CN108469525A - 一种荧光免疫分析装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本说明书公开了一种荧光免疫装置及方法,所述装置包括:光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置;所述激发光光纤与所述发射光光纤能够相对层析试纸的目标区域移动;在所述激发光光纤与所述发射光光纤相对所述层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;所述出光口经过所述目标位置时,所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置,以激发所述目标位置上的荧光物质,形成发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;所述光强检测装置用于确定所述发射光的荧光信号强度。
Description
技术领域
本发明涉及生物检验领域,尤其涉及一种荧光免疫分析装置及方法。
背景技术
随着医疗技术的快速发展,对疾病的初步诊断可以通过对血液中某项指标的分析得到初步结论。即时检测(ponit of care testing,POCT)是一类可以快速获得测试结果的临床测试方法,目前,POCT普遍利用的检测方法为酶免疫分析法,其精密度、重复性差,线性范围较窄。
发明内容
鉴于上述问题,提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的荧光免疫分析装置及方法。
本申请实施例的第一方面,提供一种荧光免疫分析装置,所述装置包括:
光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置;
所述光源与所述激发光光纤耦合,所述发射光光纤与所述光强检测装置耦合,所述激发光光纤与所述发射光光纤能够相对层析试纸的目标区域移动;
在所述激发光光纤与所述发射光光纤相对所述层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;
所述出光口经过所述目标位置时,所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置,以激发所述目标位置上的荧光物质,形成发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;
所述光强检测装置用于确定所述发射光的荧光信号强度。
可选地,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述荧光免疫分析装置还包括:
运动机构,用于驱动所述出光口和所述入光口以预设速度相对所述目标区域移动;
在所述出光口和所述入光口以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在所述入光口到达所述目标位置前已经衰减完毕。
可选地,所述激发光光纤的第一段与所述发射光光纤的第二段相邻设置,所述第一段包括所述出光口,所述第二段包括所述入光口。
可选地,所述发射光光纤的直径大于或等于所述激发光光纤的直径。
可选地,所述出光口到所述层析试纸之间的距离小于所述入光口到所述层析试纸之间的距离。
可选地,所述出光口的中心与目标中心之间的连线方向,与所述出光口和所述入光口的移动方向平行,所述目标中心为所述入光口的中心在所述出光口所在平面上的投影。
可选地,所述装置还包括:一根或多根接收光光纤,垂直于所述入射光光纤移动方向设置,且与所述入射光光纤并排设置,用于接收所述发射光。
可选地,所述入光口在经过所述目标区域中的空白区域的任一位置时,所述任一位置的本底荧光通过所述入光口进入所述发射光光纤;
所述光强检测装置,用于根据所述第一发射光以及所述本底荧光,确定所述目标位置处的荧光光强。
本申请实施例的第二方面,提供一种荧光免疫分析方法,应用于荧光免疫分析装置中,所述荧光免疫分析装置包括:光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置,所述方法包括:
控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,其中,所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;
