CN115166235A

CN115166235A - 非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN115166235A
Application number: CN202110362858.2A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 颜世君; 周兵强; 邓均华
Original assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒，该试剂盒包含试纸条，其包括底板，底板上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫上吸附有胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白；硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，检测线上固定化有重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，质控线上固定化有非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体，重组非洲猪瘟病毒P30蛋白如SEQ.ID No.3所示。该试剂盒能实现感染早期的检测，且检测灵敏度高于现有技术中试剂盒的灵敏度，便于临床及时准确、便捷的监测预警。

Description

非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫测定法领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、发病率高、病死率高(可高达100％)，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。

该病在我国被列为一类动物疫病，属于世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病。我国于2018年报告了首例非洲猪瘟病例，并迅速传播到各个省区。中国的生猪数量占全球的50％，ASFV在中国的传播严重威胁着世界养殖业。迄今为止，非洲猪瘟主要的诊断是在病毒基因检测的基础上，通过RT-PCR和部分基因组序列分析进行的，耗时长，不能及时给出是否感染的准确判断。因此，临床上亟需研制出快速准确有效地检测抗体的胶体金试纸条，以便完成猪场的实时检测、避免检测样品运输等因素引起不必要的传播。

同时，现有技术中亟需一种具有高灵敏度和高特异性，能对非洲猪瘟早期感染进行检测的试剂盒，能对临床及时准确、便捷的监测预警以及对疫苗早期免疫效果进行监测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒，其中，所述试剂盒包含非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条，其中，所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条包括底板，所述底板上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上吸附有胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白；所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述质控线上固定化有非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体，其中，所述重组非洲猪瘟病毒P30蛋白如SEQ ID No.3所示。

本发明的非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒，使用重组非洲猪瘟病毒P30蛋白作为抗原，以双抗原夹心法检测样品中的非洲猪瘟病毒抗体，具有高灵敏度和高特异性，可以在感染早期进行监测预警。

本发明非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒中的非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条中胶体金标记抗原蛋白、检测线上固定化抗原蛋白的制备可用不同分子生物学表达方式实现，也可用同一种分子生物学表达方式，所述分子生物学表达方式包括但不限于原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统，或者直接合成；更优选地，所述原核表达系统为E.Coli表达系统，所述哺乳动物细胞表达系统为CHO细胞表达系统，所述昆虫细胞表达系统为杆状病毒表达系统。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白分别为不同表达系统表达或制备方法所得；所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白分别为选自以下表达系统表达的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白或者直接合成：原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统。

一对不同表达系统表达所得的本发明的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，当作为双抗原进行夹心法检测抗体时，能保证更好的检测灵敏度。

作为本发明的一种更优选实施方式，所述原核表达系统为E.Coli表达系统，所述哺乳动物细胞表达系统为CHO细胞表达系统，所述昆虫细胞表达系统为杆状病毒表达系统。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白、和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达或CHO细胞表达系统表达。

本发明使用由杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统表达的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白作为双抗原夹心检测非洲猪瘟病毒抗体，能实现高灵敏度的临床检测，能早期检测感染情况。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述试剂盒中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，或所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达。

本发明使用分别由杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统表达的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白作为双抗原夹心检测非洲猪瘟病毒抗体，能实现高灵敏度的临床检测，远高于现有技术中的试剂盒，能检测早期感染情况以及监测免疫初期状态。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为5μg/ml～20μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.05mg/ml～0.25mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为1mg/ml～2mg/ml。

本发明的一些实施方式，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度的浓度可以为5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml。

本发明的一些实施方式，所述固定化有重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的浓度可以为0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.10mg/ml、0.11mg/ml、0.12mg/ml、0.13mg/ml、0.14mg/ml、0.15mg/ml、0.16mg/ml、0.17mg/ml、0.18mg/ml、0.19mg/ml、0.20mg/ml、0.21mg/ml、0.22mg/ml、0.23mg/ml、0.24mg/ml、0.25mg/ml。

