CN110964102B

CN110964102B - 能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤细胞株及应用

Info

Publication number: CN110964102B
Application number: CN201811141428.2A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 李玉芳
Original assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN110964102A

Abstract

本发明提供了能同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的单克隆抗体4B1与4E10，该单克隆抗体能有效中和犬、猫、水貂细小病毒。单克隆抗体4B1与4E10制备的胶体金检测试剂盒能对来源于犬、猫、水貂的样本进行检测，且能对多种靶标检测，具有很高的灵敏度。

Description

能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明涉及能同时与犬、猫、水貂细小病毒反应的单克隆抗体，该单克隆抗体的可变区序列、分泌其的杂交瘤细胞株，以及使用该单克隆抗体制备的试剂盒和应用，属于含有抗体的医药配制品和免疫测定法领域。

背景技术

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV，常被称为CPV-2或CPV2)、猫细小病毒(又称猫泛白细胞减少症病毒，Feline panleukopenia virus，FPV)、水貂细小病毒(又称水貂肠炎病毒，Mink enteritis virus，MEV)，简称犬、猫、水貂细小病毒，均属于细小病毒属，是三种极为相似的自主复制型病毒(参见于明科等.水貂肠炎病毒、猫泛白细胞减少症病毒以及犬细小病毒2型间的关系比较.中国兽医杂志,1992(6):45-47)，属于致病性最强、感染范围最宽的一种；四季均可引发感染，能引起犬、猫、水貂的高度接触性、急性传染病，引发的临床症状为高热、呕吐、严重脱水、白细胞减少，体温升高，食欲废绝，精神沉郁，感染率、死亡率均较高，特别地幼龄动物死亡率高达90％，带来巨大损失(参见饶家辉等.猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒的特征比较.中国畜牧兽医,2009,36(7):166-168)。

细小病毒在遗传进化过程中，随着抗原漂移，新的病毒变异株不断出现，并不断扩大其宿主范围。近年来，与CPV2不同基因型的CPV2a、CPV2b、CPV2c变异株在不同国家和地区相继报道，这些变异株均能在犬、猫之间复制、感染和传播；另在狐狸、貉等毛皮动物体内也分离到CPV2。

目前，同时检测犬、猫、水貂细小病毒的方法包括PCR、血凝试验等方法，但这些方法各有缺点，以PCR(参见刘维全等.肉食兽细小病毒通用PCR诊断技术的建立.中国兽医学报.2001,21(3):249-251)为主的分子生物学方法对技术和设备要求均较高、操作繁琐、耗时较长；血凝试验(参见夏咸柱等.犬、猫、貂细小病毒通用快速诊断盒的研制.病毒学报,1987,3(2)：191-195)不仅需要红细胞且要求红细胞必须现配现用，而且不同病毒所需的pH值不一致，操作时间较长，临床实际检测时发现还易受分泌物或排泄物中的杂质干扰。上述这些检测方法均难以在兽医临床现场应用。而且这些方法建立得比较早，对现有流行毒株的检测存在不确定性。目前商品化产品主要是单独检测犬细小病毒或猫细小病毒的胶体金检测试纸条，代价较高。此外，目前商品化产品检测的靶标为粪便、肛拭子，当用于检测其他类型的样本时，准确度不能保证。因此，急需研制一种快速简便、准确的、同时检测犬、猫、水貂细小病毒的产品以用于临床诊断。

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)可引起犬科、鼬科、浣熊科、猫科大型动物等的高度接触性传染病-犬瘟热(俗称狗瘟)。该病与细小病毒病这两种传染病常引发大批犬、水貂、狐狸、貉子等伴侣及毛皮经济动物发病，使得病情更为严重。随着这些伴侣、毛皮经济动物的饲养量大幅度增加及异地交流的增多，发病率、致死率也升高，使目前伴侣、毛皮经济动物的造成严重危害、损失，受到了广泛重视。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一对同时与犬、猫、水貂细小病毒反应的单克隆抗体，以及含单克隆抗体的试剂盒及其应用。

本发明涉及一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的单克隆抗体4B1的可变区序列，其中，所述单克隆抗体4B1重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4B1轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明涉及一种同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的能力。

