DE69732034T2

DE69732034T2 - Assay-verfahren

Info

Publication number: DE69732034T2
Application number: DE69732034T
Authority: DE
Inventors: Derek Alan COOKSON; Phelim Daniels
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-08
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2017-05-09
Also published as: AU738175B2; GB9609653D0; US6991938B1; WO1997043644A1; EP0918991A1; AU2707597A; EP0918991B1; DE69732034D1; JP2000513810A; CA2253527A1; ATE285581T1; JP4068148B2; CA2253527C; PT918991E; ES2230601T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assayverfahren zum Quantifizieren eines Analyts in einer Probe, insbesondere ein kinetisches Assayverfahren, während dessen Verlauf eine Komponente des Assaysystems wenigstens teilweise, direkt oder indirekt, an die Oberfläche eines Festkörpers gebunden wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung weist spezielle Anwendbarkeit auf dem Gebiet von Immunoassays auf und wird hierin mit spezieller Bezugnahme auf Immunoassays beschrieben werden; jedoch kann das Verfahren auch in anderen Assays, die auf der Affinität zwischen der zu analysierenden Spezies (nachfolgend "Ligand") und einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden (nachfolgend "spezifischer Bindungspartner") basieren, verwendet werden.
Die Ligandenkonzentration in derartigen Systemen kann durch Verfolgen des Ausmaßes an Komplexbildung oder der Geschwindigkeit, mit der die Komplexbildung geschieht, bestimmt werden. Ein bevorzugter Weg, dies zu erreichen, ist durch Konjugieren einer zusätzlichen Komponente mit einem messbaren Parameter an entweder den Liganden oder dessen spezifischen Bindungspartner. Diese zusätzliche Komponente ist auf dem Fachgebiet als eine Markierung bekannt, und verschiedene chemische und biochemische Markierungen, z. B. radioisotopische oder biochemilumineszierende Arten, Spinmarkierungen, Fluorophore, Chromophore, etc., sind bekannt. Im Verlauf derartiger Assays wird die Markierung eigentlich, zumindest indirekt, an eine feste Oberfläche gebunden.
Konventionell haben die meisten Immunoassaysysteme der oben beschriebenen Art darauf beruht, dass Wasch- und/oder Trennungsschritte) im Assayprotokoll waren um gebundene Markierungen von in Lösung verbleibender Markierung zu trennen; Letztere würde andernfalls frei sein um mit der gebundenen Markierung zu interferieren und zu ungenauen Ergebnissen führen. Sobald die Trennung ausgeführt worden ist, können eine Vielfalt bekannter Verfahren verwendet werden um die gebundene Markierung zu quantifizieren und dadurch ein Maß der in der untersuchten Probe vorliegenden Ligandenkonzentration zu ergeben. In derartigen Systemen muss der Trennungsvorgang zu jeder Zeit (t), bei der es gewünscht ist, eine Messung durchzuführen, wiederholt werden, was das Verfahren als Ganzes einigermaßen arbeitsintensiv und langsam macht. Zusätzlich zu diesen Problemen gibt es einen Grad von Willkürlichkeit bei der Einschätzung des Inkubationsbeginns des Assays, was zu Fehlern bei der gesamten Zeitmessung führt.
Um das Lesen des Assays zu beschleunigen und/oder die Sensitivität konventioneller Assaysysteme zu erhöhen, wäre es wünschenswert, kinetische Messungen durchzuführen. Die Limitationen, auf die oben Bezug genommen wurde, bedeuten, dass sich konventionelle Assaysysteme nicht eignen, verlässliche kinetische Messungen durchzuführen, und dies ist nur in sehr wenigen Fällen getan worden, wo es die Charakteristika des Assaysystems erlauben. Z. B. ist es bekannt, kinetische Messungen in Immunoassaysystemen durchzuführen, bei denen Enzyme die Markierung der Wahl sind, wobei die Entwicklungsrate des Produkts der Enzym-katalysierten Reaktion der gemessene Parameter ist. In diesem Fall verkürzt die Messung der Enzymmarkierung nur die Dauer des Signalerzeugungsschritts und hat keinen Einfluss auf die zur Messung der Antikörper:Antigen-Bindung benötigten Zeit, d. h., die kinetische Messung betrifft den letzten Schritt des Assays und nicht die Schlüsselimmunreaktion.
