JPH03506078A - 化学的試験方法において使用する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学的試験方法において使用する装置 本発明は、化学的、、生化学的または臨床的試験方法において使用する装置、そ れらの製造方法、および該装置の使用方法に関する。

より詳しくは、本発明は、中でもイムノアッセイが重要なグループを構成してい る特異的結合アッセイにおける使用に適する装置に関する。

少量の試験試料の処理および測定のための様々な分析装置が従来技術において記 載されている。特に、ＩＥ［’−Ａ−１’、’１１４ｇは、好都合に製造するこ とができ且つ非常に少量の液体試料を使った特異的結合アッセイに適当であるキ ャピラリー充填セル装置を記載している。それらの装置は、各々が毛管作用によ り試料液をキャビティ中に吸込むことができる程十分に小さい寸法を有する１ま たは複数のキャビティを有し、ここで前記キャビティの表面は、該装置中で実施 される試験に適当な固定化試薬を担持しており、そして前記表面は、光透過性導 波管として働くように改造され且つキャビティの壁を形成している透明固体プレ ートの表面であり、前記プレートは、実質上光学的に平滑であり（「光学縁」） そして該プレートの水平面に対して例えば成る横断角で横断するが最も好ましく は垂直である縁を有する。そのような装置は、便利な試料の捕集および前記固定 化試薬と試料との反応生成物のその場での光学分析を可能にする。導波プレート は、使用することになっている波長の輻射線、例えば赤外、可視および／または 紫外光に対して透過性であるべきであり、そしてＢＰ−Ａ−１７１１４８に記載 の装置を使った１つの方法は、アッセイ方法およびアッセイしようとする試料に 依存して異なるであろう程度に蛍光物質が固定化試薬に結合するように準備し、 次いで生成した結合した蛍光物質の光学測定を行うものである。

ＥＰ・−Ａ−１７１１４８は、アッセイの幾つかの形式が、試薬含有導波管表面 の反対側のキャピラリーキャビティの壁が光吸収性、不透明または反射性材料か ら作られているのが適切であり得る可能性、即ち装置が第１図に描写され下記に 詳細に記載される構造を有する可能性を開示している。

分析物溶液中の蛍光団と導波管表面に結合した蛍光団から生じる蛍光の角度分布 の相違は当業界において公知である。

理想条件下では、導波管の縁から出てくる蛍光の角度識別は、他の発光シグナル を区別するのに十分であろう。しかしながら１、実際には、装置中の様々な欠陥 が、溶液中の蛍光団からの蛍光を散乱させ、そして通常はエバネッセント結合し た蛍光に関係づけられる角度において光学縁から、即ち表面結合した蛍光団から 出現させ得る。

本発明者らは、驚くべきことに、試薬を有する導波管表面と反対側のキャピラリ ーセルの壁はアッセイに関与する波長の輻射線に対して透明な材料から形成され ているが、前記透明材料の１もしくは複数の外側表面、好ましくは少なくとも導 波管に平行な表面に、不透明または光吸収性材料の層が適用されるならば、第１ 図に描写された構造を含むＥＰ−Ａ−ｉ７１１４８に記載の構造物を上回る有意 に改善された性能によって、この問題が解決できることを見出した。「不透明層 」なる用語は、以後、そのような不透明または光吸収性材料の層を意味するのに 用いられる。

本発明の１つの観点によれば、特異的反応性試料捕集および試験装置が提供され 、該装置は、毛管作用により試料液をキャビティ中に吸込むことができる程十分 に小さい寸法を有する１または複数のキャビティを有し、前記１または複数のキ ャビティの１表面は、該装置中で実施される試験に適当な固定化試薬を担持して おり、前記表面は、光透過性導波管として働くように改造された第一の透明固体 プレートの表面であり、前記プレートは、実質上光学的に平滑であり且つ該プレ ートの平面に対して横断する縁を有し、前記装置は、前記導波管と反対側の１ま たは複数のキャビティの壁が第二の透明プレートを含んで成ることを特徴とし、 前記第二の透明プレートがキャビティから遠い方の表面上に光吸収性または不透 明材料を担持している。

上述した様に、第一の透明固体プレートは、該プレートの水平面に対して横断す る縁を有する。前記縁は、任意の横断角であることができるが、最も好ましくは 垂直である。

ある態様では、本発明は、試料液中に存在する分析物の蛍光イムノアッセイまた は発光イムノアッセイに使用される装置も提供する。該装置は、試験しようとす る試料液の一定量を捕集および保持するための平面キャピラリーセルを含んで成 り、前記キャピラリーセルは、一方の端にキャピラリーキャビティ中への試料液 の進入を可能にする第一の開口および他方の端には試料液で満たされるにつれて キャビラリーキャビテ、イからの空気の排出を可能にする第二の開口を有するキ ャピラリーキャビティを限定している、向かい合わせに固定された内側表面を提 供するように、間に空隙を有する一緒に固定されそして２つの対辺に沿ってシー ルされた一対の平らで平行な２枚のプレートを含んで成る。ここで、前記プレー トの一方は、導波管の水平面に対して横断し且つシールされた辺に対して垂直で ある光学的に平滑な縁を有する光透過性導波管であり、前記導波管は、使用中キ ャピラリーキャビティ内部に捕集された試料液と接触するように、内側表面の少 なくとも一部分に、標識リガンドを直接的または間接的に結合することのできる 固定化試薬を結合しており、前記固定化試薬と前記標識リガンドは、該装置中で 実施することになっている分析物についての試験に適するものであり、標識リガ ンドは、使用時に捕集された試料液と接触しそして試料液中に遊離されるように 、前記装置内部に遊離できるように保持される。そして他方のプレートは、キャ ビティから遠い方の表面上に、光吸収性または不透明材料を担持している。

