CN109320606B - 一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体7D7、含该单克隆抗体的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒及其应用。本发明提供抗体检测试剂盒具有高灵敏度，并可明显增宽检测的线性范围；检测时不受动物种属限制，适用于偶蹄类动物口蹄疫疾病的大规模筛查。含单克隆抗体7D7的偶联物制备的疫苗，可去除非结构蛋白，免疫动物后可避免FMDV非结构蛋白抗体的干扰，从而准确区分感染动物和免疫动物。

Description

一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体及含该单克隆抗体的检测试剂盒等应用，属于生物医药领域。
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot andMouthDisease Virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染的烈性传染病。该病可感染70余种家畜和野生动物，以牛、羊、猪为主，感染发病率高达100％，易出现发热、跛行和在皮肤及其黏膜上出现泡状斑疹等症状，特别地成年易感动物死亡率为5％～20％，幼畜的死亡率为50％～80％。该病一旦爆发则迅速传播，作为国际兽医局OIE及我国认定的必需通报的烈性传染病，已经对世界各国造成了巨大的经济损失。鉴于我国防治该病的主要措施是实行免疫接种，对牛、羊、猪等易感畜群每年定期注苗2-3次。因此，在检测和防治该病的发生、活畜检疫等方面，迫切需要建立准确、快捷的区分自然感染动物和免疫动物的诊断方法，特别地，鉴别免疫动物和自然感染动物也是OIE判定一个国家有无口蹄疫流行的依据之一。
近年来，中国、英、美、荷兰等各国学者对口蹄疫病毒的非结构蛋白(Non-Structural Protein，Nsp)2C、3A、3B、3ABC等片段作了大量细致的研究，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，是目前研究较多的不依赖于血清型的感染状况检测评估的方法。ELISA中HRP酶通过催化反应催化TMB底物使其发生颜色变化，并采用比色法检测样本中抗体的含量，而显色方法易受环境和底物等因素影响，且不同试剂盒采用的非结构蛋白的不同，所检测的灵敏度和特异性均有差异，检测范围较窄，易造成假阴性。
特别地，目前主要是通过接种灭活疫苗以控制该病的流行，而口蹄疫属于烈性传染病，对于该病的防治采用强制免疫和发现后全部动物宰杀的措施，因此在生产中区分免疫动物和自然感染动物显得尤其关键。但灭活疫苗仅用过滤工艺技术去除有限的细胞碎片故而纯化不彻底，导致免疫后机体产生非结构蛋白抗体，对鉴别免疫动物和自然感染动物造成干扰。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可用于制备口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒。
本发明涉及一种特异性结合口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体7D7的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段。
本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体7D7，包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质，以及用于对口蹄疫病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明含单克隆抗体7D7的抗体检测试剂盒，具有高灵敏度，可明显增宽检测的线性范围；检测时可不受动物种属限制，适用于偶蹄类动物口蹄疫疾病的大规模筛查，为尽早开展疫病防控工作奠定基础。
本发明还涉及含所述单克隆抗体7D7的偶联物，其中，所述单克隆抗体7D7偶联物为其绵羊红细胞偶联物或其琼脂糖凝胶偶联物。
本发明还涉及使用所述单克隆抗体7D7偶联物制备抗口蹄疫疫苗组合物的方法，该方法能使用单克隆抗体7D7的偶联物以及重复回收的单克隆抗体7D7的偶联物制备不含有非结构蛋白成分的疫苗组合物。
本发明还涉及使用所述方法制备的抗口蹄疫疫苗组合物，通过单克隆抗体7D7偶联物间接制备的疫苗，能去除其中的非结构蛋白组分，减少非特异反应，从而制备出不含有非结构蛋白成分的抗原，以利于区分免疫动物和自然感染动物。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猪圆环病毒2型特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明涉及一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体7D7的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种由所述单克隆抗体7D7可变区序列组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合口蹄疫病毒非结构蛋白的能力。
本发明的单克隆抗体7D7可变区(重链可变区和轻链可变区)能特异性结合口蹄疫病毒3ABC蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体7D7，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
所述单克隆抗体7D7为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体7D7，为IgG抗体，相对亲和力大于5.0ng/ml，与口蹄疫病毒非结构蛋白反应性良好。