Kinetische Messungen sind auch bei bestimmten Immunosensoren verwendet worden. Hier wird die Geschwindigkeit der Signaländerung der Probe, die eine unbekannte Menge von Antigen enthält, gemessen und mit den gleichen Parametern für Standards, die eine bekannte Konzentration von Antigen enthalten, verglichen. Der günstigste Weg, dies zu erreichen, ist eine Kurve der Geschwindigkeit der Signaländerung (dI/dt in Messgrößen pro Zeiteinheit) gegen bekannte Antigenkonzentrationen in dem Standard zu erstellen. Auf diese Art und Weise kann dI/dt für die interessierende Probe einfach von der Standardkurve abgelesen werden um zu der unbekannten Antigenkonzentration zu gelangen. Naturgemäß leidet ein derartiges Verfahren unter dem Nachteil, dass dem Assay erlaubt sein muss, ein willkürlich bestimmtes Gleichgewicht zu erreichen, an welchem Punkt eine einzelne Endpunktmessung des Signals durchgeführt wird. Die Geschwindigkeit, mit der das Gleichgewicht erreicht wird, kann prohibitiv langsam sein, und dies an sich kann Fehler in die gemessene Geschwindigkeit der Signaländerung einführen, die kritisch von den herrschenden Bedingungen (z. B. Temperatur, Viskosität) abhängig sein wird. Es ist in einem derartigen System eindeutig nicht möglich, schnelle und genaue Messungen der Ligandenkonzentration zu erhalten.
Kinetische Messungen sind auch verwendet worden um die Konzentration einer Unbekannten in einigen Immunoassays, wie in EP-A-667528 (Daikin Industries, Limited) offenbart, zu bestimmen. Jedoch beziehen derartige Assays nicht das kontinuierliche Verfolgen der Konzentration der Unbekannten ein.
In anderen Assaysystemen, beispielsweise die in EP-A-184600 (Battelle Memorial Institute), können kinetische Messungen durchgeführt werden, werden aber nicht verwendet um die Konzentration einer Unbekannten in einer Probe zu bestimmen, wobei statt dessen eine einzelne Endmessung diesbezüglich verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Fund, dass in Assayverfahren, während deren Verlauf eine Komponente des Assaysystems direkt oder indirekt an die Oberfläche eines Festkörpers gebunden wird oder auf ihr adsorbiert wird, eine verlässliche Messung der gebundenen oder adsorbierten Komponente (d. h. ohne Interferenz von der freien Komponente in Lösung) durch direktes und kontinuierliches Verfolgen der Komponente erhalten werden kann.
Es sollte betont werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren Assaysysteme sowohl der direkten und indirekten Art betrifft, wobei die einzige Anforderung ist, dass sie das Binden einer Komponente des Assaysystems an die Oberfläche eines Festkörpers einschließen. Direkte Assayverfahren können typischerweise Verfolgen des reflektierten und/oder erzeugten Signals innerhalb einer bestrahlten festen optischen Struktur (z. B. ein Wellenleiter) einschließen um das Ausmaß, zu dem (oder die Geschwindigkeit, zu der) die optischen Charakteristika der optischen Struktur und/oder des erzeugten Signals durch die biochemische Komplexierung eines Liganden und spezifischen Bindungspartners, der an die optische Struktur gebunden ist (z. B. Antigen/Antikörper-Komplexierung), verändert sind, zu bestimmen. Indirekte Assayverfahren können typischerweise Verfolgen einer Markierung (z. B. ein Fluorophor), die an eine oder mehrere der im Assay vorliegenden Komponenten und direkt oder indirekt an den Festkörper gebunden ist, einschließen. Derartige Verfahren sind z. B. inter alia in WO-A-88/07202 und WO-A-90101166 (Ares Serono) beschrieben. Die Erfindung ist ebenso auf Verdrängungsassays, wo die markierte Komponente von der festen Oberfläche infolge der Antikörper:Antigen-Wechselwirkung entfernt wird, anwendbar.
Das neuartige Assayverfahren der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, dass ein Hinweis auf die unbekannte Ligandenkonzentration zu einer sehr frühen Phase der Inkubationsperiode erhalten werden kann, ohne die Notwendigkeit auf irgendeinen willkürlich bestimmten Endpunkt, wie z. B. ein Gleichgewicht, zu warten. Außerdem ist der Bediener in der Lage, das Ergebnis kontinuierlich zu beobachten und zu beurteilen, ob es lohnenswert wäre, weitere Ablesungen in einem Versuch, um die Genauigkeit des Ergebnisses zu verbessern, durchzuführen. Zusätzlich erlaubt kontinuierliches Verfolgen, dass Zufallsfehler, verursacht durch z. B. Probleme mit der Instrumentierung, leicht identifiziert werden. Irgendein ungewolltes Ergebnis kann einfach isoliert und ignoriert werden.
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung kinetischer Messungen um quantitativ eine unbekannte Probe in einem Assaysystem, bei dem eine Komponente davon wenigstens teilweise direkt oder indirekt an die Oberfläche eines Festkörpers, z. B. die Oberfläche eines festen optischen Wellenleiters, einer Elektrode oder eines piezoelektrischen Kristalls, gebunden wird, zu bestimmen, und wobei die Ergebnisse der Bestimmung kontinuierlich verfolgt werden, ein.
