CN113009139B - 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括可以与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体。采用猪伪狂犬病毒的两株特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，利用本发明试剂盒进行检测与其他病毒均不发生交叉反应，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中猪伪狂犬病毒抗原的含量。

Description

检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫检测试剂盒，适用于猪伪狂犬病毒抗原的特异、快速、准确定量检测。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies)，又名奥耶斯基病(Aujeszky’s disease，AD)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病。该病能够侵害包括猪、牛、绵羊、兔、狐狸、犬猫、雪貂、鼠、水貂等多种动物。猪是天然宿主和储存者，除了猪，其余动物发病后均出现瘙痒、高热和脑脊髓炎症状，甚至可导致死亡。猪感染PRV后主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎与种猪不育，哺乳仔猪出现神经症状后死亡率高，育成育肥猪呼吸道症状，PRV病毒感染易形成潜伏感染，导致长期带毒、向外界排毒；另外，PRV在应激条件下易被激活，可引起反复感染和散毒，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。
目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备，可用于猪伪狂犬病毒抗原检测。目前，常见的猪伪狂犬病毒抗原检测方法主要是基于PCR技术建立的一系列检测方法，依赖于检测的引物和探针的特异性，需要进行一系列核酸提取的步骤，由于核酸极易引起核酸的气溶胶污染，导致检测结果的假阳性率较高，因此用酶联免疫吸附试验对猪伪狂犬病毒抗原进行定量检测显得更为便捷、检测结果更为准确可靠。单克隆抗体具有较强的特异性，且纯度高，均一性好的优点，基于单克隆抗体技术建立的酶联免疫吸附试验可用于猪伪狂犬病毒的抗原定量检测，敏感性高、特异性好、且操作便捷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒，该试剂盒利用两株可以与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体PRV-Mc3作为捕获抗体，另外一株可以与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体PRV-Mc4作为检测抗体制成的酶标抗体作为检测抗体，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的猪伪狂犬病毒抗原检测方法，用于检测疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等中的猪伪狂犬病毒抗原含量。
基于上述目的，本发明的特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原酶联免疫试剂盒，包括以一株与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体PRV-Mc3作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为另外一株可与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体PRV-Mc4作为检测抗体制成的酶标抗体。所述酶标抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。
优选的，所述捕获抗体(单克隆抗体PRV-Mc3)为含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc3-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～67位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第100～110位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQID No.2的第89～96位氨基酸所示。
所述检测抗体(单克隆抗体PRV-Mc4)为含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc4-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第50～66位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89～96位氨基酸所示。
优选的，所述PRV-Mc3-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～121位所示；所述PRV-Mc3-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
优选的，所述PRV-Mc4-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～120位所示；所述PRV-Mc4-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述猪伪狂犬病毒的一株特异性单克隆抗体PRV-Mc3用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成1～10μg/ml的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体PRV-Mc3与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
优选的，所述试剂盒还包括抗原标准品，所述抗原标准品为猪伪狂犬病毒抗原，纯度不低于80％，抗原含量为4μg/ml，使用时用样品稀释液稀释至(3.1ng/ml～200ng/ml)。抗原含量为4μg/ml，使用时用样品稀释液进行(1:20～1:1280)倍比稀释，所测OD450nm值用于绘制标准曲线。
本发明试剂盒是采用猪伪狂犬病毒特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测样品中猪伪狂犬病毒的抗原含量。
更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本发明还要求保护单克隆抗体，其可与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗体：