术语“口蹄疫病毒抗原”是指以口蹄疫病毒非结构蛋白制备的抗原。
术语“鲁米诺化学发光体系”包括发光底物1：含1.0～6.8×10-3mol/L过氧化氢的Tris-HCl缓冲液(0.05～0.5mol/L，pH值8.5)，和发光底物2(避光)：含1.2～9.5×10-4mol/L鲁米诺和1.5～5.5×10-4mol/L对碘苯酚的Tris-HCl缓冲液(0.05～0.5mol/L，pH值8.5)。
术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖甘酶。
术语“金属离子”包括但不限于金、银。
本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括所述单克隆抗体7D7，包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质，以及用于对口蹄疫病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述单克隆抗体7D7使用酶标记或金属离子标记，所述检测试剂为鲁米诺化学发光体系，所述阳性对照为口蹄疫病毒抗原的高免血清，所述阴性对照为无口蹄疫抗体的猪血清。
本发明的口蹄疫病毒抗体检测试剂盒能特异性结合口蹄疫病毒非结构蛋白，不受表面抗原位点发生变异的影响，保证了试剂盒的广谱性检测范围；本发明的试剂盒检测线性范围广，能较商业试剂盒提早一至两天发现感染动物，有利于病情的及早诊断。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有0.2～10μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
作为本发明的一种实施方式，本发明的检测试剂盒中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有2.0μg/ml FMDV 3ABC的支持介质。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中所述酶标记单克隆抗体7D7含量为1-6μg/ml；所述金属离子标记为金标记，所述金标记单克隆抗体7D7含量为3-10μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述口蹄疫病毒抗原抗体反应的支持介质为微滴定板。
本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括酶标剂记的所述单克隆抗体7D7，包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质，以及用于对口蹄疫病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述检测试剂为所述标记的酶的底物和显色剂，所述阳性对照为口蹄疫病毒抗原的高免血清，所述阴性对照为无口蹄疫抗体的猪血清。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有0.2～10μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有2.0μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述酶标记的单克隆抗体7D7含量为2.0-8.0μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述口蹄疫病毒抗原抗体反应的支持介质为微滴定板。本发明还涉及所述抗体检测试剂盒检测样品中口蹄疫病毒的方法，所述方法：步骤1)将检测样品与标记的所述抗体或所述抗体片段共同加入包被口蹄疫病毒抗原的检测孔，步骤2)检测标记的所述抗体或所述抗体片段与检测样品中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体共同竞争结合包被的抗原；其中，所述步骤1)、2)中的标记为酶标记或金属离子标记，所述抗体或所述抗体片段为所述单克隆抗体7D7；其中，所述步骤1)中抗原附着在支持介质上，所述支持介质优选为微滴定板。
本发明的阻断法能特异检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体，对不同种类的偶蹄类动物均能有效检测，与商业试剂盒相比，检测线性范围宽，对感染阳性动物能提前一至两天检出，因此能更有效地鉴别诊断阳性感染动物。
本发明还涉及一种单克隆抗体7D7偶联物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤1A)无菌采集绵羊红细胞后，醛化红细胞，步骤2A)鞣化已醛化后的红细胞，步骤3A)将所述单克隆抗体7D7与已鞣化醛化后的红细胞，形成绵羊红细胞抗体偶联物；优选地，所述步骤1A)中所述醛化为双醛法。
作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体7D7红细胞偶联物的制备方法中，所述步骤3A)中所述单克隆抗体7D7的含量为0.2-0.8mg/ml。
本发明还涉及一种单克隆抗体7D7偶联物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤1B)环氧氯丙烷、NaBH4活化琼脂糖凝胶，洗涤所述活化的琼脂糖凝胶，去除环氧氯丙烷；步骤2B)将所述单克隆抗体7D7与已活化的琼脂糖凝胶反应，离心取沉淀重悬后的悬液即为琼脂糖凝胶抗体偶联物。
作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体7D7琼脂糖凝胶偶联物的制备方法中，所述步骤2B)中所述单克隆抗体7D7的含量为0.5-1.0mg/ml。