便宜上、光吸収性または不透明材料を担持している第二の透明プレートの表面を 、本明細書中では、前記プレートの外側表面と称し、該プレートの反対表面を内 側表面と称する。

成る状況下では、前記外側表面に加えて、キャピラリーキャビテイ壁の内側表面 の一部分のみ、即ち第二の透明プレートの内側表面の一部分のみが、光吸収性ま たは不透明材料を担持しているならば、有利であり得ることを本発明者らは発見 した。

従って、本発明の更なる観点によれば、特異的反応性試料捕集および試験装置を 提供し、該装置は、毛管作用により試料液をキャビティ中に吸込むことができる 程十分に小さい寸法を有するｌまたは複数のキャビティを有し、前記ｌまたは複 数のキャビティの１表面は、該装置中で実施される試験に適当な固定化試薬を担 持しており、前記表面は、光透過性導波管として働くように改造された第一の透 明固定プレートの表面であり、前記プレートは、実質上光学的に平滑であり且つ 該プレー）・の平面に対して横断する縁を有し、前記装置は、前記導波管と反対 側の１または複数のキャビティの壁が第二の透明プレートを含んで成り、前記第 二の透明プレートがその外側表面上に光吸収性または不透明材料の層を担持して おり、そして内側表面の一部分のみの上にも光吸収性または不透明材料の層を担 持していることを特徴とする。

本発明の装置は、ＩＥＰ−Ａ−１７１１４８に記載のものと大体同じであるが該 装置の適当な表面に光吸収性または不透明層を適用する追加の特徴を有する方法 により製造することができる。

本発明によれば、上述の特異的反応性試料捕集および試験装置の製造方法が提供 され、該方法は次の段階を含んで成る。

（ａ＞多数の該装置の部分を提供するであろうシート材料の表面上に固定化され た特異的反応性コーティングを形成せしめ、 （ｂ）前記コーティングされたシート材料と一緒になって多数の装置の各々に、 特異的反応性コーティングと接触した時に毛管現象により一定容儀の試料液を捕 集および保持するための毛管寸法のキャビティを提供する追加の構造物の１また は複数の表面上に光吸収性または不透明層を形成せしめ、そして （ｃ）各々が１または複数の試料捕集および試験装置を提供する部分にシート材 料を分割する。

この方法では、特異的反応性コーティングと外側の不透明層が両方とも連続であ るか、または成るパターン、例えば不連続部分のパターンに、例えば二次元配列 のバッチとして、分割することができる。そのようなバッチが形成される場合、 まず連続コーティングを形成せしめ次いでその一部分を除去して所望のパターン 、例えば不連続部分の配列を残すことによるか、またはバッチの配列（例えば、 スクリーン印刷したもの）として、それらを作製することができる。キャビテイ 壁の内側表面の一部分が不透明層を担持すべき場合、製造中に適用される適切な 不透明層は、もちろん不連続層として適用されるだろう。

特異的反応性コーティングは、直接的または間接的のいずれかでキャビティの表 面上に固定化され得る。例えば、特異的反応性コーティングが抗体である時、そ れ自体前記表面に結合している抗一種抗体を用いて間接固定化を行うことができ る。あるいは、抗体をビオチンと接合せしめ、そして前記表面上に予め固定化さ れたアビジンと複合体形成せしめることにより、固定化を行うことができる。直 接固定化は、適当な試薬（例えばアミノプロピルトリメトキシシランのようなシ ラン化試薬）での処理により前記表面を活性化させることによって行うことがで き、適当な架橋剤（例えばグルタルアルデヒド）を使ってそれに抗体を共有結合 させることができる。

従来技術の装置に関して既に述べたように、液体試料中のリガンドについてのア ッセイにおいて本発明の装置を用いる１つの方法は、アッセイやアッセイされる 試料物質に応じて異なるであろう程度に蛍光物質が固定化試薬に結合するように 準備し、次いで生成した結合した蛍光物質の光学測定を実施することである。

適当な蛍光物質は、典型的には、蛍光団で標識されたリガンド類似体またはアッ セイ中に蛍光団で標識されるリガンド特異的結合相手のいずれかである、補助試 薬を含んで成る。

アッセイを実施する時、試料を装置に導入する前に、蛍光物質を既知量において 液体試料中に導入することができる。あるいは、例えば可溶性保湿剤コーティン グを用いて、可溶性の遊離可能な形で装置内の表面上に蛍光物質を予め固定化す ることができる。後者の場合、装置中への試料液の導入が可溶性保湿剤コーティ ングを溶解し、それによって補助試薬が試料液中に分散されるようになる。

成る態様において、本発明は、次の段階を含んで成る上記方法を提供する： （ａ）装置中で実施される試験に適当な試薬を、光透過性導波管として働くこと ができ且つ多数の装置の部分を提供することができる透明なフラットシート材料 の表面上の部分に固定化し； （ｂ）追加の構造物の１表面上に光吸収性または不透明層を形成せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の前または後に、多数の装置の各装置に、２つの反対側に沿っ てシールされ且つその内側表面の少なくとも一部分上に固定化試薬を含有するキ ャピラリーキャビティを提供するように、間隙をあけて平行関係において前記シ ート材料に前記追加の構造物を取り付け、ここで前記キャピラリーキャビティは 、前記固定化試薬と接触すると毛管作用により一定容量の試料液を捕集および保 持するように改造されており：そして （ｄ）組立てたシートを部分に分割し、各部分は、各装置の透明シート材料がシ ートの平面に対し２て横断し且つシールされた側面に対して垂直である少なくと も１つの光学的に平滑な縁を有するような、１または複数の試料捕集および保持 装置を提供する。