获取发射光,所述发射光为所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置上,激发所述目标位置上的荧光物质形成的发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;
根据所述发射光信号,确定所述发射光信号的荧光信号强度。
可选地,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,包括:
控制所述出光口与所述入光口以预设速度相对所述目标区域移动;
其中,所述出光口和所述入光口以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在所述入光口到达所述目标位置前已经衰减完毕。
通过本申请的一个或者多个技术方案,本申请具有以下有益效果或者优点:
本申请实施例提供的荧光免疫分析装置,包括光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置;采用时间分辨荧光免疫分析来实现对试纸上样本的被测指标的检测,即,通过使激发光光纤的出光口和所述入光口先后通过所述目标位置,形成时间差,在该时间差内,荧光寿命小于该时间差的荧光物质形成的发射光在发射光光纤经过目标位置时衰减完毕,荧光寿命大于或等于该时间差的荧光物质形成的发射光射入发射光光纤,被传输至光强检测装置,光强检测装置根据接收到的发射光来确定荧光信号强度,进而确定被测指标的浓度。采用时间分辨荧光免疫分析,能够显著提高被测指标检测的精密度和稳定性。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本申请的限制。而且在整个附图中,用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中:
图1为本申请实施例示出的一种荧光免疫分析装置的示意图;
图2为本申请另一实施例示出的荧光免疫分析装置的示意图;
图3为本申请实施例中出光口的中心与目标中心的连线方向与运动方向存在夹角的示意图;
图4为本申请实施例中接收光光纤的位置示意图;
图5为本申请实施例提供的另一种荧光免疫分析装置的框图;
图6为本申请实施例示出的层析试纸结构示意图。
图7为本申请是实施例示出的D二聚体抗原标准品浓度与测定的信号平均值的标准曲线。
具体实施方式
本实施例公开一种荧光免疫分析装置,该装置包括:光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置;所述光源与所述激发光光纤耦合,所述发射光光纤与所述光强检测装置耦合,所述激发光光纤与所述发射光光纤能够相对层析试纸的目标区域移动;在所述激发光光纤与所述发射光光纤相对所述层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;所述出光口经过所述目标位置时,所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置,以激发所述目标位置上的荧光物质,形成发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;所述光强检测装置用于确定所述发射光的荧光信号强度。
下面通过附图以及具体实施例对本申请技术方案做详细的说明,应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明,而不是对本申请技术方案的限定,在不冲突的情况下,本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。
实施例一
如图1所示,为本申请实施例示出的一种荧光免疫分析装置的示意图,该装置包括:
光源11、激发光光纤12、发射光光纤13、光强检测装置14;光源11与激发光光纤12耦合,发射光光纤13与光强检测装置14耦合,激发光光纤12与发射光光纤13能够相对层析试纸的目标区域移动;在激发光光纤12与所述发射光光纤13相对所述层析试纸移动时,激发光光纤12的出光口15与所述发射光光纤13的入光口16先后通过所述目标区域上的同一目标位置;出光口15经过所述目标位置时,光源11产生的激发光通过出光口15射出照射到所述目标位置,以激发所述目标位置上的荧光物质,形成发射光,所述发射光在入光口16经过所述目标位置时进入发射光光纤13,传输至光强检测装置14;光强检测装置14用于确定所述发射光的荧光信号强度。
本申请实施例中,光源11为能够激发荧光物质的光源,例如紫外灯、激光、LED等,在一个实施例中,光源11为能量强、脉宽窄的LED紫外灯。光源11与激发光光纤12耦合是指,光源11发出的激发光能够直接或通过其他部件射入激发光光纤12。发射光光纤13与光强检测装置14耦合是指,经发射光光纤13传输的发射光能够直接或通过其他部件入射到光强检测装置14上。光强检测装置可以根据实际需要进行选择,例如光电倍增管、光敏二极管、硅光电池等。
