CN105695420A - 小鼠骨髓杂交瘤细胞株、及其产生的单克隆抗体和应用 - Google Patents

小鼠骨髓杂交瘤细胞株、及其产生的单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了两株小鼠骨髓杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞株分别分泌的抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11、1G5，以及制备的含单克隆抗体6E11、1G5的检测试剂盒和药物组合物、及两者的应用，属于生物技术领域。使用含单克隆抗体6E11和1G5制备的犬瘟热病毒抗原检测试剂盒灵敏度高，并且操作简便、快速、省时，或提高了CDV感染的检出率，便于大规模筛查方面时应用，适合基层或现场快速检测。

Description

小鼠骨髓杂交瘤细胞株、及其产生的单克隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及犬瘟热病毒小鼠骨髓杂交瘤细胞株、其产生的单克隆抗体，含单克隆抗体的检测试剂盒和应用，属于生物技术领域。
背景技术
犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)属于副黏病毒科麻疹病毒属，病毒核酸为单股RNA，病毒粒子呈圆形或不整形，有时呈长丝状。CDV对热和干燥敏感，在50-60℃温度下30分钟即可灭活，在炎热季节CDV在犬群中不能长期存活。在较冷的温度下，CDV可存活较长时间,在2-4℃可存活数周，在-60℃可存活超过7年。
犬瘟热病是由犬瘟热病毒引起的，属于犬科、浣熊科和鼬科动物的一种急性、高度接触性传染病，以双相热型发热、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、神经炎和足垫硬化为特征。染病犬的死亡率高达30％-80％，严重影响犬及其它易感染动物的健康，造成大批犬死亡，并可引起患病动物的严重后遗症，造成了严重的经济损失。
目前，国内外犬瘟热病毒检测方法包括电镜观察、亲和素-生物素-复合物法(ABC)、免疫荧光法(IFA)、聚合酶链式反应法(PCR)，检测时需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，从而限制了其在大规模筛查方面的应用，使得这些方法偏向于实验室诊断，不适合基层或现场快速检测。基于此，亟需发展一种快速、简便、灵敏度高的检测方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了犬瘟热病毒小鼠骨髓杂交瘤细胞株，其分泌的抗犬瘟热病毒单克隆抗体，可以有效地诊断、预防和/或治疗犬瘟热病毒所引发的感染；含所述抗犬瘟热病毒单克隆抗体的检测试剂盒，可快速、简便、准确地检测犬瘟热病毒抗原。
本发明涉及一种小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain6E11)，保藏号为CCTCCNo：C2015202，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain1G5)，保藏号为CCTCCNo：C2015201，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种抗犬瘟热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的本发明的所述单克隆抗体或其可变区氨基酸序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及犬瘟热病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11和有效量的所述单克隆抗体1G5，还包括所述单克隆抗体和犬瘟热病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明还涉及所述抗犬瘟热病毒药物组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用，其中，所述非诊断目的的犬瘟热病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含犬瘟热病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的犬瘟热病毒全病毒抗原。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过使用特异性高的抗犬瘟热病毒单克隆抗体，制备的酶标记的犬瘟热病毒检测试剂盒在硝酸纤维素膜上完成了ELISA检测过程，实现了酶联免疫级联放大效应，因此其灵敏度可以达到ELISA水平，并且操作仅需30分钟，较ELISA简便、快速、省时；
(2)本发明使用金标记的犬瘟热病毒检测试剂盒敏感性高于市售进口胶体金检测试纸条，提高了CDV感染的检出率。
附图说明
图1为酶免疫层析检测试纸条的侧面示意图，图中：1-硝酸纤维素膜，2-酶标垫，3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-质控线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液，10-支撑物，11-检测样品。
图2为小鼠骨髓杂交瘤细胞株6E11和1G5分泌单克隆抗体6E11和1G5的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图，其中：泳道M为Marker；泳道1为单克隆抗体1G5，包括上端的重链和下端的轻链；泳道2为单克隆抗体6E11，包括上端的重链和下端的轻链。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain6E11)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：C2015202，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株由犬瘟热病毒CVCCAV299株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
术语“犬瘟热病毒”(caninedistempervirus，CDV)在分类上属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，是一种单链RNA病毒，可感染犬科、浣熊科和鼬科动物，感染后以双相热型发热、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、神经炎和足垫硬化为特征。