本发明的一些实施方式，所述固定化有非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度可以为1mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2mg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述试剂盒中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为12μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.2mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为2mg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触，使得非洲猪瘟病毒P30抗体与所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的结合体能在其上向所述底板第二端迁移。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述试剂盒中，所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含0.3％V/V Tween-20的pH7.4的0.02M PB溶液。

本发明还提供了一种制备所述试剂盒的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)表达、纯化预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，表达纯化预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，制备所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体；步骤(2)将所述步骤(1)所述表达、纯化预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白用胶体金标记，将所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白吸附于所述金标垫，将所述表达纯化预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白固定于所述检测线，将所述制备的非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体固定于所述质控线；步骤(3)将所述样品垫、所述步骤(2)吸附了所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的金标垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次组装到所述底板，所述硝酸纤维素膜与所述金标垫接触或与所述样品垫、所述金标垫接触，使得非洲猪瘟病毒P30抗体与所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的结合体能在其上向所述底板第二端迁移，得到所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条；步骤(4)配制样品处理液；以及步骤(5)将所述步骤(3)制备的所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条、和所述步骤(4)制备的所述样品处理液组装成试剂盒。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)中所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白、和所述预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达或CHO细胞表达系统表达。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达，所述预备检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，或所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，所述预备检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(2)中所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为5μg/ml～20μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.05mg/ml～0.25mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为1mg/ml～2mg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(2)中所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为12μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.2mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为2mg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(4)的所述样品处理液为含0.3％V/V Tween-20的pH7.4的0.02M PB溶液。

本发明制备的试剂盒用于检测血清中的非洲猪瘟病毒P30抗体，灵敏度高、特异性良好，且检出抗体时间较早，便于临床及时准确的监测预警。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

术语“非洲猪瘟病毒P30蛋白”或“ASFV P30蛋白”，又称CP204L或P32，是由ORFCP204L基因编码的一大小为30kD的蛋白，是ASFV主要的结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，在病毒感染的早期表达和分泌，并在病毒侵入过程中发挥作用。

术语“质控线”或“对照线”可互换。

术语“原核表达系统”，指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。

术语“真核表达系统”，指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入真核细胞的方法，使其在特定真核生物或细胞内表达。

术语“哺乳动物细胞表达系统”，指通过基因克隆技术，将外源目的基因，在哺乳动物细胞内表达，哺乳动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

术语“昆虫细胞表达系统”，指通过基因克隆技术，将外源目的基因，在昆虫细胞内表达，具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统，并能正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构。

术语“酵母表达系统”，指通过基因克隆技术，将外源目的基因，在酵母细胞内表达，酵母繁殖快，能高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。

术语“蛋白化学合成”，指多个氨基酸在一定的条件下通过肽键形成多肽链，在合成前各氨基酸经过基团保护，氨基和羧基的活化处理，然后经接肽，最后形成多肽链；化学合成提供了一条快速、高效的蛋白蛋白制备途径，同时它能方便地引入非天然氨基酸，改变碳链骨架以及其他化学修饰来提高蛋白质活性，构建新蛋白。

术语“杆状病毒表达系统”，用杆状病毒做载体，高效表达外源基因，制备蛋白。

术语“CHO细胞表达系统”，CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster OvaryCell)，是最具代表性的动物细胞表达系统，被广泛应用于生物制药领域，CHO细胞是生产蛋白类生物制品最重要的表达系统。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1重组ASFV P30蛋白的制备及鉴定

1.1杆状病毒表达系统制备重组ASFV P30蛋白

根据杆状病毒表达系统密码子的偏爱性对ASFV P30基因序列(Genbank登录号：MH766894.10)进行密码子优化并在C端添加6个组氨酸，获得SEQ ID No.1所示的ASFV P30序列，将其插入pFastBacI载体，于金斯瑞生物科技有限公司合成重组质粒pFastBac-P30。