本明細書中で使用する「リガンド類似体」という用語は、アッセイ中のリガンド と同じ特異的結合相手の同一結合部位と複合体形成することができる種を言い、 そして特に、アッセイ中の既知量のリガンドが範囲内に含まれる。

上記で定義した不透明層の適当な材料は、例えば、所望により熱もしくは赤外線 照射により硬化され得る黒色塗料、シリコーン塗料、顔料、または適当な光学的 および他の物理的性質を有する他の任意の（好ましくは不活性の）材料である。

そのような材料は、少なくともアッセイに関与する波長において、光を減衰また は吸収すべきである。材料の不透明層の厚さは、典型的には最小で３ミクロンで あろう。

本発明は蛍光に関して特定的に記載されるが、同様な考察を燐光および発光に応 用できることは理解されるであろう。

本発明のより良い理解のために、添付図面について言及する。

第１図は、ＢＰ−Ａ−１７１１４８において提案されたキャピラリー充填装置の 変形の断面図である。

第２図〜第６図は、本発明の様々な態様に従ったキャピラリー充填装置の断面図 である。

第７図は、第５図において断面とし、で示された本発明のキャピラリー充填装置 の平面図である。

第８図は、第２図の装置における溶液蛍光の減衰を概略的に示す。

第９図は、第３図の装置における溶液蛍光の減衰を概略的に示す。

第１０図は、本発明に従−２て′Ｔアッセイ実施するのに適当な簡易装置を概略 的に示す。

第１図について説明する。描写された装置は、上層の透明（例えばプラスチック 、シリカまたはガラス）プレー）・１と下層の透明プレー１−２を含んで成り、 両プレートは、適当な接着剤の接着跡（図示せず）により１−未満前れた実質」 二平行関係において一緒に固定された厚さほぼ１ｍｍのブｌノー１−である。そ のようにして形成されたセルキャビティ３は両端が外側に開かれており、そのた め毛管作用によって一方の口に試料が吸込まれる時、他方の口がら空気が排出で きる。この装置の下層プレート２はプレート１よりも大きく、装置から遠方に伸 びる区画４を有する。使用時、プレート２０区画４は、１滴の試料液を上に適用 することができる滞留性プラットホームとして働き、そのためこの液体は毛管作 用によりセルキャビティ：３を満たすことができる。

キャピラリーセルの内側表面上に固定化されているのは５、装置を使用する予定 の試験に関連した材料の層５である。第１図では、層５はプレート２上に担持さ れた材料のバッチである。イムノアッセイの場合、層５は、例えば関連の固定化 抗体であることができる。重層または隣接関係のいずれかにおいで、１より多く の層５が存在してもよい。

セルの内側表面上の平面１上に担持されているのは、光吸収性または不透明材料 の層６であり、この材料は、装置を使用する予定の試験の性質および使用する予 定の光の波長に適当なものである。

第２図は、本発明の態様に従ったキャピラリーセル装置の線断面図を示す。この 装置は、第（図に関連づけると上層の透明プレート７と下層の透明プレート８を 含んで成る。プ１）−ト８の表面上に反応層９が存在する。プレート７はその外 側表面上に不透明層ＩＯを担持している。

第３図は、本発明の別の態様に従ったキャピラリーセル装置の線断面図を示す。

プレー）・１１と１２は第１図および第２図と同じ関係で存在し；反応性層１３ が上記と同様に配置され得る。この態様では、ブＩ／−）１１は外側表面上に不 透明層１４を担持しており、そしてその反対表面（即ちセルキャビティの内側表 面）の一部分のみに類似または同一材料の層１５を担持している。

第４図は、本発明の更なる態様に従ったキャピラリーセル装置の線断面図を示す 。第２図に示した態様と同様に、上層プレート１７の外側表面上に不透明層１６ が配置される。しかしながら、第４図に示される態様では、上層と下層のプレー ト１７と１８は、各プレートが第１図に示した区画４と同様に滞留性プラットホ ームとして働くことができるように片寄らせである。

第５図は、本発明の別の態様に従ったキャピラリーセル装置の線断面図を示す。

同じく、上層プレート２２の外側表面上に不透明層２１が配置される。しかしな がら、この場合では、上層と下層のプレートの末端が滞留性プラットホームとな らないように整列される。

第６図は、本発明の別の態様に従ったキャピラリーセル装置の線断面図を示す。

この態様は第２図に示したものの変形であり、上層の透明プレート２４の内側表 面上に適当な蛍光物質を含む可溶性保湿剤材料の層２３を追加の特徴として有す る。

第７図は、第５図に示した装置の平面図を示す。不透明層２５は中央領域として 示される。上層プレートと下層プレートは、毛管寸法（例えば１００ミクロン） の空隙を作るために適当な直径のガラスバロチー二を含んだ適当な接着剤の接着 跡２６と２７により、所望の関係の位置に保持される。