本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、犬源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用基因工程方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，而仍能够保持与犬瘟热病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体为单克隆抗体6E11，由所述小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌产生。
所述单克隆抗体6E11重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体6E11轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列。
本发明的单克隆抗体6E11的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体6E11IPMA(免疫过氧化物酶单层细胞试验)效价为1:12800，与犬瘟热病毒具有良好的反应性。
本发明涉及小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain1G5)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：C2015201，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株由犬瘟热病毒CVCCAV299株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体为单克隆抗体1G5，由所述小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌产生。
所述单克隆抗体1G5重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体1G5轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列。
本发明的单克隆抗体1G5的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体1G5IPMA(免疫过氧化物酶单层细胞试验)效价为1:12800，与犬瘟热病毒具有良好的反应性。
本发明还涉及一种抗犬瘟热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体6E11重链可变区和/或轻链可变区，和/或免疫量的所述的单克隆抗体1G5重链可变区和/或轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体6E11重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体6E11重链可变区和轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体6E11重链可变区和所述的单克隆抗体1G5轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体1G5重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体1G5重链可变区和轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述药物组合物包含免疫量的所述的单克隆抗体6E11轻链可变区和所述的单克隆抗体1G5重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种抗犬瘟热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或其保守性变异体，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或其保守性变异体的所述单克隆抗体，以及药学上可接受的载体；或所述药物组合物包含免疫量的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或其保守性变异体，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或其保守性变异体的所述单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包含免疫量的单克隆抗体6E11或单克隆抗体1G5，以及药学上可接受的载体。
本发明涉及一种犬瘟热病毒检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11和/或有效量的所述单克隆抗体1G5，还包括所述单克隆抗体和犬瘟热病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
本发明涉及一种犬瘟热病毒酶标检测试剂盒，其中，所述酶标检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11、有效量的所述单克隆抗体1G5，还包括对所述单克隆抗体和犬瘟热病毒抗原的抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述检测试剂盒还包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，当所述缓冲液供应单元向所述酶免疫层析检测试纸条供给缓冲液，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的单克隆抗体1G5，所述酶底物能与所述单克隆抗体1G5上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体1G5能溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体6E11；其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下所述按钮可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)固定化有所述单克隆抗体6E11，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶标垫(2)上的所述酶标记单克隆抗体1G5对于固定在检测线(6)的所述单克隆抗体6E11而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
