载体上加入封闭液进行封闭;
(3)将重组的受体结合蛋白(RBD三聚体蛋白)与待测样品(含有新型冠状病毒的中和抗体)进行孵育;
(4)孵育后的样品加入固相载体中,固相载体上包被的ACE2二聚体蛋白与中和抗体竞争性结合RBD三聚体蛋白;固相载体孵育结束后,倒去固相载体上液体;
(5)继续向固相载体上加入TMB底物,TMB底物被RBD三聚体蛋白偶联的HRP催化,发生显色反应;
(6)终止显色反应,以酶标仪进行检测。
需要说明的是,显色反应结束后,发光信号越强,说明与固相载体上ACE2二聚体蛋白结合的RBD三聚体蛋白数量越多,也即待测样品中中和抗体的含量越少。也即,新型冠状病毒中和抗体的滴度与信号的强度成反比。
本公开的试剂组合物或试剂盒能够用于新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度和稳定性检测,解决了目前试剂盒存在一定假阴性,且不适于长期动态跟踪检测的问题。试剂组合物或试剂盒检测新冠病毒中和抗体的步骤简化、操作简单,能够实现对新冠病毒中和抗体大规模、高通量检测的需求,且检测成本低、试剂盒或试剂组合物易于量产,能极大地满足市场上对新冠疫苗接种后的中和抗体跟踪检测的需求。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法,例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
实施例1:重组ACE2单体蛋白的质粒构建与蛋白表达纯化
1、实验方法与步骤
1.1表达质粒的设计与构建:pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-His质粒表达一种融合蛋白,该蛋白包含ACE2蛋白胞外区肽酶结构域(pepidase domain,氨基酸19-615)以及C端His标签。采用工程化Secrecon信号肽,且加入三个丙氨酸序列(SecreconAAA,参考文献https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340)。DNA片段的合成以及基因克隆工作通过苏州金唯智生物科技有限公司委托完成。
1.2蛋白质表达纯化
1.2.1 pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-His质粒提取
用去内毒素质粒大提试剂盒,按步骤提取质粒。测OD值后,-20℃保存。
1.2.2 Expi 293F细胞培养及ACE2蛋白表达
①细胞复苏
(1)将装有P5代次后的Expi 293F细胞冻存管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)移出37℃水浴。
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后转移至二级生物安全柜中,小心开启管盖,把细胞转入含有30ml Free StyleTM 293 Expression Medium的细胞三角摇瓶中,然后把摇瓶移至CO2培养箱中,37℃、120rpm培养3d后进行细胞传代。
②细胞传代
将Expi 293F细胞复苏培养3d后,按2×105Cells/ml的接种量往含150mlFreeStyleTM 293 Expression Medium的1L摇瓶中接种细胞,37℃、120rpm培养3d至细胞密度达到1-1.5×106/ml。
③细胞转染
(1)吸取900μg pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-His质粒溶液,加入45ml Opti-MEM培养基中,充分涡旋混合;
(2)吸取2.7ml的25kd PEI溶液(1mg/ml)加入步骤(1)混合液中,涡旋混合后室温下静置30min;
(3)各吸取15ml质粒/PEI混合液,分别加入3瓶含150ml Expi 293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中;
(4)转染后,于37℃、120rpm、5%CO2的摇床培养箱中孵育3h后,分别向3个摇瓶中补加150ml FreeStyleTM 293 Expression Medium,继续培养4d后离心收集上清。
1.2.3重组ACE2-His的镍柱纯化
步骤1.2.2中收集的上清,继续8000rpm离心20min,收集上清,用于纯化重组ACE2-His蛋白。
(1)Equllibration:设置流速3ml/min,以Buffer A(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH8.0)平衡2×5ml GE Histrap FF Column 5-10个CV至基线平稳;
(2)Sample Application:设置流速6ml/min,使900ml离心收集的上清液上样完全;
(3)Column Wash:设置流速10ml/min,以Buffer A冲洗2×5ml GE Histrap FFColumn 5-10个CV至基线平稳;
(4)Gradient Elution:设置流速6ml/min,以10%、20%、50%和100%(V/V)的Elution Buffer(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)进行梯度洗脱,收集洗脱液至15ml离心管中,250mM Imidazole洗脱液可收集较纯的ACE2-His蛋白;
(5)收集的洗脱样品分别跑SDS-PAGE进行鉴定。
2.实验结果
SDS-PAGE检测ACE2-His的表达
分别收集镍柱纯化中不同浓度咪唑的洗脱液,各吸取40μl跑SDS-PAGE验证,并通过还原SDS-PAGE验证ACE2-His的表达(图1),结果表明重组ACE2-His已在Expi293F细胞中实现了分泌型表达。
实施例2:重组ACE2-FFc蛋白的质粒构建与蛋白表达纯化
1.实验方法与步骤
1.1表达质粒的设计与构建:pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-FFc质粒表达一种融合蛋白,该蛋白包含ACE2蛋白胞外区肽酶结构域(pepidase domain,氨基酸19-615)以及Fc标签,且ACE2蛋白胞外区与Fc标签之间通过柔性连接子(Flexible linker)进行连接(参考文献doi:10.1016/j.addr.2012.09.039.)。采用工程化Secrecon信号肽,且加入三个丙氨酸序列(SecreconAAA,参考文献https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340)。DNA片段的合成以及基因克隆工作通过苏州金唯智生物科技有限公司委托完成。
1.2蛋白质表达纯化
1.2.1 pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-FFc质粒提取
用去内毒素质粒大提试剂盒,按步骤提取质粒。测OD值后,-20℃保存。
1.2.2 Expi 293F细胞培养及ACE2-FFc蛋白表达
①细胞复苏
(1)将装有P5代次后的Expi 293F细胞冻存管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)移出37℃水浴。
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后转移至二级生物安全柜中,小心开启管盖,把细胞转入含有30ml FreeStyleTM 293 Expression Medium的细胞三角摇瓶中,然后把摇瓶移至CO2培养箱中,37℃、120rpm培养3d后进行细胞传代。