第８図は、第２図に記載の本発明の装置において溶液中の蛍光団から生じた蛍光 の典型的光線および表面結合した蛍光団から生じた蛍光の典型的光線をたどった 進路を概略的に示す。試料／ガラス界面における屈折は、溶液蛍光団から出る光 線の幾つかの進路を、界面に対する臨界角よりも小さい界面における法線に対す る角度（試料溶液／ガラス界面については、それらの角度は典型的には法線に対 してＯ゛〜６０°の範囲にあるだろう）で」二層プレート３５中に伝える。それ らの光線は、不透明層３７との相互作用で減衰される。下層ガラスプレート３６ の表面上に固定された試薬に結合している蛍光分子（即ちエバネッセント領域内 ）は、エパネッセント波結合の結果として、全範囲の角度（即ち試料と下層ガラ スプレートとの界面における臨界角よりも大きい法線に対する角度を含む）に渡 り下層プレート３６中に光を放射する。それらの光線の幾°つかは、下層を通っ て「進行コし、不透明層３７と相互作用することなく末端３８から出てくるだろ う。従って、表面結合した蛍光団から生じる蛍光と溶液蛍光団から生じる蛍光と の識別が著しく高められる。

第９図は、′５Ｊ３図の装置における溶液蛍光団から生じた蛍光光線の進路を概 略的に示す。この状況下では、溶液蛍光から生じた光線の幾つかは、不透明層３ ９において減衰を受けるだけでなく、部分屈折の結果として更に不透明層４０等 において減衰を受ける。層３９と４０の両方と相互作用する光線は端４１から出 てくることができず、よって層４０の使用は、表面結合した蛍光団から生じる蛍 光と溶液蛍光団からのものとの更に優れた識別をもたらし得るので、感度を増加 させ得る。

第１Ｏ図は、本発明と関連して用いるのに適当な簡単な蛍光測定装置を略図形態 において示す。種々の部品の特定例を比較例Ａにおいて後述する。

適当な光源５１からの光は、レンズ５２により大まかに集束された後、アッセイ に関与する蛍光団を励起させるのに用いる波長の範囲を限定するフィルタースタ ック５３を通過する。別のレンズ５４が、装置５５を通して試験装置５６の所望 の領域上にこの光を集束させる。

試験装置５６の適当な縁から出た光（「発光」）は、装置５７次いで１または複 数のレンズ５８を通過する。更なる装置５９を用いて発光をモニタリングする角 度範囲を限定する。更なるフィルター６０を用いて成る波長の光（例えば励起波 長の光）を除去し、別のレンズ６１が残りの発光を光検出器上に集束させる。

本発明は、また、本発明の装置を使って試料中のリガンドについてアッセイする 方法を提供し、該方法は、（ａ）導波管の表面と接触している試料をインキュベ ートし、ここで前記導波管は前記装置の一部分であり、直接的または間接的のい ずれかにおいてその上に吸着されているかまたはそれに結合されでいる固定化試 薬は、インキュベーション中に補助試薬（蛍光団でａ識されたリガンド類似体ま たは蛍光団で標識された別の特異的結合相手のいずれかである）が直接的または 間接的に前記導波管の表面に結合するようになるような、検出を所望するリガン ドに対する特異的結合相手であり： （ｂ）試料液体中に存在する補助試薬と導波管に結合した補助試薬が励起される ような適当な光源からの光で前記装置を照射し；そして （Ｃ）補助試薬が複合体形成により前記導波管に結合したかどうか、および所望 であればその程度を測定するために、前記導波管から出てくる輻射線をモニタリ ングする、ことを含んで成る。

本発明のアッセイ方法において、第二の透明プレートがその外側表面と内側表面 の一部分のみとの両方に光吸収性または不透明材料を担持している態様の装置を 用いる時、光吸収性または不透明材料を担持していない前記第ニブレートの内側 表面の部分は、光源からの光で照射される第一プレートの領域と反対側にある部 分であろう。

本発明の方法は、特に抗原または抗体のアッセイ、即ちイムノアッセイに適用す ることができ、本発明の好ましい態様においては、リガンドが抗原であり、そし て特異的結合相手が前記抗原に対する抗体を含んで成る。しかしながら、本発明 は抗体と抗原のアッセイに限定されると解釈してはならない。本発明の方法によ りアッセイすることができるリガンドの例を、各場合において適当な特異的結合 相手の表示お一緒に下の第１表に示す。

第１表 抗　　原　　　　　　　　　　　特異的抗体抗　　体　　　　　　　　　　　　 　　抗　　原ホルモン　　　　　　　　　　　ホルモンレセプターホルモンレセ プター　　　　　　ホルモンポリヌクレオチド鎗　　　　　　相補的ポリヌクレ オチド鎖アビジン　　　　　　　　　　　ビオチンビオチン　　　　　　　　　 　　アビジンプロティンＡ　　　　　　　　　免疫グロブリン免疫グロブリン　 　　　　　　　プロティンＡ酵素補因子（基質）または　　　酵　　素阻害剤 レクチン　　　　　　　　　　　特異的炭水化物本発明の方法は非常に広範な利 用可能性を有するが、特に次のものをアッセイするのに用いることができる：ホ ルモン、例えばペプチドホルモン〔例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＩ）、黄体 形成ホルモン（Ｌｌ（）、、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）　、濾胞刺 激ホルモン（ＦＳＩ（）　、インスリンおよびプロラクチン〕もしくは非ペプチ ドホルモン〔例えばステロイドホルモン、例えばコルチゾール、エストラジオー ル、プロゲステロンおよびテストステロン、または甲状腺ホルモン、例えばチロ キシン（Ｔ４）およびトリョードチロニン〕、タンパク質〔例えばガン胎児性抗 原（ＣＥＡ）およびアルファフェトプロティン（ＡＦＰ）　）　、薬剤（例えば ジゴキシン）、糖、毒素、ビタミン、タンパク質、ウィルス、例えばインフルエ ンザウィルス、バラ−インフルエンザウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス 、呼吸ウィルスおよびＡＩＤＳウィルス、または微生物。