本发明制备的单克隆抗体7D7的两种偶联物能够处理重复再生，并能用于或其再生的偶联物能用于制备不含有非结构蛋白成分的口蹄疫灭活疫苗。
本发明还涉及所述制备方法制备的单克隆抗体7D7偶联物，其中，所述绵羊红细胞抗体偶联物中所述单克隆抗体7D7含量为0.2-0.8mg/ml，或所述琼脂糖凝胶抗体偶联物中所述单克隆抗体7D7含量为0.5-1.0mg/ml。
本发明还涉及一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤(1)制备口蹄疫O型灭活抗原，所述口蹄疫O型灭活抗原含量为4.2mg/l 146S抗原；步骤(2)将10ml所述的绵羊红细胞抗体偶联物加入1000ml所述步骤(1)制备的O型灭活抗原，充分摇震混合，室温连续搅拌作用1～5小时，离心，收集上清，即为去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原；以及步骤(3)将所述步骤(2)制备的去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原加入佐剂，混匀。
本发明还涉及一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤(1)制备口蹄疫O型灭活抗原，所述口蹄疫O型灭活抗原含量为4.2mg/l 146S抗原；步骤(2)将10ml所述的琼脂糖凝胶抗体偶联物入1000ml所述步骤(1)制备的O型灭活抗原，充分摇震混合，室温连续搅拌作用1～5小时，期间摇震3次，过100目滤网，收集滤液，即为去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原；以及步骤(3)将所述步骤(2)制备的去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原加入佐剂，混匀。本发明还涉及所述制备方法制备的疫苗组合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中所含佐剂为ISA206佐剂；所述佐剂含量为50％。
本发明的疫苗组合物不含有口蹄疫病毒的非结构蛋白，重复免疫8次后血清中仍检测不到其抗体的存在，因此，通过免疫本发明的疫苗组合物能够有效区分免疫动物和自然感染动物，有利于在田间快速鉴定、判断动物感染情况。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物中所含佐剂为ISA206佐剂，所述佐剂含量为50％。
本发明还涉及所述偶联物在制备预防和/或治疗口蹄疫的药物中的应用。本发明所述单克隆抗体7D7的偶联物能用于制备不含非结构蛋白成分的灭活疫苗。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO40.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及检验
1.1FMDV非结构蛋白的制备及鉴定
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的口蹄疫病毒(登录号为DQ478936.1)中3ABC蛋白的基因序列设计引物对上游引物1：5-AGCAGATCTCAATTCCTTCCCAAAAATCTG-3’，下游引物1：5’-AATCACTCGTGGTGCGGTTCGGGGTC-3’。按曹轶梅(曹轶梅，刘在新，卢曾军等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达.畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118)所述方法，采用RT-PCR扩增3ABC基因，用设计的引物对病毒RNA反转录的cDNA进行PCR扩增，经1％的琼脂糖凝胶电泳检测发现：产生了约1.3Kb条带，与预期相符。
将FMDV 3ABC基因克隆后的序列作为模板，于FMDV Nsp5’端加入Bgl II和Nde I、3’端引物加入终止密码子TAA和Sal I位点。设计上游引物2：5'-AGA TCT CAT ATG GGA CCCTAC GTC GG-3'，下游引物2：5'-GTC GAC TTA CTC TTG CTG TGG TAG CTG-3'，按曹轶梅所述方法用RT-PCR扩增Nsp基因。利用设计引物中的酶切位点，将PCR产物与pGEX-T-Easy载体进行酶切后连接，转化到大肠杆菌，用设计引物对连接产物转化的菌落进行PCR扩增鉴定，证实成功的构建了Nsp基因与pGEX-4T-1载体的重组质粒。
之后对构建成功的重组质粒转化、扩增、进行IPTG诱导表达蛋白，蛋白处理后经SDS-PAGE检测，表达的FMDV 3ABC为28.5KD。将其用离子层析方法纯化后用BCA蛋白定量，浓度为1.25mg/ml。
1.2FMDV非结构蛋白单克隆抗体7D7的制备及鉴定
将实施例1.1制备的FMDV 3ABC作为免疫原与弗氏佐剂乳化，并按终含量0.5mg/ml、300μl/只免疫6-8周龄BALB/c小鼠。免疫3次后，对小鼠进行采血并用间接ELISA方法(将实施例1.1制备的FMDV3ABC作为包被原包被于反应板)检测小鼠血清的ELISA效价，同时将购买的GST蛋白包被于反应板作为对照。将FMDV 3ABC作为包被原筛选的ELISA效价达1:12800、而购自于Sigma公司的GST蛋白作为包被原筛选ELISA为阴性的小鼠进行融合及亚克隆筛选，获得1株杂交瘤细胞，其分泌产生抗FMDV 3ABC的单克隆抗体7D7，将其注入小鼠腹腔，制备腹水并纯化，纯化后用BCA蛋白定量试剂盒(购自Pierce公司)按照说明书对单克隆抗体7D7进行定量分析，结果：单克隆抗体7D7的蛋白含量为3.75mg/ml。