②细胞传代
将Expi 293F细胞复苏培养3d后,按2×105Cells/ml的接种量往含150mlFreeStyleTM 293 Expression Medium的1L摇瓶中接种细胞,37℃、120rpm培养3d至细胞密度达到1-1.5×106/ml。
③细胞转染
(1)吸取900μg pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-FFc质粒溶液,加入45ml Opti-MEM培养基中,充分涡旋混合;
(2)吸取2.7ml的25kd PEI溶液(1mg/ml)加入步骤(1)混合液中,涡旋混合后室温下静置30min;
(3)各吸取15ml质粒/PEI混合液,分别加入3瓶含150ml Expi 293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中;
(4)转染后,于37℃、120rpm、5% CO2的摇床培养箱中孵育3h后,分别向3个摇瓶中补加150ml FreeStyleTM 293 Expression Medium,继续培养4d后离心收集上清。
1.2.3重组ACE2-FFc Protein A柱纯化
①离心收集上清
(1)收集900ml Expi 293F细胞悬液,置于1L离心瓶中,1000rpm离心10min后收集上清;
(2)步骤(1)中收集的上清,继续8000rpm离心20min,收集上清,用于纯化重组ACE2-FFc蛋白。
②ProteinA柱纯化重组ACE2-FFc蛋白
(1)Equllibration:设置流速3.5ml/min,以Buffer A(10mM PBS,pH7.4)平衡5mlHiTrap rProtein A FF Column5-10个CV至基线平稳;
(2)Sample Application:设置流速3.5ml/min,使900ml离心收集的上清液上样完全;
(3)Column Wash:设置流速3.5ml/min,以Buffer A冲洗5ml HiTrap rProtein AFF Column 5-10个CV至基线平稳;
(4)Gradient Elution:设置流速3.5ml/min,以Elution Buffer(100mM Glycine-HCl,pH3.0)进行洗脱,收集洗脱液至15ml离心管中;
(5)收集的洗脱样品分别跑SDS-PAGE进行鉴定。
2.实验结果
SDS-PAGE检测ACE2-FFc的表达
分别收集Protein A柱洗脱液,各吸取40μl跑SDS-PAGE验证(图2),结果表明重组ACE2-FFc蛋白已在Expi 293F细胞中实现了分泌型表达。如图2所示,泳道1为还原型上样缓冲液的SDS-PAGE蛋白电泳,所得蛋白条带为蛋白单体。泳道2为非还原型上样缓冲液的SDS-PAGE蛋白电泳,所得蛋白条带为蛋白二聚体。因此,该纯化蛋白在非还原状态下应为二聚体蛋白。
实施例3:ACE2-RFc蛋白的表达质粒构建与蛋白表达纯化
1.实验方法与步骤
1.1表达质粒的设计与构建:pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-RFc质粒表达一种融合蛋白,该蛋白包含ACE2蛋白胞外区肽酶结构域(pepidase domain,氨基酸19-615)以及Fc标签,且ACE2蛋白胞外区与Fc标签之间通过刚性连接子(Rigid linker)进行连接(参考文献doi:10.1016/j.addr.2012.09.039.)。采用工程化Secrecon信号肽,且加入三个丙氨酸序列(SecreconAAA,参考文献https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340)。DNA片段的合成以及基因克隆工作通过苏州金唯智生物科技有限公司委托完成。
1.2 ACE2-RFc的蛋白表达
1.2.1 pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-RFc质粒提取
用去内毒素质粒大提试剂盒,按步骤提取质粒。测OD值后,-20℃保存。
1.2.2 Expi 293F细胞培养与蛋白表达
①细胞复苏
(1)将装有P5代次后的Expi 293F细胞冻存管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)移出37℃水浴。
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后转移至二级生物安全柜中,小心开启管盖,把细胞转入含有30ml FreeStyleTM 293 Expression Medium的细胞三角摇瓶中,然后把摇瓶移至CO2培养箱中,37℃、120rpm培养3d后进行细胞传代。
②细胞传代
将Expi 293F细胞复苏培养3d后,按2×105Cells/ml的接种量往含150mlFreeStyleTM 293 Expression Medium的1L摇瓶中接种细胞,37℃、120rpm培养3d至细胞密度达到1-1.5×106/ml。
③细胞转染
(1)吸取900μg pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-ACE2-RFc质粒溶液,加入45ml Opti-MEM培养基中,充分涡旋混合;
(2)吸取2.7ml的25kd PEI溶液(1mg/ml)加入步骤(1)混合液中,涡旋混合后室温下静置30min;
(3)各吸取15ml质粒/PEI混合液,分别加入3瓶含150ml Expi 293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中;
(4)转染后,于37℃、120rpm、5%CO2的摇床培养箱中孵育3h后,分别向3个摇瓶中补加150ml FreeStyleTM 293 Expression Medium,继续培养4d后离心收集上清。
1.2.3重组ACE2-RFc Protein A柱纯化
①离心收集上清
(1)收集900ml Expi 293F细胞悬液,置于1L离心瓶中,1000rpm离心10min后收集上清;
(2)步骤(1)中收集的上清,继续8000rpm离心20min,收集上清,用于纯化重组ACE2-RFc蛋白。
②ProteinA柱纯化重组ACE2-RFc蛋白
(1)Equllibration:设置流速3.5ml/min,以Buffer A(10mM PBS,pH7.4)平衡5mlHiTrap rProtein A FF Column5-10个CV至基线平稳;
(2)Sample Application:设置流速3.5ml/min,使900ml离心收集的上清液上样完全;
(3)Column Wash:设置流速3.5ml/min,以Buffer A冲洗5ml HiTrap rProtein AFF Column 5-10个CV至基线平稳;
(4)Gradient Elution:设置流速3.5ml/min,以Elution Buffer(100mM Glycine-HCl,pH3.0)进行洗脱,收集洗脱液至15ml离心管中;
(5)收集的洗脱样品分别跑SDS-PAGE进行鉴定。
2.实验结果:
分别收集Protein A柱洗脱液,各吸取40μl跑SDS-PAGE验证(图3),结果表明重组ACE2-RFc蛋白已在Expi 293F细胞中实现了分泌型表达。如图3所示,泳道1为还原型上样缓冲液的SDS-PAGE蛋白电泳,所得蛋白条带为蛋白单体。泳道2为非还原型上样缓冲液的SDS-PAGE蛋白电泳,所得蛋白条带为蛋白二聚体。因此,该纯化蛋白在非还原状态下应为二聚体蛋白。