作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体4B1。

所述单克隆抗体4B1，其识别的抗原表位为VP2蛋白的表位，重链可变区为SEQ.IDNo.1或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.2或其简并序列编码；对CPV不同基因型的HI效价为1∶20480～1∶40960，FPV、MEV的HI效价均为1∶2560，对CPV不同基因型、FPV、MEV的IFA效价为1∶6400～1∶12800，与CPV不同基因型、FPV、MEV均具有良好的反应性。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单链抗体重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码。该单链抗体对CPV、FPV、MEV的HI效价均≥1∶1280，表明其与CPV、FPV、MEV均具有良好的反应特性，可用于制备疫苗。

本发明涉及一种杂交瘤细胞4B1株，所述杂交瘤细胞4B1株分泌所述的单克隆抗体4B1。

杂交瘤细胞4B1株能有效分泌单克隆抗体4B1，分泌的单克隆抗体4B1纯度高。

本发明涉及一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的单克隆抗体4E10的可变区序列，其中，所述单克隆抗体4E10重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4E10轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明涉及一种同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码或其序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的能力。

作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体4E10。

所述单克隆抗体4E10，其识别的抗原表位为VP2蛋白的表位，重链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.3或其简并序列编码，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.4或其简并序列编码；对CPV不同基因型的HI效价为1∶2560～1∶5120，FPV的HI效价为1∶2560，MEV的HI效价为1∶5120，对CPV不同基因型、FPV、MEV的IFA效价为1∶12800～1∶25600，与CPV不同基因型、FPV、MEV均具有良好的反应性。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单链抗体重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码。该单链抗体对CPV、FPV、MEV的HI效价均≥1∶1280，表明其与CPV、FPV、MEV均具有良好的反应特性，可用于制备疫苗。

本发明涉及一种杂交瘤细胞4E10株，所述杂交瘤细胞4E10株分泌所述的单克隆抗体4E10。杂交瘤细胞4E10株能有效分泌单克隆抗体4B1，分泌的单克隆抗体4E10纯度高。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体4B1、有效量的所述单克隆抗体4E10，以及同时对犬、猫、水貂细小病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。

本发明的试剂盒根据双抗体夹心检测抗原的原理构建，可通过包括但不限于ELISA、酶免试纸条、胶体金检测试纸条、荧光试纸条等方法实现抗原检测。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括部件：底板(5)，所述底板(5)具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)与金标垫(2)接触或与样品垫(1)、金标垫(2)接触使得犬、猫、或水貂细小病毒抗原与所述单克隆抗体4E10的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4E10，所述硝酸纤维素膜上包括检测线(6)和一条质控线(7)，所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体4B1，所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体4B1固定含量为0.5-2.5mg/ml，所述单克隆抗体4E10标记时含量为5-60μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体4B1固定含量为0.7-2.0mg/ml，所述单克隆抗体4E10标记时含量为8-50μg/ml；所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。

作为本发明的一种实施方式，所述金标垫(2)上还含有胶体金标记的单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜(3)上包括二条检测线，所述二条检测线上分别固定化有所述单克隆抗体4B1和单克隆抗体6E11；其中，所述犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCCNo：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌；所述犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌；所述单克隆抗体1G5标记时含量为18～60μg/ml，所述单克隆抗体6E11固定含量为0.8～3mg/ml；所述相邻的所述检测线之间、离所述质控线最近的检测线与质控线之间的距离≥4mm。

所述小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株保藏号为CCTCC No：C2015202，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株保藏号为CCTCC No：C2015201，均公开于专利申请CN105695420A。

作为本发明的一种实施方式，从所述底板(5)第一端向第二端的方向上有二条检测线6A、6B，所述单克隆抗体4B1固定在所述检测线6A或6B上，另一所述固定单克隆抗体6E11则固定在所述检测线6B或6A上。

作为本发明的一种实施方式，从所述底板(5)第一端向第二端的方向上有二条检测线6A、6B，所述单克隆抗体4B1和1G5可以任一排列方式分别固定在所述检测线6A、6B上。

本发明试剂盒检测样本选自眼鼻分泌物(即眼鼻拭子)、唾液、呕吐物、肛门分泌物(即肛拭子)、粪便、血清、尿、肠相关的脏器组织；所述试剂盒检测样本来源于犬、猫、水貂。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒所检测的样本选自眼鼻分泌物或眼鼻拭子、唾液、呕吐物、肛门分泌物或肛拭子、粪便、血清、尿、肠组织；所述试剂盒检测样本来源于犬、猫、水貂。

