DE69004049T2

DE69004049T2 - Vorrichtung für chemische testverfahren.

Info

Publication number: DE69004049T2
Application number: DE90908261T
Authority: DE
Inventors: John Attridge; Alan Smith
Original assignee: ARS HOLDING 89 NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1990-05-17
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2010-05-18
Also published as: ATE96228T1; JP2525958B2; EP0426817A1; AU617254B2; GB8911462D0; EP0426817B1; CA2031515C; CA2031515A1; US5192502A; DK0426817T3; DE69004049D1; JPH03506078A; ES2045921T3; WO1990014590A1; AU5740390A

Description

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Verwendung in chemischen, biochemischen oder klinischen Testverfahren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtungen.
Genauer betrifft die Erfindung Vorrichtungen, die zur Verwendung in spezifischen Bindungsassays, unter denen eine wichtige Gruppe die Immunoassays sind, geeignet sind.
Verschiedene analytische Vorrichtungen zur Handhabung und Messung kleiner Volumina an Testproben sind im Stand der Technik beschrieben. Insbesondere beschreibt die EP-A-171148 durch die Kapillarwirkung füllbare, zellenartige Vorrichtungen, die bequem hergestellt werden können und die für spezifische Bindungsassays, bei denen sehr kleine flüssige Proben verwendet werden, geeignet sind. Diese Vorrichtungen besitzen eine Kavität oder Kavitäten, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit in die Kavität durch die Kapillarwirkung gezogen werden kann, worin eine Oberfläche der Kavität ein immobilisiertes Reagens, das für den in der Vorrichtung auszuführenden Test geeignet ist, trägt, und worin die Oberfläche eine Oberfläche aus einer transparenten, festen Platte ist, die so angepaßt ist, daß sie als ein lichtdurchlässiger Hohlleiter wirkt und eine Wand der Kavität bildet, wobei die Platte eine Kante besitzt, die im wesentlichen optisch eben ist ("optische Kante") und transversal, z.B. in irgendeinem transversalen Winkel, aber am bevorzugtesten senkrecht, zu der Ebene der Platte verläuft. Solche Vorrichtungen ermöglichen eine bequeme Probennahme und optische in situ-Analyse der Reaktionsprodukte der Probe mit dem immobilisierten Reagens.
Die Hohlleiterplatte sollte für die Strahlung der Wellenlänge, die verwendet werden soll, beispielsweise infrarotes, sichtbares und/oder ultraviolettes Licht, durchlässig sein, und ein Verfahren unter Verwendung einer in der EP-A- 171148 beschriebenen Vorrichtung ist so ausgelegt, daß ein fluoreszierendes Material an das immobilisierte Reagens in einem je nach dem Assay und dem zu untersuchenden Probenmaterial variierenden Ausmaß gebunden wird, und dann das so erhaltene, gebundene, fluoreszierende Material optisch gemessen wird.
Die EP-A-171148 beschreibt die Möglichkeit, daß es bei einigen Formen des Assays angebracht sein könnte, daß die Wand der Kapillarkavität gegenüber der reagenstragenden Hohlleiteroberfläche aus einem lichtabsorbierenden, lichtundurchlässigen oder -reflektierenden Material hergestellt ist, d.h. bei einer Vorrichtung, die die in Fig. 1 dargestellte Struktur besitzt, welche nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
Der Unterschied in den Winkelverteilungen der Fluoreszenz aus Fluorophoren in der Analytenlösung und aus Fluorophoren, die an die Hohlleiteroberfläche gebunden sind, ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Unter idealen Bedingungen würde die Winkeldiskriminierung von Fluoreszenz aus der Kante des Hohlleiters ausreichen, um die verschiedenen Emissionssignale zu trennen. In der Praxis können jedoch verschiedene Unvollständigkeiten der Vorrichtung, die Steuung und Aussendung von Fluoreszenz aus den Fluorophoren in der Lösung von der optischen Kante in Winkeln, die normalerweise bei auslöschend gekoppelter Fluoreszenz, d.h. aus oberflächengebundenen Fluorophoren auftreten, verursachen.
Die Erfinder haben nun überraschend gefunden, daß dieses Problem mit einer signifikant verbesserten Leistungsfähigkeit gegenüber den in der EP-A-171148 beschriebenen Strukturen, einschließlich der in Fig. 1 dargestellten Struktur, überwunden werden kann, wenn die Wand der Kapillarzelle gegenüber der reagenstragenden Hohlleiteroberfläche aus einem für die Strahlung der in dem Assay verwendeten Wellenlängen durchlässigen Material gebildet ist, aber eine Schicht aus einem lichtundurchlässigen oder -absorbierenden Material auf eine oder mehrere äußere Oberflächen des lichtdurchlässigen Materials, bevorzugt mindestens auf die äußere Oberfläche, die parallel zu dem Hohlleiter angebracht ist, aufgebracht ist. Der nachstehend verwendete Ausdruck "lichtundurchlässige Schicht" bedeutet eine derartige Schicht aus einem lichtundurchlässigen oder lichtabsorbierenden Material.
So wird gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung eine spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung bereitgestellt, die eine Kavität oder Kavitäten besitzt, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit durch die Kapillarwirkung in die Kavität gezogen werden kann, wobei eine Oberfläche der oder jeder Kavität ein immobilisiertes Reagens trägt, das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist, wobei die Oberfläche eine Oberfläche einer ersten transparenten, festen Platte mit der Eignung, als lichtdurchlässiger Hohlleiter zu wirken, ist, wobei die Platte eine Kante besitzt, die im wesentlichen optisch eben ist und transversal zu der Ebene der Platte angeordnet ist, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß die dem Hohlleiter gegenüber liegende Wand der oder jeder Kavität eine zweite transparente Platte besitzt, wobei die zweite transparente Platte auf ihrer kavitätsfernen Oberfläche eine Schicht aus einem lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Material trägt.
Wie vorstehend erwähnt, besitzt die erste transparente, feste Platte eine Kante, die transversal zu der Ebene der Platte angeordnet ist. Diese Kante kann in jedem transversalen Winkel angeordnet sein, aber ist am bevorzugtesten senkrecht angeordnet.
In einer Ausführungsform wird erfindungsgemäß auch eine Vorrichtung, wie hier beschrieben, zur Verwendung in einem Fluoroimmunoassay oder einem Lumineszenzimmunoassay auf einen Analyten, der in einer Probenflüssigkeit vorhanden ist, bereitgestellt, wobei die Vorrichtung eine planare Kapillarzelle zum Sammeln und zum Zurückhalten des Volumens der darin zu testenden Probenflüssigkeit besitzt, wobei die Kapillarzelle ein Paar aus flachen, parallelen Platten besitzt, die mit einem Luftraum dazwischen aneinander fixiert sind und entlang zwei gegenüberliegender Seiten versiegelt sind, so daß fixierte, einander gegenüberliegende innere Oberflächen erhalten werden, die eine Kapillarkavität mit einer ersten Öffnung an einem Ende zum Einlassen der Probenflüssigkeit in die Kapillarkavität und einer zweiten Öffnung an dem anderen Ende davon für den Luftaustritt aus der Kapillarkavität bei Auffüllen mit der Probenflüssigkeit definieren, wobei eine der Platten ein lichtdurchlässiger Hohlleiter mit einer optisch ebenen Kante ist, die transversal zu der Ebene des Hohlleiters und senkrecht zu den versiegelten Seiten davon angeordnet ist, wobei an mindestens einen Teil der inneren Oberfläche des Hohlleiters zum Kontakt mit der in die Kapillarkavität aufgenommenen Probenflüssigkeit bei Verwendung ein immobilisiertes Reagens mit der Fähigkeit zur direkten oder indirekten Bindung eines markierten Liganden gebunden ist, wobei das immobilisierte Reagens und der markierte Ligand dem Test auf den Analyten, der in der Vorrichtung durchgeführt werden soll, angepaßt sind, wobei der markierte Ligand in freisetzbarer Form in der Vorrichtung zurückgehalten wird, so daß er bei Verwendung mit der darin aufgenommenen Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird und darin freigesetzt wird, und worin die andere Platte auf ihrer kavitätsfernen Oberfläche eine Schicht aus lichtabsorbierendem oder -undurchlässigem Material trägt.