如图2所示,为本申请另一实施例示出的荧光免疫分析装置的示意图,图2中,光源11产生的激发光通过透镜组21、滤光片22进入激发光光纤12。其中,透镜组21以及滤光片22可以根据实际需要进行选择,以光源11为LED紫外灯为例,透镜组21可以为紫外透镜组,滤光片22可以为紫外滤光片,LED紫外灯产生的激发光通过紫外透镜组聚集到激发光光纤的一端,紫外滤光片对激发光滤光后获得紫外光,通过光纤传导由激发光光纤12的出光口射出。在一个实施例中,激发光光纤12的出光口所在平面、发射光光纤13的入光口所在平面均与层析试纸所在平面平行。
本申请实施例中,激发光光纤12与发射光光纤13能够相对层析试纸的目标区域移动,应理解的是,相对移动可以是激发光光纤12与发射光光纤13运动,层析试纸的目标区域不动,也可以是激发光光纤12与发射光光纤13不动,层析试纸的目标区域运动,或者激发光光纤12与发射光光纤13、层析试纸的目标区域均运动。
目标区域可以是层析试纸的所有区域,也可以是层析试纸的部分区域,例如,目标区域为包括层析试纸T带在内的测试区域。在一个实施例中,在层析试纸的样品垫上滴入标记有长寿命荧光物质的样本,样本可以为全血、血清、血浆、尿液或其他体液,或稀释后的上述样本,样本中包含的生物物质可以是能够通过层析方式检测的大分子蛋白质、小分子半抗原、核酸或寡核苷酸中的一种或多种。样本可以通过毛细作用在层析试纸上向前层析,标记有长寿命荧光物质的生物物质可以被固定在T带,当受到激发光的照射时,形成发射光,即荧光。发射光通过入光口16进入发射光光纤13,传输至光强检测装置14,通过光强检测装置14检测长寿命荧光物质形成的发射光的荧光强度,可以确定标记有长寿命荧光物质的生物物质的浓度。
应理解的是,层析试纸本身也可以存在荧光物质,当激发光照射到层析试纸上时,除了长寿命荧光物质形成发射光,其他荧光物质也会被激发形成发射光,通常来讲,这些荧光物质的寿命比长寿命荧光物质的寿命短,产生的荧光也会较快衰减完毕。因此,本申请实施例中,通过控制出光口15和入光口16先后通过目标位置,利用出光口15和入光口16到达目标位置的时间差,使得短寿命荧光物质激发形成的发射光在入光口16到达目标位置之前就衰减完毕,长寿命荧光物质形成的发射光在入光口16到达目标位置时被接收。有效的避免了其他荧光物质的干扰,提高了检测长寿命荧光强度的准确度。
本申请实施例中,通过激发光光纤12相对层析试纸的运动,可以使激发光对目标区域进行逐点扫描或逐行扫描,为了能够对整个目标区域进行扫描,在一个实施例中,可以控制发激发光纤12和发射光光纤13做连续往返运动,或控制层析试纸做连续一维运动,使层析试纸做连续的进给运动,完成对整个目标区域的扫描。
光强检测装置14可以包括光敏二极管、硅光电池、光电倍增管等元件,用于将光信号转变为电信号,还可以包括控制器,用于根据电信号确定光强。在一个实施例中,激发光对目标区域进行逐点扫描,当完成对目标区域的扫描后,光强检测装置14对接收到的光信号进行处理,可以得到一密集的测试点的序列测试值,该测试点对应激发光的每个激发点,根据序列测试值绘制拟合曲线,并计算该曲线波峰的面积,从而确定荧光信号的强度。
可选地,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述荧光免疫分析装置还包括:运动机构,用于驱动出光口15和入光口16以预设速度相对所述目标区域移动;在出光口15和入光口16以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在入光口16经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在入光口16到达所述目标位置前已经衰减完毕。
本申请实施例中,第一荧光物质可以为长寿命荧光物质,第二荧光物质可以为短寿命荧光物质。长寿命荧光物质可以根据需要来进行选择,在一个实施例中,长寿命荧光物质可以包含镧系元素,例如稀土离子螯合物或包含有稀土离子螯合物的高分子荧光纳米微粒。预设速度可以为默认值,也可以根据荧光标记物质来确定。例如,以荧光物质为镧系元素为例,由于镧系元素的发射光延续时间为100~1000微秒,因此,可以控制激发光光纤的出光口15与发射光光纤的入光口16经过目标位置的时间差为100~1000微秒。在该时间差内,普通荧光,如层析试纸的背景荧光,已经衰减完毕,当入光口16到达目标位置时,只有镧系元素激发出的发射光能够射入入光口16,避免了背景荧光的干扰。根据时间差,以及根据出光口15与入光口16之间的距离,即可确定运动机构驱动出光口15和入光口16的预设速度。