1.3单克隆抗体7D7的鉴定
用单克隆抗体亚型ELISA鉴定试剂盒(购自Thermo公司)检测单克隆抗体7D7类型和亚类的鉴定，结果：单克隆抗体7D7的亚类为IgG2a，轻链为kappa链。
将单克隆抗体7D7按照宋帅等(宋帅，林彤，邵军军，常惠芸.抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学，2009,25(4):333-335)文中的操作方法测定其相对亲和力。其中FMDV 3ABC的包被浓度为2μg/ml，酶标二抗的稀释度为1:10000，测定纯化后的单克隆抗体7D7的相对亲和力。结果：单克隆抗体7D7的相对亲和力为7.63ng/ml。
1.4单克隆抗体7D7特异性的鉴定
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的口蹄疫病毒(登录号为DQ478936.1)中结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4蛋白氨基酸序列合成蛋白，将其包被于滴定板，同时将实施例1.1制备的FMDV 3ABC包被于滴定板，加入稀释后7D7，37℃孵育60min，洗板后加入酶标羊抗鼠IgG按1︰10000浓度稀释，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，终止后OD450的吸光值读数。检测结果：结构蛋白包被的滴定板吸光值很低，与空白对照值相近，而非结构蛋白包被滴定板吸光值高，表明7D7仅与口蹄疫病毒非结构蛋白发生作用，而不与口蹄疫病毒结构蛋白结合。
将单克隆抗体7D7加入猪圆环病毒SH株、猪瘟病毒CSFV C株、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV JXA1-R株、猪伪狂犬病病毒PRVBartha K-61株、猪细小病毒PPV WH-1株感染的细胞，固定后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗，置荧光显微镜观察，以测定单克隆抗体7D7与PCV、CSFV、PRRSV、PRV、PPV是否具有交叉反应性。结果：单克隆抗体7D7与PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV接种细胞均未出现特异性荧光，无交叉反应。
以上结果表明：单克隆抗体7D7仅与口蹄疫病毒非结构蛋白作用，而不与口蹄疫病毒结构蛋白以及其它病毒反应，特异性良好。
1.5单克隆抗体7D7可变区序列的测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-ATTCGAGCTCATTCCGAACG-3’
P2：5’-AGCTTCAGGCTACGCGTAAC-3’
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-CTAGGCAATTGCGACTACT-3’
P4：5’-ATGCATTGCCGATCTACCG-3’
按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志,2001,15(2):65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体7D7的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。测定单克隆抗体7D7的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4。
1.6酶标记单克隆抗体7D7的制备
以改良过碘酸钠法标记单抗。先用过碘酸钠处理HRP，再用0.2mol/L碳酸盐缓冲液于2-8℃透析，测定OD280nm并计算蛋白含量，按抗体与HRP1︰1的质量比进行标记反应，产物用Sephacyl S-200柱层析纯化。使用0.22μm过滤器过滤，4℃以4000g离心30分种，重悬沉淀即为酶标抗体，经BCA测定酶标抗体定量分析，结果：含量为1.8mg/ml，ELISA检测酶标抗体效价>1:12800。-20℃冻存备用。
1.7金标单克隆抗体7D7的制备
制备胶体金和金标抗体：100mL 0.01％四氯金酸溶液加热至沸，添加1％柠檬酸钠溶液2mL，搅拌混均后反应10分钟，继续搅拌使之冷却至室温，吸取0.5mL制备好的胶体金溶液于离心管中，用0.1mol/LK2CO3调pH至8.5，加入抗体7D7溶液30μL，5分钟后加入0.1mL10％NaCl，静置2h，调pH至8.5，搅拌均匀反应10分钟后，3000r/min4℃离心30分钟弃沉淀，上清在4℃12000g条件下离心45分钟，弃上清，沉淀溶于2mL的含终浓度为1％牛血清白蛋白的PBS中，即为金标抗体，经BCA测定酶标抗体定量分析，结果：含量为2.4mg/ml，ELISA检测金标抗体效价>1:128000。2-8℃保存备用。
实施例2口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒的制备及应用
2.1试剂盒的制备
包被板：将实施例1.1制备的FMDV 3ABC用CB缓冲液(0.02mol/L，pH值9.6)稀释至2.0μg/ml，2～8℃包被过夜，弃包被液后按200μl/孔加入含20％小牛血清的PB溶液(0.02mol/L，pH值7.4)于37℃封闭2小时，弃去封闭液后干燥、封装。
酶标试剂：将实施例1.6制备的酶标单克隆抗体7D7使用样品稀释液进行稀释，选择代表性浓度阐述试剂盒中酶标试剂的浓度范围，见表1。
金标试剂：将实施例1.7制备的金标单克隆抗体7D7使用样品稀释液进行稀释，选择代表性浓度阐述试剂盒中酶标试剂的浓度范围，见表1。
样品稀释液：磷酸盐缓冲液。
浓缩洗涤液：含0.5％吐温-20×磷酸盐缓冲液。