将5μl重组质粒pFastBac-P30转化到DH10Bac感受态细胞中，依次冰浴30分钟、42℃水浴60秒、冰浴2分钟，再加入400μl SOC培养基，于37℃、200转/分钟条件下培养4小时。取100μl菌液涂布于含IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗的平板，37℃培养至少48小时，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落于含IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗的平板二次划线，37℃培养至少12小时，挑取白色单一菌落至含卡那/四环/庆大三抗的液体LB培养基摇菌过夜，次日取1μl作为模板。

用上游引物5’-GGATTATTCATACCGTCCCA-3’和下游引物5’CAAATGTGGTATGGCTGATT-3’对菌液进行PCR鉴定。PCR反应体系为25μl 2×PrimeSTAR GC buffer、1μl模板、1μl/1μlprimers(10pM)、4μl dNTPs(2.5mM)、0.5μl PrimeSTAR(2.5U/μl)、17.5μl ddH₂O。PCR扩增条件为：98℃预变性2分钟；98℃变性10秒、55℃退火15秒、72℃延伸1分钟，30个循环；72℃终止延伸10分钟，4℃forever。将PCR产物经凝胶电泳鉴定，于约750bp处出现明显的特异性条带，与预期相符，经测序公司测序与SEQ ID No.1序列一致。按Bac-to-Bac操作说明上的方法提取重组杆粒Bacmid，并命名为重组Bac-P30。

将重组Bac-P30按CellfectinⅡReagent转染试剂盒说明书操作转染到sf9昆虫细胞，置于27℃恒温培养箱培养大约72小时，待细胞病变明显后收获细胞上清，即为重组杆状病毒rBac-P30 P1代。

将rBac-P30 P1代按体积比1∶20～1∶40加入铺有sf9细胞的培养皿中，27℃继续培养直到72小时左右细胞病变明显时收获上清标记为rBac-P30 P2代，2～8℃避光保存。按体积比1∶100～1∶200接种并重复上述步骤，依次获得rBac-P30 P3代、rBac-P30 P4代。

再将rBac-P30 P4代按体积比1∶10～1∶100接种于sf9细胞，将细胞置于27℃、120转/分钟摇床中培养，接种后48小时～72小时收获细胞，按3000×g离心10分钟收集感染细胞，用细胞裂解液(25mM NaHCO₃，pH8.3)裂解细胞，按10000×g、4℃离心10分钟获得裂解上清，经SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot鉴定于约30kD处出现一明显的特异性条带。将鉴定正确的裂解上清收集用于制备杆状病毒表达系统表达的重组ASFV P30蛋白。

1.2CHO细胞表达系统制备重组ASFV P30蛋白

按CHO细胞表达系统密码子的偏爱性对ASFV P30基因序列(Genbank登录号：MH766894.10)进行密码子优化并在C端添加6个组氨酸，获得SEQ ID No.2所示的ASFV P30序列，并于金斯瑞生物科技有限公司获得SEQ ID No.2所示序列N端添加鼠源IgG信号肽的ASFV P30的合成基因。

用限制性内切酶XbaI和HindIII对合成基因进行双酶切，酶切体系为：2μg合成基因、5μl 10×buffer、2.5μl/2.5μl XbaI/HindIII、ddH₂O补至总体积50μl，于37℃水浴2小时后进行胶回收获得目的片段。与同样经双酶切、胶回收处理的pCDNA3.4载体连接，连接体系为1μl 10×T4连接buffer、1μl T4连接酶、6μl目的片段、2μl载体，于22℃水浴2小时。将连接产物转化入大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素筛选抗性的平板，挑取单克隆菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒，经双酶切鉴定筛选阳性重组质粒，双酶切鉴定体系为2μl 10×buffer、1μg重组质粒、1μl/1μl XbaI/HindIII、ddH₂O补至总体积20μl。将酶切产物经凝胶电泳鉴定，于载体位置约6000bp及目的片段位置约750bp处出现明显的特异性条带，与预期相符。选择插入片段正确的克隆送测序公司测序，测序结果与SEQ ID No.2一致，将鉴定正确的阳性质粒命名为pCDNA3.4-P30。