本发明的试剂盒不仅可以检测犬源、猫源、水貂源的临床样品，还可以检测多种靶标，具有广泛的临床应用，弥补了现有商业诊断试剂不能同时检测犬源、猫源、水貂源样品的不足。

本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤1)用胶体金标记所述单克隆抗体4E10为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4E10标记时含量为10～60μg/ml；步骤2)固定所述单克隆抗体4B1、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、质控线，所述单克隆抗体4B1稀释至0.8～2.0mg/ml固定后作为检测线T1，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1～3mg/ml固定后作为质控线；步骤3)配制样品处理液，分装；以及步骤4)将所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)还包括用胶体金分别标记所述单克隆抗体4E10、单克隆抗体1G5为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4E10标记时含量为5～60μg/ml、所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～60μg/ml；所述步骤2)还包括固定所述单克隆抗体4B1、固定单克隆抗体6E11分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T2、质控线，所述单克隆抗体4B1、所述单克隆抗体6E11分别稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1、T2。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。

本发明还涉及所述试剂盒的检测方法，所述检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心，10分钟后判定结果。

本发明还涉及所述抗体或抗体片段用于犬、猫、水貂细小病毒抗原表位鉴定研究；所述抗体或抗体片段为单克隆抗体4B1或单克隆抗体4E10。

本发明的含有所述单克隆抗体对的试剂盒不仅能高灵敏度地检测CPV、FPV、MEV，还可检测犬源、猫源、水貂源的多个靶标，而且符合率较高、准确度较高，弥补了现有商品化产品仅能单一检测CPV或FPV的缺陷，填补了现有商业应用上的空白，且具有快速、简便、准确的优势，更有利于临床的应用。

本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬、猫、水貂细小病毒检测中的应用。其中，所述非诊断目的的犬、猫、水貂细小病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测。

本发明还涉及一种单链抗体，所述单链抗体重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码；或所述单链抗体重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码。这两种单链抗体对CPV、FPV、MEV的HI效价均≥1∶1280，表明其与CPV、FPV、MEV均具有良好的反应特性，可用于制备疫苗。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“犬细小病毒”(Canine parvovirus，CPV，常被称为CPV-2或CPV2)，属于细小病毒科细小病毒属，是DNA病毒中分子量最小的病毒；随着抗原漂移不断产生新的突变株(变异后的基因型包括CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)，其宿主范围也不断扩大，可感染犬科、猫科、鼬科等多种动物，感染后的临床症状包括肠炎型(具有严重的呕吐、严重的出血性腹泻)和心肌炎型(可导致幼犬呼吸、心血管的衰竭)。

术语“猫细小病毒”又称猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)、猫瘟热病毒、猫瘟病毒、猫传染性肠炎病毒，属于细小病毒科细小病毒属，仅1个血清型，可感染猫科、浣熊科、鼬科等多种动物，以猫科动物及鼬科中水貂最为易感，主要引发猫科动物的猫泛白细胞减少症(一种急性高度接触性的传染病，又称猫瘟热、猫传染性肠炎、猫细小病毒性肠炎、猫共济失调症等)，感染后的临床症状主要包括白细胞减少、出血性肠炎、腹泻、突发性发热及呕吐等。

术语“水貂细小病毒”又称貂细小病毒、水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)、貂肠炎病毒、水貂肠炎细小病毒，属于细小病毒科细小病毒属，仅1个血清型，可感染鼬科、猫科等多种动物，感染后的临床症状主要包括急性肠炎、白细胞减少、腹泻等。

术语“VP2蛋白”为犬、猫、水貂细小病毒的主要结构蛋白，是构成核衣壳的2种蛋白之一，形成环状结构，其分子量约为65kD。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、犬、猫、水貂源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187、GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持同时与犬、猫、水貂细小病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

术语“有效量”当理解为“检测有效量”时，是指能够以高灵敏度检测出阳性样本，并可区分出阴性样本的量。

术语“质控线”、“对照线”可互换使用，是指用于检测抗原抗体反应的条件是否适宜，同时用于监测反应背景能否干扰影响检测结果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实例中所用的样品保存液为PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1犬、猫、水貂细小病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验

1.1抗原制备

将符合犬细小病毒临床症状、犬细小病毒PCR方法(使用犬细小病毒PCR检测试剂盒检测，购自北京世纪元亨)检测为阳性的犬源病料接种细胞，分离获得犬细小病毒，将其VP2蛋白扩增、测序并与Genbank已公布的犬细小病毒流行株进行基因进化树分析发现其属于同一分支，鉴定其为CPV2a。