Durch "kinetische Messungen" sind direkte und kontinuierliche Messungen einer messbaren Eigenschaft oder eines messbaren Effekts, assoziiert mit der gebundenen Komponente (nachfolgend ein "Analyt-abhängiger Parameter") zu einer Zeit, bevor der Assay einen im Wesentlichen stationären Zustand, d. h. Gleichgewicht, erreicht, gemeint.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Assayverfahren, bei dem eine Komponente wenigstens teilweise direkt oder indirekt an einen Festkörper, z. B. einen optischen Wellenleiter, eine Elektrode oder einen piezoelektrischen Kristall, gebunden wird, wobei der Assay für x-Proben, jede von bekannter Analytkonzentration (C_a), durch Messen des Wertes eines Analyt-abhängigen Parameters (P_z) kontinuierlich für jede Probe unabhängig, zu einer Vielzahl von Zeiten (t_y) nach dem Beginn der Inkubation, kalibriert worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte:
für einen Analyt unbekannter Konzentration (C_b) das Messen auf eine direkte und kontinuierliche Art und Weise von n unabhängigen Werten eines Analyt-abhängigen Parameters (P_d), der mit der Komponente assoziiert ist, jeweils zur Zeit t_e nach dem Beginn der Inkubation, und
das Manipulieren des genannten gemessenen Analyt-abhängigen Parameters um quantitativ eine unbekannte Probe zu bestimmen durch das Kombinieren der Daten (P_d, t_e) mit den Kalibrierungsdaten (P_z, t_y, C_a) um die unbekannte Analytdosis (C_b) zur Zeit t_e zu berechnen,
wobei die Ergebnisse der Bestimmung kontinuierlich verfolgt werden, umfasst, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem ein Assayverfahren, bei dem eine Komponente wenigstens teilweise direkt oder indirekt an einen Festkörper, z. B. einen optischen Wellenleiter, eine Elektrode oder einen piezoelektrischen Kristall, gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein Analyt-abhängiger Parameter, assoziiert mit der Komponente, auf eine direkte und kontinuierliche Art und Weise gemessen wird, und dass genannter gemessener Analyt-abhängiger Parameter manipuliert wird um quantitativ eine unbekannte Probe zu bestimmen, und dass die Ergebnisse der Bestimmung kontinuierlich verfolgt werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kalibrieren des Assaysystems für x Proben, jede von bekannter Analytkonzentration (C_a), durch Messen des Wertes eines Analyt-abhängigen Parameters (P_z) kontinuierlich für jede Probe unabhängig zu einer Vielzahl von Zeiten (t_y) nach dem Beginn der Inkubation,
(b) für einen Analyt unbekannter Konzentration (C_b) kontinuierliches Messen n unabhängiger Werte eines Analyt-abhängigen Parameters (P_d) jeweils zur Zeit (t_e) nach dem Beginn der Inkubation,
(c) Kombinieren der Daten (P_d, t_e) aus Schritt (b) mit den Kalibrierungsdaten (P_z, t_y, C_a) aus Schritt (a) um die unbekannte Analytdosis (C_b) zur Zeit t_e zu berechnen, bereit.

In einer Ausführungsform ist der Analyt-abhängige Parameter ein Analyt-abhängiger optischer Parameter (d. h. eine messbare optische Eigenschaft oder ein messbarer optischer Effekt), aber Parameter, die elektrochemische oder piezoelektrische Eigenschaften/Effekte betreffen, können verwendet werden.
Der oben genannte Analyt-abhängige Parameter kann in geeigneter Weise irgendein Parameter sein, der mit der Wechselwirkung zwischen angewandter Strahlung und der relevanten gebundenen Assaykomponente assoziiert ist, und schließt ein, ist aber nicht limitiert auf, lichtabsorbierende, Streuungs-, Fluoreszenzemissions-, Phosphoreszenzemissions-, Lumineszenzemissions- (einschließlich Chemilumineszenz, Biolumineszenz und Elektrochemolumineszenz) oder Farbemissionseigenschaften. Der Ausdruck ist außerdem dafür bestimmt, die messbaren Effekte zu umfassen, die die gebundene Komponente beispielsweise auf den Brechungsindex oder die Transmissionsfähigkeit der optischen Oberfläche, auf die gesamte interne Reflektion oder Oberflächenplasmonresonanz (SPR, "surface plasmon resonance") innerhalb des festen optischen Körpers, oder Wechselwirkungen mit evaneszenten Wellen auf der Oberfläche des Körpers haben kann. Geräte und Verfahren zum Messen derartiger Analyt-abhängiger optischer Parameter oder Manipulieren der oben genannten Effekte sind im Fachgebiet bekannt.
Die Erfindung erstreckt sich außerdem auf die Verwendung von nicht-optischen Geräten, wie z. B. elektrochemischen und anderen Sensorgeräten (z. B. piezoelektrische Kristalle).
Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "Festkörper" dafür bestimmt, sich geeigneterweise auf irgendeine der bekannten Oberflächen, an die brauchbar Ligand und/oder spezifische Bindungspartnerkomponent(en) gebunden werden können, z. B. in der Form eines elektrochemischen, optischen, piezoelektrischen oder faseroptischen Biosensors, wie in US-A-5356780 beschrieben, oder einer optischen Struktur, fähig, einen SPR-Effekt (z. B. ein Beugungsgitter) aufzuweisen, oder eines transparenten optischen Körpers (z. B. ein Prisma, ein Blatt oder eine Faser, die als ein Wellenleiter, wie in EP-A-170376 (Unilever) beschrieben, wirken), der in EP-A-171148 (Unilever) und WO-A-95/24632 (Applied Research Systems) beschriebenen Art, zu beziehen. In elektrochemischen Assaygeräten, wo der Festkörper eine Elektrode ist, ist es bekannt, Komponenten, die an mangetische Perlen gebunden sind, oder Partikel, die von einem magnetischen Feld, das bei der Elektrode erzeugt wird, angezogen werden können, zu verwenden. Diese Geräte sind auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar und sind beispielsweise in EP-A-170446 (Serono Diagnostics Limited) beschrieben.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Festkörper mit einem spezifischen Bindungspartner für den interessierenden Analyt beschichtet werden. Spezifische Bindungspartner können auf die Oberfläche des Festkörpers durch bekannte Verfahren, beispielsweise wie in EP-A-171148 beschrieben, aufgetragen werden.
Die Erfindung ist insbesondere geeignet für Assayverfahren, während deren Verlauf eine Komponente, die als eine Markierung fungiert und optisch messbare Eigenschaften, wie z. B. lichtabsorbierende, lichtdurchlassende, lichtstreuende, fluoreszente, phosphoreszente, lumineszente oder Farbeigenschaften aufweist, wenigstens teilweise (direkt oder indirekt) an die Oberfläche eines transparenten Festkörpers (z. B. einen optischen Wellenleiter), insbesondere Verfahren der Art, wie beispielsweise in EP-A-170376 und EP-A-171148 beschrieben, gebunden wird.
In Ausführungsformen der Erfindung, die indirekte Assaytechniken betreffen, kann das Binden der Markierungen, direkt oder indirekt, zu einem oder einem anderen des Liganden oder dessen spezifischen Bindungspartners durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren durchgeführt werden. Die Identität derartiger Markierungen ist dem Fachmann ebenso gut bekannt und schließt jene, die oben erwähnt wurden, ein.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist, in bestimmten Ausführungsformen, zur Verwendung bei spezifischen Bindungsassayverfahren in chemischen, biochemischen oder klinischen Testverfahren, insbesondere bei Immunoassayverfahren, vorgesehen. Beispiele derartiger Verfahren sind inter alia in EP-A-0171148, WO-A-92/09892, WO-A-93/25892 und WO-A-93/25908 beschrieben.
Das vorliegende Verfahren ist außerdem auf eine große Vielfalt von Vorrichtungen anwendbar, vorausgesetzt, dass diese von einer Art sind, die von einer an einen Festkörper gebundenen Komponente Gebrauch machen, einschließlich beispielsweise "dip-stick"- oder Testreifensensoren, Vorrichtungen, die eine "Probendurchfluss"-Konfiguration verwenden, oder Vorrichtungen, die Probenaufnahmen verwenden. Probenaufnahmevorrichtungen sind zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, wobei eine mehr bevorzugte Vorrichtung eine Kapillarfüllvorrichtung, besonders eine Fluoreszenz-Kapillarvorrichtung, beispielsweise die in EP-A-171148, WO-A-90/14590 oder in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB95/02236 (Applied Research Systems ARS Holding NV) beschriebene Vorrichtung, ist. Derartige Kapillarfüllvorrichtungen können einzeln oder in einem geeigneten Halter, wie in WO-A-90/1830 beschrieben ist, verwendet werden.
Beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens um eine unbekannte Probe zu bestimmen, ist es zuerst notwendig, das Instrument unter Verwendung eines Satzes von Lösungen, die bekannte Konzentrationen des Analyts enthalten, zu kalibrieren (d. h. Schritt (a), wie im Vorangegangenen definiert). Das an diesen Schritt angepasste Protokoll kann bequem von dem Bediener ausgewählt werden und soll in keinerlei Hinsicht den Rahmen der Erfindung einschränken. Derartige vom Bediener bestimmte Variablen schließen die Zahl von Standards (oben als x bezeichnet), die typischerweise 3 oder mehr sein könnte, die Zahl von Vorrichtungen, die Zahl von Ablesungen, das Zeitintervall zwischen Ablesungen und die Gesamtdauer, über die die Kalibrierung durchgeführt wird, ein.