Zur Vereinfachung wird die Oberfläche der zweiten transparenten Platte, die die Schicht aus lichtabsorbierendem oder -undurchlässigem Material trägt, hier als äußere Oberfläche der Platte bezeichnet, die gegenüberliegende Oberfläche als innere Oberfläche bezeichnet.
Es wurde gefunden, daß es unter einigen Umständen vorteilhaft sein könnte, wenn zusätzlich zu der äußeren Oberfläche nur ein Teil der inneren Oberfläche der Wand der Kapillarkavität, d.h. nur ein Teil der inneren Oberfläche der zweiten transparenten Platte, das lichtabsorbierende oder -undurchlässige Material trägt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung bereitgestellt, die eine Kavität oder Kavitäten besitzt, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit in die Kavität durch die Kapillarwirkung gezogen werden kann, wobei eine Oberfläche der oder jeder Kavität ein immobilisiertes Reagens, das für den in der Vorrichtung durchzuführenden Test geeignet ist, trägt, wobei die Oberfläche eine Oberfläche aus einer ersten transparenten, festen Platte mit der Eignung, als lichtdurchlässiger Hohlleiter zu wirken, ist, wobei die Platte eine Kante besitzt, die im wesentlichen optisch eben ist und transversal zu der Ebene der Platte angeordnet ist, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß die Wand der oder jeder Kavität gegenüber dem Hohlleiter eine zweite transparente Platte besitzt, wobei die zweite transparente Platte auf ihrer äußeren Oberfläche eine Schicht aus einem lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Material trägt und auch nur auf einem Teil ihrer inneren Oberfläche eine Schicht aus einem lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Material trägt.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können nach Verfahren, die im weiten Sinne denen, die in der EP-A-171148 beschrieben sind, ähnlich sind, aber mit der zusätzlichen Besonderheit, daß eine lichtabsorbierende oder -undurchlässige Schicht auf die geeignete Oberfläche bzw. die geeigneten Oberflächen der Vorrichtung aufgebracht wird, hergestellt werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch reaktiven Probensammel- und -testvorrichtungen, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt, welches die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bilden eines immobilisierten, spezifisch reaktiven Überzugs auf der Oberfläche eines schichtförmigen Materials, die einen Teil einer Vielzahl von Vorrichtungen ergeben soll,
(b) Bilden einer lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Schicht auf einer oder mehreren Oberflächen einer weiteren Struktur, die zusammen mit dem beschichteten, schichtförmigen Material für jede der Vielzahl der Vorrichtungen eine Kavität mit Kapillardimensionen zum Sammeln und Zurückhalten mittels Kapillarwirkung eines Volumens an Probenflüssigkeit in Kontakt mit dem spezifisch reaktiven Überzug ergibt, und
(c) Trennen des schichtförmigen Materials in Anteile, die jeweils eine oder mehrere der Probensammel- und -testvorrichtung(en) ergeben.
Bei diesem Verfahren können sowohl der spezifisch reaktive Überzug als auch die äußere lichtundurchlässige Schicht kontinuierlich sein oder in ein Muster, beispielsweise aus getrennten Teilen, aufgeteilt sein, z.B. als eine zweidimensionale Anordnung von Feldern. Wenn solche Felder gebildet werden, können sie so gebildet werden, daß man beispielsweise zuerst eine kontinuierliche Beschichtung bildet und dann Teile davon unter Entstehung des gewünschten Musters, z.B. der Anordnung von getrennten Teilen, entfernt, oder eine Anordnung von Feldern (z.B. durch Siebdruck) bildet. Wenn ein Teil der inneren Oberfläche der Wand der Kavität eine lichtundurchlässige Schicht tragen soll, wird die relevante lichtundurchlässige Schicht, die während der Herstellung aufgebracht wird, natürlich als diskontinuierliche Schicht aufgebracht.
Der spezifisch reaktive Überzug kann auf der Oberfläche der Kavität entweder direkt oder indirekt immobilisiert werden. Wenn beispielsweise der spezifisch reaktive Überzug ein Antikörper ist, kann eine indirekte Immobilisierung mittels eines Anti-Spezies-spezifischen Antikörpers, der seinerseits an die Oberfläche gebunden ist, hergestellt werden. Alternativ kann die Immobilisierung durch Konjugieren eines Antikörpers mit Biotin und Komplexieren mit auf der Oberfläche vorimmobilisiertem Avidin durchgeführt werden. Die direkte Immobilisierung kann durch Aktivieren der Oberfläche durch Behandlung mit einem geeigneten Reagens (z.B. ein Silanisierungsreagens, wie Aminopropyltrimethoxysilan), woran der Antikörper kovalent unter Verwendung eines geeigneten Vernetzungsreagenses (z.B. Glutaraldehyd) gekoppelt ist, durchgeführt werden.
Wie bereits unter Bezug auf die Vorrichtungen aus dem Stand der Technik erwähnt, ist ein Verfahren zur Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Assay auf einen Liganden in einer flüssigen Probe das Veranlassen der Bindung eines fluoreszierenden Materials an das immobilisierte Reagens in einem Ausmaß, daß in Abhängigkeit von dem Assay und dem untersuchten Probenmaterial variiert, und die anschließende Durchführung einer optischen Messung des so erhaltenen, gebundenen, fluoreszierenden Materials.
Ein geeignetes fluoreszierendes Material enthält typischerweise ein Hilfsreagens, das entweder ein Analogon des Liganden ist, das mit einem Fluorophor markiert ist, oder ein spezifischer Bindungspartner für den Liganden während des Assays, der mit einem Fluorophor markiert ist, ist. Bei der Durchführung eines Assays kann das fluoreszierende Material in einer bekannten Menge in die flüssige Probe vor Einbringen der Probe in die Vorrichtung eingebracht werden. Alternativ kann das fluoreszierende Material auf eine Oberfläche in der Vorrichtung in einer löslichen, freisetzbaren Form, beispielsweise mittels eines löslichen Netzüberzugs vorimmobilisiert sein. In dem zuletzt genanten Fall löst das Einbringen der Probenflüssigkeit in die Vorrichtung den löslichen Netzüberzug auf, so daß das Hilfsreagens in der Probenflüssigkeit dispergiert wird.
In einer Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein, wie vorstehend beschriebenes, Verfahren bereitgestellt, das die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Immobilisieren eines Reagenses, das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist, auf Teilen der Oberfläche eines transparenten, flachen, schichtförmigen Materials, das als lichtdurchlässiger Hohlleiter wirken kann, und das einen Teil einer Vielzahl von Vorrichtungen ergeben soll;
(b) Bilden einer lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Schicht auf einer Oberfläche einer weiteren Struktur;
(c) entweder vor oder nach Stufe (b), Befestigen der weiteren Struktur parallel an dem schichtförmigen Material mit einem Abstand dazu, wodurch für jede Vorrichtung einer Vielzahl von Vorrichtungen eine Kapillarkavität gebildet wird, die entlang der zwei gegenüberliegenden Seiten davon versiegelt ist und das immobilisierte Reagens auf mindestens einem Teil der inneren Oberfläche davon enthält, wobei jede Kapillarkavität dem Sammeln und Zurückhalten eines Volumens an Probenflüssigkeit mittels Kapillarwirkung bei Kontakt mit dem immobilisierten Reagens angepaßt ist; und
(d) Trennen der zusammengefügten Schichten in Teile, wobei jeder Teil eine oder mehrere Probensammel- und -testvorrichtung(en) ergibt, so daß das transparente, schichtförmige Material jeder Vorrichtung mindestens eine optisch ebene Kante transversal zu der Ebene der Schicht und senkrecht zu den versiegelten Seiten davon besitzt.
Der hier verwendete Ausdruck "Analogon eines Liganden" bezieht sich auf ein Teilchen mit der Fähigkeit zur Komplexbildung mit der gleichen Bindungsstelle des gleichen spezifischen Bindungspartners wie der Ligand im Assay und umfaßt u.a. eine bekannte Menge des zu bestimmenden Liganden.