术语“有效量”当理解为“诊断有效量”时，是指能够利用所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在犬瘟热病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓，所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同，根据公知文献的教导，本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量，以用于诊断样品中是否存在犬瘟热病毒。本领域技术人员知晓，适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲液/剂，和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。本发明所述试剂盒有效检测样品中是否存在犬瘟热病毒的量时所采用的检测方法可以使用酶联免疫吸附、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原。
术语“酶”是包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任一种。
术语“缓冲液”包括“磷酸盐缓冲液”，是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更优选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，所述酶标检测试剂盒中的所述酶免疫层析检测试纸条包括固相的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10，其中2属于样品供应区，3属于底物供应区，5、8属于缓冲液供应单元，6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。所述检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段；吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端，且与硝酸纤维素膜1有重叠；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段，上面干燥有酶标记的所述单克隆抗体1G5；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3，且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸，以防止底物缓冲液9渗漏，其上有缓冲液按钮，按下缓冲液按钮可刺破铝箔纸，并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端，其上固定化有所述单克隆抗体6E11。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端、检测线6的上游，其上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗。
本发明涉及一种犬瘟热病毒金标检测试剂盒，其中，所述金标检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11、有效量的所述单克隆抗体1G5，以及用于对所述单克隆抗体和犬瘟热病毒抗原的抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述金标检测试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体1G5的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜近所述底板第二端的位置上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体6E11，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述吸水垫在近所述底板第二端并与硝酸纤维素膜接触。
本发明涉及一种犬瘟热病毒检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包括固定在支持介质上的单克隆抗体6E11、以及含有标记的单克隆抗体1G5的反应液以及检测抗原抗体反应的试剂、阴性对照、阳性对照；所述支持介质包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜；所述标记的单克隆抗体1G5的标记物包括酶、胶体金、荧光、同位素、生物素、铁蛋白；以及所述检测抗原抗体反应的试剂包括酶显色、荧光、胶体金、化学发光试剂。
作为本发明的一种实施方式，所述包括含包被预检测犬瘟热病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体6E11的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；或所述试剂盒包括含包被预检测犬瘟热病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体1G5的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；或所述检测试剂盒包括含包被预检测犬瘟热病毒抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体6E11与所述单克隆抗体1G5混合的反应液、酶标记的羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为Vero细胞培养的CDV病毒液，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为2mol/l的浓H2SO4溶液。
术语“检测方法”可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、胶体金检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法及类似检测方法。
术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物(包括眼鼻拭子及肛拭子)、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。当采集眼鼻拭子时，使用经样品稀释液润湿的微生物拭子轻拭犬眼角及鼻腔分泌物，并轻轻转动，以获得病毒丰度较高的眼鼻拭子样品；当采集肛拭子时，将经样品稀释液润湿的微生物拭子插入肛门1.5-2cm处，并轻轻转动，以获得病毒丰度较高的肛拭子样品。
