CN106680509A - 铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法 - Google Patents

铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗卫生技术领域，具体提供一种铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板，所述衬板的上表面依次搭接设置有样品垫、结合垫、NC膜以及吸收垫，所述NC膜上设置有检测线和质控线，NC膜的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。相应的，本发明还提供了所述蛋白定量检测试剂盒的制备及使用方法。本发明结合荧光免疫层析技术和时间分辨免疫荧光理论，进行铁蛋白检测时具有操作简便、能够实现即时检测、并且灵敏度高、特异性好的优点。实现一次加样，10min读取测试结果，灵敏度可达2.5ng/ml。

Description

铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法
技术领域
本发明属于医疗卫生技术领域，具体涉及一种铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法。
背景技术
目前基于胶体金法或第一代荧光法的检测试剂，在定量检测精密度和准确性以及操作便利性方面还存在严重的缺陷。第一代荧光检测法的铁蛋白试剂大部分都是利用普通的荧光物质进行标记。普通的荧光物质Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性；普通荧光物质的荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。而且在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，对检测结果产生严重的干扰。1942年Wissman发现，某些β-二酮与铕配合后可吸收紫外光，发出强烈的铕离子的特征荧光。1979年，芬兰SoiniHemmia提出时间分辨荧光免疫分析理论；2003年，上海新波生物技术有限公司应用该技术推出了首个体外诊断产品。目前，也有少数公司利用时间分辨免疫分析理论，做出了铁蛋白定量检测试剂，但是，这些铁蛋白定量检测试剂均需要加样、孵育、洗涤等步骤，操作复杂，检测时间长，而且需要专业人士操作，还不能做到即时检测。
综上，为了解决传统铁蛋白检测存在的易受本底荧光干扰、灵敏度低、特异性差、操作复杂、检测时间长并且不能做到即时检测等不足，一种新的铁蛋白定量检测技术亟待开发。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种操作简便、能够实现即时检测、并且灵敏度高、特异性好的铁蛋白定量检测试剂盒。本发明还相应提供了所述铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，所述制备方法能够进一步提升所制得的铁蛋白定量检测试剂盒用于检测铁蛋白的灵敏度和特异性。同时，本发明还相应的提供了所述铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，该使用方法能够消除试剂盒的本底荧光干扰，进一步提升检测结果的灵敏度和特异性。
本发明的设计思路：非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730μs，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。
本发明所采用的技术方案为：
本发明首先提供一种铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板，所述衬板的上表面依次搭接设置有样品垫、结合垫、NC膜以及吸收垫，所述NC膜上设置有检测线和质控线，所述NC膜的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。
相应的，本发明还提供了前述本发明的铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，该制备方法中“将各个预制好的部件按照结构要求组装在一起”的具体方式是本领域技术人员根据行业通用知识可以轻松实现的，并且该部分并不是本发明的创新点所在，因此不再详细赘述。本发明的制备方法中，结合垫以及NC膜的包被是至关重要的。
结合垫中的所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下步骤制备：S1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；S2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；S3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；S4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液，摇床反应，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。
根据本发明的实施例，进一步的特征优化，结合垫中的所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下具体步骤制备实现：s1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；s2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；s3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；s4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液得到标记反应体系，并使第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。
结合垫中的所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下步骤制备：P1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；P2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；P3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；P4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液，摇床反应，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。
根据本发明的实施例，进一步的特征优化，结合垫中的所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下具体步骤制备实现：p1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；p2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；p3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；p4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液得到标记反应体系，并使鸡IgY在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。
第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球分别制备获取后，即可将两者混合用于结合垫的制备，具体过程步骤为：将所得第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液和鸡IgY标记的荧光微球溶液混合得混合液，将混合液在乳胶垫上喷膜得到微球乳胶结合垫，将微球乳胶结合垫在37℃条件下烘干24h后即得所述结合垫。