Geeignete Materialien für die vorstehend definierte lichtundurchlässige Schicht sind beispielsweise schwarz pigmentierte Anstrichstoffe, ggf. durch Hitze oder Infrarotbestrahlung härtbar, pigmentierte Anstrichstoffe aus Silicon, Farbstoffe oder jedes andere (bevorzugt inerte) Material mit geeigneten optischen und anderen physikalischen Eigenschaften. Solche Materialien sollten Licht mindestens bei den an dem Assay beteiligten Wellenlängen schwächen oder absorbieren. Die Dicke der lichtundurchlässigen Materialschicht beträgt typischerweise minimal 3 um.
Die Erfindung wird unter Bezug auf Fluoreszenz näher beschrieben, aber es ist zu verstehen, daß analoge Überlegungen auch für Phosphoreszenz und Lumineszenz gelten.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die die beigefügten Figuren Bezug genommen.
Darin
zeigt Fig. 1 einen diagrammartigen Schnitt durch eine Variante einer durch Kapillarwirkung füllbaren Vorrichtung, wie sie in der EP-A-171148 vorgeschlagen ist;
zeigen die Fig. 2 bis 6 diagrammartige Schnitte durch durch Kapillarwirkung füllbare Vorrichtungen gemäß verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung;
zeigt Fig. 7 eine Draufsicht auf die erfindungsgemäße, durch Kapillarwirkung füllbare Vorrichtung, wie in einem Schnitt von Fig. 5 gezeigt ist;
zeigt Fig. 8 in schematischer Form die Abschwächung einer Fluoreszenzlösung in der Vorrichtung von Fig. 2;
zeigt Fig. 9 in schematischer Form eine Abschwächung einer Fluoreszenzlösung in der Vorrichtung von Fig. 3;
zeigt Fig. 10 schematisch eine einfache Apparatur zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays;
zeigt Fig. 11 grafisch die Ergebnisse eines Assays auf menschliches Choriongonadotropin (hCG), der unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik durchgeführt wurde;
zeigt Fig. 12 einen Vergleich der Ergebnisse aus Fig. 11 mit denen, die in einem Assay unter Verwendung einer Variante einer im Stand der Technik vorgeschlagenen Vorrichtung erhalten wurden;
zeigt Fig. 13 einen Vergleich der Ergebnisse, die zuerst in Fig. 12 gezeigt wurden, mit denen, die in einem Assay gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform erhalten wurden;
zeigt Fig. 14 einen Vergleich der Testergebnisse, die mit zwei verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erhalten wurden;
zeigt Fig. 15, wie das Hintergrundsignal, das bei Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung beobachtet wird, je nach der Länge der lichtundurchlässigen Schicht, die auf die äußere Oberfläche aufgebracht ist, variieren kann.
Unter Bezug auf Fig. 1 enthält die dargestellte Vorrichtung eine obere transparente (z.B. Kunststoff, Kieselsäure oder Glas) Platte 1 und eine untere transparente Platte 2, wobei beide Platten etwa 1 mm dick sind und im wesentlichen parallel zueinander mit einem Abstand von weniger als 1 mm mittels Verbindungsschienen (nicht gezeigt) mit einem geeigneten Klebstoff miteinander fixiert sind. Die so gebildete Zellkavität 3 ist an beiden Enden nach außen offen, so daß, wenn die flüssige Probe in eine Öffnung der Kavität mittels Kapillarwirkung eingezogen wird, die Luft durch die andere Öffnung entweichen kann. Die untere Platte 2 der Vorrichtung ist größer als die Platte 1, wobei die zuerst genannte einen Absatz 4 besitzt, der sich von der Öffnung weg erstreckt. Bei Gebrauch dient Absatz 4 der Platte 2 als Rückhalteplattform, auf die ein Tropfen der Probenflüssigkeit aufgebracht werden kann, so daß diese Flüssigkeit zur Füllung der Zellkavität 3 durch kapillare Fließwirkung veranlaßt werden kann.
Auf die innere Oberfläche der Kapillarzelle ist eine Schicht 5 aus einem Material entsprechend dem Test, für den die Vorrichtung verwendet werden soll, immobilisiert. In Fig. 1 ist die Schicht 5 ein Feld aus einem Material auf der Platte 2. Im Falle eines Immunoassays kann die Schicht 5 beispielsweise ein relevanter immobilisierter Antikörper sein. Mehr als eine solche Schicht kann vorhanden sein, entweder übereinander angebracht oder nebeneinander angeordnet.
Auf der Platte 1 der inneren Oberfläche der Zelle ist eine Schicht 6 aus einem lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Material angebracht, wobei das Material der Art des Tests, für den die Vorrichtung verwendet werden soll, und den Wellenlängen des Lichts, das verwendet werden soll, angepaßt ist.
Die Fig. 2 zeigt einen diagrammartigen Schnitt durch eine Kapillarzellvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. Die Vorrichtung umfaßt eine obere transparente Platte 7 und eine untere transparente Platte 8, die wie in Fig. 1 angeordnet sind. Eine reaktive Schicht 9 ist auf der Oberfläche der Platte 8 vorhanden. Die Platte 7 trägt auf ihrer äußeren Oberfläche eine lichtundurchlässige Schicht 10.
Die Fig. 3 zeigt einen diagrammartigen Schnitt durch eine Kapillarzellvorrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung. Die Platten 11 und 12 sind wie in den Fig. 1 und 2 angeordnet; die reaktive Schicht 13 kann wie in den vorstehenden Ausführungsformen vorhanden sein. Bei dieser Ausführungsform trägt die Platte 11 eine lichtundurchlässige Schicht 14 auf ihrer äußeren Oberfläche und eine Schicht 15 aus einem ähnlichen oder identischen Material nur auf einem Teil der gegenüberliegenden Oberfläche (d.h. auf der inneren Oberfläche der Zellkavität).
Die Fig. 4 zeigt einen diagrammartigen Schnitt durch eine Kapillarzellvorrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung. Eine lichtundurchlässige Schicht 16 ist auf der äußeren Oberfläche der oberen Platte 17, wie in der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsform, angebracht. In der in Fig. 4 gezeigten Ausführungsform sind jedoch die oberen und unteren Platten 17 und 18 versetzt, so daß jede Platte einen Absatz besitzt, der als Rückhalteplattform dienen kann, analog dem in Fig. 1 gezeigten Absatz 4.
Die Fig. 5 zeigt einen diagrammartigen Schnitt durch eine Kapillarzellvorrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung. Wieder ist eine lichtundurchlässige Schicht 21 auf der äußeren Oberfläche der oberen Platte 22 angebracht. In diesem Falle sind jedoch die Enden der oberen und unteren Platten so ausgerichtet, daß keine Rückhalteplattform vorhanden ist.
Die Fig. 6 zeigt einen diagrammartigen Schnitt durch eine Kapillarzellvorrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung. Diese Ausführungsform ist eine Variante der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsform mit der zusätzlichen Besonderheit einer Schicht 23 aus einem löslichen Netzmaterial, das ein geeignetes fluoreszierendes Material auf der inneren Oberfläche der oberen transparenten Platte 24 enthält.
Die Fig. 7 zeigt eine Draufsicht auf die in Fig. 5 gezeigte Vorrichtung. Die lichtundurchlässige Schicht 25 ist als zentraler Bereich gezeigt. Die obere Platte und die untere Platte werden durch die Verbindungsschienen 26 und 27 mit einem geeigneten Klebstoff, in den kleine Glaskugeln mit einem geeigneten Durchmesser zur Erzeugung eines Hohlraumes mit einem Kapillardurchmesser (z.B. 100 um) eingearbeitet sind, in den gewünschten relativen Positionen gehalten.
Die Fig. 8 zeigt schematisch die Wege eines typischen Fluoreszenzlichtstrahls aus einem Fluorophor in Lösung und eines typischen Fluoreszenzlichtstrahls aus einem oberflächengebundenen Fluorophor in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Fig. 2. Die Brechung an der Grenzfläche Probe/Glas verursacht, daß bestimmte Lichtstrahlen aus den Flurophoren in der Lösung sich in die obere Platte 35 mit Winkeln zu der Normalen an der Grenzfläche, die kleiner als der kritische Winkel für die Grenzfläche sind, fortpflanzen (für eine Grenzfläche Probenlösung/Glas würden diese Winkel typischerweise im Bereich von 0º bis 60º zu der Normalen liegen). Diese Strahlen erleiden eine Abschwächung bei der Wechselwirkung mit der lichtundurchlässigen Schicht 37. Die an das auf der Oberfläche der unteren Glasplatte 36, (d.h. innerhalb des Feldes mit Fluoreszenzauslöschung) immobilisierte Reagens gebundenen fluoreszierenden Moleküle senden Licht in die untere Platte 36 über den ganzen Bereich der Winkel (d.h. einschließlich der Winkel zu der Normalen, die größer als der kritische Winkel an der Grenzfläche der Probe und der unteren Platte sind) als Ergebnis der fluoreszenzwellenlöschenden Kopplung. Einige dieser Strahlen werden durch die untere Platte "geführt" und treten aus dem Ende 38 ohne Wechselwirkung mit der lichtundurchlässigen Schicht 37 aus. Die Unterscheidung zwischen Fluoreszenz aus den oberflächengebundenen Fluorophoren und aus Fluorophoren in Lösung wird dadurch deutlich verstärkt.