本发明还涉及所述检测试剂盒检测样品中犬瘟热病毒的方法，所述方法包括：步骤(1)将检测样品与所述单克隆抗体6E11和/或所述单克隆抗体1G5进行接触，步骤(2)检测所述单克隆抗体6E11和/或所述单克隆抗体1G5与检测样品中犬瘟热病毒的抗原抗体反应；其中，所述步骤(1)中的所述单克隆抗体6E11或所述单克隆抗体1G5附着在固相上，所述固相优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种；其中，所述方法步骤(2)中所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒酶标检测试剂盒检测样品中犬瘟热病毒的方法包括：将采集的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头这段留于瓶中；将含有样品的样品处理管盖子头部折断，挤出一滴样品加入所述酶免疫层析检测试纸条上所述酶标垫的位置中，同时迅速按下缓冲液按钮；30分钟后在所述酶免疫层析检测试纸条的检测区观察记录结果，以及结果判定，结果判定标准为：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒金标检测试剂盒检测样品中犬瘟热病毒的方法包括：将采集的微生物拭子插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头这段留于瓶中；将含有样品的样品处理管盖子头部折断，挤出一滴样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中，10分钟后判定结果，结果判定标准为：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒检测试剂盒检测样品中犬瘟热病毒的方法包括：将包被所述单克隆抗体6E11的ELISA板用封闭液进行封闭，用洗涤液进行洗涤；使用样品处理管预处理样品，将所述预处理样品于稀释液中稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，同时做阳性对照、阴性对照，于反应45分钟后洗涤；加入稀释的酶标记所述单克隆抗体1G5，于37℃作用40-80min反应后洗涤；加入底物显色液，于37℃反应10min后加入终止液；用酶标仪读取数据，对结果进行判定。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒检测试剂盒检测样品中犬瘟热病毒的方法包括：将包被犬瘟热病毒抗原的ELISA板用封闭液进行封闭，同时做阴性对照、阳性对照，并用洗涤液进行洗涤；使用样品处理管预处理样品，将所述预处理样品于稀释液中进行稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，并用已知浓度的犬瘟热病毒抗原进行梯度稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应，于反应后洗涤；将含所述单克隆抗体6E11的反应液，或含所述单克隆抗体1G5的反应液，或含所述单克隆抗体6E11和所述单克隆抗体1G5混合的反应液，稀释后加入ELISA反应孔，于37℃反应20-40min，洗涤，同时设空白对照；将酶标记的羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗稀释后加入ELISA反应孔中，于37℃反应20-40min，洗涤；加入底物显色液，于37℃反应10min后加入终止液；用酶标仪读取数据，对结果进行判定。
本发明涉及所述抗犬瘟热病毒药物组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述检测试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用，其中，所述非诊断目的的犬瘟热病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含犬瘟热病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的犬瘟热病毒全病毒抗原的检测。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体6E11和/或有效量的单克隆抗体1G5的抗原检测试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的所述犬瘟热病毒酶标检测试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的所述犬瘟热病毒金标检测试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的所述单克隆抗体6E11和所述单克隆抗体1G5进行夹心法检测的检测试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用。
本发明所述检测试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，其1L体积配方为：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实例中所用的样品保存液为pH的7.4磷酸缓冲液(简称PBS)，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明实施例中所用的PBS(pH7.2，0.15mol/L)为Na2HPO4·12H2O39.7g；NaH2PO4·2H2O6.72g；NaCl9g；蒸馏水加至1000ml。充分溶解后，混合均匀，121℃30min高压灭菌。
本发明实施例中的酶标抗体以辣根过氧化物酶(HRP)为例进行标记，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
1.1抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备和纯化
将犬瘟热病毒CVCCAV299株(参见中国微生物资源网http://cutke.com/index.php/Good/index/model/0/id/92311.html)接种Vero细胞，至病变为85％时收获病毒，-40℃快速冻融一次，3000r/min离心30min，去除细胞碎片后分装。按照HarlowE等(HarlowE,LaneD.Antibodies:alaboratorymanual.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998,139-312)文献的操作方法制备小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株、小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株，提交保藏。进一步使用上述两株细胞株，分别制备并纯化抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11、抗犬瘟热病毒单克隆抗体1G5。
