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Verfahren zur Durchführung immunologischer Bestimmungen Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Bestimmung (Analyse) von Substanzen, die in einer Probe
enthalten sind, unter Ausnutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion.
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Aufgrund der jüngsten Fortschritte auf medizinischem Gebiet ist es
möglich geworden, sehr kleine Menge biologischer Substanzen zu bestimmen und dies
trägt zu einer frühen Diagnose verschiedener Krankheiten bei. Zum Beispiel können
bösartige Tumore etwa durch Alpha-Fetoprotein (AFP) und carcinoembryonales Antigen
(CEA), eine abnorme Hormonsekretion wie von Insulin und Thyroxin und immunologische
Erkrankungen, z.B. durch Immunoglobulin, in einem frühen Stadium diagnostiziert
werden. Daher hinaus ist es möglich geworden, den Verlauf bzw. Erfolg einer medizinischen
Behandlung zu überwachen. Fernex trägt die Bestimmung von niedermolekularer. Haptenen
(wie Arzneimitteln) dazu bei, ein Verabreichungsschema für Arzneimittel zu entwickeln.
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Die meisten dieser biologischen Substanzen wurden mit Hilfe eines
immunologischen VerLahrens bestimmt, bei dem die Antigen-Antikörper-Reaktion ausgenutzt
wird. Es sind ziele unterschiedliche immunologische Bestiwmungsverfahren bekannt.
Z.B. wird Antigen oder Antikörper an feine Teilchen aus Glas oder synthetischem
Harz fixiert und mit einer Probe von Antikörper oder Antigen zusammengebracht, während
markierende Antikörper oder Antigene, die mit sehr empfindlichen Markierungssubstanzen,
wie Radioisotpen, fluoreszierenden Snbstanzen, lumineszierenden Substanzen bzw.
Enzymen markiert sind, angewandt werden, um
einen Antigen-Antikörper-Komplex
zu bilden. Dann wird der Antigen-Antikörper-Komplex nachgewiesen, um das in der
Probe enthaltene Antigen bzw. den Antikörper quantitativ zu bestimmen.
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Fig. 1 zeigt einen Reaktionsverlauf einer bekannten enzymimmunologischen
Analyse unter Anwendung eines Enzyms als Markierungssubstanz. Auf der Außenseite
eines unlöslichen Trägers 1 ist ein Antikörper 1A fixiert, der spezifisch mit dem
in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Antigen reagiert. Wenn in der Probe Antikörper
anstelle von Antigenen bestimmt werden sollen, muß das Antigen, das mit der Probe
spezifisch reagiert, auf dem unlöslichen Träger 1 fixiert werden. Zunächst reagiert
der Antikörper 1A auf dem Träger 1 mit dem in der Probe enthaltenen Antigen 2. Dann
wird freies Antigen, das nicht mit dem Antikörper 1A auf dem Träger 1 reagiert hat,
von dem auf dem Träger 1 gebundenen Antigen 1A durch Waschen abgetrennt. Diese Trennstufe
wird allgemein als B-F-Trennung bezeichnet. Anschließend wird der Träger 1 mit einem
Markierungsreagens 3 umgesetzt, bestehend aus Antikörper 3A markiert mit Enzym 3B,
wobei der Antikörper 3A spezifisch mit dem Antigen 2 der Probe reagiert.
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Anschließend wird erneut eine B-F-Trennung durchgeführt, um freies
Markierungsreagens von dem Markierungsreagens abzutrennen, das an das Antigen 2
der Probe gebunden ist, das seinerseits mit dem Antikörper 1A, der auf dem Träger
1 fixiert ist, reagiert hat. Ferner wird ein Farbreagens zugesetzt, um eine Farbreaktion
durchzuführen mit dem Enzym 3B des Markierungsreagens 3. Schließlich wird die Reaktionsflüssigkeit
kolorimetrisch untersucht, um die Enzymaktivität nachzuweisen. Auf diese Weise wird
die Substanz 2 in der Probe mit hoher Empfindlichkeit quantitativ bestimmt. Das
oben erwähnte immunologische Bestimmungsverfahren wird weitgehend angewandt.