Die Fig. 9 zeigt schematisch die Wege der Fluoreszenzlichtstrahlen aus den Fluorophoren in Lösung in der Vorrichtung gemäß Fig. 3. Dabei erleiden einige Lichtstrahllen aus der Lösungsfluoreszenz nicht nur eine Abschwächung an der lichtundurchlässige Schicht 39, sondern eine weitere Abschwächung an der lichtundurchlässigen Schicht 40 usw. als Ergebnis einer "Teilreflexion". Strahlen, die mit beiden Schichten 39 und 40 wechselwirken, können aus dem Ende 41 nicht austreten, und so kann die Verwendung der Schicht 40 zu einer noch weiteren Unterscheidung zwischen der Fluoreszenz aus den oberflächengebundenen Fluorophoren und der aus den Fluorophoren in Lösung führen, wodurch die Empfindlichkeit erhöht wird.
Die Fig. 10 zeigt in schematischer Form eine einfache Vorrichtung für die Fluorimetrie, die zur Verwendung im Zusammenhang mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Spezifische Beispiele der verschiedenen Komponenten sind nachstehend in Vergleichsbeispiel A angegeben.
Licht aus einer geeigneten Quelle 51 wird grob durch eine Linse 52 gebündelt, bevor es durch einen Filterschacht 53 hindurchtritt, der den Wellenlängenbereich der zur Anregung der Fluorophore, die an dem Assay beteiligt sind, verwendet wird, festlegt. Eine weitere Linse 54 fokussiert dieses Licht auf den gewünschten Bereich der Testvorrichtung 56 durch eine Öffnung 55.
Licht, das aus einer geeigneten Kante der Testvorrichtung 56 austritt (das "emittierte Licht") tritt durch eine Öffnung 57 und dann durch eine oder mehrere Linsen 58. Eine weitere Öffnung 59 wird verwendet, um den Winkelbereich, über den das emittierte Licht gemessen wird, zu definieren.
Ein weiterer Filter 60 wird verwendet, um das Licht bestimmter Wellenlängen (z.B. Licht mit Anregungswellenlängen) zu entfernen, und eine weitere Linse 61 fokussiert das verbleibende emittierte Licht auf einem Fotodetektor 62.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zum Test auf einen Liganden in einer Probe unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit der Oberfläche eines Hohlleiters, wobei der Hohlleiter ein Teil der Vorrichtung ist, wobei das immobilisierte Reagens, das entweder direkt oder indirekt darauf adsorbiert oder daran gebunden ist, ein spezifischer Bindungspartner für den Liganden, der nachgewiesen werden soll, ist, so daß während der Inkubation ein Hilfsreagens (das entweder ein Ligandenanalogon, das mit einem Fluorophor markiert ist, oder ein weiterer spezifischer Bindungspartner, der mit einem Fluorophor markiert ist, ist) entweder direkt oder indirekt an die Oberfläche des Hohlleiters gebunden wird;
(b) Bestrahlen der Vorrichtung mit Licht aus einer geeigneten Lichtquelle, so daß das in der Probenflüssigkeit vorhandenen Hilfsreagens und das an den Hohlleiter gebundene Hilfsreagens angeregt werden; und
(c) Messen der aus dem Hohlleiter austretenden Strahlung, um zu bestimmen, ob, und ggf. in welchem Ausmaß das Hilfsreagens an den Hohlleiter infolge von Komplexbildung gebunden wurde.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Assayverfahren die verwendete Vorrichtung eine Ausführungsform ist, bei der die zweite transparente Platte eine Schicht aus einem lichtabsorbierenden oder -undurchlässigen Material auf beiden äußeren Oberflächen davon und nur einem Teil der inneren Oberfläche davon trägt, ist der Teil der inneren Oberfläche der zweiten Platte, der das lichtabsorbierende oder lichtundurchlässige Material nicht trägt, der Teil, der gegenüber der Fläche der ersten Platte, die mit Licht aus der Lichtquelle bestrahlt wird, liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders anwendbar auf Assays von Antigenen oder Antikörpern, d.h. Immunoassays, und in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand ein Antigen und der spezifische Bindungspartner umfaßt einen Antikörper gegen das Antigen. Jedoch soll die Erfindung nicht auf Assays von Antikörpern oder Antigenen beschränkt werden. Beispiele von Liganden, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammen mit einer Angabe eines geeigneten spezifischen Bindungspartners im jeweiligen Fall angegeben. Tabelle 1 Ligand Spezifische Bindungspartner Antigen Antikörper Hormon Hormonrezeptor Polynucleotidstrang Avidin Biotin Protein Immunglubulin Enzym Enzym-Cofaktor (Substrat) oder -inhibitor Lectine spezifisches Kohlenhydrat der Lectine spezifischer Antikörper komplementärer Polynucleotidstrang Immunglobulin spezifisches Kohlenhydrat Lectine
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine sehr breite Anwendbarkeit, aber kann insbesondere für Assays verwendet werden: Hormone, einschließlich Peptidhormone (z.B. schilddrüsenstimulierendes Hormon (z.B. TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (hCG), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder nicht-peptidartige Hormone (z.B. Steroidhormone, wie Cortisol, Östradiol, Progesteron und Testosteron, oder Schilddrüsenhormone, wie Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z.B. carcinoembryonales Antigen (CEA) und α-Fötoprotein (AFP)), Arzneimittel (z.B. Digoxin), Zucker, Toxine, Vitamine, Proteine, Viren, wie Influenza-, Parainfluenza-, Adeno-, Hepatitis-, respiratorische und AIDS-Viren, oder Mikroorganismen.
Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Antikörper", der hier verwendet wird, die folgenden Bedeutungen umfaßt:
(a) Eine der verschiedenen Immunglobulinklassen oder -unterklassen, z.B. IgG, IgA, IgM oder IgE, abgeleitet von einem der üblicherweise verwendeten Tiere, z.B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse;
(b) monoclonale Antikörper;
(c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, wobei die Fragmente solche sind, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, d.h. Fragmente ohne den Fc-Teil (z.B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sog. "Halb-Molekül" -Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schwerkettigen Komponenten des intakten Antikörpers verknüpfen, erhalten wurden.
Das Verfahren zur Herstellung der Antikörperfragmente ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Antigen" werden sowohl permanent antigene Teilchen (z.B. Proteine, Bakterien, Bakterienfragemente, Zellen, Zellfragmente und Viren), als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, verstanden.
Beispiele für die Fluorophore, die bei dem erfindungsgemäßen Assayverfahren verwendet werden können, umfassen Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodaminisothiocyanat, Lucifer-Gelb, 2,4-Dinitrofluorbenzol, Phenylisothiocyanat und Dansylchlorid, XRITC, TRITC und Phycobilinproteine (z.B. Allophycocyanin und Phycoerythrin).
Erfindungsgemäß wird weiterhin eine Apparatur bereitgestellt, die zur Verwendung bei dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Assayverfahren geeignet ist, welche eine Strahlungsquelle, die so angeordnet werden kann, daß bei Verwendung die Strahlung in eine erfindungsgemäße, vorstehend beschriebene Vorrichtung in einem solchen Winkel einfällt, daß sowohl die gebundenen als auch die freien Fluorophore angeregt werden, und Mittel zur Messung der auftretenden Strahlung umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung über eine Maske bestrahlt werden, wodurch das effektive Volumen der Vorrichtung, in dem die Bindungsreaktion stattfindet, definiert wird. Das effektive Volumen ist das Produkt der Entfernung zwischen den unteren und oberen Platten der Vorrichtung und der Fläche der bestrahlten Zone.