1.2抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鉴定
1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
运用PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1：
表1各单克隆抗体类型的鉴定
单克隆抗体 IgA IgM IgG3 IgG2b IgG2a IgG1 Kappa Lambda
1G5 - - - - - + + -
6E11 - - - - - + + -
注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
由表1可知，单克隆抗体1G5、6E11重链亚型都为IgG1，轻链类型都为kappa。
1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定
按照苏建青(苏建青等，犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定，吉林农业大学学报，2009,31(1):88～92)所提供的方法进行单克隆抗体的特异性鉴定。
测定结果显示：单克隆抗体1G5、6E11与其他病毒均不发生反应，均是抗犬瘟热病毒的特异性单克隆抗体。
1.3纯化单克隆抗体的检验
1.3.1纯化单克隆抗体的外观
室温下，肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。
1.3.2无菌试验
采用无菌检验法，取纯化后的单克隆抗体原料接种10mL/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5mL/管)。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。改良马丁培养基置于20-25℃培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体1G5、6E11原料符合无菌要求。
1.3.3单克隆抗体纯度
采用SDS-PAGE电泳鉴定，上样量为10μg，检测结果如图2所示。
结果表明：单克隆抗体1G5、6E11的纯度均不低于80％。
1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定
对纯化的单克隆抗体进行其相对亲和力的测定:将纯化开始作倍比稀释，分别加入包被有CDV抗原(1:200倍V/V稀释)的96孔酶标板，同时设阴性血清和空白对照37℃反应30分钟，用PBST洗板3次，拍干；每孔加入羊抗鼠IgG-HRP(1:1×104稀释)100μL/孔，反应过后洗涤同上，每孔加入100μL/孔TMB(四甲基联苯胺)底物溶液显色，用2moL/LH2SO4(50μL/孔)终止反应，读取OD450nm值。结果以与包被抗原出现50％结合时的单克隆抗体的蛋白含量，即为该株单克隆抗体的相对亲和力。
以纯化单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD450nm值作图，曲线趋于平坦时的OD450nm作为100％，即抗原与单克隆抗体的结合已达到饱和状态。取曲线上50％饱和度所对应的单克隆抗体浓度，即为该株单克隆抗体的相对亲和力，亲和力越大，所需单克隆抗体的量越低。计算结果表明：单克隆抗体1G5、6E11的相对亲和力均为1:5120。
1.3.5单克隆抗体IPMA效价的测定
参照刘杉杉(刘杉杉等，猪细小病毒抗体IPMA检测方法的建立及应用，中国兽医科学，2011,41(04):387-391)所述建立的IPMA检测方法，用此方法对两株单克隆抗体进行效价测定。
测定结果表明：单克隆抗体1G5、6E11的IPMA效价均为1:12800。
1.3.6单克隆抗体中和效价的测定
参照焦金波(焦金波等，犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集，252-254)方法对两株单克隆抗体进行中和效价测定。
测定结果表明：单克隆抗体1G5、6E11的中和效价分别为1:1280、1:640。
1.4单克隆抗体1G5、6E11可变区序列的测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计1G5重链可变区引物序列：
P1：ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA
设计1G5轻链可变区引物序列：
P3：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计6E11重链可变区引物序列：
P1：ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA
设计6E11轻链可变区引物序列：
P3：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体6E11、1G5的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体6E11的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQIDNo.2、SEQIDNo.4；单克隆抗体1G5的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQIDNo.5、SEQIDNo.7所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQIDNo.6、SEQIDNo.8。
1.5单克隆抗体的配对
选择犬瘟热病毒CVCCAV299株病毒液，稀释到102 . 5TCID50/ml，对于不同搭配模式进行检测，结果见表2：
表2单克隆抗体搭配检测
注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
结果显示：除了固相的单克隆抗体6E11与酶标的单克隆抗体1G5检测102 . 5TCID50/ml的犬瘟热病毒CVCCAV299株病毒稀释液为阳性，其它搭配检测均为阴性。因而，以单克隆抗体6E11作为固定抗体、单克隆抗体1G5作为标记抗体进行试验。
实施例2犬瘟热病毒抗原检测试剂盒的制备及检测方法、质量研究及应用
2.1抗原检测试剂盒的制备及检测方法