Nach Füllen einer Vorrichtung mit einem bestimmten Standard, werden Messungen des Analyt-abhängigen Parameters (oben allgemeiner als P_z bezeichnet) zu regelmäßigen Intervallen, wie z. B. alle fünf Sekunden, für so lange, wie es angebracht ist, genommen. Dieses Vorgehen wird wahlweise für weitere Vorrichtungen wiederholt, was Antwortdaten bei jedem Zeitpunkt (oben als t_y bezeichnet) für alle Standardanalyte ergibt. Für jeden Zeitpunkt t_y ist es deshalb möglich, eine Standardkurve von P_z gegen C_a (angemessen zur Zeit t_y) zu erzeugen. In einer Ausführungsform können die (P_z, C_a) Daten an eine Standardgleichung, wie z. B. eine logistische Gleichung mit n-Parametern oder einen angebrachten Algorithmus, unter Verwendung irgendeiner üblichen Anpassungsmethode, wie z. B. einer Methode der kleinsten Quadrate, angepasst werden.
Im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der unbekannte Analyt-abhängige Parameter (oben als P_d bezeichnet) zu irgendeinem Zeitpunkt (oben als t_e bezeichnet), gemessen und zum Bestimmen einer Konzentration durch Interpolation der Standardkurve (P_z, C_a) für diesen Zeitpunkt verwendet werden. Angebrachte Glättungssoftware kann verwendet werden um die Genauigkeit der Bestimmung der Konzentration des Analyts in der Probe zu verbessern. Typischerweise werden die in diesem Schritt erhaltenen (t_e, C_b) Daten manipuliert um ein Dosis-gegen-Zeit-Profil für die Probe zu ergeben, wofür ein Beispiel in 2 gegeben ist.
Wie zuvor betont worden ist, ist das erfindungsgemäße Verfahren ein kinetisches Verfahren, und in Schritt (b) ist das Intervall zwischen Ablesungen Bediener-bestimmt und typischerweise in der Größenordnung von weniger als 60 s, besonders weniger als 30 s, insbesondere weniger als 10 s und speziell 5 s oder weniger.
In der Praxis stellt man sich vor, dass die Kalibrierungsdaten aus Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens von einem Hersteller für jede Charge von Reagentien erstellt und als eine Reihe von kinetischen Standardkurven präsentiert werden können. Diese Kurven würden dann an den Kunden über geeignete Mittel zum Speichern maschinenesbarer, codierter Daten, wie z. B. Software-Strichcodes oder Magnetstreifen, für jede Charge von Reagentien geliefert werden. Folglich würde beispielsweise das geeignete Instrument beim Laufenlassen unbekannter Proben die Kalibrierungskurven in seiner Software tragen und sie als "Nachschlagetabellen" verwenden um die Dosis des Analyts in der im Test befindlichen Probe zu berechnen.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Kalibrieren eines Assaysystems bereit, das Schritt (a), wie vorangehend definiert, und nachfolgendes Anpassen der (P_z, C_a) Daten an eine Standardgleichung (angemessen für Zeit t_y) umfasst, wobei das Verfahren ferner den Schritt des Speicherns der Kalibrierungsdaten auf einem Mittel zum Speichern maschinenlesbarer, codierter Daten umfasst. Ein Kit, der eine Assayvorrichtung zusammen mit Mitteln zum Speichern maschinenlesbarer, codierter Daten umfasst, der Kalibrierungsdaten P_z, t_y, C_a, wie vorangehend definiert, enthält, und der angepasst ist, mit Ablesemitteln zum Zwecke des quantitativen Bestimmens eines unbekannten Analyts angepasst ist, bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Ein Technologiegebiet, das sich in den letzten Jahren signifikantem Fortschritt unterzogen hat, sind die sogenannten "point-of-care"-Assaysysteme. Diese sind auf sehr genaue, sensitive und schnelle Assayverfahren angewiesen um die Durchführung erfolgreichen Testens nahe am Patienten zu ermöglichen. Eindeutig deshalb bietet sich die vorliegende Erfindung mit den vorangehend erwähnten Vorteilen einer derartigen Technologie an.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auf Assays von Antigenen oder Antikörpern, d. h. auf Immunoassays, anwendbar, und in einer Ausführungsform der Erfindung ist der im Assay befindliche Ligand ein Antigen, und der spezifische Bindungspartner umfasst einen Antikörper gegen das Antigen. Jedoch ist, wie oben erwähnt, die Erfindung nicht als limitiert auf Assays von Antikörpern oder Antigenen anzunehmen. Beispiele von Liganden, die durch das verbesserte erfindungsgemäße Assayverfahren untersucht werden können, sind unten in Tabelle 1, in jedem Fall zusammen mit einer Angabe eines geeigneten spezifischen Bindungspartners, aufgeführt.