取pCDNA3.4-P30质粒的保藏菌液，接种于50ml含有卡那抗性的的LB液体培养基，在37℃、220转/分钟条件下培养12～16小时，再用OMEGA无内毒素质粒中提试剂盒进行质粒抽提。测定质粒浓度，浓度为1μg/μl。使用BstZ17I内切酶对提取的pCDNA3.4-P30质粒进行线性化酶切，线性化酶切体系为50μl 10×buffer、50μg pCDNA3.4-P30、10μl BstZ17I、390μl ddH₂O，酶切条件为37℃、1～2小时。

基于脂质体法进行质粒转染，转染前24小时，按照5×10⁵～6×10⁵个活细胞/ml的细胞密度传代CHO-S细胞，将培养瓶置于37℃、含8％CO₂、相对湿度70％～80％的条件下振荡摇床培养，转速为130转/分钟。转染当日用Countstar进行活细胞计数，细胞活率应大于95％；按照1×10⁶个活细胞/ml的密度接种至新的125ml培养瓶中，补加培养基至30ml。将培养瓶置于振荡摇床直至转染。

转染过程为：将50μg线性化的质粒加入含OptiPRO SFM培养基的离心管中，使终体积为1.5ml，轻轻混匀，作为质粒混合液。将50μl混匀的转染试剂FreeStyle MAX加入1.45mlOptiPRO SFM中，轻轻混匀并立即加入质粒混合液中。混匀后于室温孵育10分钟，使转染试剂和质粒形成DNA-脂质复合物。逐滴将3ml DNA-脂质复合物加入至含有细胞的125ml培养瓶中，慢慢晃动培养瓶。将培养瓶置于37℃、含8％CO₂、相对湿度70～80％的条件下振荡摇床培养，转速为130转/分钟，获得转染细胞。

转染后48小时，开始进行加压筛选，筛选过程为：(1)离心转染细胞，在选择培养基(含8mM L-谷氨酰胺及1％抗结团剂的CD FortiCHO培养基)中重悬细胞，按5×10⁵个活细胞/ml的接种密度接种2个T-150培养瓶，每瓶含有40ml培养基。(2)在第1个T-150培养瓶中加入G418至终浓度为0.6mg/ml；在第2个T-150培养瓶中，加入G418至终浓度为0.8mg/ml，然后将培养瓶置于37℃、含8％CO₂、70％～80％相对湿度培养箱中培养。(3)从培养后第7日对培养瓶中的细胞开展计数，当存活率不低于30％且有复苏迹象，将细胞转移至125ml摇瓶中，接种密度为3×10⁵个活细胞/ml。将细胞置于37℃、含8％CO₂，相对湿度70％～80％的条件下振荡摇床培养，转速为130转/分钟。(4)每3～4日传代培养瓶中的细胞，每次传代的接种密度为3×10⁵个活细胞/ml，根据培养基的体积添加适量的G418维持选择压力。(5)当细胞存活率大于85％，活细胞密度大于1×10⁶个活细胞/ml时，完成加压筛选，冻存细胞。

用含G418抗性的选择培养基对加压筛选获得的细胞池进行有限稀释后接种96孔板，使每孔细胞数为0.5～1个/孔，37℃、5％CO₂条件静置培养。培养约20天，使用点杂交检测方法筛选表达量高的阳性细胞株进行扩大培养。将筛选出的单细胞集落从96孔板转移至含有克隆生长培养基(CD FortiCHO完全培养基和1∶100稀释的抗结团剂)的24孔板中。每2～5日转移克隆以扩大培养细胞。