实施例4:重组新冠病毒RBD三聚体蛋白的表达质粒构建与表达纯化
1.实验方法与步骤
1.1表达质粒的设计与构建:pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-Foldon质粒表达RBD三聚体蛋白,其序列包含新冠病毒RBD,蛋白C端野生型或突变型thrombin连接子,Foldon三聚体元件(参考文献doi:10.1016/j.jmb.2004.09.079)以及C端6xHistag标签。采用工程化Secrecon信号肽,且加入三个丙氨酸序列(SecreconAAA,参考文献https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340)。编码该蛋白的基因片段克隆到pCDNA3.1(+)载体。基因片段的合成与克隆工作通过委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
RBD三聚体蛋白的表达
1.2.1 pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-Foldon质粒提取
用去内毒素质粒大提试剂盒,按步骤提取质粒。测OD值后,-20℃保存。
1.2.2 Expi 293F细胞培养以及RBD三聚体的蛋白表达
①细胞复苏
(1)将装有P5代次后的Expi 293F细胞冻存管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)移出37℃水浴。
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后转移至二级生物安全柜中,小心开启管盖,把细胞转入含有30ml培养基的细胞三角摇瓶中,然后把摇瓶移至CO2培养箱中,37℃、120rpm培养3d后进行细胞传代。
②细胞传代
(1)将Expi 293F细胞复苏培养3d后,按2×105Cells/ml的接种量往含150ml培养基的1L摇瓶中接种细胞,37℃、120rpm培养3d至细胞密度达到1-1.5×106/ml。
③细胞转染
(1)吸取900μg pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-Foldon质粒溶液,加入45mlOpti-MEM培养基中,充分涡旋混合;
(2)吸取2.7ml的25kd PEI溶液(1mg/ml)加入步骤(1)混合液中,涡旋混合后室温下静置30min;
(3)各吸取15ml质粒/PEI混合液,分别加入3瓶含150ml Expi 293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中;
(4)转染后,于37℃、120rpm、5%CO2的摇床培养箱中孵育3h后,分别向3个摇瓶中补加150ml培养基,继续培养4d后离心收集上清。
1.2.3重组RBD三聚体的蛋白质纯化
①离心收集上清
(1)收集900ml Expi 293F细胞悬液,置于1L离心瓶中,1000rpm离心10min后收集上清;
(2)步骤(1)中收集的上清,继续8000rpm离心20min,收集上清,用于纯化重组三聚体RBD蛋白。
②镍柱亲和层析法纯化重组三聚体RBD
(1)Equllibration:设置流速3ml/min,以Buffer A(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH8.0)平衡2×5ml GE Histrap FF Column 5-10个CV至基线平稳;
(2)Sample Application:设置流速6ml/min,使900ml离心收集的上清液上样完全;
(3)Column Wash:设置流速10ml/min,以Buffer A冲洗2×5ml GE Histrap FFColumn 5-10个CV至基线平稳;
(4)Gradient Elution:设置流速6ml/min,以10%、20%、50%和100%(V/V)的Elution Buffer(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)进行梯度洗脱,收集洗脱液至15ml离心管中,250mM Imidazole洗脱液可收集较纯的三聚体RBD蛋白;
(5)收集的洗脱样品分别跑SDS-PAGE进行鉴定。
2.实验结果
SDS-PAGE检测三聚体RBD的表达
分别收集镍柱纯化中不同浓度咪唑的洗脱液,各吸取40μl跑SDS-PAGE验证,并通过非还原与还原SDS-PAGE验证三聚体RBD的表达(图4),结果表明重组三聚体RBD已在Expi293F细胞中实现了分泌型表达。
实施例5:重组新冠病毒RBD单体蛋白的表达质粒构建与表达纯化
1.实验方法与步骤
1.1表达质粒的设计与构建:pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-His质粒表达RBD三聚体蛋白,其序列包含新冠病毒RBD以及蛋白C端6x His-tag标签。编码该蛋白的基因片段克隆到pCDNA3.1(+)载体。基因片段的合成与克隆工作通过委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
RBD三聚体蛋白的表达
1.2.1 pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-His质粒提取
用去内毒素质粒大提试剂盒,按步骤提取质粒。测OD值后,-20℃保存。
2.2.1 Expi 293F细胞培养以及RBD单体蛋白的蛋白表达
①细胞复苏
(1)将装有P5代次后的Expi 293F细胞冻存管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,细胞融化后尽快(约1min)移出37℃水浴。
(2)迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒,然后转移至二级生物安全柜中,小心开启管盖,把细胞转入含有30ml培养基的细胞三角摇瓶中,然后把摇瓶移至CO2培养箱中,37℃、120rpm培养3d后进行细胞传代。
②细胞传代
(1)将Expi 293F细胞复苏培养3d后,按2×105Cells/ml的接种量往含150ml培养基的1L摇瓶中接种细胞,37℃、120rpm培养3d至细胞密度达到1-1.5×106/ml。
③细胞转染
(1)吸取900μg pCDNA3.1(+)-SecreconAAA-RBD-His质粒溶液,加入45ml Opti-MEM培养基中,充分涡旋混合;
(2)吸取2.7ml的25kd PEI溶液(1mg/ml)加入步骤(1)混合液中,涡旋混合后室温下静置30min;
(3)各吸取15ml质粒/PEI混合液,分别加入3瓶含150ml Expi 293F细胞悬浮液的1L三角摇瓶中;
(4)转染后,于37℃、120rpm、5% CO2的摇床培养箱中孵育3h后,分别向3个摇瓶中补加150ml培养基,继续培养4d后离心收集上清。
2.2.2重组RBD单体蛋白的蛋白质纯化
①离心收集上清
(1)收集900ml Expi 293F细胞悬液,置于1L离心瓶中,1000rpm离心10min后收集上清;
(2)步骤(1)中收集的上清,继续8000rpm离心20min,收集上清,用于纯化重组RBD单体蛋白。