将符合猫细小病毒临床症状、猫细小病毒PCR方法(使用猫泛白细胞减少症病毒PCR检测试剂盒检测，购自北京世纪元亨)检测为阳性的猫源病料接种细胞，将其VP2蛋白扩增、测序并与Genbank已公布的猫细小病毒毒株进行基因进化树分析发现其属于同一分支，分离获得猫细小病毒FPV。

将符合水貂细小病毒临床症状、水貂细小病毒PCR方法(根据文献建立的方法，张海玲等.水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用.特产研究.2007,(2):1-3)检测为阳性的水貂源病料接种细胞，将其VP2蛋白扩增、测序并与Genbank已公布的水貂细小病毒毒株进行基因进化树分析发现其属于同一分支，分离获得水貂细小病毒MEV。

将临床分离到的CPV、FPV、MEV分别培养，收获细胞培养物。

1.2犬、猫、水貂细小病毒单克隆抗体的制备和纯化

分别将CPV、FPV、MEV作为抗原，同时将CPV、FPV、MEV混合后作为抗原，与弗氏佐剂乳化，按200μl/只免疫小鼠，4只/组，三免后采血测定小鼠血清的HI效价，先用CPV、FPV、MEV分别作为HA抗原进行HI效价测定，再将HI效价最高的小鼠血清，用CPV、FPV、MEV同时进行HI效价测定。其中，用猪红细胞按《中国兽药典》进行红细胞凝集试验即HA试验，根据结果制备8单位抗原，再对待检样品进行红细胞凝集抑制试验即HI效价测定，按《中国兽药典》进行。结果如下：

表1CPV、FPV、MEV三种抗原免疫后小鼠血清的HI效价

将HI效价相对均较高的CPV单独免疫组，CPV、FPV、MEV混合免疫组的小鼠进行细胞融合。用HI方法(CPV、FPV、MEV作为抗原分别筛选)进行亚克隆筛选及培养，共获得6株均与CPV、FPV、MEV反应的阳性杂交瘤细胞，并对其细胞上清测定HI效价。

同时为避免筛选的6株阳性杂交瘤细胞存在假阳性、筛选方法单一造成所筛选杂交瘤细胞所针对的抗原谱选择范围窄、漏筛等现象发生，用CPV(2a，实施例1.1)、CPV S0425株(2b，参见CN107541501A)、CPV GX1581株(2c，Hongchao Wu,et al.Molecularepidemiological survey of canine parvovirus in domestic dogs in fourprovinces,China.VirusDisease,2018,29(1):113-117)、FPV(Philips-Roxane株，来源于ATCC)、MEV(实施例1.1)均制备IFA抗原板，进行IFA方法复筛。

IFA检测方法：培养F81细胞，分别接种上述CPV2a、CPV2b、CPV2c、FPV、MEV的病毒液，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清；用80％冷丙酮于2～8℃固定30min，PBS洗3次，病毒接种孔和细胞对照孔分别加入100μl细胞上清原液，同时用CPV阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入1︰200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入50μl PBS后于荧光显微镜下观察。

共获得5株阳性杂交瘤细胞，详见表2。

表2 6株阳性杂交瘤细胞上清评价结果

根据上述评价结果，将5株即3H6、4B1、4E10、6A8、8G4株均与CPV、FPV、MEV反应的细胞复苏后注射小鼠体内制备腹水。用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体5株单克隆抗体的腹水，用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：3H6、6A8纯度分别为50％、60％，较低；4B1、4E10、8G4纯度均不低于85％。用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白含量，结果：单克隆抗体3H6、4B1、4E10、6A8、8G4的浓度分别为1.0、3.8、3.5、3.2、0.8mg/ml。为避免纯度低对特异性的影响，舍弃纯度较低、蛋白含量均较低的2株3H6、6A8。

1.3试纸条用单克隆抗体配对试验初步研究

1.3.1抗体相加试验

用抗体相加试验进行初步研究。将离心后的CPV病毒液(实施例1制备)作为包被原，包被于微孔板后用封闭液进行封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应，洗涤、拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应。两株单克隆抗体反应完毕后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG与之反应，洗涤、显色，测定其吸光度A值。按公式AI＝[(A1.2-A1)/A2]×100％，分别计算单隆抗体两两叠加的增值指数AI。其中，A1、A2分别为单抗1和2的A值，A1.2为单抗1叠加单抗2的A值；当AI大于50％即可初步断定两种单抗对应不同的抗原结合位点。结果见表3。可知：单克隆抗体4B1、4E10、8G4抗体相加指数AI值均＞50％，其余均＜50％。表明三株单克隆抗体识别不同的抗原表位，可用于建立双抗体夹心方法检测抗原。