用流加补料培养鉴定不同克隆的表达量，用EfficientFeed^TM C+AGT^TM添加剂及Dynamis培养基组合对筛选获得的不同细胞克隆进行流加补料培养，具体操作为：复苏各克隆至含有Dynamis培养基的125ml培养瓶中，将细胞置于37℃、含8％CO₂且相对湿度70％～80％的条件下振荡摇床培养，转速为150转/分钟。每2～3日传代细胞，传代两次后每个克隆分别接种至含有60ml Dynamis^TM培养基的250ml培养瓶中，按3×10⁵个细胞/ml接种。从培养第3日开始每日取样，测定葡萄糖水平并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补葡萄糖至6g/L。分别于培养后第3日、5日、7日、10日进行补料，每次取2×EfficientFeed^TM C+AGT^TM，分别添加至细胞总培养体积的5％。培养至细胞活率80％，结束培养，收获培养物，1000g离心5分钟，收取上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blot鉴定均于约30kD出现一明显的特异性条带。收集产量最高的阳性细胞株培养上清用于制备CHO细胞表达系统表达重组ASFV P30蛋白。

1.3重组ASFV P30蛋白的纯化及鉴定

将实施例1.1杆状病毒表达系统表达的重组ASFV P30蛋白、实施例1.2CHO细胞表达系统表达的重组ASFV P30蛋白，分别用镍柱进行亲和层析及分子筛纯化，分别标记为重组ASFV P30①、重组ASFV P30②。经SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blot鉴定均获得单一条带的目的蛋白，纯度均≥95％，经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量均为1mg/ml。

实施例2重组ASFV P30蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

2.1重组ASFV P30蛋白多克隆抗体的制备

将实施例1制备的重组ASFV P30①加矿物油206佐剂按23∶27的体积比混匀后乳化，作为免疫原，通过颈部肌肉注射免疫经ASFV PCR方法及CN111929433A专利公开的ASFVELISA抗体试剂盒(间接法制备)鉴定抗原抗体均为阴性的猪，2ml/头；间隔21日后用相同剂量加强免疫一次。二免后定期采血分离血清，用实施例1.1重组杆状病毒rBac-P30制备的间接免疫荧光IFA抗原板进行IFA检测。当血清IFA抗体效价≥1∶1280时，颈动脉放血，收集血清。再将血清用Protein G亲和层析法纯化、分装，即为重组ASFV P30蛋白多克隆抗体，-70℃以下保存备用。

2.2重组ASFV P30蛋白多克隆抗体的鉴定

重组ASFV P30蛋白多克隆抗体经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量为5mg/ml。

重组ASFV P30蛋白多克隆抗体用实施例1.1重组杆状病毒rBac-P30制备的间接免疫荧光IFA抗原板进行IFA检测，结果：重组ASFV P30蛋白多克隆抗体IFA效价为1∶1280。

实施例3胶体金检测试纸条的制备

3.1金标抗原的制备及鉴定

将100ml 0.01％V/V氯金酸溶液加热煮沸后再加入1.8ml 1％W/V柠檬酸三钠溶液，制备成胶体金，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，即得胶体金溶液。紫外扫描胶体金溶液的最大吸收峰为521～523nm，OD值为0.9～1.0。

用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.4，匀速搅拌30分钟后，将实施例1制备的重组ASFV P30①、重组ASFV P30②(工作浓度12μg/ml)分别加于胶体金溶液中进行标记，匀速搅拌30分钟后逐滴加入的10％W/V BSA使终浓度为30μl/ml，匀速搅拌30分钟后于2～8℃11000转/分钟离心30分钟，弃上清，将沉淀用1/20体积金标恢复液溶解，即为金标抗原，获得金标抗原ASFV P30①、金标抗原ASFV P30②。其中，金标恢复液为含0.58％W/VNa₂HPO₄·12H₂O、0.059％W/V NaH₂PO₄·2H₂O、0.01％W/V BSA、0.05％W/V蔗糖、0.01％W/VPVP、0.5％V/V Tween 20的溶液，并用0.22μm滤膜过滤，2～8℃保存。