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Bei dem bekannten immunologischen Bestimmungsverfahren, bei dem ein
Markierungsreagens, enthaltend Antikörper oder Antigen, angewandt wird, wird, nachdem
der auf dem Träger fixierte Antikörper bzw. das Antigen mit dem Antigen bzw. Antikörper
der
Probe reagiert hat, die erste B-F-Trennung durchgeführt, und nachdem
das Antigen bzw. der Antikörper der Probe mit dem Markierungsreagens reagiert hat,
wird die zweite B-F-Trennung durchgeführt. Daher erfordert die Analyse zahlreiche
Stufen und das Bestimmungsverfahren wird kompliziert. Außerdem ist es erforderlich,
verschiedene Arten von Reagentien zu verwenden, wodurch die laufenden Kosten hoch
werden. Es ist zu bemerken, daß eine Analysiervorrichtung zur Durchführung der bekannten
Bestimmung ebenfalls kompliziert und teuer wird.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein immunologisches Bestimmungsverfahren
zu entwickeln, mit dessen Hilfe Proben mit weniger Stufen genau analysiert werden
können, ohne daß teure Reagentien angewandt werden müssen. Bei diesem Verfahren
soll die B-F-Trennung nicht erforderlich sein.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigen oder
Antikörper in einer Probe auf immur,ologischC Weise, das die folgenden Stufen umfaßt:
Vermischen einer Probe, die die zu bestimmende Substanz enthält, mit einem Flüssigkristall,
mit Flüssigkristall-Molekülen, auf denen eine Substanz fixiert ist, die spezifisch
in einer immunologischen Reaktion mit der in der Probe enthaltenen Substanz reagiert,
und Messung der Konzentration der in der Probe enthaltenen Substanz entsprechend
der Orientierung der Flüssigkristalle.
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Bei Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde die folgende Tatsache
ausgenutzt: Flüssigkristalle werden verbreitert als passive Elemente unter Ausnutzung
elektrooptischer und thermooptischer Effekte angewandt. Feine Flüssigkristall-Moleküle
werden in einer Flüssigkeit suspendiert und die dreidimensionale molekulare Anordnung
durch elektrische Spannung und mechanischen DrucK verändert, so daß auf die Flussigkristalle
auffallendes Licht polarisiert oder selektiv reflektiert wird. Daher ist es, wenn
die Orientierung von Fltissigkristallen verändert
wird durch immunologische Bindung von Antigen oder Antikörper aus
der Probe möglich, die Menge an Antigen oder Antikörper in der Probe zu messen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Flüssigkristalle anstelle
eines unlöslichen Trägers angewandt und Antikörper bzw.
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Antigen, der (das) spezifisch mit dem Antigen bzw. Antikörper in der
Probe reagiert, wird an die Flüssigkristall-Moleküle fixiert. Dann wird Antigen
oder Antikörper aus der Probe in die Lösung der Flüssigkristalle gegeben, um die
Antigen-Antikörper-Reaktion durchzuführen. Die Orientierung der Flüssigkristall-Moleküle
wird verändert je nach der Menge an Antigen oder Antikörper in der Probe, das (der)
mit dem auf den Flüssigkristall-Moleküle fixierten Antikörper bzw. Antigen reagiert
hat, und die Flüssigkristall-Lösung dient als Analysator oder Rotator für auffallendes
polarisiertes Licht. Daher kann durch Messung der durch die Flüssigkeitskristallösung
hindurchgehenden Menge an polarisiertem Licht die Menge an Antigen oder Antikörper
in der Probe, die an die Flüssigkristall-Moleküle gebunden ist, direkt gemessen
werden, ohne daß eine B-F-Trennung durchgeführt werden muß. Auf diese Weise kann
gemäß der Erfindung das Bestimmungsverfahren einfach gemacht werden und in einer
einfachen kleinen und billigen Analysiervorrichtung durchgeführt werden. Darüber
hinaus können die laufenden Kosten wesentlich verringert werden, da keine teuren
Markierungssubstanzen und Farbreagentien erforderlich sind.