1)含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc3-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～67位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第100～110位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89～96位氨基酸所示。
2)含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc4-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第50～66位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89～96位氨基酸所示。
3)含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述PRV-Mc3-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～121位所示；其PRV-Mc3-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
4)含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述PRV-Mc4-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～120位所示；其PRV-Mc4-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
通过上述重链可变区和轻链可变区序列，可以与动物源恒定区(如鼠抗体重链和轻链恒定区)连接，制备得到可与猪伪狂犬病毒特异性结合的单克隆抗体。
上述酶联免疫试剂盒在特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原中的应用也属于本发明的保护范围。
上述可以与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。特别是在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用。
上述的可以与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体的获得方法如下：按照本领域已知的常规方法筛选本发明猪伪狂犬病毒特异性单克隆细胞株，再采用基因测序的方法测定特异性单克隆细胞株的基因序列，利用基因合成，构建重组表达载体的方法制备稳定表达的单克隆抗体作为本发明的捕获单克隆抗体及检测单克隆抗体。具体来讲，本发明猪伪狂犬病毒的特异性单克隆抗体，可包括下述步骤：
1)利用蔗糖密度梯度法(60％、45％、30％、15％)，获得抗原，纯度不低于80％，将抗原调整浓度至10μg/ml，作为免疫原使用；
2)用猪伪狂犬病毒抗原作为免疫原免疫动物，连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次10μg/只动物；
3)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆；当被免疫动物的血清抗体水平用间接ELISA进行检测效价超过1:50000时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤，然后在HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用间接ELISA等方法鉴定所需的特异性单克隆抗体细胞株，经配对试验，优选分泌PRV-Mc3的单克隆细胞株和分泌PRV-Mc4的单克隆细胞株为配对用于检测猪伪狂犬病毒抗原的单克隆细胞株。
4)特异性阳性克隆杂交瘤细胞株总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。
5)反转录、PCR扩增及基因测序：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得杂交瘤细胞的cDNA。针对重链(VH-1：5’-GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3’；VH-2：5’-ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’)和轻链(VL-1：5’-GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3’；VL-2：5’-CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’)可变区设计通用引物，利用扩增引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取单克隆抗体重链和轻链可变区序列信息。
6)特异性单克隆抗体的基因序列的合成、穿梭载体的构建、重组Bacmid的筛选与提取、重组杆状病毒的拯救：①基因序列的合成：根据已测得单抗PRV-Mc3和PRV-Mc4的重链和轻链可变区的序列，将鼠抗体重链和轻链恒定区的序列补充在可变区部分，然后送往北京中美泰和公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化。②穿梭载体的构建：根据重链和轻链的序列信息以及pFastBacdual载体序列信息，设计相应引物，扩增重链和轻链全长的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体中，其中pFastBacdual载体含有两个启动子，即PH启动子和P10启动子，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为4600bp，阴性克隆为300bp，选取完全无300bp条带的克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×106的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。
7)特异性单克隆抗体的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×106的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。用Na3PO4 pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将细胞上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的猪伪狂犬病毒gB特异性单克隆抗体PRV-Mc3及PRV-Mc4。
本发明试剂盒的检测程序为：
1)平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3)样品稀释：抗原标准品用样品稀释液进行1:20～1:1280倍系列稀释，对应抗原浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.2ng/ml、3.1ng/ml，待测样品同样用样品稀释液进行4～8个梯度稀释。
4)加样：取出所需板条，剩余板条装入铝箔袋中封好，置于2～8℃保存备用。将稀释好的待检样品、系列稀释的抗原标准品加入到包被板中，100μl/孔，设1孔作为阴性质控，仅加入样品稀释液。加样过程时间跨度应尽量短。如图1所示加样：S1～S7：1:20～1:1280倍比稀释抗原标准品，N：表示阴性质控孔，仅加入样品稀释液；T1：表示加各待检样品。