本明細書中で使用する「抗体」なる用語は、その範囲内に次のものを包含すると 解釈されるだろう：（ａ）常用される任意の動物、例えばヒツジ、ウサギ、ヤギ またはマウス由来の免疫グロブリンの様々なりラスまたはサブクラスのいずれか 、例えばｉｇＧ、　ＩｇＡ、　ｉｇＭまたは１１；（ｂ）モノクローナル抗体； （Ｃ）モノクロ−カルまたはポリクローナル抗体の完全分子または「断片」　； ここで断片は、抗体の結合領域を含むもの、即ちＦｃ部分を欠く断片（例えばＦ ａｂ、　Ｆａｂ’　、　Ｆ（ａｂ’　）、）または完全抗体中の重鎮を結合して いるジスルフィド結合の還元的開裂により得られたいわ１ゆる「半分子」断片で ある。

抗体断片の調製方法は当業界で周知であり５、従って本明細書中には記載しない 。

本明細書中で使用する「抗原】なる用語は、永久的に抗原性の種（例えばタンパ ク質、細菌、細菌断片、細胞、細胞断片およびウィルス）および適当な条件下で 抗原性になり得るハプテンの両方を包含すると解釈されるだろう。

本発明のアッセイ方法において使用できる蛍光団の例としては、フルオレセイン インチオシアネ−１−（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート、ルシフェ リンイエロー、２．４−ジニトロフルオロベンゼン、フェニルインチオシアネー トおよびダンシルクロリド、ＸＲｌＴＣ，ＴＲＩＴＣおよびフィコビリタンパク 質（例えばアロフィコシアニンおよびフイコエリトリン）が挙げられる。

本発明は更に、上記のような本発明のアッセイ方法における使用に適当な装置を 提供する。この装置は、使用中８、輻射線が結合した蛍光団と遊離の蛍光団の両 方を励起させるような角度において上記の本発明の装置に入るように配７置する ことができる輻射線源、および出てきた輻射線をモニタリングするための手段を 含んで成る。更なる態様においでは、該装置はマスクを経て照明され、それによ って結合反応が起こる装置の有効容量を限定することができる。有効容量は、装 置の下層ブ１．／−１−と上層プレートとの間の距離２・照明帯の面積との積で ある。

１ｍｍの厚さを有する一枚のＰｅｒｍａ、ｂｉｏｃ力°ラス（Ｐｉｌｋｉｒ４ｔ ｏｎＧｌａｓｓ　Ｌｔｄ９．　Ｓｔ　Ｈｅ１ｅｎｓ、　Ｕに）を、超純水中の洗 剤（例えばＴｗｅｅｎ　２０）を使って超音波振動により洗浄した。これをアミ ノプロピルトリエトキシシランの２％水溶液中で３〜４のｐｌ（において２５℃ で２時間インキュベートすることにより、ガラスの表面を活性化した。水中です すいだ後、ガラス板を１１５℃で４時間以上乾燥させた。次いでこのガラスを０ ．０５Ｍ＋、）ン酸緩衝液（ｐＨ７）中の２．５％グルタルアルデヒド溶液中で ６０分間インキコベートし、次いで蒸留水で徹底的に洗浄した。

このガラスをリン酸緩衝液中のｈＣＧに対するモノクローナル抗体の１％溶液中 で２〜４時間インキュベートした。次に緩衝液でガラス板を洗浄した。既知のや り方で６Ｍ尿素溶液を浸透させることにより１、望ましくない吸着タンパク質を 除去段階（ｉ）から得られた導波管基板上に、キャピラリーセル装置の長さ方向 の縁を決めるパターンにおいて、直径１００ミクロンのガラス微小球（Ｊｅｎｃ ｏｎｓ　１．ｔｄ、、　ＵＫ）を含む紫外線硬化接着剤（ＵＶＳ　９１．　Ｎｏ ｒｌａｎｄ　Ｉｎｃｌ、　ｌｌ５Ａ）の接着跡をスクリーン印刷することにより 、ＥＰ−Ａ−１７１１４８中に記載されたような試験装置を製作した。次いで一 枚の透明なＰｅｒｍａｂｌｏｃガラス板を導波管基板上に置き、この積層板に減 圧を適用した。減圧の結果、上板のガラスが接着剤上に押しつけられ、ガラス微 小球がガラス板の間に１００ミクロンの隙間を限定するようにした。次いで接着 剤を硬化させるために、この積層板を紫外線光源に暴露した。最後に、標準的な ガラス罫書および破断法を使って、積層板を個々の試験装置に作り上げた。

（ｉｉｉ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に接合したＰＩＴＣ （Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ、、　ＩＪＫ）２ ００ｍｇと異なる抗原決定基に特異的なｈＣＧに対する第二モノクローナル抗体 ５■を、炭酸水素すＩ−ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９，０）　１．４ｍｌ中で一緒に 混合した。この混合物を室温で１８時間放置しておくと、その間にモノクローナ ル抗体へのＦＩＴＣの接合が起こった。次いで超精密５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５ ０上でのゲル濾過により、混合物を精製した。