②镍柱亲和层析法纯化重组RBD单体蛋白
(1)Equllibration:设置流速3ml/min,以Buffer A(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH8.0)平衡2×5ml GE Histrap FF Column 5-10个CV至基线平稳;
(2)Sample Application:设置流速6ml/min,使900ml离心收集的上清液上样完全;
(3)Column Wash:设置流速10ml/min,以Buffer A冲洗2×5ml GE Histrap FFColumn 5-10个CV至基线平稳;
(4)Gradient Elution:设置流速6ml/min,以10%、20%、50%和100%(V/V)的Elution Buffer(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0)进行梯度洗脱,收集洗脱液至15ml离心管中,250mM Imidazole洗脱液可收集较纯的RBD单体蛋白;
(5)收集的洗脱样品分别跑SDS-PAGE进行鉴定。
2.实验结果
SDS-PAGE检测RBD单体蛋白的表达
分别收集镍柱纯化中不同浓度咪唑的洗脱液,各吸取40μl跑SDS-PAGE验证(图5),结果表明重组RBD-His蛋白已在Expi 293F细胞中实现了分泌型表达。
实施例6:新冠病毒中和抗体试剂盒的制备及灵敏度与稳定性测试
1.实验方法与步骤
1.1 ACE2单体、ACE2-RFC和ACE2-FFC的固相包被
1×PBS分别稀释ACE2单体、ACE2-RFC或ACE2-FFC至终浓度为2μg/ml,加入96孔酶标板孔,放于4℃冰箱包被16h;
1.2封闭
在达到包被孵育时间后,洗涤四次(1×洗液250μL/孔)注入封闭液120μL/孔,4℃封闭过夜;
1.3干燥
吸干封闭液并甩干,23℃干燥3小时或2-8℃干燥过夜,湿度小于40%;
1.4热封
将干燥后反应板装入铝箔袋抽真空并热封,做好标识,放置2-8℃保存。
1.5 HRP-RBD三聚体和HRP-RBD单体标记连接
1.5.1透析
1)HRP透析:称取1000units的HRP,溶于500μL水中,加入100μL 0.1M的NaIO4室温反应20min,1mM醋酸钠(pH=4.4),4℃透析过夜;
2)RBD三聚体和HRP-RBD单体透析:用透析液将纯化后的RBD蛋白浓度调整到1mg/ml并装入10KD透析袋中,用0.05M的CBS透析液透析24h±2h。
1.5.2标记
加10ul的0.2M CBS(pH=9.5)缓冲液到透析后HRP中,与3ml的RBD三聚体(1mg/ml)和HRP-RBD单体(1mg/ml)室温孵育2h,加入50μL现配的NaBH4(4mg/ml)4℃还原2h,期间偶尔涡旋,连接完成后4℃保存待用。
1.6溶剂配制
1)0.05M的CBS:精密称取1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3,溶于纯化水中,调节PH至9.6±0.2后,纯化水定容至1L;
2)1mM醋酸钠溶液:精密称取82mg的醋酸钠,溶于纯化水中,加醋酸调节PH至4.4±0.2后,定容至1L
3)封闭液:称取1g的BSA溶于纯化水中,按体积比加入0.1%proclin300最后定容至100mL;
4)10×样品稀释液:精密称取81.82g氯化钠,2.01g氯化钾,14.2g磷酸氢二钠,2.45g磷酸二氢钾,调节PH至7.4±0.2,定容于1L纯化水中,用前稀释至1×使用。
5)10×洗液:81.82g氯化钠,2.01g氯化钾,14.2g磷酸氢二钠,2.45g磷酸二氢钾,5mL吐温20,调节PH至7.8±0.2,定容于1L纯化水中,用前稀释至1×使用。
6)终止液:2%硫酸
1.7检测流程
图6显示新型冠状病毒中和抗体检测体外诊断试剂盒检测流程图:
1.7.1检测开始前,取出试剂盒内所有试剂,提前恢复至室温;
1.7.2稀释样品、阴参和阳参:样品稀释液10倍稀释样品(或者阴参、阳参),例如取6μL的待测样品,加入54μL的样品稀释液;
1.7.3 HRP-RBD三聚体或HRP-RBD单体(统称HRP-RBD)稀释:HRP-RBD与标记抗原稀释液(0.01M PBS,1%BSA,pH=7.8±0.2)按1:1000稀释,例如取1μL的HRP-RBD,加入1000μL的样品稀释液;
1.7.4稀释后的样品(或者阴参、阳参)和HRP-RBD混合孵育:吸取“1.7.2”项下稀释的样品(或者阴参、阳参)与“1.7.3”项下稀释的HRP-RBD,体积比1:1混合,例如吸取60μL“1.7.2”项下稀释的样品(或者阴参、阳参)与60μL“1.7.3”项下稀释的HRP-RBD混合,37℃孵育30min;
1.7.5板孵育:吸取100μL“1.7.4”项的混合液,加入“1.4”项准备的酶标板孔中,37℃孵育15min;
1.7.6底物反应显色:板孵育结束后,倒去板中液体,加入260μL洗液,洗板4次,拍干板中液体,加入100μL的TMB底物,室温反应15min;
1.7.7终止显色结束后,加入50μL的终止液,放置于酶标仪中,读取450nm处的吸光值。
1.8灵敏度与加速稳定性实验
灵敏度实验:将步骤1.4准备的酶标板孔,步骤1.5标记的HRP-RBD,步骤1.6准备的试剂用于梯度稀释的阳性对照进行测试。阳性对照采用样品稀释液进行比例为1/2,1/4,1/8和1/16的稀释。
加速稳定性实验:将步骤1.4准备的酶标板孔,步骤1.5标记的HRP-RBD,步骤1.6准备的试剂放入37℃烘箱中1天,3天,5天,7天后取出相应的试剂和酶标板,按照步骤1.7的检测流程,对商用试剂盒的阴参和阳参进行检测,以其OD450处的吸光值判断试剂盒活性。
2.实验结果
2.1.表1:商用试剂盒的结果参考标准
表1
OD450吸光值 |
样品 |
>1.0 |
阴参 |
<0.3 |
阳参 |
2.2结果
2.2.1不同原料组合的检测灵敏度测试
为检测三种不同的原料组合的灵敏度,分别采用这三种原料组合做成ELISA试剂盒。具体组合如下表所示:
表2
组合 |
包被蛋白(包被浓度) |
标记蛋白(稀释度) |
1 |
ACE2单体(2μg/ml) |
RBD单体(1:1000) |
2 |
ACE2-FFc(2μg/ml) |
RBD三聚体(1:1000) |
3 |
ACE2-RFc(2μg/ml) |
RBD三聚体(1:1000) |
如表2所示,不同的包被蛋白均采用2μg/ml的包被浓度。不同的标记蛋白在与HRP偶联之前的浓度均为1mg/ml。与HRP偶联之后的稀释度均为1:1000。三种原料组合的试剂盒均采用相同的其他试剂与操作流程。采用商用试剂盒的阳性对照对这三种原料组合的灵敏度进行测试。为了更准确地区分灵敏度的差别,对阳性对照按1/2,1/4,1/8和1/16的稀释比例,采用样品稀释液进行稀释。
图7示出了不同ACE2蛋白和RBD蛋白组合检测新型冠状病毒中和抗体的灵敏度差异。由图7可知,ACE2单体/RBD单体的组合具有最低的灵敏度,ACE2-FFc二聚体/RBD三聚体、ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体的组合均具有提高的检测灵敏度,且ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体的灵敏度高于ACE2-FFc二聚体/RBD三聚体。
2.2.2不同原料组合的加速稳定性测试
为检测三种不同的原料组合的稳定性,分别采用这三种原料组合做成ELISA试剂盒。具体组合如下表所示:
表3
组合 |
包被蛋白(包被浓度) |