表3单克隆抗体两两叠加的增值指数AI

1.3.2试纸条配对试验

用实施里1.2中的CPV2a(10^5.5TCID₅₀/ml)、CPV2b(10^5.5TCID₅₀/ml)、CPV2c(10^5.4TCID₅₀/ml)、FPV(10^5.5TCID₅₀/ml)、MEV(10^5.8TCID₅₀/ml)病毒液及其稀释液、PCR检测为阴性的10份犬源粪便样品、PBS缓冲液，按实施例2制备试纸条，对单克隆抗体配对试验进行进一步确认，结果：含单克隆抗体8G4的配对制备的试纸条检测出现假阴性、假阳性，存在严重的非特异；而单克隆抗体4B1、4E10配对制备的试纸条可准确检测CPV、FPV、MEV三种病毒。特别地，将4E10作为金标抗体、4B1作为固定抗体配对制备的试纸条检测灵敏度最高，后续试验以此单克隆抗体配对制备试纸条进行检测。见表4。

表4抗体配对检测不同样品灵敏度

1.4单克隆抗体4B1、4E10其它特性的鉴定

亚型：用单克隆抗体亚型试剂盒对抗体的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体4B1、4E10的重链亚型分别为IgG2b、IgG2a，轻链亚型均为kappa。

HI效价测定：将CPV2a、CPV2b、CPV2c、FPV、MEV分别作为HA抗原，测定HA效价后将其分别稀释成8单位抗原，再对单克隆抗体4B1、4E10进行HI效价测定。结果见表5。

IFA效价测定：将实施例1制备的CPV2a、CPV2b、CPV2c、FPV、MEV IFA抗原板取出，对单克隆抗体4B1、4E10进行IFA效价测定。结果见表5。

表5单克隆抗体4B1、4E10的HI、IFA效价结果汇总

特异性：将CPV、犬瘟热病毒CDV、犬腺病毒1型CAV-1、犬腺病毒2型CAV-2、犬副流感病毒CPIV、犬冠状病毒CVV、FPV、猫杯状病毒FCV、猫疱疹病毒FHV、水貂细小病毒MEV、水貂犬瘟热病毒以及培养的用F81细胞分别制备IFA抗原板进行IFA检测，用于测定单克隆抗体的特异性。结果显示：单克隆抗体4B1、4E10仅与CPV、FPV、MEV反应为阳性，与犬源、猫源、水貂源其它常见病毒反应均为阴性，表明：单克隆抗体4B1、4E10均为犬、猫、水貂细小病毒的特异性单克隆抗体。

1.5单克隆抗体识别蛋白的研究

用DNA试剂盒提取实施例1制备的CPV、FPV、MEV核酸，作为模板，根据NCBI公布的VP1、VP2蛋白基因序列设计引物，分别用PCR扩增CPV、FPV、MEV的VP1蛋白、VP2蛋白的基因序列，通过杆状病毒表达系统分别表达，将表达后的质粒转染至细胞培养，培养后80％冷丙酮固定，作为IFA抗原板，将单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光IFA检测。结果：单克隆抗体4B1、4E10、8G4均只与VP2蛋白构建的质粒呈阳性反应。表明：单克隆抗体4B1、4E10、8G4均识别犬、猫、水貂细小病毒的VP2蛋白。但结合实施例1.3的试纸条配对结果，分析发现：识别VP2蛋白不同的抗原决定簇，未必可组装成双抗夹心法检测抗原。

1.6单克隆抗体4B1、4E10可变区序列的测定

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAA

P2：CCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG

设计轻链可变区引物序列：

P3：ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCT

P4：CCCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATCCA

收集2株单克隆抗体4B1、4E10的细胞上清，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体4B1的重链可变区、轻链可变区序列分别如SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2所示，单克隆抗体4E10的重链可变区、轻链可变区序列分别如SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.4所示。

实施例2试纸条的制备及应用

2.1试纸条1-2的制备及检测

将0.01％氯金酸溶液加热煮沸后再加入1％柠檬酸三钠溶液，制备成胶体金，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，即得胶体金溶液。