3.2金标垫的制备

金标垫的制备包括以下步骤：

A1)制备，用实施例3.1中的金标恢复液将实施例3.1制备的金标抗原按3倍进行稀释后，用三维划膜喷金仪按照5μl/cm的喷量喷至玻璃纤维素膜上。

A2)干燥，将喷好的金标垫置于37℃恒温干燥箱干燥4～6小时，常温、干燥、密封保存。

3.3硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

硝酸纤维素膜(NC膜)的制备包括以下步骤：

B1)包被，将实施例1制备的重组ASFV P30蛋白用包被缓冲液(含0.58％W/VNa₂HPO₄·12H₂O、0.059％W/V NaH₂PO₄·2H₂O、0.85％W/V NaCl、1％W/V蔗糖的溶液，用0.22μm滤膜过滤，2～8℃保存)稀释至0.2mg/ml，作为检测线(T线)包被液；将实施例2制备的重组ASFV P30蛋白多克隆抗体用包被缓冲液稀释至2mg/ml，作为对照线(C线)包被液；用三维划膜喷金仪按照1.0μl/cm的量，将T线、C线包被液包被于NC膜T线和C线处。

B2)干燥，将包被好的NC膜置于37℃恒温干燥箱干燥16～20小时，常温、干燥、密封保存。

3.4试纸条组装

将样品垫、实施例3.2制备的金标垫、实施例3.3制备的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上，即为非洲猪瘟病毒胶体金检测试纸条。根据金标抗原、T线包被液用抗原的不同将试纸条按以下方法组合为试纸条1～4。

表1试纸条1～4的组合

试剂盒编号	试纸条编号	金标抗原	T线包被用抗原
				试剂盒1	试纸条1	ASFV P30①	ASFV P30②
试剂盒2	试纸条2	ASFV P30②	ASFV P30①
				试剂盒3	试纸条3	ASFV P30①	ASFV P30①
试剂盒4	试纸条4	ASFV P30②	ASFV P30②

连同含样品处理液A2的样品处理管组装成试剂盒1～4。

3.5非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒检测方法的建立

检测方法如下：

步骤1)样品处理，用吸管吸取血清，滴加4滴至1ml样品处理液中，混匀；或用移液器对血清进行10倍稀释(如15μl样品加135μl样品处理液)，混匀。

步骤2)加样，室温下，用吸管吸取处理好的样品，滴加4滴至试纸条加样孔；或使用移液器取100μl处理好的样品，加至试纸条加样孔。

步骤3)水平静置，10分钟内观察结果。结果判定：对照线、检测线均显色，判为阳性；仅对照线显色，判为阴性；对照线不显色，判为无效。

3.5样品处理液配方

选试纸条1并用样品处理液A1～A6(见表2)、其它条件一致的情况下分别制备试剂盒A1～A6，对非洲猪瘟(CD2v缺失)阳性血清(购自中国兽医药品监察所，经间接ELISA方法测定P30蛋白抗体效价为1∶16)、特异性血清(10份阴性血清)进行检测，结果(见表2)：当样品稀释液为A2时制备的试剂盒A2检测灵敏度对应的稀释倍数最高且阳性检出率最高特异性较好。

表2样品处理液所含组分及对应试剂盒检测结果

实施例4试剂盒的评价

4.1灵敏度

将非洲猪瘟(CD2v缺失)阳性血清实施例3的样品处理液A2分别按2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍体积进行稀释，用试剂盒1～4按实施例3.4分别进行检测，结果：试剂盒1、2检测阳性血清2倍～64倍均为阳性，检测128倍～256倍均为阴性；试剂盒3、4检测阳性血清2倍～32倍均为阳性，检测64倍～256倍均为阴性。表明试剂盒1、2检测的灵敏度对应稀释倍数为64倍，优于试剂盒3、4检测的灵敏度对应稀释倍数为32倍。