应理解的是,运动机构还可以驱动用于放置层析试纸的样品台运动,只要能够使层析试纸与激发光光纤、发射光光纤之间相对运动,达到激发光光纤与发射光光纤先后到达目标位置即可。
可选地,激发光光纤12的第一段121与发射光光纤13的第二段131相邻设置,第一段121包括出光口15,第二段131包括入光口16。
如图2所示,第一段121与第二段131沿与层析试纸相对运动的方向相邻设置,在一个实施例中,第一段121与第二段131可以通过粘贴、绑定等方式固定在一起,两根光纤中心之间的距离为两根光纤半径之和。那么根据两根光纤半径之和以及时间差,则可以确定运动机构的预设速度。应理解的是,两根光纤中心之间的距离可以大于或等于两根光纤的半径之和,例如,当两根光纤之间使用铝箔来屏蔽其他光时,需要考虑到铝箔的厚度,此时两根光纤中心之间的距离大于两根光纤的半径之和。激发光光纤12和发射光光纤13的直径可以根据实际需要进行选择,在一个实施例中,激发光光纤12和发射光光纤13的直径均为125微米。
可选地,发射光光纤13的直径大于或等于激发光光纤12的直径。为了防止长寿命荧光物质产生的激发光被漏接,可以将发射光光纤12做粗,扩大发射光光纤12的接收范围,在一个实施例中,通过调整发射光光纤12的直径是的处于距离入光口中心100~900微米范围内的荧光都能进入发射光光纤内。发射光光纤和激发光光纤的直径可以根据实际需要来进行设置,在一个实施例中,发射光光纤和激发光光纤直径的比值范围为1:1~5:1。
可选地,出光口15到所述层析试纸之间的距离小于入光口16到所述层析试纸之间的距离。为了防止普通荧光物质产生的发射光进入发射光光纤,本申请实施例中,可以增加入光口16到层析试纸之间的距离,来延长发射光进入入光口16的距离,从而延长发射光进入入光口16的时间,使得普通荧光能够全部衰减完全,无法进入发射光光纤13。
应理解的是,由于激发光可能存在对光强检测装置14对荧光强度检测的干扰,即,激发光可能会进入发射光光纤13传输至光强检测装置14处。为了避免激发光的干扰,本申请实施例中,可以将激发光光纤12与发射光光纤13用铝箔或者金箔隔开,如图1所示,发射光光纤外周包括了一层厚度为1微米的铝箔。
另外,为了避免其他光的干扰,本申请实施例中,还可以在入光口16处设置滤光片,以过滤除长寿命荧光以外的其他光。
可选地,出光口15的中心与目标中心之间的连线方向,与出光口15和入光口16的移动方向平行,所述目标中心为入光口16的中心在出光口15所在平面上的投影。
请参考图3,为本申请实施例中出光口的中心与目标中心的连线方向与运动方向存在夹角的示意图,当出光口15的中心与目标中心的连线与运动方向不平行时,荧光物质激发后的部分发射光有可能无法被发射光光纤接收到,因此,为了保证发射光能够全部被接收,需要使出光口15的中心与目标中心的连线方向与运动方向平行,这里的平行,可以是连线方向与运动方向之间的夹角小于一阈值。
另外,为了保证发射光能够全部被接收,所述装置还包括:一根或多根接收光光纤,垂直于入射光光纤13移动方向设置,且与入射光光纤13并排设置,用于接收所述发射光。
请参考图4,为本申请实施例中接收光光纤的位置示意图,由于并排设置了一根或多根接收光光纤41,当出光口15的中心与目标中心的连线方向与运动方向不平行时,无法进入入光口16的发射光可以通过接收光光纤41被接收。在一个实施例中,接收光光纤41与光强检测装置14耦合,能够将接收到的发射光传输至光强检测装置14,光强检测装置14根据发射光光纤13以及接收光光线41传输的发射光,来确定荧光强度。
可选地,入光口16在经过所述目标区域中的空白区域的任一位置时,所述任一位置的本底荧光通过入光口16进入所述发射光光纤;光强检测装置14,用于根据所述第一发射光以及所述本底荧光,确定所述目标位置处的荧光光强。
本申请实施例中,层析试纸的目标区域中包括标记有长寿命荧光物质的生物物质区域,还包括有不含有长寿命荧光物质的生物物质区域。在一个实施例中,目标区域包括固定了捕获探针的区域,能够固定标记有长寿命荧光物质的生物物质,还包括未固定捕获探针的空白区域。当出光口15和入光口16通过多次运动对目标区域扫描时,在固定了捕获探针的区域接收到长寿命荧光物质形成的发射光,确定与长寿命荧光物质形成的长寿命荧光信号强度。由于荧光免疫分析装置本身的一些元器件也可能存在荧光,即存在本底荧光,因此,在对目标区域进行扫描时,在每个扫描点都可能会有本底荧光进入发射光光纤13,对长寿命荧光信号产生干扰。因此,本申请实施例中,在对空白区域进行多次扫描时,对空白区域的本底荧光信号进行接收,确定出本底荧光信号的平均强度,在长寿命荧光信号强度中减去该本底荧光信号的平均强度,得到最终的长寿命荧光信号的强度,使得结果更加准确。