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In den beiliegenden Zeichnungen sind Fig. 1 eine schmatische Ansicht,
die die aufeinanderfolgenden Stufen eines bekannten immunologischen Bestimmungsverfahrens
zeigt; Fig. 2 bis 5 schematische Ansichten, die die aufeinanderfolgenden Stufen
einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens zeigen;
Fig. 6 Kurven, die die Beziehung zwischen der Konzentration der
zu bestimmenden Substanz in der Probe und dem photoelektrisch umgewandelten Ausgangs
signal zeigen; Fig. 7 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Konzentration der
Substanz in der Probe und der Zeit nach dem Anlegen der Spannung angibt; Fig. 8
eine schematische Ansicht, die eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zeigt; und Fig. 9 und 10 schematische Ansichten, die eine weitere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen.
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Die Fig. 2 bis 5 sind, wie oben erwähnt, schematische Ansichten, die
die aufeinanderfolgenden Stufen bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen
immunologischen Bestimmungsverfahrens zeigen. Bei dieser Ausführungsform werden
starre stäbchenförmige Flüssigkristall-Moleküle 10 anstelle des unlöslichen Trägers
verwendet und Antikörper 11, der spezifisch mit dem in der Probe enthaltenen Antigen
reagiert, ist auf diesen Flüssigkristall-Molekülen 10 fixiert. Der Antikörper 11
kann auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 in ähnlicher Weise fixiert sein wie auf
einem unlöslichen Träger, wie Glas oder Kunststoffperlen, wie er nach dem Stand
der Technik verwendet wird. Die Flüssigkristall-Moleküle 10, an die der Antikörper
11 fixiert ist, werden in ein die Probe 12 enthaltendes Reaktionsgefäß 13 eingebracht.
Das Reaktionsgefäß 13 besteht aus transparentem bzw. durchsichtigem Kunststoff und
ein Paar transparenter Elektroden 14a und 14b wird an den Seitenwänden 13a und 13b
einander gegenüber angeordnet. Die transparenten Elektroden 14a und 14b sind über
einen Schalter 15 und eine Gleichstromquelle 16 verbunden. Gegenüber (auf der dem
Reaktionsgefäß abgewandten Seite) der Elektrode 14a ist eine Polarisierungsplatte
17 und eine Lichtquelle 18 angeordnet und gegenüber der transparenten Elektrode
14b ist ein lichtaufnehmendes Element 19 angeordnet.
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Fig. 2 zeigt einen Zustand, in dem Antigen aus der Probe nicht an
die Flüssigkristall-Moleküle gebunden ist und kein elektrisches Feld angelegt ist.
In diesem Falle sind die Flüssigkristall-Moleküle 10 in der Probe 12 suspendiert
und willkürlich in unterschiedlichen Richtungen orientiert. Daher wirkt die Kombination
aus Flüssigkristall-Molekülen 10, Probe 12, Reaktionsgefäß 13 und transparenten
Elektroden 14a und 14b nicht als Analysator. Von der Lichtquelle 18 ausgesandtes
Licht wird durch die Polarisierungsplatte 17 in linear polarisiertes Licht umgewandelt
und trifft dann auf das Reaktionsgefäß 13 auf. Wie oben gesagt sind die Flüssigkristall-Moleküle
10 nicht in einer Richtung orientiert, sondern in unterschiedlichen Richtungen.
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Daher wird nahezu das gesamte auftreffende Licht von den Flüssigkristall-Molekülen
10 nicht unterbrochen, sondern geht durch das Reaktionsgefäß 13 durch. Das aus dem
Reaktionsgefäß 13 austretende Licht wird von dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommen.