5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
7)加酶：各孔加100μl酶标抗体。
8)温育：置37℃温箱，反应30min。
9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
12)测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
13)结果分析：抗原标准品(200ng/ml)孔OD450nm值应≥1.0，否则无效；阴性质控孔OD450nm值应≤0.15，否则无效；浓度计算：根据抗原标准品各孔OD450nm值绘制标准曲线，计算各待测样品中猪伪狂犬病毒含量。
在上述检测方法中，待测样品的选择可以是多样的，如对于猪伪狂犬病毒感染动物，可为来自感染动物的活检物，也可为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。
步骤13)中的结果分析方法可为：以抗原标准品检测孔各稀释度OD450nm值和阴性质控孔OD450nm值作为X轴，以蛋白浓度为Y轴，采用EXCEL程序，→“插入”→“散点图”，选择“带平滑线和数据标记的散点图”→“趋势线”→选中“多项式”→“显示公式”和“显示R平方值”。通常R2值≥0.98表明标准曲线可信(其中应舍弃OD过高或者过低的点)。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。根据多项式公式，样品孔OD450nm值带入计算获得样品中抗原浓度。
本发明的积极效果在于：本发明提供了对猪伪狂犬病毒的定量检测的酶联免疫检测试剂盒，敏感性高、特异性好、且操作便捷，能够稳定地检测猪伪狂犬病毒抗原含量。该试剂盒是采用猪伪狂犬病毒的2株特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，可通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测样品中猪伪狂犬病毒抗原的含量，且与其他病毒如口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、猪瘟病毒均不发生交叉反应。
综上所述，本试剂盒采用猪伪狂犬病毒的2株特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中猪伪狂犬病毒抗原的含量。同时该操作方法可在1.5小时内完成最多检测除抗原标准品和阴性质控孔外的88份样品的检测，大大缩短了检测周期，通常蔗糖密度梯度法3天才可以完成大约5份样品检测，且不需要昂贵的超速离心机，为猪伪狂犬病毒感染的鉴定，疫苗生产中的质量控制提供了更为便捷有效的方法，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明试剂盒酶联免疫板加样示意图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、猪伪狂犬病毒单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株的筛选
包括以下步骤：
1)猪伪狂犬病毒变异株(PRV Hnxy株，CN 110527669 A中公布的菌种保藏编号为CGMCC No.17696的毒株)病毒培养后，灭活，然后经过中空纤维或膜包纯化获得纯化的猪伪狂犬病毒的抗原，将抗原调整浓度至10μg/ml，纯度不低于80％，将抗原调整浓度至10μg/ml，作为免疫原使用；
2)免疫动物为BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每只小鼠注射10μg抗原；
3)末次免疫后7天，取小鼠尾血分离血清后，用间接ELISA进行检测，效价＞1:50000后，分离免疫动物的脾细胞，将其与生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，用HAT选择性培养基筛选获得杂交瘤细胞；
4)对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆，最终获得3个特异性阳性克隆；具体操作步骤：用口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、猪瘟病毒等抗原溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液稀释浓度至2μg/ml，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100μl，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后用铝箔纸进行封袋，置2～8℃保存备用。
取细胞培养上清加入包被有病毒抗原的酶标板中，37℃反应30分钟，用洗涤液(含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，使用时用双蒸水稀释20倍。)洗板4次，拍干后，向每孔加入1:5000稀释的兔抗鼠IgG-HRP标记物(购自美国Sigma公司)，37℃反应30分钟，用洗涤液4次，拍干后，向每孔加入底物液A(为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液)和底物液B(为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)各50μl底物工作液，37℃避光反应15分钟。向每孔加入50μl终止液(2mol/L的硫酸溶液)，振荡混匀终止反应。15分钟内测定每孔的OD450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准，测定细胞培养上清中特异性单克隆抗体效价，同时测定单克隆抗体洗板株是否与其他病毒存在交叉反应，获得3株特异性细胞克隆，他们只与猪伪狂犬病毒有强烈信号反应。然后再与口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、猪瘟病毒等毒株进行特异性筛选，最终筛选到2株单抗与猪伪狂犬病毒有强烈信号反应、而不与口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、猪瘟病毒等毒株反应，将这2株编号为PRV-Mc3和PRV-Mc4。
实施例2、猪伪狂犬病毒单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株的基因测序及单克隆抗体重组表达系统的建立
包括以下步骤：
1)特异性阳性克隆杂交瘤细胞株总RNA提取、反转录、PCR及序列测定：
①总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5mlEP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。
②反转录：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得杂交瘤细胞的cDNA。
③PCR反应及其产物的克隆测序：针对重链和轻链可变区设计通用引物，序列信息如下：
表1重链和轻链可变区通用引物
名称 序列