实施例二
如图5所示,为本申请实施例提供的另一种荧光免疫分析装置的框图,该装置包括光学系统、层析试纸驱动系统、信号检测与控制系统。
光学系统,包括LED紫外灯、紫外滤光片、紫外透镜组、激发光光纤、发射光光纤、光电倍增管。其中,LED紫外灯作为光源,产生的光经过紫外透镜组聚集到激发光光纤的一端,紫外滤光片对激发光进行滤光后得到紫外光,紫外光通过光纤传到由出光口射出,照射到层析试纸上的目标区域。目标区域上的被检测物质被标记有长寿命荧光物质,在在外光的激发下,长寿命荧光物质产生发射光,由发射光光纤的入光口进入发射光光纤,传导到光电倍增管的靶面上,光电倍增管将光信号转变为电信号。
层析试纸驱动系统,可以包括功率放大器、高精度步进电机、XY位移和光电开关,四个元器件依次串接。层析试纸在高精度步进电机的驱动下,做连续一维运动,使层析试纸做连续的进给运动,以实现对目标区域的逐点或逐行扫描。功率放大器还连接单片机MCU(Microcontroller Unit,微控制单元),MCU分别连接RAM、EPROM、键盘、显示器、打印机及电源,通电后光源产生的激发光扫描目标区域,通过依次串接光电倍增管、前置放大器、信号放大及甄别器、A/D转换电路将检测到信号输入单片机MCU。
信号检测与控制系统,其工作过程如下:层析试纸的目标区域的目标位置在被激发光光纤出光口射出的激发光激发后,出光口通过放置有层析试纸的样品平台移动,移动到相邻的位置,此时,产生的长寿命荧光和背景荧光经过衰减,当与出光口距离一定长度的发射光光纤的入光口到达目标位置时,距离入光口中心一预设范围内的长寿命荧光进入发射光光纤,并经过滤光片进入光电倍增管,将光信号变成荧光强度信号,被单片机记录下来,激发光光纤和发射光光纤连续对运动路径上的样品点进行扫描,可以不断进行长寿命的荧光的强度探测,而短寿命的荧光在发射光光纤的入光口到达前已经衰减掉,不能进入光纤,因此探测不到,避免了背景荧光的干扰,实现了时间分辨荧光检测。
实施例三
本公开实施例提供一种荧光免疫分析方法,应用于荧光免疫分析装置中,所述荧光免疫分析装置包括:光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置,该方法包括:
控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,其中,所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;
获取发射光,所述发射光为所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置上,激发所述目标位置上的荧光物质形成的发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;
根据所述发射光,确定所述发射光的荧光信号强度。
可选地,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,包括:
控制所述出光口与所述入光口以预设速度相对所述目标区域移动;
其中,所述出光口和所述入光口以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在所述入光口到达所述目标位置前已经衰减完毕。
可选地,所述方法还包括:
获取所述荧光免疫分析装置的本底荧光信号;
所述根据所述发射光,确定所述发射光的荧光信号强度,包括:
根据所述发射光,以及所述本底荧光,确定所述发射光的荧光信号强度。
关于上述方法,其中各步骤的具体方式已经在本申请提供的荧光免疫分析装置的实施例中进行了详细描述,此处将不做详细阐述说明。
实施例四
本申请实施例中,层析试纸的制备可以通过以下方式来制备。
1、抗D二聚体单克隆抗体致敏有机高分子荧光纳米微粒(EDC法)
搅拌下将5ml表面带-COOH的有机高分子荧光纳米微粒(含Eu3+螯合物,Thermofisher,95nm)对0.1M pH6.2的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)缓冲液透析24小时,取出置于洁净的玻璃小瓶中;加入水溶性EDC(碳二亚胺,Sigma)12mg,搅拌溶解,室温反应10min;加入抗D二聚体单克隆抗体1mg,搅拌均匀,4℃反应10min;将混合物上2×50cmsephadexG200柱,以50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.8,含0.9%NaCl)洗涤,收集第一个荧光纳米微粒标记的抗体峰。