用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8.0，匀速搅拌后将单克隆抗体4E10溶液(工作浓度为5-60μg/ml)加于胶体金溶液中进行标记，搅拌后逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30min。于2～8℃静置2小时后，4℃2000r/min离心30min，沉淀用1/10体积的含1％BSA的PBS缓冲液溶解即为金标单克隆抗体4E10，用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体4E10包被做成金标垫2；将单克隆抗体4B1(包被浓度为0.5-2.5mg/ml)和羊抗鼠二抗(包被浓度为1-3mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线6和质控线7。将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4粘贴于底板5上，即为犬、猫、水貂细小病毒胶体金检测试纸条(作为试纸条1)。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。

将金标抗体4E10、固定抗体4B1，与CN105695420A中犬瘟热病毒单克隆抗体1G5、6E11，制备胶体金溶液并标记1G5(按CN105695420A专利进行，标记浓度为20～60μg/ml)作为金标抗体1G5，用喷涂或浸润使金标抗体4E10、金标抗体1G5包被做成金标垫2；将固定抗体4B1、固定抗体6E11和羊抗鼠二抗喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线6A、检测线6B和质控线(C)。将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4粘贴于底板5上，即为试纸条2。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。

检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-4滴混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。

2.2试纸条中单克隆抗体工作浓度的优化

分别按表6中的固定抗体4B1、金标抗体4E10的浓度制备试纸条，并对CPV2a(10^5.5TCID₅₀/ml)、FPV(10^5.5TCID₅₀/ml)、MEV(10^5.8TCID₅₀/ml)病毒液及其稀释液、样品处理液、PCR检测60份临床阳性样品(犬源、猫源、水貂源各20份)进行检测。选择试纸条检测灵敏度高、与PCR符合率高且检测样品处理液背景清晰的搭配模式，作为胶体金试纸条制备的优选固定抗体浓度、优选金标抗体标记浓度。结果(见表6)：固定抗体浓度为0.5-2.5mg/ml、金标抗体标记浓度5～60μg/ml时均可制备试纸条用于检测，但当固定抗体浓度为0.7-2.0mg/ml、金标抗体标记浓度为8～50μg/ml时制备的试纸条检测效果最优。

表6试剂条1中单克隆抗体工作浓度

另从成本角度考虑用试纸条1D用于后续评价。

2.3胶体金检测试纸条的应用

2.3.1试纸条1-2特性研究

(1)敏感性

按照实施例2.2.1中所述的检测方法，用试纸条1-2分别检测CPV2a(10^5.5TCID₅₀/ml)、CPV2b(10^5.5TCID₅₀/ml)、CPV2c(10^5.4TCID₅₀/ml)、FPV(10^5.5TCID₅₀/ml)、MEV(10^5.8TCID₅₀/ml)病毒液及其稀释液、PCR检测为阳性的60份临床样品(犬源、猫源、水貂源各20份)、PCR检测为阴性的60份临床样品(犬源、猫源、水貂源各20份)，以及犬瘟热病毒CDV CVCC AV299株(源于中国微生物资源)，对试纸条1、2进行检测。同时用韩国安捷的犬细小病毒胶体金检测试纸条(简称安捷CPV试纸条)、猫瘟病毒胶体金检测试纸条(简称安捷FPV试纸条)进行检测，结果：试纸条1、2检测CPV不同基因型的灵敏度为10^2.6～10^2.7TCID₅₀/ml、FPV的灵敏度为10^3.9TCID₅₀/ml、MEV的灵敏度为10^4.2TCID₅₀/ml，检测犬源、猫源、水貂源的阳性符合率为87％～92％、阴性符合率均为100％，比市售的临床常用安捷CPV试纸条、FPV试纸条检测相应病毒液的灵敏度高2～8倍，检测临床样品的符合率远远高于市售产品，弥补了市售常用产品仅能准确检测犬源、猫源其中1种临床样品的缺陷，填补了不能检测MEV临床样品、无市售MEV胶体金检测试纸条产品的空白。特别地，试纸条2检测CDV的灵敏度提高了2倍。见表7。

表7试纸条1、2与市售临床常用产品比较结果

注：*中的16份样品均为犬源临床样品；#中的19份样品15份为猫源临床样品、4份为犬源临床样品。CDV试纸条为专利CN105695420A制备的CDV胶体金检测试纸条。