根据本发明的一个实施例，所述NC膜的制备方法为：向10mmol/L的PBS缓冲液中加入5wt％的蔗糖得到包被稀释液，使用所述包被稀释液分别稀释第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY多抗抗体得到第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液，然后使用第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液分别在硝酸纤维素膜上的T线和C线处划线，依次分别形成包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鸡IgY多抗抗体的质控线，然后将硝酸纤维素膜在37℃条件下干燥4～6h即得所述NC膜。
出于消除本底荧光，降低本底干扰的角度考虑，本发明还提供了前述本发明的铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：将待测样品置于样品垫，待测样品由样品垫向吸收垫层析，待测样品经过结合垫进入NC膜的检测线和质控线进行反应，反应结束后用紫外光源对NC膜的检测线和质控线进行扫描，并通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值即T/C值，分析折算出样品中待测物的浓度。
结合本发明提供的铁蛋白定量检测试剂盒及其制备方法，其原理是采用荧光微球双抗体夹心免疫层析法定量检测血清或血浆中的SF浓度。具体的：本产品检测线包被有第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，质控线包被有羊抗鸡IgY多抗抗体；待测样品中的SF与结合垫中的纳米荧光微球标记的第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体结合，形成荧光微球-第一鼠抗SF单抗-SF-第二鼠抗SF单抗夹心复合物并被固定在检测线上。而鸡IgY标记的荧光微球继续向前层析，与固定在质控线的羊抗鸡IgY多抗结合并固定。反应结束后，用紫外光源(365nm)对检测区(即检测线和质控线区域)扫描，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm)，且衰变时间也较长。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1-10ns)全部衰变后，再测量铕元素的特异性荧光，完全排除非特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值即T/C值，分析出样品中待测物的浓度，排除荧光强度随时间延长而衰减对定量造成的影响。
本发明的有益效果为：
本发明的铁蛋白定量检测试剂盒适用于体外定量检测人血清、血浆以及全血中的铁蛋白(SF)含量。可用于缺铁性贫血的辅助诊断。铁蛋白作为身体组织中主要贮存铁质的一种蛋白，是维持铁质平衡中不可缺少的一种重要蛋白。SF浓度代表体内储存铁的水平，因此，检测SF浓度，可判定体内铁储存状况。
本发明的提供的铁蛋白定量检测试剂盒，基于时间分辨荧光免疫层析法的理论基础及前述设计思路，将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，使瞬时荧光干扰减到最小化。并且通过一步加样，10分钟即可读取检测结果，实现了更为方便快捷。
结合本发明的铁蛋白定量检测试剂盒及其使用方法，用于铁蛋白检测，可达到2.5ng/ml的灵敏度，不仅高于传统的胶体金检测法，而且高于目前市面上行业内的其他荧光免疫定量产品。进一步的，本发明的线性范围宽，准确度、精密度优于胶体金免疫层析，CV值比胶体金免疫层析小，因而检测值更准确可靠。在检测耗时方便，一次加样、10min即可读取检测结果，实现了POCT即时检测。通过干法工艺、一步即实现了铁蛋白的检测，方便快捷。
附图说明
图1是本发明的铁蛋白定量检测试剂盒的结构示意图。
图中：1为样品垫；2为结合垫；3为NC膜；4为吸收垫；5为衬板；“T”线为检测线，“C”线为质控线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步阐释。
本发明中的荧光微球为稀土铕荧光微球，采购自南京基蛋生物科技有限公司。本发明中的其他试剂及仪器同样皆为常见普通市售产品，此处不再一一赘述其各自来源。本发明中的第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体和第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体分别指代两种不同结合位点的铁蛋白单抗抗体。
实施例1：
如图1所示，本实施例提供了一种铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板5，所述衬板5的上表面依次搭接设置有样品垫1、结合垫2、NC膜3以及吸收垫4，所述NC膜3上设置有检测线和质控线，所述NC膜3的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜3的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫2处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。
实施例2：
结合附图1，本实施例提供前述实施例1所述铁蛋白定量检测试剂盒的具体制备方法，步骤如下：
1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液。向荧光微球稀释液内加入10mg/ml的EDC溶液每1000μL荧光微球稀释液添加20～50μL的EDC溶液，然后置于摇床，并在4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液。将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀。向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶。
2a、向步骤1所得下层沉淀的硼酸缓冲液复溶液中加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液得到标记反应体系，通过控制第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液的添加量使第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体在标记反应体系中的浓度为25μg/ml。将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。
2b、向步骤1所得下层沉淀的硼酸缓冲液复溶液中加入鸡IgY的稀释液得到标记反应体系，通过控制鸡IgY的稀释液的添加量使鸡IgY在标记反应体系中的浓度为25μg/ml。将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。
3、将2a所得第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液和2b所得鸡IgY标记的荧光微球溶液按照1:1的比例混合均匀得到混合液。使用混合液在乳胶垫上进行喷膜得到微球乳胶结合垫，喷膜时混合液的用量为8μl/cm，然后将微球乳胶结合垫竖立放在试管架上，放入电热恒温鼓风干燥箱在37℃条件下烘干24h即得所述结合垫2，为了保证干燥，干燥后的结合垫2应在湿度≤20％的环境下取出，取出后裁剪成30cm×0.8cm的长条备用。
4、取硝酸纤维素膜并将其裁剪成30cm/段，将片段硝酸纤维素膜贴在衬板5的中间位置，衬板5为PVC板。向10mmol/L的PBS缓冲液中加入蔗糖得到包被稀释液，蔗糖的加入量为所述PBS缓冲液的5wt％。使用所述包被稀释液分别稀释第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY多抗抗体得到第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液。然后使用第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液分别在硝酸纤维素膜上的T线和C线处划线，依次分别形成包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鸡IgY多抗抗体的质控线。然后将包被好的硝酸纤维素膜放入电热恒温鼓风干燥箱，在37℃条件下干燥4～6h即得所述NC膜3。