Tabelle 1
Das erfindungsgemäße Verfahren hat sehr breite Anwendbarkeit, kann aber insbesondere in Assays für: Hormone, einschließlich Peptidhormone (z. B. Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Chorionzottengonadotrophin (hCG), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin), oder Nicht-Peptidhormone (z. B. Steroidhormone, wie z. B. Cortisol, Östradiol, Progesteron und Testosteron, oder Thyroidhormone, wie z. B. Thoyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z. B. carcinoembrionisches Antigen (CEA) und Antikörper, Alphafetoprotein (AFP) und Prostata-spezifisches Antigen (PSA)), Arzneimittel (z. B. Digoxin, Missbrauchsarzneimittel), Zucker, Toxine, Vitamine, Viren, wie z. B. Influenza-, Para-Influenza-, Adeno-, Hepatitis-, respiratorische und AIDS-Viren, Virus-ähnliche Partikel oder Mikroorganismen, verwendet werden.
Es wird selbstverständlich sein, dass der hierin verwendete Ausdruck "Antikörper" innerhalb seines Bereichs einschließt:

(a) Beliebige der verschiedenen Klassen oder Subklassen von Immunglobulin, z. B. IgG, IgA, IgM oder IgE, das aus irgendeinem der üblicherweise verwendeten Tiere, z. B. Schafen, Kaninchen, Ziegen oder Mäusen, stammt,
(b) monoklonale Antikörper,
(c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, wobei die Fragmente jene, die die Bindungsregion des Antikörpers, d. h. Fragmente frei von dem Fc-Anteil (z. B. Fab, Fab', F(ab')₂) enthalten, die sogenannten "Halbmolekül"-Fragmente, erhalten durch reduktive Spaltung der Disulfidbrücken, die die Komponenten der schweren Kette im intakten Antikörper verbinden, oder Fragmente, erhalten durch synthetische Verfahren, sind,
(d) durch rekombinante DNA-Techniken hergestellte oder modifizierte Antikörper, einschließlich "humanisierte Antikörper".

Das Verfahren zur Herstellung von Antikörperfragmenten ist im Fachgebiet gut bekannt und wird hierin nicht beschrieben werden.
Der Ausdruck "Antigen", wie hierin verwendet, wird verständlicherweise sowohl dauerhaft antigene Arten (beispielsweise Proteine, Peptide, Bakterien, bakterielle Fragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren), als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, einschließen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für den normalen Bereich an Probenarten, z. B. Urin, auf Serum basierende und Gesamtblutproben, Lebensmittelproben, wie z. B. Wasserproben und Milchproben, und auf den bekannten Bereich von Verfahrensarten, beispielsweise Kompetitions- oder Sandwichassays, einschließlich inter alia direkten Antigenassays, kompetitiven Antigenassays, direkten Antikörperassays, Sandwichantikörperassays, verknüpften Antikörperassays, kompetitiven Antikörperassays und dergleichen, anwendbar.
Die detaillierte Präparation der Assayvorrichtungen innerhalb des Rahmens des erfindungsgemäßen Verfahrens und die zum Sammeln der Daten verwendeten Assayabläufe sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Erfindung wird nun in einer nicht-limitierenden Art durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden.
BEISPIELE
Beispiel A
1. Herstellung der Ausgangsmaterialien:
1.1 Herstellen Antikörper-beschichteter optischer Wellenleiter:
Monoklonale Anti-PSA-Antikörper wurden von Serono Diagnostics S A, Coinsins, Schweiz, bereitgestellt. Eine Scheibe Permablockglas (Pilkington Glass Ltd., St. Helens, UK) mit einer Dicke von ungefähr 1 mm wurde mit Detergens (z. B. Tween 20) in ultrareinem Wasser mit Ultraschallbehandlung gereinigt. Die Glasoberfläche wurde durch Inkubieren in einer 2%igen Lösung von Aminopropyltrimethoxysilan in Wasser (pH 3–4) zwei Stunden lang bei 75°C aktiviert. Nach Spülen in Wasser wurde die Glasscheibe bei 115°C wenigstens vier Stunden lang getrocknet. Das Glas wurde dann 60 Minuten in einer 2,5%igen Lösung von Glutaraldehyd in einem 0,05-molaren Phosphatpuffer (pH 7) inkubiert und dann gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Anti-PSA-Antikörper wurden auf das Glas gemustert durch das diskrete Dosieren einer 1%igen Lösung des Antikörpers in Phosphatpuffer (pH 7) auf das Glas und 2- bis 4-stündiges Inkubieren desselben, wonach die Glasscheibe mit Pufferlösung gewaschen wurde. Ungewolltes adsorbiertes Protein wurde durch Einweichen mit 6 M Harnstofflösung auf eine bekannte Art und Weise entfernt. Schließlich wurde eine Schicht aus Saccharose/Lactose über der Oberfläche der Glasscheibe durch Auftragen durch Schleuderbeschichtung ("spin coating") gebildet. Dies bildete Platte 4 der FCFD-Testvorrichtung.