鲁米诺化学发光体系：发光底物1(含3.0×10-3mol/L过氧化氢的Tris-HCl缓冲液(0.15mol/L，pH值8.5))和发光底物2(避光)：含7.0×10-4mol/L鲁米诺和3.0×10-4mol/L对碘苯酚的Tris-HCl缓冲液(0.15mol/L，pH值8.5)。
阴性对照：无口蹄疫抗体的猪血清。
阳性对照：以实施例1中制备的FMDV抗原作为免疫原，免疫无口蹄疫病毒的兔制备的高免血清。
将包被板、酶标试剂、样品稀释液、浓缩洗涤液、鲁米诺化学发光体系、阳性对照、阴性对照进行组装以制备成试剂盒1A-1D，2-8℃保存。
将包被板、金标试剂、样品稀释液、浓缩洗涤液、鲁米诺化学发光体系、阳性对照、阴性对照进行组装以制备成试剂盒2A-2D，2-8℃保存。
将包被板、酶标试剂、样品稀释液、浓缩洗涤液、ELISA用显色液(含A液与B液)、终止液、阴性对照、阳性对照，其中显色液A含TMB 20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO4 2.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；所述终止液为2M的H2SO4。组装，以制备成试剂盒3A-3D，2-8℃保存。
表1试剂盒中标记试剂浓度
Figure BDA0001366846070000141
2.2方法
检测方法：(1)采样及处理采集偶蹄动物的血液，37℃放置1小时后，转至2～8℃冰箱中过夜，第二天离心取上清即为血清样品；(2)编号及加样根据检测血清的数量进行编号排列，分别在相应孔中加入样品稀释液50μl，然后加入待测血清样品或阴性对照、阳性对照各50μl，轻轻震荡混匀；(3)样品孵育用封板膜封板后置37℃温育0.5～2小时；(4)样品洗涤按3min/遍，用样品洗涤液洗3～5遍后，最后一次尽量甩干；(5)加酶标试剂或金标试剂按100μl/孔加入酶标试剂或金标试剂，同时做空白对照；(6)贴上封板膜，于37℃孵育0.5～1小时；(7)洗涤同(4)；(8)加鲁米诺化学发光体系(每孔加入发光底物1、2各50μl/孔)，反应10分钟内用化学发光检测仪检测各孔的发光强度，记录RLU值；或加显色液A与B，于室温孵育10～15分钟后用终止液进行终止，经酶标仪扫描后计算结果并进行判断。
按以下公式：
试剂盒1A-1D阻断率＝(NC均值×0.6-样品RLU值)/(NC均值×0.6)×100％，计算样品抗体阻断率。
试剂盒2A-2D阻断率＝(NC均值×0.5-样品RLU值)/(NC均值×0.5)×100％，计算样品抗体阻断率。
试剂盒3A-3D阻断率＝(NC均值-样品RLU值)/(NC均值)×100％，计算样品抗体阻断率。
根据阳性血清与阴性血清的检测结果，确定牛、羊与猪血清非结构蛋白抗体阴、阳性判定标准为：若阻断率＜25％则口蹄疫病毒感染为阴性；若阻断率≥40％则口蹄疫病毒感染为阳性，表明该动物自然感染口蹄疫病毒；25％≤阻断率＜40％，提示该动物可能感染口蹄疫病毒。
2.2.1试剂盒包被浓度及标记试剂范围的选择
包被浓度的优化：按照表2进行5种抗原浓度的包被，分别用3份阳性样品和1份阴性样品进行检测，对阳性样品P和阴性样品N计算和筛选。
表2抗原包被浓度筛选
Figure BDA0001366846070000151
根据统计学结果N/P值＞3.0的可以用于阻断法建立，选择N/P值在其范围的抗原包被浓度范围为0.2-10μg/ml，取最高的N/P值的、2μg/ml包被浓度进行相关实施例研究。
标记试剂范围的选择：将阳性血清按表3进行倍比稀释，用试剂盒1A-1D、2A-2D、3A-3D按实施例2.2所述方法进行检测及判定，并经荷兰Ceditest试剂盒、OIE推荐的酶联免疫电转移印迹试验EITB鉴定，结果见表3。
表3不同试剂盒检测阳性血清不同稀释倍数结果汇总
Figure BDA0001366846070000161
注：+表示阳性，-表示阴性，±表示可疑。
由表3可知：试剂盒1A、1D、2A、2D、3A、3D检测阳性血清1/8-1/128稀释样品，与荷兰Ceditest试剂盒、EITB鉴定结果总体一致性均较差；而化学发光试剂盒中一抗为酶标试剂时其范围在1.0-6.0μg/ml时(如试剂盒1B、1C)效果较好，与EITB检测结果一致性高，且优于Ceditest试剂盒；化学发光试剂盒中一抗为金标试剂时其范围在3.0-10μg/ml时(如试剂盒2B、2C)效果较好，与EITB一致性高且优于Ceditest试剂盒；ELISA试剂盒中一抗为酶标试剂时其范围在2.0-8.0μg/ml时(如试剂盒3B、3C)效果较好，与Ceditest试剂盒的检测结果相当，与EITB一致性较好。
表明：ELISA试剂盒与商品化试剂盒的检测效果相当，与OIE推荐的EITB一致性较高；另外，无论是ELISA试剂盒还是化学发光试剂盒，只有将单克隆抗体7D7设定在一定范围内才能减少假阴性、假阳性从而得出较为准确的检测结果，从而真实地区分感染动物和免疫动物，为大规模筛查和早期预防提供可靠的保障。
另从成本角度考虑用试剂盒1B、2B、3B用于后续评价。
2.3试剂盒1B、2B、3B的特性
2.3.1试剂盒1B、2B、3B的敏感性
已知同一猪感染FMDV-O型病毒前后的血清，用实施例2.1制备的试剂盒1B、2B、3B和荷兰Ceditest公司的口蹄疫NS(3ABC)检测试剂盒分别对血清样品进行检测，结果见表4。由表4可知：试剂盒3B较荷兰Ceditest试剂盒早1-2天、试剂盒1B与2B较荷兰Ceditest试剂盒早2-3天检出，且检测为阳性结果的持续升高的时间长，表明试剂盒1B、2B、3B均具有灵敏度高、检测线性范围宽的优势，也即检测鉴定自阳性结果开始持续时间长。
表4试剂盒1B、2B、3B与市售试剂盒敏感性比较
Figure BDA0001366846070000171
注：+表示阳性，-表示阴性。