（ｉｖ）　ｈＣＧ標準液の調製 一次国際標準調製物（７５１５３７）に対して検量されたｈＣＧの凍結乾燥調製 物をＢｉｏｄａｔａ　ＳｐＡ、　Ｍｉ、１ａｎ、　’　Ｉｔａｌｙから入手した 。

この試料をウマ血清（Ｓｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ、、　Ｗ ｏｒｋｉｎｇ。

ＵＫ）中に希釈し、必要とする範囲のｈＣＧ標準液を得た。

（ｖ）　ｈＣＧアッセイの測定に使用する装置第１０図は、適当なアッセイ測定 を行うのに使った簡易蛍光測定装置を示す。キセノンフラッシュランプ５１　（ Ｈｅｉｎｍａｎｎ）からの光は、Ｆｌ、ＴＣ標識抗体を励起させるのに用いる波 長域を限定するフィルタースタック５３を通過する前にレンズ５２により集束さ れる。フィルタースタックは、３つのフィルター：８Ｇ７５ｃｈｏｔｔガラスフ イルター（Ｈａｔｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　０ｐｔｉｃｓ　ｉＪＫ　Ｌｔｄ、。

Ｗａｔｆｏｒｄ、　　ＵＫ）、　４５０−４８０ｎｍ　ＦｉＴＣ通過幅妨害フィ ルター（Ｏｐｔ、ｏｍｅｔｒｉｃｓ　Ｌｔ、ｄ、、　ＩＪＫ）および４７５ｎｌ ！ｌ短波通過妨害フィルター（Ｃｏｍａｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、 、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＩＪＫ）を有する。第二レンズ５４は、照明領域お よび試験セルの活性容量を限定する窓５５を通して試験セル５６の活性表面上に 励起光を集束させる。

試験セルの光学縁から出た光は、溶液から直接出た光が検出光学素子に入るのを 防ぐ窓５７を通過する。レンズ系５８は発光を集束し、そして窓５９は発光が測 定される角度範囲を限定する。これは、エバネッセント結合した蛍光発光に関連 づけられる角度と一致するように選択された。５ｃｈｏｔｔ　０Ｇ５１５５１５ ｎｍ、−、）ｒｙイド状ガラス長波通過フィルター６０（Ｅａｌｉｎｇ　Ｅｌｅ ｃｔｒ。

０ｐｔｉｃｓ　ＩＪＫ　！、ｔｄ。、　Ｗａｔ、ｆｏｒｄ、　ＩＪＫ）はいずれ かの分散した励起光を除去（〜５．そして第二のレンズ６１は光電子増倍管検出 器６２（ｌｉａｍａｍａｔｓｕ　Ｒ，９３１Ａ、　Ｈａｔ＜ｕｔｏ　ＵＫ　Ｌｔ ｄ、、）上に発光を集束させる。

１ｉＣＧについてのアッセイ手順 ｃｘ　ｈＣＧ−ＦＩＴＣ接合体をｈＣＧ標準液の各々に添加して約０．５ｍＡ’ の試験溶液を得た。接合体濃度は１．、　ｚ　７ｍ１．であった。８つの試験セ ルを選び、その各々を興なる試験溶液で満たし５た。２０での湿潤環境中での２ ０分間のインキュベーション後、セルを読んだ。こ・うし７て作成し、た標準曲 線は、不透明層を有さ１１Ｃいセル装置に”ついて第Ｌ１図に示される。「溶液 蛍光団Ｊからのバックグー５・ランドシグナルは高く、乏しいシグナル対バック グラウンド比を与え、乏しいγツセ、イ感度を生ずる。

比較例Ｂ 装置の内側表面に不透明層を有するセル（第１図参照）中で比較例Ａを参照のこ と。

（ｉｉ、　）試験セルの製作 Ｐｅｒｍａｂｌｏｃガラスを洗剤と超音波振動を使って洗浄した。

ガラスを乾燥した後、黒インクを使って表面上に所望のパターンの不透明層をス クリーン印刷した１、印刷された不透明材料を熱硬化させた後、積層前に不透明 材料が必ず装置の内側にくるように注意しながら、このガラス板を比較例Ａの未 処理のＰｅｒｍａｂｌｏｃガラスの代わりに使った。残りの試験セル製作工程は 比較例Ａに記載したものと同じであ−、た３、第１図に描写されるような試験セ ルが得られた。

（ｉｉｉ）　ＦＩＴＣに接合した抗−ｈ　（’、、Ｇの調製比較例Ａと同じ。

（ｉｖ）　ｈＣＧ、ｐ準液の調製 比較例Ａと同じ。

（ｖ）アッセイの測定に使用する装置 比較例Ａと同じ。

ｈＣＧについてのアッセイ手順 用いたアッセイ手順は比較例Ａに記載のものと同じであるが、ただし４つのセル を各々のｈＣＧ試験溶液で処理した。

第１２図において、この例の結果を比較例Ａからの結果と比較する。不透明層の 存在は、バックグラウンドシグナルをかなり減少させた。結果として、１０００ ａ＋ｌｌＪ／ｒｎ１．のｈＣＧについてシグナル対バックグラウンド比が１．２ ：１から３：１：こ改善され、従ってアッセイ感度が改善された。

比較例Ａと同じ。

（１１）試験セルの製作 試験セルの製作方法は比較例Ｂと同様であった。ただし、必ず不透明層を製作工 程中セルの外側に維持するように注意を払った。第２図に図示される試験セルが 得られた。