1.2 Herstellung von an Allophycocyanin (APC) konjugiertes PSA
Ein zweiter monoklonaler Anti-PSA-Antikörper, der ein zu dem oben in 1.1 verwendeten Epitop verschiedenes Epitop auf dem PSA-Molekül erkennt, wurde an Allophycocyanin (λex = 650 nm, λem = 660 nm) von Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, konjugiert und wurde wie geliefert verwendet.
1.3 Mikrodosierung der spezifischen Reagentien über eine diskrete Zone des Anti-PSA-Antikörpers
Eine undurchsichtige Beschichtung wurde durch Siebdruck auf eine saubere Scheibe Permablockglas, wie in GB 8911462.3 beschrieben, aufgedruckt ("screen printed"). Die Messzone der Vorrichtung wurde durch Mikrodosieren einer Schicht aus Anti-PSA/Allophycocyanin-Antikörperkonjugat in Puffer, enthaltend Polyvinylalkohol, in einem Gebiet von 3 × 7 mm auf das Glas über der Zone hergestellt. Nachdem das Konjugat luftgetrocknet war, wurde eine Schicht Polyvinylalkohol (4% in Puffer) über dem Konjugat mikrodosiert. Schließlich wurde die gesamte Glasscheibe in eine Schicht aus Saccharose/Lactose durch Sprühbeschichten eingehüllt. Diese bildete Platte 2 der FCFD-Testvorrichtung.
1.4 Herstellung von FCFD-Testvorrichtungen
FCFD-Testvorrichtungen, wie sie z. B. in EP-A-0171148 beschrieben worden sind, wurden durch Siebdrucken ("screen printing") von Klebspuren eines Ultraviolett-härtenden Klebers (UVS 91, Norland Inc., USA), die Glasmikrokügelchen von 100 μm Durchmesser enthielten (Jencons Ltd., UK) auf den aus 1.1 oberhalb resultierenden Wellenleiter, in einem Muster, das die langen Ränder der Kapillarzellvorrichtung definiert, hergestellt. Eine Glasscheibe, wie in 1.3 oben definiert, wurde dann über dem Wellenleiter plaziert und ein Vakuum an dem Laminat angelegt. Aufgrund des Vakuums wurde bewirkt, dass die obere Glasscheibe auf den Kleber herunterdrückte, wobei die Glasmikrokügelchen einen Spalt von 100 μm zwischen den Glasscheiben definierten. Das Laminat wurde dann einer Ultraviolett-Lichtquelle ausgesetzt um den Kleber zu härten. Schließlich wurde die Laminatscheibe in individuelle Testvorrichtungen, wie in EP-A-0171148 beschrieben, gebrochen.
1.5 Apparat, verwendet bei der Messung des PSA-Assays
Ein einfacher Fluorimetrie-Apparat, umfassend eine kontinuierliche Lichtquelle (bereitgestellt durch lichtemittierende Dioden, die Licht mit einer geeigneten Wellenlänge emittieren, um den Allophycocyaninfluorphor anzuregen und eine Photomultiplierröhre (PMT, "photomultiplier tube"). Licht, das aus dem optischen Ende des FCFD hervortritt, wird gefiltert um Streu pumpenlicht ("stray pump light") zu entfernen, und der diskrete Winkelbereich, erforderlich zum Ablesen der gebundenen Fluoreszenz, wird durch Fokussieren des Lichts auf die PMT durch eine Blende gemessen.
2. Assayverfahren für PSA
Signale, Indikativ für die Analytkonzentrationen, wurden von den FCFD-Vorrichtungen durch das folgende Verfahren erhalten. Die Vorrichtung, die die zu untersuchende Probe enthielt, wurde durch Licht, geeignet zum Stimulieren des innerhalb der Prüfungsmittelanordnung ("test reagentry") enthaltenen Fluorphors, flutbeleuchtet ("flood illuminated"). Das Eingangslicht ("input light") ist kontinuierlich und seine Intensität zu jedem erforderlichen Messzeitpunkt wiederholbar.
Beim Abschätzen der Konzentration einer unbekannten Probe ist es zuerst notwendig, das Instrument unter Verwendung eines Satzes von Lösungen, die bekannte Konzentrationen des Analyts enthalten, zu kalibrieren. Für die hier präsentierten Daten wurden sieben Standardkonzentrationen verwendet, wobei jede Konzentration in Duplikatvorrichtungen laufen gelassen wurde. Nach Füllen einer Vorrichtung mit einer bestimmten Standardkonzentration wurden Messungen des Fluoreszenzlevels bei regelmäßigen Intervallen (alle 5 Sekunden für die präsentierten Daten) genommen. Auf diese Art und Weise konnte die Reaktionskinetik, wie in 1 demonstriert, verfolgt werden. Messungen wurden über eine Dauer von 20 Minuten genommen. Nach Abschließen kinetischer Messungen auf allen Vorrichtungen, waren Daten (zu allen Zeitpunkten) hinsichtlich der Antwort auf alle jeweiligen Standardanalytkonzentrationen verfügbar. Deshalb war es möglich, eine "Standardkurve" entsprechend jedem der Zeitpunkte zu erstellen. Im Fall der vorliegenden Daten war die verwendete Standardgleichung eine Logistik mit vier Parametern, die durch eine konventionelle Methode der kleinsten Quadrate angepasst worden war.