因为口蹄疫是一种急性、热性、高度接触性传染病，潜伏期只有2～4天，最长也仅达1周，因此，对于口蹄疫感染的能及时早期检测诊断至关重要，本发明的试剂盒3B较商品化试剂盒早1-2天检出，试剂盒1B、2B较商品化试剂盒2-3天检出对于临床上及时、准确的确诊口蹄疫感染具有重要意义。
2.3.2试剂盒1B、2B、3B特异性及符合率
采集非免疫健康动物及感染动物血清并用试剂盒1B、2B、3B分别检测，以检测阴性血清数与总健康血清数的比值计算特异性，以检测阳性血清数与感染动物血清总数的比值计算敏感性，结果见表5。由表5可知：试剂盒1B和2B对68份来自感染后3-20天牛血清的检测敏感性为95％以上，而酶免法3B试剂盒敏感性略有下降，同样的结果出现在对感染后12天至29天的54份羊血清的检测和对72份感染后10天-27天的猪血清的检测，说明化学发光法能增加试剂盒的敏感性。对来自健康牛、羊与猪血清的特异性均在95％以上。
表5试剂盒1B、2B、3B特异性及敏感性检测结果
Figure BDA0001366846070000181
2.4试剂盒1B、2B、3B的应用
2.4.1牛血清样品检测
用实施例2.1制备的抗体检测试剂盒1B与荷兰Ceditest公司的口蹄疫NS(3ABC)检测试剂盒和国产兰兽研口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒，分别检测125份口蹄疫O型灭活疫苗免疫牛血清样本，142份健康牛血清样本，采集感染口蹄疫O型病毒的临床血清样本68份；用实施例2.1制备的抗体检测试剂盒2B与荷兰Ceditest公司的口蹄疫NS(3ABC)检测试剂盒和国产兰兽研口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒，分别检测142份健康牛血清样本、感染口蹄疫O型病毒的68份临床牛血清样本、125份口蹄疫O型灭活疫苗免疫牛血清样本。
结果见表6：用实施例2.1制备的试剂盒1B、2B、3B与OIE推荐的EITB检测方法的符合率均在97％以上；对感染口蹄疫O型病毒牛的68份血清，使用3种试剂盒进行检测，与EITB检测方法检测的阳性血清数量相近，比市售的试剂盒检测出更多的阳性临床血清，说明在临床血清样品的检测中与EITB有很好的一致性，能够快速准确的检测到感染的动物，起到预警作用。
表6试剂盒1B、2B、3B与市售两种试剂盒检测牛血清的结果比较
Figure BDA0001366846070000191
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
2.4.2羊血清样品检测
用实施例2.1制备的抗体检测试剂盒1B、2B、3B与OIE推荐的EITB检测方法、进口荷兰Ceditest公司的口蹄疫NS(3ABC)检测试剂盒和国产兰兽研口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒，分别检测151份健康羊血清样本，感染口蹄疫O型的55份临床羊血清样本，127份口蹄疫O型灭活疫苗免疫羊血清样本。
结果见表7：用实施例2.1制备的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒与EITB方法的符合率均在97％以上，对感染的55份临床血清1B、2B、3B与EITB检测方法检测阳性血清数量相近，符合率高，比荷兰Ceditest和兰兽研的试剂盒检测的阳性血清数量多，说明在临床样品的检测中与EITB有很好的符合率，能够快速准确的检测到感染的动物，起到预警作用。
表7试剂盒1B、2B、3B与市售两种试剂盒及EITB检测羊血清的结果比较
Figure BDA0001366846070000201
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
2.4.3猪血清样品检测
用实施例2.1制备的抗体检测试剂盒1B、2B、3B与OIE推荐的EITB检测方法、进口荷兰Ceditest公司的口蹄疫NS(3ABC)检测试剂盒和国产兰兽研口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒，分别检测163份健康猪血清样本、感染口蹄疫O型的72份临床猪血清样本、136份口蹄疫O型灭活疫苗免疫猪血清样本。
结果见表8：用实施例2.1制备的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒与OIE推荐的EITB检测方法的符合率在97％以上；对感染口蹄疫O型病毒的72份猪血清，使用3种试剂盒较市售的试剂盒检测阳性率高，与EITB检测方法检测阳性血清数量相近，说明在临床样品的检测中与金标准EITB有很好的符合率，能够快速准确的检测到感染的动物，起到预警作用。
表8试剂盒1B、2B与市售两种试剂盒检测猪血清的结果比较
Figure BDA0001366846070000202
综上所述，在不同的种类的偶蹄类动物中，含单克隆抗体7D7的抗体ELISA试剂盒、化学发光试剂盒能较好区分自然感染和疫苗免疫的动物，且化学发光试剂盒灵敏度高、检测线性范围宽，与市售的的商品化试剂盒符合率均>97％，适用于我国偶蹄类动物口蹄疫疫病的大规模检测，为开展疫病防控工作奠定基础。
实施例3无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的制备及应用
3.1单克隆抗体7D7偶联物的制备