（ｉｉｉ）　ＦＩＴＣに接合した抗−ｈＣＧの調製比較例Ａと同じ。

（ｉｖ）　Ｍ：Ｇ標準液の調製 比較例Ａと間じ。

（ｖ）アッセイの測定に使用する装置 比較例へと同じ。

ｈＣＧについてのアッセイ手順 比較例Ｂと同じ。第１３図はこの例からの結果と比較例Ｂのものとを示す。各々 のセルタイプについての標準曲線は同等である。しかしながら、セルの外側に不 透明層を用いると、アッセイ精度が増加する（内側不透明層についての標準曲線 の精度は８゜０％であるのに比べて、外側不透明層のものは４．６％であり、従 ってこの精度の増加によりγツセイ性能の増加が達成される）。これは、セル空 隙の均一性および調査される試料容量がガラス表面により限定され不透明層の印 刷の質により限定されるのではないために起こる。

比較例Ａと同じ１、 （１１）試験セルの製作 比較例Ｂに記載の方法に従って一枚のＰｅｒｍａｂｌｏｃガラス上に全パターン の不透明材料を印刷しそして硬化させた。この後、ガラスを裏返し、最初の印刷 に合わせて反対側に第二の全パターンを印刷した。硬化後、適当な溶剤を使って 第二印刷の半分を取り除き、同じ幅であるが半分の長さを有するパターンを残し た。超音波振動による洗剤中での洗浄後、比較例Ｂに記載したようにしてガラス 積層板を調製した。範囲の小さい方の印刷が必ずセルの内側にくるように注意し た。接着剤を硬化させた後、常法により試験セルを分割した。第３図に概略的に 示される試験セルが得られた。

（ｊｉ　）　ＦＩＴＣに接合した抗−ｈＣＧの調製比較例Ａと同じ。

＜ｉｖ）　ｈＣＧａ準液の調製 比較例Ａと同じ。

（ｖ）アッセイの測定に使用する装置 比較例Ａと同じ。

ｈＣＧについてのアッセイ手順 比較例Ｂと同じ。第１４図は、この実施例の結果と比較例Ｂのものを示す。同様 に標準曲線は同等であるけれども、比較例Ｂからのセルに比べてバックグラウン ドシグナルのわずかな減少（１，０から０．９に）が認められる。あるセル幾何 学、例えばより短い試験セルについては、望ましくない「溶液シグナル」を除去 することにおけるこの配置の有効性がより大きいため、アラ七イ性能に有意な効 果を与えることができた。

比較例Ａと同じ。

（ｉｉ）試験セルの製作 実施例１と同じ。

（ｊｉ）　ＦＩＴＣに接合された抗−ｈＣＧの調製比較例Ａと同じ。

（ｉｖ）試験溶液の調製 この実施例については、ウマ血清中１　ｎ　／　ｍｊ２の接合体の試験溶液を使 った。

（ｖ）アッセイの測定に使用する装置 比較例Ａと同じ。

ｈＣＧについてのアッセイ手順 セルにゼロｈＣＧ標準試験溶液を満たし、読みを行った。外科用メスを使って不 透切縁末端から１（財）長さを減らし、そして第二の読みを行った。不透明材料 が全く残らなくなるまでこの操作を繰り返した。

第１５図に、おいて、不透明層の長さの関数、として典型的応答を示す。不透明 層の長さは、照明帯の後ろから光学縁の方向において不透明層の前縁までの距離 として定義される。結果は、光学縁の末端の照明領域の縁から測って約１５Ｍの 長さを使ったセル幾何学が、溶液シグナルを効果的に除去ヂるのに十分であり、 バックグラウンドシグナルを最小にし、従って装置の感度を増加させる（即ちシ グナル対バックグラウンド比を改善する）ことを示す。