2、制备标记物涂膜与抗体包被硝纤膜
取连接有抗D二聚体单克隆抗体标记的荧光纳米微粒,与稀释液混匀,配制成工作浓度;将溶液加入Biodot喷涂机的Airjet喷头储存瓶中;设定压力为16PSI,聚酯膜的移动速度为50mm/s;每条喷2遍;真空干燥箱中于37℃烘干12h,放入铝薄袋中,加入干燥剂,热合封口,4℃保存。
硝纤膜(NC膜)组件的制备:NC膜活化处理,水洗,干燥;将抗D二聚体单克隆抗体以0.1M磷酸盐缓冲液稀释至1.5mg/ml;将抗D二聚体单克隆抗体喷涂于测试区(T带),干燥前以2B铅笔标明测试区的确切位置与宽度(约1.5-2.5mm);完成包被后,置37℃干燥箱24h;用含1%BSA、0.5%酪蛋白、1%表面活性剂的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.0)封闭处理30min;用洗液抽洗一次;37℃干燥箱干燥备用。
3、组装
请参考图6,在湿度小于30%的室温条件下将包被有抗D二聚体测试区70的NC膜71粘于支撑片基的不干胶上;将含荧光纳米微粒的聚酯膜72、玻纤膜73、滤纸74按要求重叠组装于NC膜71上,使聚酯膜即标记物垫72的下端与NC膜71上端重叠2mm,玻纤膜即样品垫73的下端与聚酯膜72的荧光纳米微粒吸附区重叠3mm,滤纸74,即吸收垫置于NC膜11的另一端,与NC膜重叠3mm,压紧;将组装的层析试卡入检测卡外壳内。
4、二聚体标准品的配制与标定
以50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5,含0.9%NaCl,5%BSA,0.05NaN3)将婴儿脐带血清(含高浓度D二聚体)稀释成七个不同D二聚体浓度的标准品;以Wallac公司D二聚体TRIFMA(时间分辨免疫荧光分析)试剂盒测定其浓度,取七个不同浓度,分别为0、0.1、0.5、1、2、5、10mg/L。
将制备好的D二聚体荧光免疫定量测定层析试纸样品垫上加入不同浓度D二聚体抗原标准品,每个浓度设3个重复,10分钟后,通过本申请的荧光免疫分析装置读取检测线和质控线信号,实验结果及分析见表1。
表1
以D二聚体抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线,如图7所示,图7中的横坐标为标准品浓度,纵坐标为样品信号。
下面,分别对本申请提供的荧光免疫分析装置测定结果的线性范围、灵敏度(最低检测限)、重复性和准确性来进行说明。
首先,对于检测线性范围,采用上述制备的层析试纸,做检测线性范围实验。取D二聚体标准品,用生理盐水稀释成8个浓度,其浓度范围是0.1mg/L-10mg/L,每个浓度重复测定3次,将测定浓度的平局值与理论浓度进行线性回归分析,计算回归方程y=325.44x-0.3759,相关系数r=0.99995,表明层析试纸在0.1mg/L-10mg/L线性范围内相关性很好,如图7所示。
其次,对于灵敏度(最低检测限),以5%人血清白蛋白为空白样本,用上述制备的层析试纸进行测定,重复20次,计算结果均值为0.011,标准差SD为0.003,根据以空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫分析装置测定读数变化量为0.093。用稀释后浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L和0.15mg/L的D二聚体标准品溶液测定,用本申请提供的荧光免疫分析装置测定读数变化值分别为0.045、0.098、0.112,因此,层析试纸检测D二聚体灵敏度为0.05mg/L。
再次,对于重复性和准确性,配制0.5mg/L和1.0mg/L的D二聚体标准品溶液,采用上述制备的层析试纸进行测定,各浓度分别重复测定5次,分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察,结果显示变异系数分别为3.17%和3.67%;以(1-均值/标准值)×100%计算相对偏差进行准确度考察,相对偏差分别为1.1%和3%。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的普通技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种荧光免疫分析装置,其特征在于,所述装置包括:
光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置;
所述光源与所述激发光光纤耦合,所述发射光光纤与所述光强检测装置耦合,所述激发光光纤与所述发射光光纤能够相对层析试纸的目标区域移动;
在所述激发光光纤与所述发射光光纤相对所述层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;
所述出光口经过所述目标位置时,所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置,以激发所述目标位置上的荧光物质,形成发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;
所述光强检测装置用于确定所述发射光的荧光信号强度。
2.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述荧光免疫分析装置还包括:
运动机构,用于驱动所述出光口和所述入光口以预设速度相对所述目标区域移动;
在所述出光口和所述入光口以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在所述入光口到达所述目标位置前已经衰减完毕。
3.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述激发光光纤的第一段与所述发射光光纤的第二段相邻设置,所述第一段包括所述出光口,所述第二段包括所述入光口。
4.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述发射光光纤的直径大于或等于所述激发光光纤的直径。
5.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述出光口到所述层析试纸之间的距离小于所述入光口到所述层析试纸之间的距离。
6.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述出光口的中心与目标中心之间的连线方向,与所述出光口和所述入光口的移动方向平行,所述目标中心为所述入光口的中心在所述出光口所在平面上的投影。
7.根据权利要求1所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述装置还包括:一根或多根接收光光纤,垂直于所述入射光光纤移动方向设置,且与所述入射光光纤并排设置,用于接收所述发射光。
8.根据权利要求2所述的荧光免疫分析装置,其特征在于,所述入光口在经过所述目标区域中的空白区域的任一位置时,所述任一位置的本底荧光通过所述入光口进入所述发射光光纤;
所述光强检测装置,用于根据所述第一发射光以及所述本底荧光,确定所述目标位置处的荧光光强。
9.一种荧光免疫分析方法,应用于荧光免疫分析装置中,其特征在于,所述荧光免疫分析装置包括:光源、激发光光纤、发射光光纤、光强检测装置,
所述方法包括:
控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,其中,所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸移动时,所述激发光光纤的出光口与所述发射光光纤的入光口先后通过所述目标区域上的同一目标位置;
获取发射光,所述发射光为所述光源产生的激发光通过所述出光口射出照射到所述目标位置上,激发所述目标位置上的荧光物质形成的发射光,所述发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,传输至所述光强检测装置;
根据所述发射光,确定所述发射光的荧光信号强度。
10.根据权利要求9所述的荧光免疫分析方法,其特征在于,当所述目标位置上的所述荧光物质包括第一荧光物质和第二荧光物质,且所述第一荧光物质的寿命高于所述第二荧光物质的寿命时,所述控制所述激光光光纤与所述发射光光纤相对层析试纸的目标区域移动,包括:
控制所述出光口与所述入光口以预设速度相对所述目标区域移动;
其中,所述出光口和所述入光口以所述预设速度先后经过所述目标位置时,所述激发光能够激发所述目标位置处的所述第一荧光物质形成第一发射光,以及激发所述目标位置处的所述第二荧光物质形成第二发射光,所述第一发射光在所述入光口经过所述目标位置时进入所述发射光光纤,所述第二发射光在所述入光口到达所述目标位置前已经衰减完毕。
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