标记蛋白(稀释度) |
1 |
ACE2单体(2μg/ml) |
RBD单体(1:1000) |
2 |
ACE2-FFc(2μg/ml) |
RBD三聚体(1:1000) |
3 |
ACE2-RFc(2μg/ml) |
RBD三聚体(1:1000) |
如表3所示,不同的包被蛋白均采用2ug/ml的包被浓度。不同的标记蛋白在与HRP偶联之前的浓度均为1mg/ml。与HRP偶联之后的稀释度均为1:1000。三种原料组合的试剂盒均采用相同的其他试剂与操作流程。采用商用试剂盒的阴性对照和阳性对照对这三种原料组合的加速稳定性进行测试。为了更准确地区分稳定性的差别,将全套试剂盒于37℃行恒温孵育,时长分别为1天、3天、5天和7天。
图8示出了不同ACE2蛋白和RBD蛋白组合在1d、3d、5d、7d时对阴性样品的检测结果。由图8可知,ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体的检测稳定性显著优于ACE2单体/RBD单体和ACE2-FFc二聚体/RBD三聚体的组合,ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体在37℃处理7天的情况下其对阴性对照的检测仍在正常范围内(OD450nm吸光度值>1.0)。而ACE2-FFc二聚体/RBD三聚体在37℃处理5天的情况下其对阴性对照的检测在正常范围内(OD450nm吸光度值>1.0),时间均长于ACE2单体/RBD单体保持正常范围内的检测结果。
图9示出了不同ACE2蛋白和RBD蛋白组合在1d、3d、5d、7d时对阳性样品的检测结果。由图9可知,ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体和ACE2-FFc二聚体/RBD三聚体的组合在37℃处理1、3、5、7天后,其对阳性对照的检测仍在正常范围内(OD450nm吸光度值<0.3)。而ACE2单体/RBD单体的试剂盒在37℃处理7天后,其对阳性对照的检测超出正常范围内(OD450nm吸光度值>0.3)。因此,综合阴性对照和阳性对照的加速稳定性检测结果,ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体的组合有更优的稳定性。
对比实施例:
1.1灵敏度比较
本发明专利中试剂盒采用ACE2-RFc/RBD三聚体蛋白组合,实验证明,与现有的商品化试剂盒(Commercial kits)相比,本试剂盒的对阳性对照的检测灵敏度更高,如图10所示。
图10示出了本公开提供的试剂盒与商品化试剂盒灵敏度的比较结果。本公开试剂盒的包被蛋白采用ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体蛋白组合,包被蛋白(RBD三聚体蛋白)的包被浓度为2ug/ml,标记蛋白(RBD三聚体蛋白)在与HRP偶联之前的浓度为1mg/ml,与HRP偶联之后的稀释度为1:1000。为了更准确地区分灵敏度的差别,对阳性对照按1/2,1/4,1/8和1/16的稀释比例,采用样品稀释液进行稀释。结果表明,本公开提供的试剂盒可检出按1/8的比例稀释的阳性对照,而商用试剂盒仅能检出按1/2稀释的阳性对照。因此,与商用试剂盒相比,本公开提供的试剂盒具有更优的灵敏度。
1.2稳定性比较
与现有的商品化试剂盒(Commercial kits)相比,本公开的试剂盒(self kit)有更好的检测稳定性,如图11所示。
本公开提供的试剂盒其包被蛋白采用ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体蛋白组合。包被蛋白(ACE2-RFc二聚体)的包被浓度为2ug/ml。标记蛋白(RBD三聚体蛋白)在与HRP偶联之前的浓度为1mg/ml。与HRP偶联之后的稀释度为1:1000。采用商用试剂盒的阴性对照和阳性对照对两种试剂盒的加速稳定性进行测试。为了更准确地区分稳定性的差别,将全套试剂盒于37℃行恒温孵育,时长分别为1天、3天、5天和7天。
图11示出了本公开提供的试剂盒与商品化试剂盒基于阴性对照的加速稳定性测试结果。如图11所示,本公开提供的试剂盒在37℃处理7天的情况下其对阴性对照的检测仍在正常范围内(OD450nm吸光度值>1.0)。而商用试剂盒在37℃处理3天的情况下其对阴性对照的检测在正常范围内(OD450nm吸光度值>1.0),而在37℃处理5天或7天的情况下其对阴性对照的检测超出正常范围内(OD450nm吸光度值<1.0)。由此可见,本专利提供的试剂盒较之商用试剂盒,对阴性对照的检测有显著更优的稳定性。
1.3特异性比较
与现有的商品化试剂盒(Commercial kits)相比,本公开的试剂盒(self kit)有更好的检测特异性,如表4所示。
本公开提供的试剂盒其包被蛋白采用ACE2-RFc二聚体/RBD三聚体蛋白组合。包被蛋白(ACE2-RFc二聚体)的包被浓度为2ug/ml。标记蛋白(RBD三聚体蛋白)在与HRP偶联之前的浓度为1mg/ml。与HRP偶联之后的稀释度为1:1000。为了检测试剂盒的特异性,采用18份新型冠状病毒阴性血清进行测试。
表4示出了本公开提供的试剂盒与商品化试剂盒基于18份阴性血的特异性测试结果:
表4
如表4所示,本公开提供的试剂盒对所有18份阴性血的检测均判断为阴性(OD450nm吸光度值>1.0)。而商用试剂盒对18份阴性血进行检测,结果显示有16份阴性血判断为阴性(OD450nm吸光度值>1.0),而两份阴性血被判断为阳性(OD450nm吸光度值<1.0)。由此可见,本专利提供的试剂盒较之商用试剂盒有更优的检测特异性。
综上所述,本公开提供的试剂盒较之商用试剂盒有更优的灵敏度、特异性和稳定性。
本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围,提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导,对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化,并且这类变化旨在落入本公开的范围内。
序列表
<110> 江苏普瑞康生物医药科技有限公司
<120> 一种用于检测新冠病毒中和抗体的重组的受体结合蛋白、重组的受体蛋白
<130> 6A23-2028118I
<141> 2020-12-17
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agggtgcagc ctaccgagag catcgtgagg ttccctaaca tcaccaacct gtgccctttc 60
ggcgaggtgt tcaacgccac caggttcgcc agcgtgtacg cctggaacag gaagaggatc 120
agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag caccttcaag 180
tgctacggcg tgagccctac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 240
agcttcgtga tcaggggcga cgaggtgagg cagatcgccc ctggccagac cggcaagatc 300
gccgactaca actataagct gcctgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaacagc 360
aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaattacc tgtacaggct gttcaggaag 420
agcaacctga agcctttcga gagggacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc 480
ccttgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttccctc tgcagagcta cggcttccag 540
cctaccaacg gcgtgggcta ccagccttac agggtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 600
cacgcccctg ccaccgtgtg cggccctaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgc 660
gtgaacttc 669
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val
1 5 10 15
Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggctccggct acatccctga ggcccctagg gacggccagg cctacgtgag gaaggacggc 60
gagtgggtgc tgctgagcac cttcctg 87
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagc 27
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Ser Ser Gly Leu Val Pro Thr Gly Ser
1 5
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
agcagcggcc tggtgcctac cggcagc 27
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Pro Met Val Trp Ala Ala Ala
20
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atgtggtgga ggctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60
gccgccgcc 69
<210> 11
<211> 602
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
1 5 10 15
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
20 25 30
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
35 40 45
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
50 55 60
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
65 70 75 80
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
85 90 95
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
100 105 110
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
130 135 140
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
145 150 155 160
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
165 170 175
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
180 185 190
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
195 200 205
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
210 215 220
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
225 230 235 240
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
245 250 255
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
260 265 270
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
275 280 285
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
290 295 300
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
305 310 315 320
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
325 330 335
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
340 345 350
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
355 360 365
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
370 375 380
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
385 390 395 400
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
405 410 415
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
420 425 430
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
435 440 445
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
450 455 460
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
465 470 475 480
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
485 490 495
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
500 505 510
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
515 520 525