4.2特异性

对30份背景清楚且经CN111929433A专利公开的ASFV ELISA抗体试剂盒(间接法制备)检测为阴性的样品(含6份猪源其它病毒血清样本：PRRSV、PRV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV及24份2018年以前收集的猪血清)用实施例3制备的试剂盒1～4按检测方法分别进行检测，结果：试剂盒1～4检测30份样品均为阴性，特异性良好，均为100％(30/30)。

4.3重复性

任意取3批试剂盒1～4对15份被检样品重复检测5次，统计检测结果批间、批内的符合情况，结果显示3批自制试纸条批间、批内检测结果之间的符合率均为100％，说明：3批试剂盒1～4的批间、批内均具有良好的重复性。

4.4抗体消长试验

选取5头经ASFV PCR方法及CN111929433A专利公开的ASFV ELISA抗体试剂盒(间接法制备)鉴定的非洲猪瘟抗原抗体均为阴性的健康猪，分别用实施例1制备的重组ASFVP30①蛋白进行免疫，于免后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天、第15天、第21天、第28天采集血清，分别用CN111929433A专利公开的ASFV ELISA抗体试剂盒(间接法制备，简称对比)和本发明制备的试剂盒1～4进行检测，结果：试剂盒1、2于免后第7～9天检出阳性，试剂盒3、4于免后第9～11天检出阳性，而对比的试剂盒在第11天才检出阳性、第15天全部为阳性。表明试剂盒1、2、3、4检测免后的血清转阳时间较早，以试剂盒1、2检出效果为优，均优于ASFV ELISA抗体试剂盒(间接法制备)的检测效果。

表3不同试剂盒检测结果汇总

4.5保存期

将3批试剂盒1～4于37℃放置6日、9日进行热稳定性试验；将试剂盒1～4于2～30℃保存3、7、10、12、15个月，分别对试剂盒1～4进行无菌、敏感性、特异性检验，评估试剂盒1～4的实时保存期。结果：试剂盒1～4在37℃放置6日、9日或2～30℃保存15个月。

4.6临床应用

将非洲猪瘟病毒阳性血清15份、阴性血清35份，用本发明试剂盒1～4进行检测，结果显示：检测阳性血清，试剂盒1、2检出阳性率均为93％(14/15)，试剂盒3、4检出阳性率均为87％(13/15)；检测阴性血清，试剂盒1～4检测均为阴性。

以上试验结果表明：本发明制备的试剂盒1、2检测效果相当，试剂盒3、4检测效果相当，均用于检测血清中的非洲猪瘟病毒P30抗体，灵敏度高、特异性良好，且检出抗体时间较早，检测灵敏度高于现有技术中的试剂盒，且能更早检测出阳性结果，便于临床及时准确、便捷的监测预警，同时也可以对免疫了疫苗的猪的早期抗体水平进行监测。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒及其制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 1