试剂盒1即酶免疫层析检测试纸条的制备：按照CN104062430A制备酶免疫层析检测试纸条(如图1所示)，将实施例1制备的单克隆抗体1G5进行酶标记，将实施例1制备的单克隆抗体6E11和羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)分别喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜、酶标垫和底物垫用塑料外壳包装起来，做成酶免疫检测试纸条。并配制磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时，将样品与样品处理液混合，将2～3滴(约80μl)混合液滴加于酶免疫层析检测试纸条的加样孔处，同时迅速按下缓冲液按钮，静置30分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
试剂盒2即胶体金检测试纸条的制备：按照李红梅等(李红梅，聂政，陈佳等.免疫检测用的胶体金制备工艺的优化研究.食品工业科技，2009,30(12)：289-291)建立的胶体金制备方法，制备胶体金溶液并标记单克隆抗体1G5，单克隆抗体6E11和羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，将该硝酸纤维素膜和浸润有金标单克隆抗体1G5的金标垫用塑料外壳包装起来，做成胶体金检测试纸条。并配置相应的磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时，将样品与样品处理液混合，将2～3滴(约80μl)混合液滴加于胶体金测试纸条的加样孔处，同时迅速按下缓冲液按钮，静置10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果。结果判定标准：质控线显色则试验成立，检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色则试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
试剂盒3即双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备：以双抗夹心原理检测临床样品中的CDV，制备ELISA试剂盒：取实施例1纯化的单克隆抗体6E11用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至4μg/ml，100μL/孔，置于4℃包被过夜，取出用PBST洗板3次，拍干；用5％的牛血清白蛋白以200μL/孔加入，37℃封闭1小时，洗板3次，拍干。每次检测时设置阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为实施例1制备的CDVAV299株病毒液，含量为103 . 0TCID50/ml，阴性对照为PBS缓冲液。在8个孔内分别加入100μL的、含量分别为104.0、103.5、103.0、102.5、102..0、101.0、100 . 5TCID50/ml的CDVAV299株病毒液以及PBS作为标准曲线样品；同时将待检样品加入包被有单克隆抗体6E11的样品孔，100μL/孔，置于37℃反应45分钟，取出用PBST洗板3次，拍干；加入经5000倍稀释的HRP标记单克隆抗体1G5作为二抗，100μL/孔，置于37℃作用1小时，取出用PBST洗板3次，拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液50μL/孔，37℃反应10min；最后加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，用酶标仪检测OD450nm。样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性(前提条件：阴性对照OD值低于0.2，阳性对照OD值不低于0.8，实验结果有效)；并将已知病毒液测定的结果绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品中的病毒含量。
2.2抗原检测试剂盒的质量研究
灵敏度检验：将犬瘟热病毒CVCCAV299株病毒液(105 . 5TCID50)进行一系列稀释，稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4，然后用试剂盒1、2、3进行检测，结果见表3。由表3可知：试剂盒1的灵敏度为102 . 5TCID50/ml，试剂盒2为103 . 5TCID50/ml，试剂盒3为102 . 5TCID50/ml。
表3犬瘟热病毒酶免疫层析快速检测试纸条灵敏度测定
病毒稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4
试剂盒1 + + + -
试剂盒2 + + - -
试剂盒3 + + + -
注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。
敏感性检验：用试剂盒1、2、3分别对20份已知CDV抗原阳性样品(P1-P20)进行检测，试剂盒1、3检测结果均为阳性。试剂盒2检测结果显示19份阳性。证明：试剂盒1、2、3均有良好的敏感性。
特异性测定：用试剂盒1、2、3分别对10份特异性样品进行检测，包含CDV抗原阴性犬粪便5份、犬细小病毒病毒液(CVCCAV298株)、犬腺病毒I型病毒液(Utrecht株)、犬腺病毒II型病毒液(TorontoA26/61株)、犬轮状病毒病毒液(CU-1株)、犬冠状病毒病毒液(1-71株)样品。试剂盒1、2、3对10份样品检测结果均为阴性，证明3个试剂盒均有良好的特异性。
重复性试验：分别用试剂盒1、2、3对30份被检样品进行检测，试剂盒1、2重复性试验检测结果一致，试剂盒3重复性试验检测结果<15％，表明3种试剂盒都有良好的重复性。
保存期研究：分别将试剂盒1、2、3按照以下要求进行检测，将三个连续批号试剂盒分别于37℃放置6天后进行热稳定性试验；将试剂盒在2-8℃分别存放6个月、9个月、12个月和15个月，进行试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件的试剂盒进行质控品检验。质控品包括敏感性质控品、特异性质控品、精密性质控品。质控品信息及检测如下：敏感性质控品为S1-S4，分别为稀释为104 . 5、103 . 5、102 . 5TCID50/ml的CDV病毒液(S1-S3)，CDV抗原阳性粪便1份(S4)，样品处理液S5。应S1-S4均为阳性，S5为阴性；特异性质控品为N1-N3，分别为CDV抗原阴性腹泻杂食犬粪便N1，CDV抗原阴性腹泻主食狗粮犬粪便N2、CDV-2a病毒液。应均为阴性；精密性质控品CV为病毒含量为103 . 5TCID50/ml的CDV病毒液。重复检测10次。试剂盒1、2应10次检测均为阳性且试纸条间显色强度一致。试剂盒3应10次检测OD值之间CV值不高于15％。试剂盒1、2、3在37℃条件下保存，贮存6天；在2-8℃规定条件下保存，贮存15个月，仍能通过成品试剂盒质控标准，表明试剂盒有效期试验期间质量稳定，保存期至少可达12个月。