Nachfolgend auf dieses Kalibrierungsverfahren wurden Proben unbekannter Konzentration im selben Kinetikmodus laufen gelassen. Der Fluoreszenzlevel bei jedem Zeitpunkt wurde aus der zugehörigen Standardkurve interpoliert, was ermöglichte, dass ein Konzentrationslevel festgestellt wurde. Die Ergebnisse der Abhängigkeit der gemessenen Dosis von der Assayzeit, interpoliert aus der relevanten Standardkurve, sind in 2 gezeigt.

Claims

Assay-Verfahren, bei dem eine Komponente wenigstens teilweise an einen Festkörper gebunden wird, wobei der Assay für x Proben, jede von bekannter Analytkonzentration (C_a), durch Messen des Wertes eines Analyt-abhängigen Parameters (P_z) kontinuierlich für jede Probe unabhängig, zu einer Vielzahl von Zeiten (t_y) nach dem Beginn der Inkubation, kalibriert worden ist, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren die Schritte: für einen Analyt unbekannter Konzentration (C_b) das Messen auf eine direkte und kontinuierliche Art und Weise von n unabhängigen Werten eines Analyt-abhängigen Parameters (P_d), der mit genannter Komponente assoziiert ist, jeweils zur Zeit t_e nach dem Beginn der Inkubation, und das Manipulieren des genannten gemessenen Analyt-abhängigen Parameters, um quantitativ eine unbekannte Probe zu bestimmen durch das Kombinieren der Daten (P_d, t_e) mit den Kalibrierungsdaten (P_z, t_y, C_a), um die unbekannte Analytdosis (C_b) zur Zeit t_e zu berechnen, wobei die Ergebnisse der Bestimmung kontinuierlich verfolgt werden, umfasst.
Assay-Verfahren, bei dem eine Komponente wenigstens teilweise an einen Festkörper gebunden wird, dadurch charakterisiert, dass ein Analyt-abhängiger Parameter, assoziiert mit genannter Komponente, auf eine direkte und kontinuierliche Art und Weise gemessen wird, und dass genannter gemessener Analyt-abhängiger Parameter manipuliert wird, um quantitativ eine unbekannte Probe zu bestimmen, und dass die Ergebnisse der Bestimmung kontinuierlich verfolgt werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kalibrieren des Assay-Systems für x Proben, jede von bekannter Analytkonzentration (Ca), durch Messen des Wertes von einem Analyt-abhängigen Parameter (P_z) kontinuierlich für jede Probe unabhängig zu einer Vielzahl von Zeiten (t_y) nach dem Beginn der Inkubation, (b) für einen Analyt unbekannter Konzentration (C_b) kontinuierliches Messen n unabhängiger Werte von einem Analyt-abhängigen Parameter (P_d) jeweils zur Zeit t_e nach dem Beginn der Inkubation, (c) Kombinieren der Daten (P_d, t_e) aus Schritt (b) mit den Kalibrierungsdaten (P_z, t_y, C_a) aus Schritt (a), um die unbekannte Analytdosis (C_b) zur Zeit t_e zu berechnen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei genannter Festkörper ein optischer Wellenleiter ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei genannter Analyt-abhängiger Parameter ein optischer Parameter ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei genannter optischer Parameter Fluoreszenz-Emission ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, wobei genannter Festkörper in der Form einer Probenaufnahmevorrichtung ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei genannte Vorrichtung eine Kapillarfüllvorrichtung ist.
Verfahren zum Kalibrieren eines Assay-Systems für x Proben, jede von bekannter Analytkonzentration (C_a), umfassend: (a) Messen des Wertes eines Analyt-abhängigen Parameters (P_z) kontinuierlich für jede Probe unabhängig zu einer Vielzahl von Zeiten (t_y) nach dem Beginn der Inkubation; und (b) Anpassen der Kalibrierungsdaten an eine Standardgleichung, wobei genanntes Verfahren ferner den Schritt des Speicherns genannter Kalibrierungsdaten auf einem Mittel zum Speichern von maschinenlesbaren kodierten Daten umfasst.
Kit, umfassend eine Assay-Vorrichtung zusammen mit einem Mittel zum Speichern maschinenlesbarer kodierter Daten, welcher Kalibrierungsdaten P_z, C_a, t_y wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert, enthält, und welcher angepasst ist, um mit Lesemitteln zum Zwecke des quantitativen Bestimmens eines unbekannten Analyts zu kooperieren.
Kit nach Anspruch 9, dadurch charakterisiert, dass das Daten speichernde Mittel einen auf der Vorrichtung angebrachten Strichcode umfasst.