(2)特异性

将CPV、犬瘟热病毒CDV、犬腺病毒1型CAV-1、犬腺病毒2型CAV-2、犬副流感病毒CPIV、犬冠状病毒CVV、FPV、猫杯状病毒FCV、猫疱疹病毒FHV、水貂细小病毒MEV、水貂犬瘟热病毒以及样品处理液分别用试纸条1、2进行检测。结果：试纸条1仅能检测CPV、FPV、MEV，检测犬源、猫源、水貂源其它常见病毒均为阴性；试纸条2既能检测CPV、FPV、MEV，还能检测CDV及水貂犬瘟热病毒，检测其它病毒均为阴性。表明：试纸条1、2特异性良好。

(3)重复性

将不同批的试纸条1、2以及同一批的多个试纸条1、2分别检测CPV2a、FPV、MEV三种病毒液的灵敏度，结果：灵敏度一致，且检测同一样品的显色程度一致。同时，检测CDV、CAV-1、CAV-2、CPIV、CVV、FCV、FHV、水貂犬瘟热病毒及样品处理液的结果均一致。表明：试纸条1、2的重复性良好。

(4)保存期

将2～30℃保存6、9、12、24、27个月的试纸条1、2对CPV2a、FPV、MEV三种病毒液进行灵敏度检测，并检测CDV、CAV-1、CAV-2、CPIV、CVV、FCV、FHV、水貂犬瘟热病毒。结果：试纸条1、2保存不同时间检测CPV2a、FPV、MEV三种病毒液的灵敏度一致，均未下降；试纸条1检测CDV、CAV-1、CAV-2、CPIV、CVV、FCV、FHV、水貂犬瘟热病毒均为阴性，试纸条2检测CDV、水貂犬瘟热病毒为阳性而检测CAV-1、CAV-2、CPIV、CVV、FCV、FHV为阴性。表明试纸条1、2可保存27个月。

2.3.2临床应用

2.3.2.1犬、猫、水貂细小病毒病料检测

将实施例1中CPV PCR方法检测的临床犬源临床样品130份(包括73份阳性、57份阴性)，用试纸条1、2分别进行检测，同时用商品化安捷CPV试纸条按其说明书进行检测，结果见表8。分析发现：安捷CPV试纸条检测粪便、肛拭子的准确度较高(与其说明书吻合)，检测其它靶标的准确度较低；而本发明制备的试纸条1、2不仅可检测多个靶标而且检测的准确度均较高，与PCR方法相比阳性符合率达78％～81％、总符合率达88％～89％。

表8临床检测结果比较-犬源

将实施例1中FPV PCR方法检测的临床猫源临床样品120份(包括68份阳性、52份阴性)，用试纸条1、2分别进行检测，同时用商品化安捷FPV试纸条按其说明书进行检测，结果见表9。分析：安捷FPV试纸条检测粪便、肛拭子的准确度较高(与其说明书吻合)，检测其它靶标的准确度较低；而本发明制备的试纸条1、2不仅可检测多个靶标而且检测的准确度均较高，与PCR方法相比阳性符合率达81％～82％、总符合率达89％～90％。

表9临床检测结果比较-猫源

将实施例1中MEV PCR方法检测的临床水貂源临床样品150份(包括86份阳性、64份阴性)，用试纸条1、2分别进行检测。结果见表10。分析：本发明制备的试纸条1、2不仅可检测多个靶标而且检测的准确度均较高，与PCR方法相比阳性符合率达79％～80％，总符合率达88％～89％。

表10临床检测结果比较-水貂源

2.3.2.2CDV病料检测

用试纸条2检测犬源CDV感染的130份临床病料(含有发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状犬及攻毒试验犬咽拭子、眼鼻拭子、血清、唾液、尿液样品等)，CDV RT-PCR检测CDV阳性80份、阴性50份，试纸条2检出阳性65份，阳性符合率为81％，阴性符合率100％，总符合率为88％，比商品化试纸条(韩国安捷CDV试纸条)检测效果优，便于临床推广应用。详见表11。

表11犬源CDV临床样品检测结果

用试纸条2检测水貂源犬瘟热病毒感染的100份临床病料(含有发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状水貂及攻毒试验水貂咽拭子、眼鼻拭子、血清、粪便、唾液、尿液样品等)，CDVRT-PCR检测CDV阳性66份、阴性34份，试纸条2检出阳性53份，阳性符合率为80％，阴性符合率100％，总符合率为87％，比商品化试纸条(韩国安捷CDV试纸条)检测效果优，便于临床推广应用。详见表12。