Vergleichsbeispiel A

Optischer Immunoassay auf menschliches Choriongonadotropin (hCG) mit einer Zelle ohne lichtundurchlässige Schicht

Herstellung der Ausgangsmaterialien

(i) Herstellung des antikörper-beschichteten Hohlleiters

Eine Platte aus Permabloc-Glas (Pilkington Glass Ltd., St. Helens, UK) mit einer Dicke von 1 mm wurde mit einem Detergens (z.B. Tween 20) in ultrareinem Wasser unter Rühren mit Ultraschall gereinigt. Die Glasoberfläche wurde durch 2-stündiges Inkubieren in einer 2%igen Lösung aus Aminopropyltriethoxysilan in Wasser bei einem pH-Wert von 3 bis 4 bei 25ºC aktiviert. Nach Spülen in Wasser wurde die Glasplatte bei 115ºC mehr als 4 h lang getrocknet. Das Glas wurde dann 60 min lang in einer 2,5%igen Lösung aus Glutaraldehyd in einem 0,05 M Posphatpuffer (pH 7) inkubiert und dann gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Glas wurde 2 bis 4 h lang in einer 1%igen Lösung eines monoclonalen Antikörpers gegen hCG in Phosphatpuffer inkubiert. Die Glasplatte wurde dann mit der Pufferlösung gewaschen. Unerwünschtes adsorbiertes Protein wurde durch Eintauchen in eine 6 M Harnstofflösung auf bekannte Weise entfernt.