V<sub>H</sub>-F GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG
V<sub>H</sub>-R ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
V<sub>L</sub>-F GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC
V<sub>L</sub>-R CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
利用扩增引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取单克隆抗体重链和轻链可变区序列信息。
单克隆抗体PRV-Mc3含有重链可变区(PRV-Mc3-VH)、轻链可变区(PRV-Mc3-VL)，其PRV-Mc3-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～121位所示；其PRV-Mc3-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
所述PRV-Mc3-VH和PRV-Mc3-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc3-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～67位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第100～110位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc3-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89～96位氨基酸所示。
单克隆抗体PRV-Mc4含有重链可变区(PRV-Mc4-VH)、轻链可变区(PRV-Mc4-VL)，其PRV-Mc4-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～120位所示；其PRV-Mc4-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～108位所示。
所述PRV-Mc4-VH和PRV-Mc4-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc4-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32～36位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第50～66位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第99～109位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～56位氨基酸所示；所述PRV-Mc4-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89～96位氨基酸所示。
2)特异性单克隆抗体的基因序列的合成及重组表达系统的建立
①基因序列的合成：根据已测得单抗PRV-Mc3和PRV-Mc4重链和轻链可变区的序列，将鼠抗体重链和轻链恒定区的序列补充在可变区部分，然后进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化，PRV-Mc3重链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5(全长序列即为编码序列)所示，PRV-Mc3轻链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6(全长序列即为编码序列)所示；PRV-Mc4重链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7(全长序列即为编码序列)所示，PRV-Mc4轻链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8(全长序列即为编码序列)所示；
②穿梭载体的构建：根据重链和轻链的序列信息以及pFastBacdual(购自ThermoFisher公司，货号10712024)载体序列信息，设计相应引物(序列见下表)，扩增重链和轻链全长的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体中，其中pFastBacdual载体含有两个启动子，即PH启动子和P10启动子，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。
表2表达载体构建引物序列信息
Figure BDA0002953371880000121
Figure BDA0002953371880000131
③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，利用M13引物进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为4600bp，阴性克隆为300bp，选取完全无300bp条带的克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。
④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×106的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。
3)特异性单克隆抗体的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×106的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。用Na3PO4 pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将细胞上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的猪伪狂犬病毒特异性单克隆抗体PRV-Mc3及PRV-Mc4。用紫外分光光度计测定OD280nm值，用该OD280nm值除以经验系数1.48即为单克隆抗体的浓度，单位为mg/ml。结果显示，纯化后的PRV-Mc3分泌的单克隆抗体浓度为2.08mg/ml，纯化后的PRV-Mc4分泌的单克隆抗体浓度为1.83mg/ml。
实施例3、制备猪伪狂犬病毒抗原定量检测酶联免疫试剂盒
1)用猪伪狂犬病毒特异性单克隆抗体制备捕获抗体包被的酶联反应板
将纯化后的特异性单克隆抗体用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
2)制备辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒特异性单克隆抗体
将猪伪狂犬病毒的特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，-20℃以下保存。具体步骤如下：
①将5mg HRP溶于0.2ml含有1.25％戊二醛的0.1mol/L pH值6.8的PBS缓冲液中，置室温偶联18个小时，充分透析出去多余戊二醛；