2.3抗原检测试剂盒的应用
用试剂盒1、2、3检测RT-PCR检测阳性样品20份，结果均为阳性，阳性符合率均为100％。
将已知病毒量的犬瘟热病毒CVCCAV299株(105 . 5TCID50)病毒液进行10-1、10-2、10-3、10-4稀释，同时用韩国安捷胶体金试纸条进行检测，与试剂盒1、2、3进行灵敏度的比较，结果见表4。由表4可知，试剂盒1、3的灵敏度高于安捷胶体金试纸条，试剂盒2的灵敏度与安捷胶体金试纸条相当。
表4试剂盒1、2、3与安捷胶体金试纸条检测比对结果
注：+表示阳性，-表示阴性。
用试剂盒1、2、3与韩国安捷公司的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条对50份(阳性40份，阴性10份)临床样品进行检测。40份阳性样品，均为经临床诊断和RT-PCR鉴定的阳性。试剂盒1、3检测结果相同，40份阳性样品均为阳性，10份阴性样品均为阴性。试剂盒2检测40份阳性样品中，38份阳性，10份阴性样品均为阴性。安捷胶体金试纸条检测40份阳性样品中，36份阳性，10份阴性样品均为阴性。将试剂盒1、2、3与韩国安捷公司的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条检测结果进行比较，见表5-7。
表5试剂盒1与进口试纸条检测临床样品比较
由表5可知，试剂盒1与进口试纸条的阳性符合率为100％，阴性符合率为71.4％，总符合率为92％。
表6试剂盒2与进口试纸条检测临床样品比较
由表6可知，试剂盒2与进口试纸条的阳性符合率为100％，阴性符合率为83.3％，总符合率为96％。
表7试剂盒3与进口试纸条检测临床样品比较
由表7可知，试剂盒3与进口试纸条的阳性符合率为100％，阴性符合率为71.4％，总符合率为92％。
因为试剂盒1、2、3检测的40份阳性样品均为经临床诊断和RT-PCR鉴定为阳性，所以根据检测结果可知：试剂盒1、2、3检测敏感性优于进口试纸条。
实施例3本发明单克隆抗体预防、治疗病毒感染的评价
3.1单克隆抗体治疗病毒感染的评价
对15只8周龄健康合格断奶犬按5mL/只的剂量腹腔注射、0.5ml/只的剂量滴鼻接种犬瘟热病毒CDV98017株(参见中国专利CN103436583A)，接种后连续观察临床症状。待感染犬出现间歇性或持续性发热、体温达39.5℃、精神不振、饮食欲减退、眼鼻有浆液性或脓性分泌物，咳嗽、喘等呼吸道症状，或出现抽搐、震颤、麻痹等神经症状，并经犬瘟热病毒抗体ELISA检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，按其说明书进行操作)确认检测阳性后，随机将感染犬分3组进行试验。按照2mL/只的量，第1组肌肉注射单克隆抗体1G5(中和效价为1:1280)，第2组肌肉注射单克隆抗体6E11，第3组注射生理盐水作为对照；每日各1次(中和效价为1:640)，连续注射三天。
观察10天，计算病犬康复比率，以试验犬精神、食欲、体温恢复正常为康复标准，结果见表8。
表8病犬康复比率
由表8可知：第1、2组犬治愈率为100％，第3组中5只犬均死亡，表明单克隆抗体1G5和6E11均可治疗犬瘟热病毒所引发的感染。
3.2单克隆抗体预防病毒感染的评价
筛选CDV抗原、抗体双阴性的8周龄健康合格断奶犬15只，随机分为3组，第4组肌肉注射2ml单克隆抗体1G5，第5组肌肉注射2ml单克隆抗体6E11，第6组肌肉注射2ml生理盐水，口服后24小时，所有试验犬按5mL/只的剂量腹腔注射、0.5ml/只的剂量滴鼻接种犬瘟热病毒CDV98017株(参见中国专利CN103436583A)，接种后连续观察临床症状，连续观察10天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒，监测排毒天数来评价该单克隆抗体的预防犬瘟热病毒感染的效果，结果见表9。
表9注射单克隆抗体后24小时预防CDV感染的试验结果
由表9可知：第4、5组犬死亡率为0％，且未见明显的犬瘟热临床症状发生，而第6组中5只犬均死亡，表明单克隆抗体1G5和6E11均可预防犬瘟热病毒所引发的感染。
由以上试验表明：两株单克隆抗体能够减轻由犬瘟热病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的治疗和/或预防作用。
实施例4基因工程抗体的制备和应用
按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体1G5和单克隆抗体6E11的重链可变区、轻链可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体1G5的重链可变区和单克隆抗体6E11的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体6E11的重链可变区和单克隆抗体1G5的轻链可变区制备单链抗体4。
取实施例1制备CDVAV299株的接种细胞，至细胞出现30％的病变，用80％丙酮4℃固定30min，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，分别加入单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4置于37℃作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG置于37℃作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，置于荧光显微镜下观察。并按照实施例1.3.5、1.3.6分别为单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4的IPMA效价和中和效价进行测定，结果见表10。
结果表明：单链抗体1、单链抗体2、单链抗体3和单链抗体4均可以和犬瘟热病毒发生特异性反应且均具有中和活性(中和效价依次为1:640、1:640、1:320、1:160)。
表10单链抗体IPMA效价及中和效价
IPMA效价 中和效价
单链抗体1 1:6400 1:640
单链抗体2 1:6400 1:640
单链抗体3 1:3200 1:320
单链抗体4 1:3200 1:160
以上结果显示SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5和SEQIDNo.7可用于犬瘟热病毒基因工程抗体的制备，还具有中和犬瘟热病毒的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株，保藏号为CCTCCNo：C2015202，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；优选地，所述单克隆抗体为单克隆抗体6E11，由权利要求1所述小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌。