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
530 535 540
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
545 550 555 560
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
565 570 575
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
580 585 590
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Ser Ser Gly
595 600
<210> 12
<211> 1806
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atgcagagca ccatcgagga gcaagccaag accttcctgg acaagttcaa ccacgaggcc 60
gaggacctgt tctatcagag cagcctggct agctggaact acaacaccaa catcaccgag 120
gagaacgtgc agaacatgaa caacgccggc gacaagtgga gcgccttcct gaaggagcag 180
agcaccctgg ctcagatgta ccccctgcaa gagattcaga acctgaccgt gaagctgcag 240
ctgcaagccc tgcagcagaa cggcagcagc gtgctgagcg aggacaagag caagagactg 300
aacaccatcc tgaacaccat gagcaccatc tacagcaccg gcaaggtgtg caaccccgac 360
aacccccaag agtgcctgct gctggagccc ggcctgaacg agatcatggc caacagcctg 420
gactacaacg agagactgtg ggcctgggag agctggagaa gcgaggtggg caagcagctg 480
agaccgctgt acgaggagta cgtggtgctg aagaacgaga tggctagagc caaccactac 540
gaggactacg gcgactactg gagaggcgac tacgaggtga acggcgtgga cggctacgac 600
tacagcagag ggcagctgat cgaggacgtg gagcacacct tcgaggagat caagcctctg 660
tacgagcacc tgcacgccta cgtgagagcc aagctgatga acgcctaccc tagctacatc 720
agccccatcg gctgcctgcc cgcccacctg ctgggcgaca tgtggggcag attctggacc 780
aacctgtaca gcctgaccgt gcccttcggg cagaagccca acatcgacgt gaccgacgcc 840
atggtggacc aagcctggga cgctcagaga atcttcaagg aggccgagaa gttcttcgtg 900
agcgtgggcc tgcccaacat gacccaaggc ttctgggaga acagcatgct gaccgacccc 960
ggcaacgtgc agaaggccgt gtgccacccc accgcctggg acctgggcaa gggcgacttc 1020
agaatcctga tgtgcaccaa ggtgaccatg gacgacttcc tgaccgccca ccacgagatg 1080
ggccacattc agtacgacat ggcctacgcc gctcagccct tcctgctgag aaacggcgcc 1140
aacgagggct tccacgaggc cgtgggcgag atcatgagcc tgagcgccgc cacccccaag 1200
cacctgaaga gcatcggcct gctgagcccc gacttccaag aggacaacga gaccgagatc 1260
aacttcctgc tgaagcaagc cctgaccatc gtgggcaccc tgcccttcac ctacatgctg 1320
gagaagtgga gatggatggt gttcaagggc gagatcccca aggatcagtg gatgaagaag 1380
tggtgggaga tgaagagaga gatcgtgggc gtggtggagc ccgtgcccca cgacgagacc 1440
tactgcgacc ccgctagcct gttccacgtg agcaacgatt acagcttcat cagatactac 1500
acaagaaccc tgtatcagtt tcagttccaa gaggccctgt gccaagccgc caagcacgag 1560
ggccccctgc acaagtgcga catcagcaac agcaccgagg ccgggcagaa gctgttcaac 1620
atgctgagac tgggcaagag cgagccctgg accctggccc tggagaacgt ggtgggcgcc 1680
aagaacatga acgtgagacc cctgctgaac tacttcgagc ccctgttcac ctggctgaag 1740
gatcagaaca agaacagctt cgtgggctgg agcaccgact ggagccccta cgccgacagc 1800
agcggc 1806
<210> 13
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Gly Pro Thr Ile
1 5 10 15
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
20 25 30
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
35 40 45
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
50 55 60
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
65 70 75 80
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
85 90 95
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
100 105 110
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
115 120 125
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
130 135 140
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
165 170 175
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
180 185 190