5、将步骤3所得结合垫2设置在所述衬板5上，并搭接设置在所述NC膜3的左侧。将样品垫1设置在所述衬板5上，并搭接设置在结合垫2的左侧。将吸收垫4设置在所述衬板5上，并搭接设置在所述NC膜3的右侧。即得所述铁蛋白定量检测试剂盒。
实施例3：
本实施例提供实施例1所得铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，具体为：将待测样品置于样品垫1，待测样品由样品垫1向吸收垫4层析，待测样品经过结合垫2进入NC膜3的检测线和质控线进行反应，反应结束后用紫外光源对NC膜3的检测线和质控线进行扫描，并通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值即T/C值，分析折算出样品中待测物的浓度。
本实施例3具体使用时：检测线包被有第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，质控线包被有羊抗鸡IgY多抗抗体；待测样品中的SF与结合垫中的纳米荧光微球标记的第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体结合，形成荧光微球-第一鼠抗SF单抗-SF-第二鼠抗SF单抗夹心复合物并被固定在检测线上。而鸡IgY标记的荧光微球继续向前层析，与固定在质控线的羊抗鸡IgY多抗结合并固定。反应结束后，用紫外光源(365nm)对检测区(即检测线和质控线区域)扫描，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm)，且衰变时间也较长。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1-10ns)全部衰变后，再测量铕元素的特异性荧光，完全排除非特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值即T/C值，分析出样品中待测物的浓度，排除荧光强度随时间延长而衰减对定量造成的影响。
结合本发明实施例1～3，在进一步的跟踪测试中，所述实施例在铁蛋白检测方面具有操作简便、能够实现即时检测、并且具有灵敏度高、特异性好的特点。采用干式检测法能够实现一步加样，10分钟即可读取检测结果，排除了本底荧光干扰，灵敏度可达到2.5ng/ml。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板(5)，所述衬板(5)的上表面依次搭接设置有样品垫(1)、结合垫(2)、NC膜(3)以及吸收垫(4)，所述NC膜(3)上设置有检测线和质控线，其特征在于：所述NC膜(3)的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜(3)的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫(2)处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。
2.一种权利要求1所述的铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下步骤制备：
S1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；
S2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；
S3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；
S4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液，摇床反应，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球具体制备步骤如下：
s1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；
s2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；
s3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；
s4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液得到标记反应体系，并使第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下步骤制备：
P1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；
P2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；
P3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；
P4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液，摇床反应，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述鸡IgY标记的荧光微球具体制备步骤如下：
p1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；
p2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；
p3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；
p4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液得到标记反应体系，并使鸡IgY在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫(2)的制备方法为：将所得第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液和鸡IgY标记的荧光微球溶液混合得混合液，将混合液在乳胶垫上喷膜得到微球乳胶结合垫，将微球乳胶结合垫在37℃条件下烘干24h后即得所述结合垫(2)。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述NC膜(3)的制备方法为：向10mmol/L的PBS缓冲液中加入5wt％的蔗糖得到包被稀释液，使用所述包被稀释液分别稀释第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY多抗抗体得到第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液，然后使用第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液分别在硝酸纤维素膜上的T线和C线处划线，依次分别形成包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鸡IgY多抗抗体的质控线，然后将硝酸纤维素膜在37℃条件下干燥4～6h即得所述NC膜(3)。
8.一种权利要求1所述的铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测样品置于样品垫(1)，待测样品由样品垫(1)向吸收垫(4)层析，待测样品经过结合垫(2)进入NC膜(3)的检测线和质控线进行反应，反应结束后用紫外光源对NC膜(3)的检测线和质控线进行扫描，通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值即T/C值，分析折算出样品中待测物的浓度。
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