表12水貂源犬瘟热病毒临床样品检测结果

综上所述，本发明的试纸条不仅能高灵敏度地检测CPV、FPV、MEV，还可检测犬源、猫源、水貂源的多个靶标，而且符合率较高、准确度较高，弥补了现有商品化产品仅能单一检测CPV或FPV的缺陷，填补了现有商业应用上的空白。特别地，与CDV联检的试纸条对各自检测互不造成干扰，与经典方法RT-PCR较为接近，检测结果较为准确、可靠。总之，本发明试纸条具有快速、简便、准确的优势，便于非诊断目的的犬、猫、水貂细小病毒检测中的临床应用，特别是流行病学调查、健康体检及排查等研究。

实施例3基因工程抗体的制备及应用

按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体4B1、4E10的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体4B1的重链可变区和单克隆抗体4E10的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体4E10的重链可变区和单克隆抗体4B1的轻链可变区制备单链抗体4。按照《中国兽药典》对单链抗体1-4分别进行HI效价检测，结果：单链抗体1-4对CPV、FPV、MEV的HI效价均≥1∶1280，表明单链抗体1-4与CPV、FPV、MEV均具有良好的反应特性。

以上结果显示SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4可用于犬、猫、水貂细小病毒基因工程抗体的制备，也可将其用于制备预防和/或治疗犬、猫、水貂细小病毒相关疾病的药物组合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤

细胞株及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4B1株（hybridoma strain 4B1）

<400> 1

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gccacggtcg tactaactac 180

aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaagtcc 300

tacggctacg aggggtttgt ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4B1株（hybridoma strain 4B1）

<400> 2

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aaatgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttac catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagttcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta ctccgtacac attcggaggg 300

gggaccaagc tggaaagaaa acgg 324

<210> 3

<211> 357

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4E10株（hybridoma strain 4E10）

<400> 3

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cgtgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgctatccgt aggtatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attactggtg gtggtggtag cgcctactat 180

ccagacactg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga acagtctgaa ctctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagaaagggg 300

gaactgggcg cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4E10株（hybridoma strain 4E10）

<400> 4

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttaa catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gccgtggatc aggcacacag ttttctctaa agatcaacag cctgcagact 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggat ctccgttcac gttcggatgg 300

gggaccaagt tggaaataaa acgg 324

Claims

1.一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的单克隆抗体4B1，其中，所述单克隆抗体4B1重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列；所述单克隆抗体4B1轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列。

2.一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的抗体，其中，所述抗体重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列；以及所述抗体轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列；

所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。

3.一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的单克隆抗体4E10，其中，所述单克隆抗体4E10重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列；所述单克隆抗体4E10轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列。

4.一种可同时特异性结合犬、猫、水貂细小病毒的抗体，其中，所述抗体重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列；以及所述抗体轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列；

所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。

5.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括部件：底板(5)，所述底板(5)具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)与金标垫(2)接触或与样品垫(1)、金标垫(2)接触使得犬、猫、或水貂细小病毒抗原与权利要求3所述的单克隆抗体4E10的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4E10，所述硝酸纤维素膜上包括检测线(6)和一条质控线(7)，所述检测线(6)上固定化有权利要求1所述的单克隆抗体4B1，所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体4B1固定含量为0.5-2.5mg/ml，所述单克隆抗体4E10标记时含量为5-60μg/ml。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述单克隆抗体4B1固定含量为0.7-2.0mg/ml，所述单克隆抗体4E10标记时含量为8-50μg/ml；所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述金标垫(2)上还含有胶体金标记的犬瘟热病毒单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜(3)上包括二条检测线，所述二条检测线上分别固定化有所述单克隆抗体4B1和犬瘟热病毒单克隆抗体6E11；其中，所述犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌；所述犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌；所述单克隆抗体1G5标记时含量为18～60μg/ml，所述单克隆抗体6E11固定含量为0.8～3mg/ml；

所述相邻的所述检测线之间、离所述质控线最近的检测线与质控线之间的距离≥4mm。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒所检测的样本选自眼鼻分泌物或眼鼻拭子、唾液、呕吐物、肛门分泌物或肛拭子、粪便、血清、尿、肠组织；所述试剂盒检测样本来源于犬、猫、水貂。