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Wie in Fig. 3 gezeigt, sind jedoch, wenn der Schalter 15 geschlossen
ist, und das elektrische Feld zwischen den Elektroden 14a und 14b in Richtung der
optischen Achse aufgebaut ist, alle Flüssigkristall-Moleküle 10 in dem Reaktionsgefäß
13 in einer Richtung senkrecht zu dem elektrischen Feld orientiert. Dann dient das
Reaktionsgefäß 13 als Analysator und nahezu das gesamte einfallende polarisierte
Licht wird von dem Analysator unterbrochen und nahezu der gesamte lineare polarisierte
Lichtstrahl trifft auf das Licht empfangende Element (Licht-Detektor) 19 auf.
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Fig. 4 zeigt einen Zustand, in dem Antigen 20 aus der Probe 12 an
den auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 fixierten Antikörper 11 gebunden ist, aber
kein elektrisches Feld angelegt ist.
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Wenn die Probe das nachzuweisende Antigen 20 enthält, reagiert dieses
mit dem auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 fixierten Antikörper 11. Daher sind
in dem Reaktionsgefäß 13 Flüssigkristall-Moleküle 10a vorhanden, an die Antigen
20 gebunden ist
und Flüssigkristall-Moleküle 10b, an die kein Antigen
gebunden ist. Die Menge an Flüssigkristall-Molekülen 10a ist proportional der Menge
Antigen 20 in der Probe.
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Wenn anschließend der Schalter 15 geschlossen wird, wie in Fig. 5
angegeben, um ein elektrisches Feld über die transparenten Elektroden 14a und 14b
zu erzeugen, werden die Flüssigkristall-Moleküle 10b, an die kein Antigen 20 der
Probe gebunden ist, innerhalb kurzer Zeit parallel zu der Elektrodenoberfläche orientiert,
während Flüssigkristall-Moleküie 10a, an die Antigen 20 der Probe gebunden ist,
kaum in der gleichen Richtung orientiert werden, da das Antigen 20 dem einen (Viskositäts)-Widerstand
entgegensetzt. Daher sind in dem Reaktionsgefäß 13 nebeneinander orientierte Flüssigkristall-Moleküle
10b und nichtorientierte Flüssigkristall-Moleküle 10a vorhanden und dadurch geht
ein Teil des einfallenden linear polarisierten Lichtes durch das Reaktionsgefäß
13 hindurch und wird von dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommen. Die von
dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommene Lichtmenge ist proportional der Menge
der Flüssigkristall-Moleküle 10a, an die das Antigen 20 der Probe gebunden ist,
so daß es durch geeignete Verarbeitung des Ausgangssignals des Licht empfangenden
Elements 19 möglich ist, das in der Probe 12 enthaltene Antigen 20 quantitativ zu
bestimmen.
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Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration an Antigen in
der Probe und dem Ausgangssignal des Licht empfangenden Elements. Die Abszisse gibt
die Zeit an, die nach Anlegen des elektrischen Feldes verstrichen ist, und die Ordinate
die Amplitude des photoelektrischen Ausgangssignals. Die Kurve A zeigt die Veränderung
des photoelektrischen Ausgangssignals, das erhalten wird, wenn die Probe 12 kein
nachzuweisendes Antigen 20 enthält. In diesem Falle nimmt die Amplitude des photoelektrischen
Ausgangssignals plötzlich bis auf einen Sättigungswert zu, wenn der Schalter 15
geschlossen wird. Die Kurven B, C und D zeigen Veränderungen des photoelektrischen
Ausgangssignals
für Proben, die Antigen 20 in unterschiedlichen
Konzentrationen enthalten. Das heißt, die Konzentration an Antigen 20 nimmt für
die Kurven B, C und D in dieser Reihenfolge zu. Wenn die Probe Antigen 20 enthält,
nimmt das photoelektrische Ausgangssignal nach und nach zu und die Anstiegszeit
wird länger, wenn die Probe das Antigen 20 in höherer Konzentration enthält.