(ii) Herstellung der Testvorrichtungen

Testvorrichtungen, wie sie in der EP-A-171148 beschrieben sind, wurden dadurch hergestellt, daß man auf die Grundplatte des Hohlleiters aus Stufe (i) Verbindungsschienen mit einem UV-härtbaren Klebstoff (UVS 91, Norland Inc., USA), enthaltend Glasmikrokugeln mit einem Durchmesser von 100 um (Jencons Ltd., UK) in einem Muster, das die langen Kanten der Kapillarzellvorrichtungen definierte, nach dem Siebdruckverfahren aufbrachte. Eine klare Platte aus Permabloc- Glas wurde dann über die Grundplatte des Hohlleiters aufgebracht, und ein Vakuum wurde an das Laminat angelegt. Als Ergebnis des Vakuums wurde die obere Glasplatte auf den Klebstoff heruntergepreßt, wobei die Glasmikrokugeln einen Hohlraum von 100 um zwischen den Glasplatten definierten. Das Laminat wurde dann einer UV-Lichtquelle ausgesetzt, um den Klebstoff zu härten. Schließlich wurde die laminierte Platte in einzelne Testvorrichtungen unter Verwendung einer Standardglasritz- und -brechtechnik gebrochen.

(iii) Herstellung eines mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten Anti-hCG-Antikörpers

200 mg FITC (Sigma Chemical Company Ltd., UK) und 5 mg eines zweiten monoclonalen Antikörpers gegen hCG, der für eine andere antigene Determinante spezifisch war, wurden miteinander in 1,4 ml einer 0,2 M Natriumbicarbonatpufferlösung (pH 9,0) vermischt. Das Gemisch wurde 18 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen; während dieser Zeit trat die Konjugation von FITC an den monoclonalen Antikörper ein. Das Gemisch wurde dann mittels Gelfiltration über Sephadex G-50- superfine gereinigt.

(iv) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Ein gefriergetrocknetes hCG-Präparat, das gegen das erste internationale Referenzpräparat (75/537) kalibriert war, wurde von Biodata SpA, Mailand, Italien, bezogen. Die Probe wurde in Pferdeserum (Serono Diagnostics Ltd., Woking, UK) verdünnt, wodurch der Bereich der benötigten hCG-Standardlösungen erhalten wurde.

(v) Apparatur, die bei der Messung des hCG-Assays verwendet wurde

Die Fig. 10 zeigt eine einfache Fluorimetrieapparatur, die zur Verwendung geeigneter Assaymessungen verwendet wurde. Licht aus einer Xenonflash-Lampe 51 (Heinmann) wird grob durch eine Linse 52 gebündelt, bevor es durch den Filterschacht 53 fällt, welcher den Wellenlängenbereich, der zur Anregung der FITC-markierten Antikörper verwendet wird, definiert. Der Filterschacht umfaßt drei Filter: A BG7 Schott- Glasfilter (Ealing Electro Optics UK Ltd., Watford, UK), ein Interferenzfilter für die FITC-Bandendurchlässigkeit von 450 bis 480 nm (Optometrics Ltd., UK) und ein Interferenzfilter mit einem kleinen Durchlässigkeitsbereich von 475 nm (Comar Instruments Ltd., Cambridge, UK). Eine zweite Linse 54 fokussierte das zur Anregung verwendete Licht auf der aktiven Oberfläche der Testzelle 56 durch eine Öffnung 55, die die beleuchtete Fläche und damit das aktive Volumen der Testzelle definiert.
Von der optischen Kante der Zelle ausgestrahles Licht fällt durch eine Öffnung 57, die verhindert, daß das direkt aus der Lösung emittierte Licht in die optische Einrichtung zur Detektion eintritt. Ein Linsensystem 58 bündelt das ausgestrahlte Licht, und eine Öffnung 59 definiert den Winkelbereich, über den die Emission gemessen wird. Dieser wurde so gewählt, daß er mit den Winkeln, die mit auslöschend gekoppelter Fluoreszenzemission verbunden sind, zusammenfällt. Ein Filter 60 mit einem langen Wellenbereich von 515 nm aus kolloidalem Glas (Schott OG515, Ealing Electro Optics UK Ltd., Watford, UK) filtert jedes Streulicht heraus, und eine zweite Linse 61 fokussiert die Emission auf einem Fotomultiplier-Detektor 62 (Hamamatsu R931A, Hakuto UK Ltd.).

Assayverfahren auf hCG

Das αhCG-FITC-Konjugat wurde zu jeder der hCG-Standardlösung zugegeben, wodurch etwa 0,5 ml Testlösung erhalten wurden. Die Konzentrationd des Konjugats betrug 1 ug/ml. Acht Testzellen wurden ausgewählt, und jede wurde mit einer anderen Testlösung gefüllt. Die Zellen wurden nach 20- minütiger Inkubation in einer feuchten Umgebung von 20ºC abgelesen. Die so gebildete Standardkurve ist in Fig. 11 für eine Zellvorrichtung ohne lichtundurchlässige Schicht gezeigt. Das Hintergrundsignal aus dem "Fluorophor in Lösung" ist hoch, was ein schlechtes Signal:Hintergrund- Verhältnis erzeugt, was zu einer schlechten Empfindlichkeit des Assays führt.

Vergleichsbeispiel B

Optischer Immunoassay auf hCG in Zellen mit einer lichtundurchlässigen Schicht auf der inneren Oberfläche der Vorrichtung (siehe Fig. 1)

Herstellung der Standardmaterialien

(i) Herstellung der antikörper-beschichteten Hohlleiter

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(ii) Herstellung der Testzellen

Permabloc-Glas wurde unter Verwendung eines Detergenses und unter Rühren mit Ultraschall gewaschen. Nach Trocknen des Glases wurde das gewünschte Muster an lichtundurchlässigen Schichten mittels eines Siebdrucks unter Verwendung von schwarzer Druckfarbe auf die Oberfläche aufgebracht. Nach thermischer Härtung des bedruckten lichtundurchlässigen Materials wurde diese Glasplatte gegen das unbehandelte Permabloc-Glas aus Vergleichsbeispiel A ersetzt, wobei darauf geachtet wurde, daß das lichtundurchlässige Material sich vor dem Laminieren auf der Innenseite der Vorrichtungen befand. Das weitere Verfahren zur Herstellung der Testzellen war das gleiche wie Vergleichsbeispiel A beschrieben ist. Es wurden die in Fig. 1 beschriebenen Testzellen erhalten.

(iii) Herstellung von an FITC konjugiertem Anti-hCG

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(iv) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(v) Apparatur, die bei der Messung des Assays verwendet wurde

Siehe Vergleichsbeispiel A.

Assayverfahren auf hCG

Das verwendete Assayverfahren war mit dem in Vergleichsbeispiel A beschriebenen identisch, ausgenommen, daß vier Zellen mit jeder der hCG-Testlösungen getestet wurden.
In Fig. 12 sind die Ergebnisse dieses Beispiels mit denen aus Vergleichsbeispiel A verglichen. Das Vorhandensein einer lichtundurchlässigen Schicht reduzierte das Hintergrundsignal beträchtlich. Das Ergebnis ist eine Verbesserung des Signal:Hintergrund-Verhältnisses von 1,2:1 auf 3:1 für 1000 mIE/ml hCG, wodurch die Empfindlichkeit des Assays erhöht wird.