atggacttca tcctgaacat cagcatgaag atggaagtga tcttcaagac cgacctgcgt 60

agcagcagcc aggtggtgtt ccacgctggt agcctgtaca actggttcag cgtggagatc 120

atcaacagcg gtcgcatcgt gaccaccgct atcaagaccc tgctgagcac cgtgaagtac 180

gacatcgtga agtccgctcg tatctacgcc ggccagggtt acaccgagca ccaggcccag 240

gaagaatgga acatgatcct gcacgtgctg ttcgaagaag aaaccgagag ctccgcttcc 300

tccgaaaaca tccacgagaa gaacgacaac gaaaccaacg agtgtaccag ctccttcgaa 360

accctgttcg aacaggagcc ttcctccgag gtgcctaagg acagcaagct gtacatgctg 420

gcccagaaga ccgtgcagca catcgaacag tacggcaagg ctcctgactt caacaaggtt 480

atccgcgctc acaacttcat ccagaccatc tacggtaccc ctctgaagga agaggaaaag 540

gaagtggtgc accatcacca ccaccac 567

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 2

atggatttca tcctgaacat cagcatgaaa atggaagtga tcttcaagac cgacctgaga 60

agctcttccc aggtggtttt ccacgccgga tctctgtaca actggttcag cgtggaaatc 120

atcaacagcg gcagaatcgt gaccacagcc atcaagaccc tgctgagcac cgtgaagtac 180

gacatcgtca aaagcgctag aatctacgcc ggccagggct acaccgagca ccaggcccag 240

gaggaatgga atatgatcct gcacgtgctg ttcgaggaag agacagagag ctccgccagc 300

tctgagaata tccacgagaa gaacgacaac gagacaaacg agtgcaccag ctccttcgag 360

acactgtttg aacaggagcc tagcagcgag gtccccaagg acagcaagct gtacatgctg 420

gcccagaaaa cagtgcagca catcgagcaa tacggcaagg cccctgattt taacaaggtg 480

attagagccc acaacttcat ccagaccatc tatggcaccc cactcaaaga ggaagaaaag 540

gaagtggtgc accaccacca ccaccac 567

<210> 3

<211> 189

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）

<400> 3

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val His His His His His His

180 185

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试剂盒，其中，所述试剂盒包含非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条，其中，所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条包括底板，所述底板上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上吸附有胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上固定化有重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述质控线上固定化有非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体；其中，所述重组非洲猪瘟病毒P30蛋白如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白分别为不同表达系统表达或制备方法所得，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白分别为选自以下表达系统表达的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白或者直接合成：原核表达系统、真核细胞表达系统，所述真核细胞表达系统包括哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、和酵母表达系统；优选地，所述原核表达系统为E.Coli表达系统，所述哺乳动物细胞表达系统为CHO细胞表达系统，所述昆虫细胞表达系统为杆状病毒表达系统；更优选地，所述所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白分别为不同真核表达系统表达所得。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达或CHO细胞表达系统表达；

优选地，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，或

所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其中，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为5μg/ml～20μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.05mg/ml～0.25mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为1mg/ml～2mg/ml；优选地，所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为12μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.2mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为2mg/ml。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其中，所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触，使得非洲猪瘟病毒P30抗体与所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的结合体能在其上向所述底板第二端迁移。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其中，所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为含0.3％V/V Tween-20的pH7.4的0.02M PB溶液。

7.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)表达、纯化预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，表达纯化预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白，制备所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体；

步骤(2)将所述步骤(1)所述表达、纯化预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白用胶体金标记，将所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白吸附于所述金标垫，

将所述表达纯化预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白固定于所述检测线，

将所述制备的非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体固定于所述质控线；

步骤(3)将所述样品垫、所述步骤(2)吸附了所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的金标垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次组装到所述底板，所述硝酸纤维素膜与所述金标垫接触或与所述样品垫、所述金标垫接触，使得非洲猪瘟病毒P30抗体与所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白的结合体能在其上向所述底板第二端迁移，得到所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条；

步骤(4)配制样品处理液；以及

步骤(5)将所述步骤(3)制备的所述非洲猪瘟病毒双抗原夹心抗体检测试纸条、和所述步骤(4)制备的所述样品处理液组装成试剂盒。

8.根据权利要求7所述方法，其中，所述步骤(1)中所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白和所述预备固定于检测线的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达或CHO细胞表达系统表达；

优选地，所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达，所述预备检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，或

所述预备胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为CHO细胞表达系统表达，所述预备检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白为杆状病毒表达系统表达。

9.根据权利要求8所述方法，其中，所述步骤(2)中所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为5μg/ml～20μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.05mg/ml～0.25mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为1mg/ml～2mg/ml；优选地，所述步骤(2)中所述胶体金标记的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白标记浓度为12μg/ml，所述检测线上固定的重组非洲猪瘟病毒P30蛋白浓度为0.2mg/ml，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白多克隆抗体的浓度为2mg/ml。

10.根据权利要求7所述方法，其中，所述步骤(4)的所述样品处理液为含0.3％V/VTween-20的pH7.4的0.02M PB溶液。