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
195 200 205
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
210 215 220
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
225 230 235 240
Gly Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ggtggcggcg gcagcggcgg gggcggcagc cctagaggcc ccaccatcaa gccctgcccc 60
ccctgcaaat gccccgcccc caacctgctg ggcggcccta gcgtgttcat cttccccccc 120
aagatcaagg acgtgctgat gatcagcctg agccccatcg tgacctgcgt ggtcgtggac 180
gtgagcgagg acgaccccga cgtgcagatc agctggttcg tgaacaacgt ggaggtgcac 240
accgctcaga cacagaccca cagagaggac tacaacagca ccctgagagt ggtgagcgcc 300
ctgcccattc agcaccaaga ctggatgagc ggcaaggagt tcaagtgcaa ggtgaacaac 360
aaggacctgc ccgcccccat cgagagaacc atcagcaagc ccaagggcag cgtgagagcc 420
ccccaagtgt acgtgctgcc ccctcccgag gaagagatga ccaagaagca agtgaccctg 480
acctgcatgg tgaccgactt catgcccgag gacatctacg tggagtggac caacaacggc 540
aagaccgagc tgaactacaa gaacaccgag cccgtgctgg acagcgacgg cagctacttc 600
atgtacagca agctgagagt ggagaagaag aactgggtgg agagaaacag ctacagctgc 660
agcgtggtgc acgagggcct gcacaaccac cacaccacca agagcttcag cagaaccccc 720
ggcaag 726
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<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Pro Arg Gly Pro
1 5 10 15
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
20 25 30
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
35 40 45
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
50 55 60
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
65 70 75 80
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
85 90 95
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
100 105 110
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
115 120 125
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
130 135 140
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
145 150 155 160
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
165 170 175
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
180 185 190
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
195 200 205
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
210 215 220
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Gly Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gccgaggccg ctgccaagga agctgccgcc aaggccccta gaggccccac catcaagccc 60
tgccccccct gcaaatgccc cgcccccaac ctgctgggcg gccctagcgt gttcatcttc 120
ccccccaaga tcaaggacgt gctgatgatc agcctgagcc ccatcgtgac ctgcgtggtc 180
gtggacgtga gcgaggacga ccccgacgtg cagatcagct ggttcgtgaa caacgtggag 240
gtgcacaccg ctcagacaca gacccacaga gaggactaca acagcaccct gagagtggtg 300
agcgccctgc ccattcagca ccaagactgg atgagcggca aggagttcaa gtgcaaggtg 360
aacaacaagg acctgcccgc ccccatcgag agaaccatca gcaagcccaa gggcagcgtg 420
agagcccccc aagtgtacgt gctgccccct cccgaggaag agatgaccaa gaagcaagtg 480
accctgacct gcatggtgac cgacttcatg cccgaggaca tctacgtgga gtggaccaac 540
aacggcaaga ccgagctgaa ctacaagaac accgagcccg tgctggacag cgacggcagc 600
tacttcatgt acagcaagct gagagtggag aagaagaact gggtggagag aaacagctac 660
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acccccggca ag 732
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<211> 10
<212> PRT
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ggtggcggcg gcagcggcgg gggcggcagc 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gccgaggccg ctgccaagga agctgccgcc aaggcc 36