②加生理盐水至1ml，然后加入2.5mg纯化的猪伪狂犬病毒的特异性单克隆抗体及0.1mlpH值9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，置于2～8℃放置24小时；
③加入0.1ml 0.3mol/L的赖氨酸溶液，室温放置2小时；
④用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。用酶标记物稀释液按一定比例稀释后即为酶标记物的工作液。
3)制备猪伪狂犬病毒抗原标准品
为了方便结果分析，所述试剂盒还包括猪伪狂犬病毒抗原标准品，具体可为猪伪狂犬病毒变异株(PRV Hnxy株，CN 110527669 A中公布的菌种保藏编号为CGMCC No.17696的毒株)病毒培养后，灭活，然后经过中空纤维或膜包纯化获得纯化的猪伪狂犬病毒的抗原，即猪伪狂犬病毒抗原纯化液，纯度不低于80％，抗原含量为4μg/ml，分装成1.0ml/管，使用时用样品稀释液进行(1:20～1:1280)倍比稀释，贴好标签，置于-20℃以下保存备用。
4)样品稀释液的制备为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
5)底物液A的制备为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)
6)底物液B的制备为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
7)20倍浓缩洗涤液的制备为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
8)终止液的制备2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
9)根据需要，试剂盒中还可以有样品稀释板(2块，96孔/块)，用于样品的稀释。
实施例4、猪伪狂犬病毒抗原定量检测酶联免疫试剂盒的使用方法
1)平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3)样品稀释：抗原标准品用样品稀释液进行1:20～1:1280倍系列稀释，对应抗原浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.2ng/ml、3.1ng/ml，待测样品同样用样品稀释液进行4～8个梯度稀释。
4)加样：取出所需板条，剩余板条装入铝箔袋中封好，置于2～8℃保存备用。将稀释好的待检样品、系列稀释的抗原标准品加入到包被板中，100μl/孔，设1孔作为阴性质控，仅加入样品稀释液。加样过程时间跨度应尽量短。如图1所示，加样：S1～S7：1:20～1:1280倍比稀释抗原标准品，N：表示阴性质控孔，仅加入样品稀释液；T1：表示加各待检样品。
5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
7)加酶：各孔加100μl酶标抗体。
8)温育：置37℃温箱，反应30min。
9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
12)测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
13)结果分析：抗原标准品(200ng/ml)孔OD450nm值应≥1.0，否则无效；阴性质控孔OD450nm值应≤0.15，否则无效；浓度计算：根据抗原标准品各孔OD450nm值绘制标准曲线，计算各待测样品中猪伪狂犬病毒含量。
在上述检测方法中，待测样品的选择可以是多样的，如对于猪伪狂犬病毒感染动物，可为来自感染动物的活检物，也可为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。
步骤13)中的结果分析方法可为：以抗原标准品检测孔各稀释度OD450nm值和阴性质控孔OD450nm值作为X轴，以蛋白浓度为Y轴，采用EXCEL程序，→“插入”→“散点图”，选择“带平滑线和数据标记的散点图”→“趋势线”→选中“多项式”→“显示公式”和“显示R平方值”。通常R2值≥0.98表明标准曲线可信(其中应舍弃OD过高或者过低的点)。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。根据多项式公式，样品孔OD450nm值带入计算获得样品中抗原浓度。
以上检测过程约需1.5小时，一次实验最多可检测88份样品。
实施例5、灵敏度试验
选用3批试剂盒，用样品稀释液，100μl/孔，重复8孔，按照实施例3的试剂盒和实施例4的检测方法进行检测，计算其平均值(X)+3×标准差(SD)即为本试剂盒的检测灵敏度，以其中最大值作为本试剂盒的灵敏度。
表3灵敏度试验
试剂盒批次 平均值(X) 标准差(SD) X+3SD
1 1.17 0.080 1.41
2 1.05 0.079 1.29
3 1.18 0.045 1.31
经3次重复试验结果(表3)显示，本试剂盒的灵敏度为1.41ng/ml，但低于该灵敏度也可用本试剂盒检测出。
实施例6、特异性试验
选用BHK21细胞宿主蛋白、口蹄疫病毒O型抗原、口蹄疫病毒A型抗原、猪瘟病毒抗原，用试剂盒中的样品稀释液进行稀释，稀释为2μg/ml，按照实施例3的试剂盒和实施例4的检测方法进行检测，同时设置阴性质控孔(即仅加入样品稀释液)，检测结果显示，本试剂盒不与BHK21细胞宿主蛋白、口蹄疫病毒O型抗原、口蹄疫病毒A型抗原、猪瘟病毒抗原发生交叉反应，特异性为100％。
实施例7、本发明试剂盒及其检测方法与蔗糖密度梯度离心方法的比较
为了验证本发明专利检测结果的准确性与便捷性，现与蔗糖密度梯度离心方法进行比较试验。用本发明专利试剂盒和蔗糖密度梯度离心同时检测提供3份猪伪狂犬病毒灭活抗原样品。检测结果(表4)显示，两种检测方法符合率较高，用EXCEL进行拟合趋势线，其相关系数R2＝0.98。
表4本试剂盒与蔗糖密度梯度离心方法的比较试验结果
样品编号 本试剂盒(μg/ml) 蔗糖密度梯度离心(μg/ml)
1 4.0 3.9
2 7.6 6.4
3 5.4 4.8
同时，在操作便捷性方面，本试剂盒整个操作仅需1.5小时，最多可检测88份样品，且不需要昂贵的仪器设备，而蔗糖密度梯度离心方法则需要72小时，而每台超速离心机只能检测5份样品，影响疫苗生产过程的质量控制与监控。
实施例8、猪伪狂犬病毒抗原定量检测酶联免疫试剂盒的应用
用实施例3的试剂盒和实施例4的检测方法检测猪伪狂犬病毒在不同生产阶段中的样品(包括细胞培养液、病毒灭活液、病毒纯化液、浓缩液)、成品疫苗中的猪伪狂犬病毒抗原含量。
表5对猪伪狂犬病毒不同生产阶段的样品检测结果
编号 结果(μg/ml)
细胞培养液 5.69
灭活液 5.92
纯化液 4.32
成品疫苗 2.37
检测结果如上表所示，本试剂盒可检测不同生产阶段中的细胞培养液、病毒灭活液、病毒纯化液、浓缩液以及成品疫苗中的猪伪狂犬病毒抗原，表明该试剂盒可用于对猪伪狂犬疫苗生产的各个环节的质量控制和监测。
序列表
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒
<130> WHOI210011
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Trp Val Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn
20 25 30
Tyr Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Tyr Ile Val Asn Phe Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Val Asp Thr
50 55 60
Met Lys Gly Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg His Asn Leu Tyr Tyr Glu Asn Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Pro Ser Gln Asp Trp Asn Ser His
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr His Ala Asn Arg Pro Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Phe Cys Leu Gly Tyr Asp Asp Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Thr Val Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Gly Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys
20 25 30
Tyr Pro Ile Trp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Val Tyr Ile Met Asn Leu Gly Trp Ser Thr Thr Tyr Val Asn Pro Met
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Ser Ile Ser Arg His Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Val Arg Thr Asn Leu Asn Tyr Lys Asn Ile Leu Gly Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr His Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Pro Gly Asp Asp Trp Lys Ser Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Ser Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Glu Arg Pro Glu Asp Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Lys Asp Ile Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gly Tyr Asp Tyr Met Gly Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 5
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatgggtct tggtggaatc aggtggaaat ctggtgcaac caggtggtag cctcaagctc 60
tcctgcgctg catccggctt cactttcaac aactacccta tgtggtgggt cagacagact 120
ccagagaaga gattggaatg ggtcgcctac atcgtgaact tcggaggtag cacctcttac 180
gtggacacca tgaaaggcag gatttctatt tctagggata atgctaagaa cactctctat 240
ctccagatgt catcactgaa gtcagaggat actgcaatct attactgtgt tagacacaat 300
ttgtattacg aaaactactt cgatttctgg ggtcagggca ctactttgac agtgtcctct 360
gcccctagcg tgtttccctt ggctccctct tctaagtcca cctccggagg cactgctgcc 420
ttgggctgct tggttaagga ctactttcca gagcccgtga ctgtgtcctg gaactctggc 480
gctctcacct ctggcgtcca cacatttccc gctgtgctgc aatcctctgg cctctacagc 540
ctgtcatccg tcgtcacagt tccctcatcc tccctcggaa cacagactta catctgcaat 600
gtgaatcata agccatcaaa cactaaggtt gacaagaagg tggaacccaa atcctgcgac 660
aagacacaca cttgcccacc ctgtcccgca ccagaactct tgggtggtcc ctccgtcttt 720
ctcttcccac ccaagccaaa ggacaccctc atgatctcaa ggacacccga ggtcacatgt 780
gttgtcgttg atgtttccca cgaagatcca gaagttaagt tcaattggta tgttgatggt 840
gtcgaagtcc acaacgctaa gaccaagcca cgcgaagaac agtacaacag cacctaccgc 900
gtggtgtccg tgctcaccgt gctccatcag gattggctca atggaaagga gtacaagtgt 960
aaggttagca ataaggctct gcctgctcct atcgagaaga ctatcagcaa ggccaaaggc 1020
cagcctcgcg agccacaagt ctacactctc cctccttcca gagatgagct gaccaagaat 1080
caagtgtcac tcacatgtct ggtgaaggga ttctatccca gcgacattgc cgttgagtgg 1140
gaaagcaatg gccaaccaga gaataactac aagactactc ctcccgtgct ggacagcgac 1200
ggcagcttct tcctgtacag caagctgaca gtggacaaat cccgctggca gcaaggcaat 1260
gtgttcagct gctctgtcat gcatgaggcc ctgcacaacc actatacaca gaaatctctg 1320
tccctctcac ccggtaag 1338
<210> 6
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatcgtta tgactcaatc accctcctct atgtatgcct cattgggcga gcgcgtgaca 60
atgtcttgca aacccagcca ggactggaac tcccacctgt catggtacca gcagaagcct 120