绵羊红细胞抗体偶联物的制备：无菌采集绵羊红细胞时加等量阿氏液和适量抗生素，按红细胞悬液1份，用10倍体积的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)将红细胞洗4-5遍，配制成8％红细胞悬液；醛化红细胞，1份红细胞悬液、等量的3％丙酮醛液于室温下缓慢搅拌17小时后用磷酸缓冲液洗4-5遍，配制成8％红细胞悬液即为醛化红细胞悬液，重复该步骤，即得到双醛化红细胞悬液；获得鞣化的醛化红细胞，将已醛化的红细胞悬液用磷酸缓冲液洗4-5遍配成2.5％悬液1份、用现配的1:200，000鞣酸1份混合，37℃水浴反应15分钟，用磷酸缓冲液洗1遍后配成2％红细胞悬液；制备绵羊红细胞偶联物，取2％鞣化的红细胞1ml，离心沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于10ml醋酸缓冲液(0.1mol/L、pH3.5～4.0)中，加入终浓度分别为0.1、0.2、0.8和1.0mg/ml的单克隆抗体7D7(见表9)，置37℃水浴中作用2～4小时，每15～20分钟用吸管轻轻吹吸混合2～3次，用磷酸缓冲液洗4-5遍，离心，再将沉淀红细胞用1％灭活兔血清的生理盐水10ml配成0.8％的红细胞悬液，即为绵羊红细胞抗体偶联物，分别标记为1～4。
琼脂糖凝胶抗体偶联物：取5g滤去水的琼脂糖凝胶，加入7.5mLNaOH(0.8mol/L)、2mL环氧氯丙烷、10mg NaBH4，于25℃摇床上反应8小时。用大量的水洗涤活化凝胶，真空抽去残存的环氧氯丙烷，然后分别加入4、5、10和12mg的单克隆抗体7D7，25℃摇床上反应6小时，3000rpm离心取沉淀，沉淀用10ml的PBS重悬，即为琼脂糖凝胶抗体偶联物，分别标记为5～8，浓度见表9。
表9偶联物中所含单克隆抗体7D7终浓度
Figure BDA0001366846070000221
3.2疫苗的制备
分别将10ml实施例3.1制备的绵羊红细胞抗体偶联物1#-4#加入1000ml O型灭活抗原(含146S量为4.2mg)，充分摇震混合，室温连续搅拌作用1～5小时，以3000rpm的速度离心10min，收集上清，按1:1V/V的比例加入ISA206佐剂，搅拌均匀即为疫苗1-4。
分别将10ml实施例3.1制备的琼脂糖凝胶抗体偶联物5#-8#加入1000ml O型灭活抗原(含146S量为4.2mg)，充分摇震混合，室温作用1～5小时，期间摇震3次，过100目滤网，收集滤液，按1:1V/V(ISA206)的比例加入ISA206佐剂，搅拌均匀即为疫苗5-8。
将O型灭活抗原与ISA206佐剂按1:1V/V混匀，即为疫苗9，作为对照组。
3.3疫苗的应用
将经荷兰Ceditest试剂盒鉴定为阴性的45头猪随机分为9组，5头/组，间隔14天于后腿肌肉免疫实施例3.2制备的疫苗1-9，共免疫2次，每次1ml，每次免疫前均采集血清，该血清用荷兰Ceditest试剂盒检测FMDV非结构蛋白抗体；2免疫后每隔14天进行采血进行监测，结果见表10。
表10疫苗免疫方法及检测结果
Figure BDA0001366846070000231
注：+表示阳性，-表示阴性，±表示可疑。
由表10可知：经过疫苗1-9免疫动物1～2次前检测均未在血清中检测到FMDV非结构蛋白抗体，而疫苗1、4、5、8、9两次免疫后的动物第14～448天均在血清中检测到FMDV非结构蛋白抗体，而疫苗2、3、6、7未出现此情况。用常规灭活疫苗免疫动物3～5次，用非结构蛋白ELISA抗体加测能检测到群体动物血清中有相应的抗体，究其原因是与普通纯化疫苗多次重复免疫后会产生痕量的Nsps蛋白有关，而用本方法获得的疫苗2、3、6、7两次免疫动物后持续检测两免后第14～448天均未检测到非结构蛋白抗体。这不仅证明了本发明的疫苗组合物能将其中含有的非结构蛋白去除干净，还证明了含单克隆抗体7D7的偶联物只有在一定范围内才能将灭活抗原中的非结构成分去除，并不引起非特异性等反应，且制备成疫苗免疫后可彻底避免FMDV非结构蛋白抗体的干扰，利于检测时区分免疫动物和自然感染动物。
另外，含有单克隆抗体7D7的偶联物制备抗口蹄疫疫苗组合物的方法能使用单克隆抗体7D7的偶联物以及重复回收单克隆抗体7D7的偶联物制备不含有非结构蛋白成分的疫苗组合物。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
<120> 一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 小鼠杂交瘤细胞
<400> 1
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cctgtacatg gcctggaatg gattggagct attcatccag gaagtggtgg tactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagtctac 240
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<212> PRT
<213> 小鼠杂交瘤细胞
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Asp Gly Arg Ser Ala Met His
100 105 110

Claims (24)

1.一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链可变区如SEQ ID No.2所示，轻链可变区如SEQ ID No.4所示；所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；所述抗体或所述抗体片段仍保持特异性结合口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的能力。
2.根据权利要求1所述抗体或抗体片段，其中，所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述抗体或抗体片段，其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体。