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Außerdem nimmt das Sättigungsniveau mit zunehmender Antigenkonzentration
ab. Es ist zu bemerken, daß nach einer ausreichend langen Zeit das photoelektrische
Ausgangssignal einen konstanten Sättigungswert erreicht unabhängig von der Konzentration
an Antigen 20, aber innerhalb eines definierten Zeitraums erreicht das photoelektrische
Ausgangs signal unterschiedliche Sä.ttigungswerte je nach der Konzentration des
Antigens 20. Daher kann durch Nachweis des photoelektrischen Ausgangssignals zu
einem bestimmten Zeitpunkt nach Anlegen des elektrischen Feldes und Vergleich des
erhaltenen Wertes mit dem photoelektrischen Ausgangs signal für eine Standardprobe
ohne das nachzuweisende Antigen die Gesamtmenge an Antigen 20 bestimmt werden.
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Fig. 7 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen Antigenkonzentration
der Probe und Zeit, während der das photoelektrische Ausgangssignal ein bestimmtes
Niveau erreicht, angibt. Wie oben erläutert, variiert die Geschwindigkeit, mit der
das photoelektrische Ausgangssignal den Sättigungswert erreicht, in Ubereinstimmung
mit der Konzentration an Antigen in der Probe. Das heißt, wenn die Antigenkonzentration
in der Probe klein ist, wird auch die Menge an Antigen, das an die Flüssigkristall-Moleküle
10 gebunden ist, gering, so daß die Flüssigkristall-Moleküle sich mit höherer Geschwindigkeit
orientieren und dadurch das photoelektrische Ausgangs signal schnell erreicht wird.
Die Anstiegsgeschwindigkeit nimmt ab mit Zunahme der Antigenkonzentration in der
Probe. Daher ist es durch Nachweis der Zeitspanne, innerhalb der das photoelektrische
Ausgangssignal auf einen vorgegebenen Wert steigt, möglich, die Gesamtmenge an Antigen
in der Probe zu bestimmen.
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Fig. 8 ist eine schematische Ansicht einer anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens, Bei dieser Aus führungs form sind entsprechende
Teile wie in den Fig. 2 bis 5 mit den gleichen Bezugsziffern wie in diesen Figuren
bezeichnet. Bei dieser Ausführungsform bestehen die Flüssigkristalle aus einem solchen
Material, daß eine Polarisationsebene, d.h.
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Polarisationsrichtung des einfallen linear polarisierten Lichtes gedreht
wird, und auf beiden Seiten des Reaktionsgefäßes 13 sind eine erste und eine zweite
Polarisationsplatte 30 und 31 angeordnet, die ein paralleles Nicol'sches Prisma
bilden.
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Das von der Lichtquelle 18 ausgesandte Licht wird durch die erste
Poralisierungsplatte 30 linear polarisiert und trifft dann auf das Reaktionsgefäß
13 auf dessen Seitenwand 13a auf, an der die transparente Elektrode 14a angelegt
ist. Die Orientierung der Flüssigkristall-Moleküle 10, an die Antikörper 11 fixiert
ist, wird verändert in Ubereinstimmung mit der Menge Antigen 20 in der Probe 12,
das an Antikörper 11 durch die immunologische Reaktion gebunden ist. Die Rotation
bzw. Drehung der Polarisationsebene des einfallenden linear polarisierten Lichtstrahls
wird beeinflußt von der Enderung der Orientierung der Flüssigkristalle. Daher verändert
sich der Drehwinkel der Polarisationsebene von linear polarisiertem Licht, das durch
das Reaktionsgefäß 13 hindurchgeht. Dieses hindurchgehende Licht trifft auf die
zweite Polarisierungsplatte 31 auf, die als Analysator dient. Die durch die zweite
Polarisierungsplatte 31 hindurchgehende Lichtmenge wird von einem Lichtdetektor
19 nachgewiesen.
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Dadurch ist es möglich, die Gesamtmenge Antigen 20 in der Probe 12
zu bestimmen.