Beispiel 1

Optischer Immunoassay auf hCG in Zellen mit einer lichtundurchlässigen Schicht auf der Außenseite der Vorrichtung

(Siehe Fig. 2)

Herstellung der Ausgangsmaterialien

(i) Herstellung von antikörper-beschichten Hohlleitern

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(ii) Herstellung der Testzellen

Das Verfahren zur Herstellung der Testzellen war das gleiche wie in Vergleichsbeispiel B, ausgenommen, daß darauf geachtet wurde, daß die lichtundurchlässigen Schichten auf der Außenseite der Zelle während des Herstellungsverfahrens erhalten wurden. Es wurden die schematisch in Fig. 2 dargestellten Testzellen erhalten.

(iii) Herstellung von mit FITC konjugiertem Anti-hCG

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(iv) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(v) Apparatur, die bei der Messung des Assays verwendet wurde

Siehe Vergleichsbeispiel A.

Assayverfahren auf hCG

Siehe Vergleichsbeispiel B. Fig. 13 zeigt die Ergebnisse dieses Beispiels und die des Vergleichsbeispiels B. Die Standardkurven sind für jeden der Zelltypen vergleichbar. Mit der lichtundurchlässigen Schicht auf der Außenseite der Zelle ist jedoch die Präzision des Assays erhöht. (Die Präzision im Verlauf der Kurve für die äußere lichtundurchlässige Schicht beträgt 4,6 %, verglichen mit 8,0 % für die innere lichtundurchlässige Schicht; daher wird eine erhöhte Leistungsfähigkeit des Assays durch diese Präzisionserhöhung erzielt.) Dies tritt deswegen auf, weil die Gleichförmigkeit des Hohlraums in der Zelle und daher das infragekommende Probevolumen nun durch die Glasoberfläche und nicht durch die Druckqualität der lichtundurchlässigen Schicht definiert werden.

Beispiel 2

Optischer Immunoassay auf hCG in Zellen mit wie in Fia. 3 gezeigt angebrachten lichtundurchlässigen Schichten

(i) Herstellung der antikörper-beschichteten Hohlleiter

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(ii) Herstellung der Testzellen

Ein volles Muster des lichtundurchlässigen Materials wurde auf eine Platte aus Permabloc-Glas nach dem in Vergleichsbeispiel B beschriebenen Verfahren gedruckt und gehärtet. Danach wurde das Glas umgedreht, und ein zweites volles Muster wurde auf diese Rückseite entsprechend dem ersten Druck aufgedruckt. Nach der Härtung wurde die Hälfte des zweiten Drucks unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels entfernt, wodurch ein Muster mit der halben Länge, aber der gleichen Breite erhalten wurde. Nach Reinigen in Detergenslösung unter Rühren mit Ultraschall wurde ein Glaslaminat, wie in Vergleichsbeispiel B beschrieben, hergestellt. Es wurde darauf geachtet, daß der weniger umfangreiche Druck auf der Innenseite der Zelle war. Nach Härten des Klebstoffs wurden die Testzellen auf übliche Weise getrennt. Es wurden Testzellen, wie sie schematisch in Fig. 3 gezeigt sind, erhalten.

(iii) Herstellung von FITC-konjugiertem Anti-hCG

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(iv) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(v) Apparatur, die zur Messung des Assays verwendet wurde

Siehe Vergleichsbeispiel A.

Assayverfahren auf hCG

Wie für Vergleichsbeispiel B zeigt Fig. 14 die Ergebnisse dieses Beispiels und die des Vergleichsbeispiels B. Die Standardkurven sind wieder vergleichbar, obwohl eine leichte Verringerung des Hintergrundsignals (von 1,0 auf 0,9) gegenüber den Zellen aus Vergleichsbeispiel B auftrat. Für einige Zellgeometrien, z.B. kürzere Testzellen, könnte die größere Wirksamkeit dieser Anordnung hinsichtlich der Entfernung eines unerwünschten "Lösungssignals" einen bedeutenderen Effekt auf die Leistungsfähigkeit des Assays haben.

Beispiel 5

Optischer Immunoassay auf hCG in einer Zelle mit unterschiedlichen Längen der äußeren lichtundurchlässigen Schicht

Herstellung der Ausgangsmaterialien

(i) Herstellung von antikörper-beschichteten Hohlleitern

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(ii) Herstellung der Testzellen

Siehe Beispiel 1

(iii) Herstellung von FITC konjugiertem Anti-hCG

Siehe Vergleichsbeispiel A.

(iv) Herstellung der Testlösung

Eine Testlösung aus 1 ug/ml Konjugat in Pferdeserum wurde für dieses Beispiel verwendet.

(v) Apparatur, die bei der Messung des Assays verwendet wurde

Siehe Vergleichsbeispiel A.

Assayverfahren auf hCG

Eine Zelle wurde mit der Null-Standard-hCG-Testlösung gefüllt, und es wurde eine Ablesung vorgenommen. Die lichtundurchlässige Schicht wurde in der Länge um 1 mm vom Ende der optischen Kante unter Verwendung eines Skalpells verringert, und eine zweite Ablesung wurde vorgenommen. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis kein lichtundurchlässiges Material übrig war.
In Fig. 15 ist die typische Antwort als eine Funktion der Länge der lichtundurchlässigen Schicht gezeigt. Die Länge der lichtundurchlässigen Schicht ist als die Entfernung von der Rückseite der Beleuchtungszone bis zu der Vorderkante der lichtundurchlässigen Schicht in der Richtung der optischen Kante definiert. Die Ergebnisse zeigen, daß für die verwendete Zellgeometrie eine Länge von etwa 15 mm, gemessen von der von der optischen Kante entfernten Kante der Beleuchtungsfläche, ausreichend ist, um effektiv das Lösungssignal zu entfernen, wodurch das Hintergrundsignal auf ein Minimum erniedrigt wird, wodurch die Empfindlichkeit der Vorrichtung erhöht wird (d.h. das Signal: Hintergrund-Verhältnis verbessert wird).

Claims

1) Spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung mit einer Kavität oder Kavitäten, die jeweils klein genug dimensioniert sind, daß eine Probenflüssigkeit in die Kavität durch die Kapillarwirkung gezogen werden kann, wobei eine Oberfläche der oder jeder Kavität ein immobilisiertes Reagenz (9), das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist, trägt, wobei die Oberfläche eine Oberfläche einer ersten transparenten, festen Platte (8) mit der Eignung, als lichtdurchlässiger Hohlleiter zu wirken, ist, wobei die Platte eine Kante, die im wesentlichen optisch eben und transversal zu der Ebene der Platte angeordnet ist, besitzt, wobei die dem Hohlleiter gegenüberliegende Wand der oder jeder Kavität eine zweite transparente Platte (7) besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite transparente Platte auf ihrer kavitätsfernen Oberfläche eine Schicht (10) aus einem lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Material trägt.

2) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite transparente Platte nur auf einem Teil der an die Kavität grenzenden Oberfläche auch eine Schicht (15) aus einem lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Material trägt.

3) Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der oder jeder Kavität in einer löslichen oder freisetzbaren Form ein fluoreszierendes Hilfsreagenz (23), das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist, trägt.