ggcaagagcc ctaagactct gatctatcac gcaaataggc ccgtggatgg cgttccgacc 180
aggctctccg gttccggctc cggtcaggac tattcattga ctatctcctc tctggaatat 240
gaggatatgg gcatctattt ctgtctcggc tacgatgacc tgtggacctt cggaggcgga 300
actaaactgg agattaagag agcagctcca tcagtgaccc tgtttccacc ctcctcagag 360
gagttgcagg ccaacaaagc aaccctggtc tgtttgatct ccgacttcta cccaggagca 420
gtgacagtgg cttggaaagc tgatagcagc cctgtgaaag ccggtgtcga aaccactaca 480
ccctccaaac agtcaaacaa caagtacgct gcttcctcct acctgtccct cacacccgag 540
cagtggaagt cccatagatc ctattcctgc caggtgacac acgaaggttc tacagtggag 600
aagaccgtgg ctcccactga atgctca 627
<210> 7
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaatgtgtct tggtggaatc aggtggaaat ctggtgcaac caggtggtag cctcaagctc 60
tccggcgctg catccggctt cactttcaac aaatacccta tctggtgggt cagacagact 120
ccagagaata gattggaatg ggtcgcctac atcatgaacc tcggatggag caccacttac 180
gtgaacccca tgcaaggcag gatttctatt tctaggcaca atgctaagaa cactctctat 240
ctcaagatgt catcactgaa gtcagaggat actgcaatct atcactgtgt tagaaccaat 300
ttgaattaca aaaacatctt gggtttctgg ggtcagggca ctactttgac agtgtcctct 360
cctagcgtgt ttcccttggc tccctcttct aagtccacct ccggaggcac tgctgccttg 420
ggctgcttgg ttaaggacta ctttccagag cccgtgactg tgtcctggaa ctctggcgct 480
ctcacctctg gcgtccacac atttcccgct gtgctgcaat cctctggcct ctacagcctg 540
tcatccgtcg tcacagttcc ctcatcctcc ctcggaacac agacttacat ctgcaatgtg 600
aatcataagc catcaaacac taaggttgac aagaaggtgg aacccaaatc ctgcgacaag 660
acacacactt gcccaccctg tcccgcacca gaactcttgg gtggtccctc cgtctttctc 720
ttcccaccca agccaaagga caccctcatg atctcaagga cacccgaggt cacatgtgtt 780
gtcgttgatg tttcccacga agatccagaa gttaagttca attggtatgt tgatggtgtc 840
gaagtccaca acgctaagac caagccacgc gaagaacagt acaacagcac ctaccgcgtg 900
gtgtccgtgc tcaccgtgct ccatcaggat tggctcaatg gaaaggagta caagtgtaag 960
gttagcaata aggctctgcc tgctcctatc gagaagacta tcagcaaggc caaaggccag 1020
cctcgcgagc cacaagtcta cactctccct ccttccagag atgagctgac caagaatcaa 1080
gtgtcactca catgtctggt gaagggattc tatcccagcg acattgccgt tgagtgggaa 1140
agcaatggcc aaccagagaa taactacaag actactcctc ccgtgctgga cagcgacggc 1200
agcttcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaaatccc gctggcagca aggcaatgtg 1260
ttcagctgct ctgtcatgca tgaggccctg cacaaccact atacacagaa atctctgtcc 1320
ctctcacccg gtaag 1335
<210> 8
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacatcgtta tgactcactc accctcctct atgtatgcct cattgggcaa gcgcgtgaca 60
atgtcttgca aacccggcga cgactggaaa tcccaactgt catggtacca gcagaagcct 120
ggcaagagct ctaagactct gatctattac gcagaaaggc ccgaggatgg cgttccgacc 180
aggctctccg gttccggctc cggtagcgag tattcattga ctatctcctc tctggaatat 240
aaggatatcg gcatctattt ctgttcaggc tacgattaca tgggtacctt cggaggcgga 300
actaaactgg agattaagag agcagctcca tcagtgaccc tgtttccacc ctcctcagag 360
gagttgcagg ccaacaaagc aaccctggtc tgtttgatct ccgacttcta cccaggagca 420
gtgacagtgg cttggaaagc tgatagcagc cctgtgaaag ccggtgtcga aaccactaca 480
ccctccaaac agtcaaacaa caagtacgct gcttcctcct acctgtccct cacacccgag 540
cagtggaagt cccatagatc ctattcctgc caggtgacac acgaaggttc tacagtggag 600
aagaccgtgg ctcccactga atgctca 627

Claims (8)

1.一种特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒，包括可与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为用可与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合的单克隆抗体作为检测抗体制成的酶标抗体；
所述捕获抗体含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述PRV-Mc3-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32~36位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51~67位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第100~110位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24~34位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50~56位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89~96位氨基酸所示；
和；
所述检测抗体含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述PRV-Mc4-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第32~36位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第50~66位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第99~109位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第24~34位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第50~56位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第89~96位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述PRV-Mc3-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1~121位所示；所述PRV-Mc3-VL的氨基酸序列如序列表中SEQID No.2的第1~108位所示;
和；所述PRV-Mc4-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3的第1~120位所示；所述PRV-Mc4-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4的第1~108位所示。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述捕获抗体溶于100μl的 pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100ng~1000ng特异性单克隆抗体PRV-Mc3，2~8℃下放置8~12小时，使捕获抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2~3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％~1.2％（ml/ml）的Tween-20的0.01M，pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液。
6.权利要求1-5中任意一项所述的酶联免疫试剂盒在特异性定量检测猪伪狂犬病毒抗原中的应用，待测样品为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液或破乳后的成品疫苗。
7.一株单克隆抗体，其可与猪伪狂犬病毒抗原特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗体：
1）含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述PRV-Mc3-VH和所述PRV-Mc3-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述PRV-Mc3-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第32~36位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51~67位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第100~110位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24~34位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50~56位氨基酸所示；
所述PRV-Mc3-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第89~96位氨基酸所示；
2）含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL均由决定簇互补区和框架区组成；
所述PRV-Mc4-VH和所述PRV-Mc4-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述PRV-Mc4-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第32~36位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第50~66位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第99~109位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第24~34位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第50~56位氨基酸所示；
所述PRV-Mc4-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第89~96位氨基酸所示；
3）含有重链可变区PRV-Mc3-VH和轻链可变区PRV-Mc3-VL；所述PRV-Mc3-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1~121位所示；所述PRV-Mc3-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1~108位所示；
4）含有重链可变区PRV-Mc4-VH和轻链可变区PRV-Mc4-VL；所述PRV-Mc4-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3的第1~120位所示；所述PRV-Mc4-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4的第1~108位所示。
8.权利要求7所述的单克隆抗体在制备检测猪伪狂犬病毒抗原的试剂盒中的应用。
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