ＦＩＧ。１０ ＦＩＧ、１１ ｈＣＧ！Ｉ、ｌｆ　（ｍｌｕ／ｍｔ） Ｆ！Ｇ、’１２ ｈＣＧ濃度（ｍｌｕ／ｍＬ） ＦＩＧ、１４ ｈＣＧ濃度（ｍ！ｕ／ｍＬ） 国際調査報告 国際調査報告 国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．特異的反応性試料−捕集および試験装置であって、該装置は、毛管作用によ り試料液をキャビティ中に吸い込むことができる程十分に小さい寸法を有する１ または複数のキャビティを有し、前記１または複数のキャビティの１表面は、該 装置中で実施される試験に適当な固定化試薬を担持しており、前記表面は、光透 過性導波管として働くように改造された第一の透明固体プレートの表面であり、 前記プレートは、実質上光学的に平滑であり且つ該プレートの平面に対して横断 する縁を有し、前記装置は、前記導波管と反対側の１または複数のキャビティの 壁が第二の透明プレートを含んで成ることを特徴とし、前記第二の透明プレート がキャビティから遠い方の表面上に光吸収性または不透明材料の層を担持してい る装置。
2. ２．前記第二の透明プレートが、キャビティから遠い方の表面上に光吸収性また は不透明材料の層を担持しており、且つキャビティに近い方の表面の一部分のみ にも光吸収性または不透明材料の層を担持している、請求項１に記載の装置。
3. ３．前記１または複数のキャビティの１表面が、可溶性の遊離可能な形において 、前記装置中で実施される試験に適当な蛍光補助試薬を担持している、請求項１ または請求項２に記載の装置。
4. ４．前記蛍光補助試薬が、試験しようとするリガンドに対する蛍光団標識特異的 結合相手であるかまたは蛍光団標識リガンド類似体である、請求項３に記載の装 置。
5. ５．試料液中に存在する分析物の蛍光イムノアッセイまたは発光イムノアッセイ に使用される装置であって、該装置は、テストしょうとする試料液の一定量を捕 集および保持するための平面キャビラリーセルを含んで成り、前記キャビラリー セルは、一方の端にキャビラリーキャビテイ中への試料液の進入を可能にする第 一の開口および他方の端には試料液で満たされるにつれてキャビラリーキャビテ ィからの空気の排出を可能にする第二の開口を有するキャビラリーキャビティを 限定している、向かい合わせに固定された内側表面を提供するように、間に空隙 を有する一緒に固定されそして２つの対辺に沿ってシールされた一対の平らで平 行な２枚のプレートを含んで成り、ここで、前記プレートの一方は、導波管の水 平面に対して横断し且つシールされた辺に対して垂直である光学的に平滑な縁を 有する光透過性導波管であり、前記導波管は、使用中キャピラリーキャビティ内 部に捕集された試料液と接触するように、内側表面の少なくとも一部分に、標識 リガンドを直接的または間接的に結合することのできる固定化試薬を結合してお り、前記固定化試薬と前記標識リガンドは、該装置中で実施することになってい る分析物についての試験に適するものであり、標識リガンドは、使用時に捕集さ れた試料液と接触しそして試料液中に放出されるように、前記装置内部に遊離で きるように保持されており、そして他方のプレートが、キャビティから違い方の 表面上に、光吸収性または不透明材料を担持している、請求項１に記載の装置。
6. ６．リガンドについてのアッセイにおける請求項１〜５のいずれか一項に記載の 装置の使用。
7. ７．請求項１〜５のいずれか一項に記載の特異的反応性試料捕集および試験装置 の製造方法であって、次の段階：（ａ）多数の該装置の部分を提供することがで きるシート材料の表面上に固定化された特異的反応性コーティングを形成せしめ ； （ｂ）追加の構造物の１表面上に光吸収性または不透明層を形成せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の前または後に、多数の該装置の各々に、特異的反応性コーテ ィングと接触した時に一定量の試料液を毛管作用により捕集および保持するため の毛管寸法のキャビティを提供するように、そして光吸収性または不透明層がキ ャビティから遠くなるように、前記シート材料を追加の構造物に取り付け；そし て （ｄ）各々が１または複数の試料捕集および試験装置を提供する部分にシート材 料を分割する、 を含んで成る方法。
8. ８．次の段階： （ａ）装置中で実施される試験に適当な試薬を、光透過性導波管として働くこと ができ且つ多数の装置の部分を提供することができる透明なフラットシート材料 の表面上の部分に固定化し； （ｂ）追加の構造物の１表面上に光吸収性または不透明層を形成せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の前または後に、多数の装置の各装置に、２つの反対側に沿っ てシールされ且つその内側表面の少なくとも一部分上に固定化試薬を含有するキ ャビラリーキャビティを提供するように、間隙をあけて平行関係において前記シ ート材料に前記追加の構造物を取り付け、ここで前記キャビラリーキャビティは 、前記固定化試薬と接触すると毛管作用により一定容量の試料液を捕集および保 持するように改造されており；そして （ｄ）組立てたシートを部分に分割し、各部分は、各装置の透明シート材料がシ ートの平面に対して横断し且つシールされた側聞に対して垂直である少なくとも １つの光学的に平滑な縁を有するような、１または複数の試料捕集および保持装 置を提供する、 を含んで成る、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記段階（ｂ）が段階（ｃ）の前に行われ、そして追加の構造物の反対表面 上に光吸収性または不透明層を形成することを含んで成る、請求項７または請求 項８に記載の方法。
10. １０．請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置を使って試料中のリガンドにつ いてアッセイする方法であって、（ａ）導波管の表面と接触している試料をイン キュベートし、前記導波管は前記装置の一部分であり、直接的または間接的のい ずれかにおいてその上に吸着されているかまたはそれに結合されている固定化試 薬は、インキュベーション中に補助試薬（蛍光団で標識されたリガンド類似体ま たは蛍光団で標識された別の特異的結合相手のいずれかである）が直接的または 間接的に前記導波管の表面に結合するようになるような、検出を所望するリガン ドに落する特異的結合相手であり； （ｂ）試料液体中に存在する補助試薬と導波管に結合した補助試薬が励起される ような適当な光源からの光で前記装置を照射し；そして （ｃ）補助試薬が複合体形成により前記導波管に結合したかどうか、および所望 であればその程度を測定するために、前記導被管から出てくる輻射線をモニタリ ングする、ことを含んで成る方法。
11. １１．前記リガンドが抗原であり、そして前記１または複数の特異的結合相手が 前記抗原に対する抗体を含んで成る、請求項１０に記載の方法。
12. １２．請求項１０または請求項１１に記載のアッセイ方法において使用される装 置であつて、使用中、輻射線結合した蛍光団と遊離の蛍光団の両方を励起させも ような角度において上記の本発明の装置に入るように配置すあことができる輻射 線源、および出てきた輻射線をモニタリングするための手段を含んで成る装置。
13. １３．使用中、アッセイが行われる装置の有効容量を限定する照明マスクを更に 含んで成る、請求項１２に記載の装置。