4.一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括权利要求2所述的单克隆抗体，包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质，以及用于对口蹄疫病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述单克隆抗体使用酶标记或金属离子标记，所述检测试剂为鲁米诺化学发光体系，所述阳性对照为口蹄疫病毒抗原的高免血清，所述阴性对照为无口蹄疫抗体的猪血清。
5.根据权利要求4所述抗体检测试剂盒，其中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有0.2～10μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
6.根据权利要求4所述抗体检测试剂盒，其中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有2.0μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
7.根据权利要求4所述抗体检测试剂盒，其中，所述金属离子标记为金标记，所述金标记单克隆抗体含量为3-10μg/ml；或所述酶标记单克隆抗体含量为1-6μg/ml。
8.根据权利要求4所述抗体检测试剂盒，其中，所述口蹄疫病毒抗原抗体反应的支持介质为微滴定板。
9.一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括酶标记的权利要求2所述的单克隆抗体，包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质，以及用于对口蹄疫病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中，所述检测试剂为所述标记的酶的底物和显色剂，所述阳性对照为口蹄疫病毒抗原的高免血清，所述阴性对照为无口蹄疫抗体的猪血清。
10.根据权利要求9所述抗体检测试剂盒，其中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有0.2～10μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
11.根据权利要求9所述抗体检测试剂盒，其中，所述包被有口蹄疫病毒抗原的支持介质为包被有2.0μg/ml FMDV 3ABC蛋白的支持介质。
12.根据权利要求9所述抗体检测试剂盒，其中，所述酶标记的单克隆抗体含量为2.0-8.0μg/ml。
13.根据权利要求9所述抗体检测试剂盒，其中，所述口蹄疫病毒抗原抗体反应的支持介质为微滴定板。
14.一种单克隆抗体偶联物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤1A）无菌采集绵羊红细胞后，醛化红细胞，步骤2A）鞣化已醛化后的红细胞，步骤3A）将权利要求2所述的单克隆抗体与已鞣化醛化后的红细胞反应，形成绵羊红细胞抗体偶联物。
15.根据权利要求14所述制备方法，其中，所述步骤1A）中所述醛化为双醛法。
16.根据权利要求14所述制备方法，其中，所述步骤3A）中所述单克隆抗体的含量为0.2-0.8mg/ml。
17.根据权利要求14~16任一项所述制备方法制备的单克隆抗体偶联物，其中，所述绵羊红细胞抗体偶联物中所述单克隆抗体含量为0.2-0.8mg/ml。
18.一种单克隆抗体偶联物的制备方法，其中，所述方法包括：步骤1B）环氧氯丙烷、NaBH4活化琼脂糖凝胶，洗涤所述活化的琼脂糖凝胶，去除环氧氯丙烷；步骤2B）将权利要求2所述的单克隆抗体与已活化的琼脂糖凝胶反应，离心取沉淀重悬后的悬液即为琼脂糖凝胶抗体偶联物。
19.根据权利要求18所述制备方法，其中，所述步骤2B）中所述单克隆抗体的含量为0.5-1.0mg/ml。
20.根据权利要求18或19所述制备方法制备的单克隆抗体偶联物，其中，所述琼脂糖凝胶抗体偶联物中所述单克隆抗体含量为0.5-1.0mg/ml。
21.一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤（1）制备口蹄疫O型灭活抗原，所述口蹄疫O型灭活抗原含量为4.2mg/l 146S抗原；
步骤（2）将10ml权利要求20所述的琼脂糖凝胶抗体偶联物加入1000ml所述步骤（1）制备的O型灭活抗原，充分摇震混合，室温连续搅拌作用1~5小时，离心，收集上清，即为去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原；
步骤（3）将所述步骤（2）制备的去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原加入佐剂，混匀。
22.一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤（1）制备口蹄疫O型灭活抗原，所述口蹄疫O型灭活抗原含量为4.2mg/l 146S抗原；
步骤（2）将10ml权利要求20所述的琼脂糖凝胶抗体偶联物加入1000ml所述步骤（1）制备的O型灭活抗原，充分摇震混合，室温连续搅拌作用1~5小时，期间摇震3次，过100目滤网，收集滤液，即为去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原；
步骤（3）将所述步骤（2）制备的去除了非结构蛋白的口蹄疫O型灭活抗原加入佐剂，混匀。
23.根据权利要求21或22所述制备方法制备的疫苗组合物。
24.根据权利要求23所述疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中所含佐剂为ISA206佐剂；所述佐剂含量为50%。
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