3.小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株，保藏号为CCTCCNo：C2015201，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日。
4.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；优选地，所述单克隆抗体为单克隆抗体1G5，由权利要求3所述小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌。
5.一种抗犬瘟热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体6E11重链可变区和/或轻链可变区，和/或免疫量的权利要求4所述的单克隆抗体1G5重链可变区和/或轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体6E11重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体6E11重链可变区和轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体6E11重链可变区和权利要求4所述的单克隆抗体1G5轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求4所述的单克隆抗体1G5重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求4所述的单克隆抗体1G5重链可变区和轻链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体6E11轻链可变区和权利要求4所述的单克隆抗体1G5重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。
6.一种抗犬瘟热病毒药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求4所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物包含免疫量的单克隆抗体6E11或单克隆抗体1G5，以及药学上可接受的载体。
7.一种犬瘟热病毒酶标检测试剂盒，其中，所述酶标检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11、有效量的所述单克隆抗体1G5，还包括对所述单克隆抗体和犬瘟热病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
其中，所述酶标检测试剂盒还包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条；所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条；所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触，当所述缓冲液供应单元向所述酶免疫层析检测试纸条供给缓冲液，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的单克隆抗体1G5，所述酶底物能与所述单克隆抗体1G5上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体1G5能溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体6E11；其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下所述按钮可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)固定化有所述单克隆抗体6E11，在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的所述酶标记单克隆抗体1G5对于固定在检测线(6)的所述单克隆抗体6E11而言是过量的；所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上，支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
8.一种犬瘟热病毒金标检测试剂盒，其中，所述金标检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体6E11、有效量的所述单克隆抗体1G5，以及用于对所述单克隆抗体和犬瘟热病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
其中，所述金标检测试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体1G5的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜近所述底板第二端的位置上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体6E11，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述吸水垫在近所述底板第二端并与硝酸纤维素膜接触。
9.一种犬瘟热病毒检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒包括固定在支持介质上的单克隆抗体6E11、以及含有标记的单克隆抗体1G5的反应液以及检测抗原抗体反应的试剂、阴性对照、阳性对照；所述支持介质包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜；所述标记的单克隆抗体1G5的标记物包括酶、胶体金、荧光、同位素、生物素、铁蛋白；以及所述检测抗原抗体反应的试剂包括酶显色、荧光、胶体金、化学发光试剂。
10.根据权利要求5或6所述抗犬瘟热病毒药物组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求7～9任一项所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒检测中的应用，其中，所述非诊断目的的犬瘟热病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含犬瘟热病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的犬瘟热病毒全病毒抗原的检测。
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