4) Vorrichtung nach Anspruch 3, zur Verwendung in einem Assay auf einen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß das Hilfsreagenz (23) entweder ein mit einem Fluorophor markierter, spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden oder ein mit einem Fluorophor markiertes Ligandenanalogon ist.

5) Vorrichtung nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Fluoroimmunoassay oder einem Lumineszenzimmunoassay auf einen in einer Probenflüssigkeit vorhandenen Analyten, umfassend eine planare Kapillarzelle zum Sammeln und Zurückhalten des Volumens der darin zu testenden Probenflüssigkeit, wobei die Kapillarzelle ein Paar aus flachen, parallelen Platten (7,8) besitzt, die mit einem Luftraum dazwischen aneinander fixiert sind und entlang zwei gegenüberliegender Seiten versiegelt sind, so daß fixierte, gegenüberliegende innere Oberflächen erhalten werden, die eine Kapillarkavität mit einer ersten Öffnung an einem Ende zum Einlassen der Probenflüssigkeit in die Kapillarkavität und einer zweiten Öffnung an dem anderen Ende davon für den Luftaustritt aus der Kapillarkavität bei Auffüllen mit der Probenflüssigkeit definieren, wobei eine der Platten (8) ein lichtdurchlässiger Hohlleiter mit einer optisch ebenen Kante ist, die transversal zu der Ebene des Hohlleiters und senkrecht zu den versiegelten Seiten davon angeordnet ist, wobei an mindestens einen Teil der inneren Oberfläche des Hohlleiters zum Kontakt mit der in die Kapillarkavität aufgenommenen Probenflüssigkeit bei Verwendung ein immobilisiertes Reagenz (9) mit der Fähigkeit zur direkten oder indirekten Bindung eines markierten Liganden gebunden ist, wobei das immobilisierte Reagenz und der markierte Ligand dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test auf den Analyten angepaßt sind, wobei der markierte Ligand in freisetzbarer Form in der Vorrichtung zurückgehalten wird, so daß er bei Verwendung mit der darin aufgenommenen Probenflüssigkeit in Kontakt gebracht wird und darin freigesetzt wird, und worin die andere Platte auf ihrer kavitätsfernen Oberfläche eine Schicht (10) aus einem lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Material trägt.

6) Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem Assay auf einen Liganden.

7) Verfahren zur Herstellung einer spezifisch reaktiven Probensammel- und -testvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Stufen:

(a) Bilden eines immobilisierten, spezifisch reaktiven Überzugs auf der Oberfläche eines transparenten, schichtförmigen Materials, das einen Teil einer Vielzahl von Vorrichtungen ergeben soll,

(b) Bilden einer lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Schicht auf einer Oberfläche einer transparenten weiteren Struktur,

(c) entweder vor oder nach Stufe (b), Befestigen des schichtförmigen Materials an der weiteren Struktur, wodurch jede der Vielzahl von Vorrichtungen mit einer Kavität mit Kapillardimension zum Sammeln und zum Zurückhalten mittels Kapillarität eines Volumens an Probenflüssigkeit in Kontakt mit dem spezifisch reaktiven Überzug versehen wird, und wodurch die lichtabsorbierende oder lichtundurchlässige Schicht kavitätsfern angebracht wird, und

(d) Trennen des schichtförmigen Materials in Anteile, die jeweils eine oder mehrere der Probensammel- und -testvorrichtung(en) ergeben.

8) Verfahren nach Anspruch 7, umfassend die Stufen

(a) Immobilisieren eines Reagenzes, das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist, auf Teilen der Oberfläche eines transparenten, flachen, schichtförmigen Materials mit der Fähigkeit, als lichtdurchlässiger Hohlleiter zu wirken, welches einen Teil einer Vielzahl von Vorrichtungen ergeben soll,

(b) Bilden einer lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Schicht auf einer Oberfläche einer weiteren Struktur,

(c) entweder vor oder nach Stufe (b), Befestigen der weiteren Struktur an dem schichtförmigen Material parallel mit einem Abstand dazu, wodurch für jede Vorrichtung der Vielzahl von Vorrichtungen eine Kapillarkavität, die entlang der zwei gegenüberliegenden Seiten davon versiegelt ist und das immobilisierte Reagenz auf mindestens einem Teil der inneren Oberfläche davon enthält, erhalten wird, wobei jede Kapillarkavität dem Sammeln und dem Zurückhalten eines Volumens an Probenflüssigkeit mittels Kapillarwirkung bei Kontakt mit dem immobilisierten Reagenz angepaßt ist, und

(d) Auftrennen der zusammengefügten Schichten in Teile, wobei jeder Teil eine oder mehrere der Probensammel- und -testvorrichtung(en) ergibt, so daß das transparente schichtförmige Material jeder Vorrichtung mindestens eine optisch ebene Kante transversal zu der Ebene der Schicht und senkrecht zu den versiegelten Seiten davon besitzt.

9) Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (b) vor Stufe (c) durchgeführt wird und die Bildung einer lichtabsorbierenden oder lichtundurchlässigen Schicht auf gegenüberliegenden Oberflächen der weiteren Struktur umfaßt.

10) Assay-Verfahren auf einen Liganden in einer Probe unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend:

(a) Inkubieren der Probe in Kontakt mit der Oberfläche eines Hohlleiters, wobei der Hohlleiter ein Teil der Vorrichtung ist, wobei das daran direkt oder indirekt adsorbierte oder gebundene immobilisierte Reagenz ein spezifischer Bindungspartner für den Liganden, der nachgewiesen werden soll, ist, so daß während der Inkubation ein Hilfsreagenz (entweder ein mit einem Fluorophor markiertes Ligandenanalogon oder ein weiterer mit einem Fluorophor markierter, spezifischer Bindungspartner) entweder direkt oder indirekt an die Oberfläche des Hohlleiters gebunden wird,

(b) Bestrahlen der Vorrichtung mit Licht aus einer geeigneten Lichtquelle, so daß das in der Probenflüssigkeit vorhandene Hilfsreagenz und das an den Hohlleiter gebundene Hilfsreagenz angeregt werden, und

(c) Messen der aus dem Hohlleiter austretenden Strahlung, um zu bestimmen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß, das Hilfsreagenz an den Hohlleiter infolge Komplexbildung gebunden wurde.

11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Antigen ist, und der oder die spezifische(n) Bindungspartner einen Antikörper gegen das Antigen umfaßt/umfassen.

12) Gerät zu Verwendung bei einem Assay-Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, umfassend eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eine Strahlungsquelle, die so angebracht werden kann, daß bei Verwendung, die Strahlung in einem solchen Winkel auf die Vorrichtung fällt, daß sowohl das in der Probenflüssigkeit vorhandene Hilfsreagenz als auch das an den Hohlleiter gebundene Hilfsreagenz angeregt werden, und Einrichtungen zum Messen der aus der Vorrichtung austretenden Strahlung.

13) Gerät nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Beleuchtungsmaske umfaßt, die bei Verwendung das effektive Volumen der Vorrichtung, in der der Test durchgeführt wird, definiert.