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Die Fig. 9 und 10 zeigen schematische Ansichten einer anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens.
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Bei dieser Ausführungsform werden cholesterische Flüssigkristalle
verwendet, bei denen die Farbe des durchgehenden Lichtes sich entsprechend der Orientierung
der Flüssigkristall-Moleküle verändert. Die Fig. 9 zeigt einen Fall, in dem eine
kleinere
Menge zu bestimmendes Antigen in einer Probe 12 in dem
Reaktionsgefäß 13 an Antikörper gebunden ist, die auf den Flüssigkristall-Molekülen
10 fixiert sind, und Fig. 10 zeigt einen Fall, in dem eine größere Menge Antigen
20 in der Probe 12 an die Flüssigkristall-Moleküle 10 gebunden ist. Die Orientierung
der Flüssigkristall-Moleküle 10 verändert sich mit der Menge an Antigen 20, das
an die Flüssigkristall-Moleküle 10 gebunden ist, und die Farbe, d.h. die Wellenlänge
des durch die Flüssigkristalle hindurchgehenden Lichtes verändert sich entsprechend
der Änderung der Orientierung. Bei dieser Ausführungsform trifft das aus einer Lichtquelle
18 austretende Licht auf das Reaktionsgefäß 13 über eine Polarisierungsplatte 30
und ein elektrisches Feld wird über die transparenten Elektroden 14a und 14b auf
den Seitenwänden 13a und 13b durch Schließen des Schalters 15 angelegt, der in Reihe
mit einer Gleichstromquelle 16 verbunden ist. Dann ändert sich die Farbe des Lichts
L, das durch das Reaktionsgefäß 13 hindurchgeht, entsprechend der Menge Antigen
20 in der Probe 12. Daher ist es durch Nachweis der Farbe des hindurchgegangenen
Lichtes L, die durch einen entsprechenden Farbdetektor gemessen wird, möglich, das
Antigen 20 in der Probe 12 quantitativ zu bestimmen.
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Wie oben erläutert, werden erfindungsgemäß Flüssigkristalle anstelle
des unlöslichen Trägers verwendet und Antikörper oder Antigen, der bzw. das spezifisch
mit Antigen oder Antikörper in einer Probe reagiert, wird auf den Flüssigkristall-Molekülen
fixiert. Dadurch ist es möglich, die Konzentration an Antigen oder Antikörper direkt
in der Probe zu messen, ohne daß die B-F-Trennung durchgeführt werden muß und ohne
daß eine Reaktion mit Markierungsreagens und Farbreagens erforderlich ist. Daher
wird das Bestimmungsverfahren sehr einfach und die Bestimmungszeit kann wesentlich
verkürzt werden.
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Fig. 5 zeigt einen Zustand, in dem Antigen aus der Probe nicht an
die Flüssigkristall-Moleküle gebunden ist und kein elektrisches Feld angelegt ist.
In diesem Falle sind die Flüssigkristall-Moleküle 10 in der Probe 12 suspendiert
und willkürlich in unterschiedlichen Richtungen orientiert. Daher wirkt die Kombination
aus Flüssigkristall-Molekülen 10, Probe 12, Reaktionsgefäß 13 und transparenten
Elektroden 14a und 14b nicht als Analysator. Von der Lichtquelle 18 ausgesandtes
Licht wird durch die Polarisierungsplatte 17 in linear polarisiertes Licht umgewandelt
und trifft dann auf das Reaktionsgefäß 13 auf. Wie oben gesagt sind die Flüssigkristall-Moleküle
10 nicht in einer Richtung orientiert, sondern in unterschiedlichen Richtungen.
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Daher wird nahezu das gesamte auftreffende Licht von den Flüssigkristall-Molekülen
10 nicht unterbrochen, sondern geht durch das Reaktionsgefäß 13 durch. Das aus dem
Reaktionsgefäß 13 austretende Licht wird von dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommen.