DE2736805C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern - Google Patents

Description

A) CroaticaChemicaActa,42(1970),457-466;und

B) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, Nr. 4 (1971), 558-560.

Da die Methode gemäß dem obigen Vorschlag die Messung der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich, einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten Latex mit extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im Bereich von 0,007 bis 0,028% liegt zu verwenden, die Reaktion des Latex und des Antigens und des Antikörpers in einem stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreinigungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu entfernen und ähnliche Maßnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis davon ist die obenerwähnte Methode nachteilig dadurch, daß die Geschwindigkeit der Antigen^Antikörper-Reaktion unvermeidbar veriiiiliden wird, daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit für die Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern ungenügend sind und daß die Abtrennung von Verunreinigungen häufig extrem

komplizierte Maßnahmen erforderlich macht. Demzufolge ist es schwierig, die obige Methode zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg)₁ Humanchoriongonadotropin (hCG) oder ähnliche Materialien zu verwenden, bei denen komplizierte Maßnahmen zur Herstellung des notwendigen Reagens erforderlich sind und bei denen es schwierig ist, eine reproduzierbare Agglutinationsreaktion der Substanz zu erreichen, die in Blut oder Urin enthalten ist, das bzw. der verschiedene andere Substanzen enthält, die die Reaktion beeinträchtigen können.
Aus

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C) Immunochemistry, VnI. 12 (1975), 349 bis 351, ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene quantitativ dadurch zu bestimmen, daß man die obenerwähnten agglutinierten Latexteilchen mit einem Laserstrahl bestrahlt und die Änderung der Breite der Spektrallinien des gebeugten Lichts des Laserstrahls mißt, um die mittlere Diffusionskonstaute (D) zu bestimmen, die einen Hinweis auf die Brownsche Bewegung der agglutinierten Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der Größe der agglutinierten Teilchen.

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Da bei dieser Methode der den Antikörper oder das Antigen tragende Latex in extrem geringer Konzentration verwendet wird, beispielsweise in einer Konzentration von lediglich 0,001 %, wird die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion vermindert, so daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. Weiterhin besitzt diese Methode den Nachteil, daß komplizierte Berechnungen unter Anwendung von Spektrumanalysenmethoden erforderlich sind, was komplizierte Maßnahmen notwendig macht, und daß irgendwelche in der Probe vorhandenen Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. Demzufolge hat sich auch diese Methode in der Praxis nicht durchsetzen können.

Die obige ' .iteraturstelle C beschreibt ferner, daß die Bestimmung mit Hilfe der in der Literaturstelle A angegebenen Trübungsmeßmethode extrem ungenaue Ergebnisse liefert (siehe die Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung).

Aus der DE-OS 22 04 684 ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit bekannt bei dem in einem Testgemisch, das neben anderen Stoffen die Körperflüssigkeit, einen Träger und serologisch bestimmende Materialien enthält, Agglutinationskomplexe beobachtet werden, wobei ais serologisch bestimmende Materialien Antikörper bzv. Antigene verwendet werden, welche an einem serologisch inerten Latexträger mit einer Teilchengröße von 0,05 bis 0,9 μηι gebunden sind, und die Lichtabsorptioii des Testgemisches nach dessen Aufteilung durch Lufteinschlüsse in Teilströmen automatisch gemessen wird. Dieses Verfahren vermag jedoch in seiner Präzision der Messung nicht vollständig zu befriedigen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung anzugeben, mit dem die Antikörper bzw. Antigene in der zu untersuchenden Probe mit hoher Präzision und mit guter Reproduzierbarkeit schnell bestimmt werden können und ferner schnell nachgewiesen werden kann, ob die Konzentration eines Antikörpers oder eines Antigen's in einer Probe oberhalb oder unterhalb eines bestimmten Wertes liegt. Dabei soll eine extrem geringe Menge der Probe ausreichend sein und auch extrem geringe Mengen des Antigens und/oder Antikörpers mit einer Präzision gemessen werden können, die der bei dem Radioimmuntest erreichten entspricht, jedoch wesentlich schneller und sicherer. Das Verfahren soll ferner nicht nur zur Bestimmung von multivalenten oder polyfunktioriellen Antigenen, sondern auch von unvollständigen Antigenen, beispielsweise Haptenen, geeignet sein und nicht nur die Agglutination der Antikörper und/oder Antigene ausnützen, sondern auch sie inhibierende Wirkungen.

Gelöst wird diese Aufgabe ausgehend von einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch, daß man die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt

Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß das Ausmaß der Antigen-Antikörper-Reaktion in Gegenwart der sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen sehr genau proportional ist der Intensität des d-tch die Mischung geführten Lichtes. Es ist ersichtlich, dab dis Ausmaß der Antigen-Antikörper-Reaktion auch proportional ist der Menge (oder der Konzentration) des Antikörpers und/oder des Antigens in der Probe, vorausgesetzt, daß die Rea.-.tion unter spezifischen Bedingungen durchgeführt wird.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Das obige erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine schnelle Bestimmung eines Antikörpers und/oder eines Antigens in einer Probe mit extrem großer Präzision unter Anwendung einer Technik, die sich von den herkömmlichen Methoden erheblich unterscheidet, bei denen die Trübung oder die mittlere Diffusionskonstante bestimmt werden.

Das Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, das erfindungsgemäß angewanot wini, liegt im Bereich des nahen Infrarots oder in einem Teil des sichtbaren Bereiches, der sich an das nahe Infrarot anschließt Vorzugsweise verwendet man erfindungsgemäß ein Licht, dessen Wellenlänge im nahen Infrarot liegt und 0,8 bis 1,8 μκη und vorzugsweise 1 bis 1,4 μπι beträgt. Zur Untersuchung von Molekülstrukturen oder Eigenschaften der Moleküle ist es bereits bekannt, Spektralanalysen durchzuführen, bei denen man Licht mit einer im infraroten Bereich liegenden Wellenlänge von mindestens 2,5 μπι oder Licht mit einer im ultravioletten Bereich liegenden Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 μίτι verwendet. Das Licht des nahen Infrarots oder des sich daran anschließenden sichtbaren Bereichs, das erfindungsgemäß angewandt wird, und das der \ iruinfachung halber im folgenden als »Licht des nahen Infrarotbereiches« bezeichnet wird, ist bis'ang nur begrenzt angewandt worden und hat nu/ geringes Interesse ge^funden.

Es wurde nunmehr gefunden, daß das Licht des nahen infrarotbereiches, sehr gut durch wäßrige Medien, die im allgemeinen die Grundmedien von Antigene oder Antikörper enthaltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösungen etc., sowie die Grundmedien der oben erwähnten Latices, hindurchdringt, wobei insbesondere das Licht des nahen Infrarotbereiches mit einer Wellenlänge von 0,8 bis 1,4 μπι und von 1,53 bis 1,88 μΐη von den wäßrigen Medien nur in geringem Ausmaß absorbiert wird. Es hat sich ferner gezeigt, daß, wenn man die durch Umsetzen der mit dem Antikörper

■ oder dem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen, die einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι, vorzugsweise von 0,1 bis 1 um, aufweisen, mit dem Antigen und/oder dem Antikörper in der Probe unter Bildung der Agglutination erhaltene Reaktionsmischung mit Licht aus dem oben erwähnten nahen Infrarotbereich mit einer Wellenlänge, die um einen Faktor von mindestens 1,5 und vorzugsweise von mindestens 2 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt, die Intensität des durch die Reaktionsmischung hindurchgeführten Lichtes sehr genau dem bei der Antigen-Antikörper-Reaktion erreichten Agglutinationsgrad entspricht. Die Durchlässigkeit für das oben erwähnte und erfindungsgemäß verwendete Licht entspricht der Extinktion A, die man mit Hilfe von Spektrophotometern bestimmen kann, beispielsweise jenen Vorrichtungen, wie sie im allEemeinen für die Infrarotspektrometrie verwendet werden, so daß diese Durchlässigkeit im folgenden der Einfachheit halber als Extinktion bezeichnet wird.

Die mit Hilfe des Infrarotspektrometers bestimmte Extinktion A entspricht der folgenden Formel:

log

in der

/o für die Intensität des durch die lediglich das Lösungsmittel enthaltende Absorptionszelle hindurchgeführten Lichtes und

/ für die Intensität des durch die eine Lösung einer bestimmten Konzentration enthaltende Zelle hindurchgeführten Lichtes stehen.

Demzufolge wird die oben angesprochene Durchlässigkeit im folgenden der Einfachheit halber als »Extinktion (A)« bezeichnet.

Erfindungsgemäß kann die Bestimmung der Extinktion A mit Hilfe eines Spektrophotometers erfolgen, das ähnlich den Spektrophotometern ist, die man für den nahen Infrarotbereich verwendet, wobei man erfindungsgemäß Licht des oben angesprochenen nahen Infrarotbereiches verwendet und die obige Formel benutzt

Wenn das Grundmedium der Probe ein transparentes flüssiges Medium ist, kann man die Bestimmung des Wertes von /o bequem in der Weise durchführen, daß man die Suspension, die die mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen enthält, verwende*, welche Suspension man beispielsweise mit Wasser auf die gleiche Konzentration wie die Mischung verdünnt hat

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert Dabei ist auf die Zeichnungen Bezug genommen. In den Zeichnungen zeigt

F i g. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, das in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von I mm aufgenommen wurde,

Fig.2 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion mit dem Durchmesser der Teilchen eines Polystyrollatex,

Fig.3 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Reaktionszeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion,

Fig.4 ein schematisches Diagramm, das den Grundaufbau einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung wiedergibt,

Fig.5 eine perspektivische Ansicht einer Absorptionszelle, die sowohl für die Proben als auch für die Kontrollproben oder Blindproben geeignet ist,

Fig.6 eine schematische Darstellung einer Rühreinrichtung, die verwendet werden kann,

Fig.7 eine Fibrinogen(Fg)-Eichkurve bei einer Wellenlänge von 1,2 μπι, die unter Verwendung von Standard-Fibrinogen-Lösungen und Antifibrinogen-Polystyrollatexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,481 μπι ermittelt würde,

F i g. 8 eine Extinktionseichkurve, die bei einer Wellenlänge von 1,2 μπι unter Verwendung von Antifibrinogen-Siliciumdioxidteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 032 μπι und einer Reihe von Standard-Fibrinogenlösungen ermittelt wurde,

F i g. 9 eine Eichkurve für die Zeit die erforderlich ist daß die Extinktion bei einer Wellenlänge von 1,2 um den Wert 03 erreicht wenn man ein mit Antifibrinogen sensibilisiertes Latexreagens mit jeder der Siandard-Fibrinogenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen umsetzt,

Fig. tO eine Extinktionseichkurve, die bei einer Wellenlänge von t,2 μιη aufgenommen wurde, indem man Oxytocin-AntiseVum mit jeder der unterschiedliche Konzentration aufweisenden Standard-Oxytocinlösungen umgesetzt hat und dann die Reaktionsmischung mit Latexteilchen versetzt hat, die mit Oxytocin sensibilisiert worden sind,

Fig. 11 eine bei 1,0μπι bestimmte Extinktions-Eichkurve, die dadurch erhalten wurde, daß man Anti-humanchoriongonadotropin-Serum mit Standardlösungen von Humanchoriongonadotropin(hCG) mit unterschiedlichen Konzentrationen umgesetzt hat und die erhaltene Reaktionsmischung mit Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexteilchen versetzt hat und

Fig. 12 anhand einer Kurve die Änderung der Nachweisempfindlichkeit mit der Konzentration des mit Antifibrinogen sensibilisierten Polystyrollatex.

In der F i g. 1 ist durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in einem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 μπι dargestellt Aus der F i g. 1 ist zu ersehen, daß Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 1,4 μιη Wasser, das das für Latices und Proben weitestgehend verwendete Grundmedium darstellt praktisch ohne merkliche Absorption durchdringt und daß Licht mit ein:r Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 μιη Wasser ebenfalls im wesentlichen durchdringt so daß man Licht mit einer Wellenlänge in diesem Bereich bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren verwenden kann. Es ist ferner aus der Fig. 1 ersichtlich, daß Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 2,1 bis 235 μπι für Wasser eine Transmission im Bereich von 20% zeigt so daß man Licht einer solchen Wellenlänge auch in Kombination mit einem hochempfindlichen Photometer anwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist

Die Fig.2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion eines Polystyrollatex (mit einem Feststoffgehalt von 1 Gew.-%), die auf der Ordinate aufgetragen ist und der Weilenlänge des Lichts, die in μτη auf der Abszisse aufgetragen ist wenn man die Bestimmung in einer Absorpuonszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt In der F i g. 2 gibt die Kurve A die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex wieder, dessen Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von

—^;

0,481 μιη aufweisen, während die Kurve B für einen Polystyrollatex steht, dessen durchschnittlicher Teil· chendurchmesser 0,804 μηι beträgt Zur Bestimmung der Extinktion v/ird der Latex vorzugsweise verdünnt, wonach der durch Multiplizieren des beobachteten Extinktionswertes mit dem Verdünnungsfaktor ermittelte Wert als Extinktion des Latex bezeichnet wird.

Aus uer F i g. 2 ist zu ersehen, daß die Extinktion des Latex bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 μΐη stark zunimmt, so daß es schwierig ist, die Änderungen der Lichttransmission einer Antigeh-Antikörper^Reaktionsmischung unter Anwendung von Licht einer solchen Wellenlänge zu bestimmen. Wenn man jedoch Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 μίτι und insbesondere von mindestens 1 μπι verwendet, so ist die Extinktion des Latex als solchen relativ gering, so daß Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 μπι und vorzugsweise mindestens 1 μπι für die oben erwähnte Messung der Lichttransmission geeignet ist.

Vergleicht man in Fig.2 die Kurve A mit der dort dargestellten Kurve B, so ist festzustellen, daß die Extinktion des Latex mit zunehmendem durchschnittlichen Durchmesser der Polystyrollatexteilchen zunimmt. Demzufolge ist ersichtlich, daß Latexteilchen mit einem extrem großen durchschnittlichen Durchmesser erfindungsgemäß nicht geeignet sind. Bei Untersuchungen hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäß geeigneten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen oder mittleren Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι aufweisen müssen und daß Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0.1 bis 1 μπι bevorzugter und mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,8 μπι am bevorzugtesten sind.

Die F i g. 3 gibt die Beziehung der Änderung der Extinktion einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung, die auf der Ordinate aufgetragen ist, mit der Wellenlänge des Lichtes, die in μηι auf der Abszisse aufgetragen ist, bei verschiedenen Reaktionszeiten wieder, wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion genau in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt wird, mit dem Unterschied, daß man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 μιτι einsetzt. Die in der F i g. 3 dargestellten Kurven C. D und E stehen für die Extinktion der Reaktionsmischung nachdem die Antigen-Antikörper-Reaktion während 3, 10 bzw. 20 Minuten durchgeführt worden ist

Die Fig.3 läßt erkennen, daß wenn man die Extinktion der Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung mit Licht einer Wellenlänge von weniger als 0,6 μπι im Wellenlängenbereich von etwa 0,6 bis 0,4 μπι bestimmt, das Ausmaß der Reaktion (das heißt die Reaktionszeit) der Extinktion nicht entspricht und daß bei Anwendung einer Wellenlänge im Bereich von nicht mehr als etwa 0,4 μπι die Extinktion sich in Abhängigkeit von dem Reaktionsfortschritt nicht merklich ändert Andererseits zeigt bei Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von mindestens etwa 0,75 μΐη die Extinktion der Reaktionsmischung eine sehr gute Korrelation zwischen der Reaktionszeit oder dem Reaktionsablauf oder Reaktionsgrad. Die in den Kurven C, D und i?der F i g. 3 gestrichelt angegebenen Bereiche deuten darauf hin, daß die Extinktion in diesen Wellenlängenbereichen selbst bei erhöhter Schlitzbreite nicht genau bestimmt werden kann, da die Absorption von Wasser in diesen Bereichen sehr hoch ist

Wie aus dem weiter unten angegebenen Beispiel 4 zu ersehen ist, erzielt man bei Verwendung eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilche.ndurchmesser von 0,804 μΐη eine gute Korrelation zwischen der Extinktion der Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung und der Konzentration des Antigens, wenn man Licht ffiit einer Wellenlänge verwendet, die Um einen Faktor von mindestens etwa 1,5 größer ist, als der durchschnittliche Durchmesser der Teilchen, beispielsweise wenn man Licht mit einer Wellenlänge von etwa 1,2 μπι verwendet, vorausgesetzt, daß die Konzen*

tration des Antigens in der Probe nicht größer ist als 0,6 μg/mi. In diesem Fall kann daher die erfindüngsgemäße quantitative Bestimmung durch Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 μπι oder mehr durchgeführt werden.

Wenn man Latexteilchen mit einem relativ geringen durchschnittlichen Durchmesser verwendet, ist es vorteilhaft, wie es aus der F i g. 3 zu ersehen ist, Licht des nahen Infrarotbereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von ei wo 0,8 bis 5,4 μΰϊ und vorzugsweise 1 bis 1,4 μπι und mehr, welche Wellenlänge mindestens um den Faktor 2 größer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu verwenden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist es erwünscht, eine Reaktionsmischung aus einem Trägermaterial spezifischer Teilchengröße, auf dem ein bestimmter Antikörper oder ein bestimmtes Antigen vorliegt und einem bestimmten Antigen oder Antikörper oder einer Mischung davon in einer zu untersuchenden Flüssigkeit mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι zu bestrahlen,, um zunächst einen Wellenlängenbereich zu ermitteln, in dem eine quantitative Beziehung zwischen der Änderung der Konzentration des besonderen Antigens, des Antikörpers oder der Mischung davon (einschließlich des Reaktionsprodukts) in der zu untersuchenden Flüssigkeit und der Extinktion der Reaktionsmischung besteht, und anschließend Licht mit einer innerhalb dieses Wellenlängenbereiches liegenden spezifischen Wellenlänge zur Bestimmung der Extinktion zu verwenden.

Somit ist es erfindungsgemäß möglich, die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe zu bestimmen, indem man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι, der vorteilhafterweise im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι, noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι und am bevorzugtesten im Bereich von 03 bis 0,6 μπι liegt, verwendet, einen Antikörper oder ein Antigen auf dem Trägermaterial fixiert (das heißt das Trägermaterial mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisiert), das sensibilisierte Trägermaterial mit dem in der Probe vorliegenden Antigen und/oder Antikörper umsetzt und die Extinktion der Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιτι, vorzugsweise im Bereich von 0,6 bis 1,8 μηι, noch bevorzugter im Bereich von 0,8 bis 1,4 μπι und am bevorzugtesten im Bereich von 1 bis 1,4 μπι mißt Wie bereits erwähnt sollte das verwendete Licht eine Wellenlänge besitzen, die mindestens um den Faktor 1,5, vorzugsweise mindestens um den Faktor 2 und noch bevorzugter mindestens um den Faktor 2,5 größer ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen.

Λ]« unlösliche Trägerteilchen werden bevorzugt Mikroteilchen aus organischen Polymeren verwendet, die im wesentlichen in dem für die Bestimmung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind und die

einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, beispielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copolymere, die man durch Emulsionspolymerisation erhält. Es können aber auch dispergierte Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodigiosin, Rickettsia, Zellmembranfragmente etc., sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpulverisierte Mine^alien, Metalle und dergleichen verwendet werden.

Zur Sensibilisierung der Trägerteilchen kann der Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Träger adsorbiert werden. Bei den Antikörpern handelt es sich um Proteine, während die Antigene einer Gruppe von verschiedenartigen Substanzen angehören, beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, um diese Antikörper oder Antigene, insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen, zu fixieren. Um ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlöslichen Trägermaterialien zu fixieren, ist es vorteilhaft, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittels, und anschließend das Antigen chemisch an das modifizierte Trägermaterial zu binden.

Die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteilchen, die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert sind (und die im folgenden als »sensibilisierte Trägerteilchen« bezeichnet werden), werden in Form einer Suspension verwendet, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 Gew.-% und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,6 Gew.-% aufweist. Wenn die Konzentration der sensibilisierten Trägerteilchen zu hoch ist, wie es aus der Fig.2 zu ersehen ist, wird die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, daß die Messung der Extinktion erschwert wird. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hierdurch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der Antigene und der Antikörper zu steigern.

Die Reaktion kann mit Vorteil unter Bewegung der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Da die Reaktion im allgemeinen in einer dünnen Zelle durchgeführt wird, erreicht man das Bewegen der so Reaktionsmischung bequemerweise zum Beispiel dadurch, daß man einen Stab vertikal oder transversal durch die Zelle bewegt Natürlich kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe außerhalb der Zelle während einer bestimmten Zeitdauer unter genau bestimmten Bedingungen umsetzen und dann die Reaktionsmischung zur Messung der Extinktion in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedingungen jedoch bei sämtlichen Messungen reproduzierbar zu halten, insbesondere hinsichtlich der Reaktionszeit, kann man M die sensibilisierten Trägerteilchen unter speziellen Bedingungen direkt in einer Zelle umsetzen, die in ein Spektrophotometer eingebracht ist, wodurch eine genauere Bestimmung möglich wird, indem man die Extinktion unmittelbar nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit bestimmt oder indem man die Zeit bestimmt, die notwendig ist, bis die Extinktion einen vorherbeitimmten Wert erreicht, wenn man die Reaktion unter £enau bestimmten Bedingungen durchführt.

Zur Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe, die eine unbekannte Menge des Antigens und/oder Antikörpers enthält, bereitet man bevorzugt eine Reihe von verdünnten Eichproben unter Verwendung einer Standardprobe, die eine definierte Menge des entsprechenden Antigens und/oder Antikörpers enthält, in dem man sie unter Anwendung verschiedener Faktoren verdünnt Dann kann man jede der verdünnten und unverdünnten Eichproben oder Standardproben unter vorbestimmten Bedingungen mit unlöslichen Trägerteilchen umsetzen, die mit einer definierten Menge eines entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert sind, worauf man die Extinktion einer jeden Reaktionsmischung bestimmt und eine Eichkurve für die besondere Kombination aus dem Antigen und/oder Antikörper mit den sensibtlisierten Trägerteilchen ermittelt die die Beziehung zwischen der Menge (Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers und der Extinktion wiedergibt (wobei diese Art von Eichkurve im folgenden der Einfachheit halber als »Eichkurve A« bezeichnet wird). Anschließend wird eine zu bestimmende unbekannte Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen, die zur Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden, unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen wie den bei der Ermittlung der Eichkurve angewandten umgesetzt worauf man die Extinktion der Reaktionsmischung mißt Die Menge (oder Konzentration) des betreffenden Antigens und/oder Antikörpers in der unbekannten Probe kann dann dadurch ermittelt werden, daß man den in dieser Weise gemessenen Extinktionswert mit der Eichkurve A vergleicht. Alternativ kann man bei der oben beschriebenen Ermittlung der Eichkurve eine Eichkurve erstellen, die die Beziehung zwischen der Menge (oder Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der verwendeten Eichprobe und der Reaktionszeit wiedergibt die erforderlich ist bis ein vorbestimmter Extinktionswert erreicht ist (wobei diese Art von Eichkurve im folgenden der Bequemlichkeit halber als »Eichkurve B« bezeichnet wird). Auch in diesem Fall kann man durch Umsetzen einer unbekannten Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie für die Herstellung der Eichkurve A angewandt wurden, die Menge (oder Konzentration) des Antigens und/oder Antikörpers in der unbekannten Probe bestimmen, indem man die Zeit mißt die bis zum Erreichen des vorbestimmten Extinktionswertes abläuft

Somit kann man die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe dadurch bestimmen, daß man entweder

A) die Extinktion der unbekannten Probe mißt (wobei man zu Eichzwecken die Eichkurve A verwendet) oder

B) die Reaktionsgeschwindigkeit oder die bis zum Erreichen eines vorgeschriebenen Extinktionswertes erforderliche Reaktionszeit bestimmt (wobei man zum Eichen die Eichkurve B verwendet).

Wie bereits beschrieben, ist die obige Methode A als Bestimmungssystem mit sehr großer Präzision nicht nur dann geeignet wenn die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe

relativ hoch ist, sondern selbst dann, wenn sie so gering ist, daß sie bislang nur mit Hilfe eines Radioimmuntests (RIA) bestimmt werden konnte. Andererseits ist die obige Methode B, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit gemessen wird, dazu geeignet, eine relativ große M finge (oder Konzentration) eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe zu bestimmen und ist dadurch besonders vorteilhaft, daß die Messung ziemlich einfach ist. Wie sich gezeigt hat, besitzt die oben angesprochene Eichkurve A eine schwache S-Form statt einer geraden Linie, was jedoch auf die Präzision der Bestimmung keinen nachteiligen Einfluß hat. Der Grund dafür, daß die Eichkurve eine S-Form hat, wie es oben beschrieben wurde, scheint offenbar der zu sein, daß die Reaktionsgeschwindigkeit die Form der Kurve bei niedrigeren Konzentrationen des Antigens und/oder des Antikörpers beeinflußt, während bei höheren Konzentrationen eine Sättigung der aktiven Stellen des Trägermaterials eintritt Es ist natürlich möglich, den !mearen Abschnitt der S-förmigen Kurve zu vergrößern, indem man die Bedingungen der Ermittlung der Eichkurve besonders auswählt, und bei der Bestimmung unbekannter Proben im wesentlichen innerhalb dieses Bereiches arbeitet

Da man wie bereits ausgeführt wurde, die sensibilisierten Trägerteilchen in einer möglichst hohen Konzentration mit der Probe in Kontakt bringt und mit "ihr umsetzt sollte die zur Bestimmung der Extinktion der Reaktionsmischung verwendete Zelle eine Dicke besitzen, die geringer ist als die einer Zelle, wie sie für die Analyse eines Spektrums im sichtbaren Bereich angewandt wird, so daß Zellen mit einer Dicke im Bereich von 0,5 bis 4 mm und insbesondere von 1 bis 2,5 mm bevorzugt sind. Wenn man Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers mit möglichst großer Genauigkeit bestimmen will, was bislang durch den Radioimmuntest (RIA) erreicht wurde, ist es besonders vorteilhaft:

a) ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonstanten einzusetzen,

b) Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,3 bis 0,6 μιτι zu verwenden, deren Teilchengrößenverteilung möglichst eng ist

c) die Extinktion mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 bis 1,4 μπι zu bestimmen,

d) eine relativ lange Reaktionszeit anzuwenden, die beispielsweise im Bereich von 1 bis 3 Stunden liegt und

e) die Konzentration des sensibilisierten Latexträgermaterials zu erhöhen, vorausgesetzt daß die Extinktion sich messen läßt

Wenn man auf der anderen Seite durch Messen der Reaktionsgeschwindigkeit (unter Verwendung der Eichkurve B) eine unbekannte Probe in relativ kurzer Zeit bestimmen will, ist es von Vorteil:

f) Latexteilchen mit einem relativ großen durchschnittlichen Durchmesser zu verwenden,

g) die Konzentration der Trägerteilchen in dem Latex zu erhöhen, vorausgesetzt daß die Messung der Extinktion möglich ist und

h) die Reaktionszeit möglichst kurz zu halten und beispielsweise eine Reaktionszeit im Bereich von 5 Sekunden bis 10 Minuten und vorzugsweise im Bereich von 10 Sekunden bis 3 Minuten anzuwenden.

Wenn man in diesem Fall die Zeit, die zum Erreichen eines vorbestimmten Extinktionswertes erforderlich ist, auf der Ordinate und die Konzentration auf der Abszisse aufträgt, und zwar jeweils in logarithmischem Maßstab, erhält man die Eichkurve B in Form einer vorteilhaften geraden Linie.

Die Erfindung wurde im vorstehenden erläutert anhand der Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe, die darauf beruht, daß man

ίο das in der Probe enthaltene Antigen und/oder den in der Probe enthaltenen Antikörper mit sensibilisierten Trägerteilchen agglutiniert (das heißt ein LA-System anwendet). Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch für eine Bestimmung geeignet, bei der die

inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination angeordnet wird (LI-System).

Zum Beispiel kann man unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, dadurch bestimmen, daß man das LI-System anwendet. In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den unlöslichen Trägerteilchen fixieren, die in dieser Weise sensibilisierten Trägerteilchen nach einer kompetitiven Reaktion mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise einer Standard-Antigenlösung) umgesetzt worden ist reagieren lassen, und dann die Extinktion der erhaltenen Reaktionsmischung bestimmen. Diese Maßnahmen werden bei verschiedenen Konzentrationen der Standard-Antigenlösung wiederholt, wodurch man schließlich die Eichkurve C erhält. Anschließend setzt man eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper einer bestimmten Konzentration um, wonach man die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial zur Reaktion bringt.

Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie zur Ermittlung der Eichkurve C angewandt werden. Die Extinktion der letztendlich mit den sensibilisierten Trägerteilchen erhaltenen Reaktionsmischung wird dann bestimmt und mit aer Eichkurve C verglichen, wodurch man die Menge (oder Konzentration) des Antikörpers in der unbekannten Probe bestimmen kann. Nach der Verfahrensweise gemäß dem oben erwähnten LI-System kann man auch einen Antikörpei ·η einer unbekannten Probe bestimmen, indem man einen bestimmten Antikörper auf den unlöslichen Trägerteilchen fixiert Weiterhin ist es gewünschtenfalls möglich, gleichzeitig ein Antigen und einen Antikörper unterschiedlicher Art auf den unlöslichen Trägerteilchen zu fixieren und dann ein Antigen und einen Antikörper in einer unbekannten Probe zu bestimmen.

Somit gelingt es erfindungsgemäß, quantitativ eine große Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern zu bestimmen, beispielsweise

1. bei der Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspendern, was für Notmaßnahmen unerläßlich ist; beispielsweise kann man die Blutgmppensubstanzen, das Au- oder HB-Antigen oder andere Verunreinigungen im Blut oder Fibrin/Fibrinogen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster Zeit als nützlich erwiesen hat bei der Überwachung der Genesung von Patienten mit Nierentransplantation oder mit Nierenversagen;

2. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin (hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwangerschaftsdiagnose oder bei der Überwachung der Genesung von Chorionepitheliomen;

3. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder von östriolglucuronid, das ein S:offwechselprodukt des Follikelhormons darstellt, im Urin, weiche Bestimmung für die Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung ist;

4. zur Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Substanz man annimmt, daß sie Uteruskontraktionen verursacht;

5. zur Bestimmung bestimmter Nebennierenrindenhormone, wie Corticoiden und Aldosteron oder adrenocorticotropen Hormonen (ACTH);

6. zur Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder zur Bestimmung des Follikel-anregenden Hormons, des luteinisierenden Hormons, von östrogenen, des Gelbkörperhormons (corpus Iuteum hormon) etc.;

7. zur Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt; und

8. zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antikörpers in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Allergien, Syphilis, hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrankheiten, wie Kollacenose, und anderen Infektionskrankheiten und dergleichen leiden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich auch zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmu-ig dieser Antigene und/oder Antikörper angewandt werden.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in einer Vorrichtung erfolgen, die eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 4 mm zur Aufnahme der durch Umsetzen des auf dem unlöslichen Träger fixierten Antikörpers oder Antigens mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium erhältlichen Reaktionsmischung und ein Photometer mit einer Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer im Bereich von 0,6 bis 2,4 μηι liegenden Wellenlänge aufweist.

Diese Meßvorrichtung kann neben den obigen Vorrichtungsmerkmalen ähnliche Merkmale aufweisen wie herkömmliche Photometervorrichtungen.

Wie aus der Fig.4 zu erkennen ist, umfaßt der Grundaufbau der Vorrichtung eine Bestrahlungseinrichtung mit einer Lichtquelle 1 und einem Filter oder Prisma 2; eine Probenzelle 3 zur Aufnahme der Probe zur Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion und eine Vergleichszelle 4 zur Aufnahme einer zur Kompensation dienenden Blindprobe; Photozellen 5 und 6 zur Messung des durch die entsprechenden Zellen hindurchgetretenen Lichtes unter Bildung von elektrischen Signalen; einen Verstärker 7 zur Verstärkung der elektrischen Signale und eine Anzeige oder Aufzeichnungseinrichtung 8 zur Anzeige oder zur Aufzeichnung der verstärkten elektrischen Signale.

Bei der Lichtquelle 1 kann es sich um eine übliche Wolframlampe handeln, deren Licht mit Hilfe des Filters oder Prismas 2 monochromatisiert wird, um einen Lichtstrahl mit einer bestimmten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μηι und insbesondere von 0,8 bis 1,4 μΐη und noch bevorzugter im Bereich von 1,0 bis 1,4 μπι zu bilden, der durch die Zellen 4 und 5 geführt wird. Das Filter oder Prisma 2 kann man daher unter jenen Produkten auswählen, die dazu geeignet sind, das Licht unter Bildung einer innerhalb der oben angegebenen Wellenlängenbereiche liegenden Wellenlänge zu monochromatisieren. Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellenlänge von 1200±50ηιμπι ergibt, als Filter oder man kann Quarzprismen oder Glasprismen verwenden.

Das in dieser Weise monochromatisierte Licht wird mit Hilfe eines Spalts oder einer Linse gebündelt, bevor es durch die Probenzelle 3 und die Vergleichszelle 4 geführt wird. Die Probenzelle 3 und die Vergleichszelle 4 können aus durchsichtigem Glas oder einem durchsichtigen synthetischen Harz (beispielsweise einem Acrylharz) bestehen und können einen schachtelartigen Aufbau mit rechteckigem oder länglichem Querschnitt besitzen (wie es in der F i g. 5 gezeigt ist). Die Dicke der Zelle, das heißt der Abstand / zwischen den Wänden a und b (durch die das Licht geführt wird) bzw. zwischen der dem Licht zugewandten Wand und der ihr gegenüberliegenden Wand kann im Bereich von 0,5 bis 4 mm und vorzugsweise im Bereich von 1 bis 2,5 mm liegen. Die lichtdurchlässigen Wände besitzen vorteilhafterweise einen Transmissionsgrad von mindestens 30% und vorzugsweise von 80% oder mehr für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι.
In die Probenzelle 3 bringt man eine Reaktionsmischung ein, die man dadurch erhalten hat, daß man ein Antigen und/oder einen Antikörper oder eine Mischung davon mit einem entsprechenden Antikörper oder Antigen, das auf unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, in einem flüssigen Medium in der oben beschriebenen Weise umsetzt In die Vergleichszelle 4 bringt man eine Vergleichsprobe ein, die lediglich eine Dispersion des Antikörpers oder des Antigens, der bzw. das auf den urlöslichen Trägerteilchen fixiert ist, in dem flüssigen Medium ein. Die durch die Zellen 3 bzw. 4 geführten Lichtstrahlen werden von den Photozellen 5 bzw. 6 aufgenommen und in elektrische Signale umgewandelt, deren Stärke proportional ist der Intensität des von der entsprechenden Photozelle aufgenommenen Lichts. Man kann irgendwelche Photozellen 5 und 6 verwenden, vorausgesetzt, daß sie dazu geeignet sind, das aufgefangene Licht in ein elektrisches Signal umzuwandeln, dessen Stärke proportional der Lichtintensität ist. Beispielsweise kann man mit Vorteil Bleisulfid-Photo-Ieiterelemente verwenden. Die in dieser Weise durch die Photozellen gebildeten elektrischen Signale können mit Hilfe des Verstärkers 7 in üblicher Weise verstärkt und in einer Anzeigevorrichtung bzw. Aufzeichnungsvorrichtung 8 aufgezeichnet oder visuell angezeigt werden. Wenn man einen Zeitmechanismus in das Anzeigegerät oder Aufzeichnungsgerät 8 einbaut, ist es möglich, die Extinktion automatisch nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit zu messen oder die Zeit zu bestimmen, die erforderlich ist, daß die Extinktion einen vorherbestimmten Wert erreicht.

Vorzugsweise ist die verwendete Probenzelle 3 mit einer Bewegungseinrichtung versehen, beispielsweise einem in der Zelle bewegbaren Mischstab.

Die F i g. 6 gibt eine besonders geeignete Form des Bewegungsmechanismus zur Bewegung der Mischung 9 aus einer Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (beispielsweise einem sensibilisierten Latex) wieder, die

in der Probenzelle 3 der erfindungsgemäßen Vorrich* tung vorliegt.

Wie aus der Fig.6 zu erkennen ist, kann man zur

Bewegung der Mischung 9 in der Zelle 3 den L-förmigen Mischstab 11 auf- und abwärts bewegen, indem man die T'förmige Verbindungsstange 14 auf- und abbewegt, wobei die Verbindungsstange 14 Über ihre obere flache

Platte 14' mit einer sich drehenden Scheibe 12 im Eingriff steht, die von einer Exzenterwelle 13 angetrieben wird. Mit der Bezugsziffer 17 ist ein Lichtabschirmungsdeckel bezeichnet, durch den die Verbindungsstange 14 über ein Rohr 15 geführt ist, das an und in dem Deckel 17 befestigt ist Die Verbindunfjsstange 14 wird durch die Drehung der Exzenterscheibe 12 nach unten gedrückt und dann durch die Ausdehnungskraft der Feder 16, die zwischen dem Deckel 17 und der oberen flachen Platte 14' der Verbindungsstanp e i4 angeordnet ist, wieder nach oben bewegt

Wenn die in der in der Fig.4 dargestellten Vorrichtung dargestellte Probenzelle 3 den Aufbau besitzt, wie er beispielsweise in der F i g 6 dargestellt ist kann man die Zelle 3 ins Dunkle, das von dem Sonnenlicht abgeschirmt ist einbringen und eine Mischung aus einer zu bestimmenden Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (einem sensibilisierten Latex) in der Zelle 3 mit Hilfe des L-förmigen Mischstabes 11 durchmischen, währenddem die Zelle mit Licht einer ausgewählten Wellenlär-ge innerhalb des nahen Infrarotbereichs bestrahlt wird, so daß es möglich ist, die Mischung zu bewegen, ohne den. Lichtstrahl zu unterbrechen. Somit icann man durch die Anwendung der oben beschriebenen Vorrichtung dse Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und den sensibilisierten Trägerteilchen beschleunigen, wobei es weiterhin möglich ist die Reaktion unmittelbar nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit zu unterbrechen und die Reaktionszeit genau zu bestimmen, nach der der Extlnktionswert einen vorbestimmten Wert erreicht hat, und dergleichen mehr.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung df*r Erfindung.

35

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit

Antifibrinogen-Antikörper sensii lilisierten

Latexreagens (Antifibrinogen-Laiexreagens,

Anti-Fg-Latexreagens)

Zu 10 ml einer Lösung von Anti-Bumanfibrinogen (Fg)-Antikörper (mit einer Konzentration von 2 mg/ml)

Tabelle I

40 in einem Glycinpul'fer gibt man 1 m! eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 μπι (der «inen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist), rührt die; Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, «rwärmt auf 4O⁰C und rührt während weiterer 30 Miniuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert schließlich unter Kühlen auf 2 bis 4° C während 50 Minuten (bei 12 000 min-¹)· Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die erhaltenen Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Anitikörper sensibilisiert sind, in einer Rinderserumalbuminlösung (mit einer Konzentration von 0,2 Gew.-°/o) unter Bildung eines Antifibrinogensensibilisierten Latexreagens, das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-°/o enthält

2. Aufnahme einer Eichkurve

Man beschickt ein Kunststoffreagensglas (mit einem Innendurchmesser von 7 mm und einer Länge von 70 ml) mit einem aliquoten Anteil von 0,1 ml des gemäß Abschnitt i hergestellten Antifibrinogcn-LaicXrcagens und 03 ml einer Standard-Fibrinogenlösung (in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-°/o Rinderserumalbumin enthält), die Fibrinogen in der in der folgenden Tabelle I angegebenen Konzentration enthält und schüttelt die Mischung während 20 Minuten auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung mit 200 Schüttelvorgängen pro Minute, um die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen. Unmittelbar darauf wird die in dem Reagensglas enthaltene Reaktionsflüssigkeit in eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm überführt und es wird die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 μπι mit Hilfe eines automatischen Spektrophotographen bestimmt (wozu man als Vergleichslösung eine Suspension von 0,1 ml des Antifibrinogen-Latexreagens verwendet, das mit 0,3 ml der isotonischen Natriumchloridlösung verdünnt ist, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält). Die Messung wird mit jeder Standard-Fibrinogenlösung zweimal durchgeführt Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung Oig/ml)

0,1
0,2
OJ
0,4
0.5

Extinktion bei 1,2 μτη	2. Me
1. Messung	0,363
0,336	0,778
0,836	1,167
?.,083	1,333
1,330	1.430
1,403

Mittelwert

0,350
0,807
1,125
1,332
1.417

Wenn man die obigen Werte graphisch aufträgt und zwar die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung auf der Abszisse und die Extinktion (Mittelwert) bei \2 μπι (der Wellenlänge des angewandten Lichts) auf der Ordinate, so erhält man die in der Fig,7 dargestellte Eichkurve.

3, Quantitative Bestimmung von Fibrinogen
in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut, Urin oder der Flüssigkeit aus dem Brustkorb (aus dem Brustfellraum) und trennt Serum oder Plasma davon ab, wenn es sich bei der Probe um eine Blutprobe handelt. Dann verdünnt man einen aliquoten Anteil von 0,3 ml der Probe oder der verdünnten Probe mit 0,1 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagsns genau nach der in dem Abschnitt 2 beschriebenen Weise und bestimmt die Extinktion in der Weise, die in dem Abschnitt 2 angegeben ist Unter Verwendung der nach der in Abschnitt 2 angegebenen Methode

ermittelten Eichkurve liest man die Fibrinogen-Ronzentration entsprechend dem ermittelten Extinktionswert ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 11 angegeben.

Zu Vergleichszwecken sind in der folgenden Tabelle II auch die Werte aufgeführt, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S, M. Ratkey et al., Brit J. Haematol. 30 [1975] 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und

Tabellen

Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science), YoL 12 [1976] 507; und Fujimaki, Ikematsu, Takeuchi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathclogy) 21 [1973] 973) ermittelt hat

Patient	Unbekannte Probe	Verdünnungs	Ermittelter	Fibriiiogenkonzentration in der unbekannten	RIA-	Objektträger-
Nn	Material	faktor	Extinktions	Probe Qig/ml)	Methode	Methode
			wert	Erfindungs
				gemäße	0,359	0,5
		X 2		Methode	5,117	8,0
1	Urin	X 16	0,764	0,402	0,368	0,5
2	Urin	X 1	1,162	5,178	0,024	weniger als 0,5
3	Urin	X 1	1,233	0347	0,006	weniger als 0,5
4	Urin	X 1	0,090	0,021	0,037	weniger als 0,5
5	Urin	X 1	0,011	0,003	0,011 Λ ΛΛΟ	weniger als 0,5
6	Urin	X 1	0,175	0,042	υ,υυσ	TTVIII5WI Bid V,«f
7	Urin	Λ 1	0,066 Λ 111	0,016 f\ /W 1	0,007	weniger als 0,5
δ	urin	X 1	U,l/1	U,U*ti	0,072	weniger als 0,5
9	Urin	X 1	0,020	0,005	0,800	1,0
10	Urin	X 10	0,199	0,048	0,863	0,9
11	Serum	X 10	0,310	0,760	1,335	1,25
12	Serum	X 10	0,330	0,812	0,892	1,0
13	Serum	X 10	0,520	1,317
14	Serum		0,348	0,858
15	Fibrino-				1,520	2,0
	genfreies	X 10
	Plasma		0,550	1,400
16	Canceröse
	BrustfMl-				197,4	320
	raurnflü?-	X6^
	sigkeit	UlO	217,12

Aus den obigen Ergebnissen ist zu ersehen, daß die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten Werte der Fibrinogen-Konzentration im wesentlichen gut übereinstimmen mit den Werten, die man nach der Radioimmuntestmethode erzielt, die als die genaueste der herkömmlichen Bestimmungsmethoden gilt Der Korrelationskoeffizient zwischen der erfindungsgemäßen Methode und der Radioimmuntestmethode beträgt 0,999.

Beispiel 2

45

Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen

Weise bereitet man ein Antifibrinogen-sensibilisiertes —

Latexreagens (das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält) mit 50 Messung Nr. dem Unterschied, daß man einen anderen Polystyrol^ tex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser

von 0,234 μπι verwendet (der einen Feststoffgehalt von

10 Gew.-% aufweist).

Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von ^; 0,1 ml des in dieser Weise erhaltenen Antifibrinogensensibilisierten Latexreagens mit 03 ml einer Standard-Fibrinogenlösung (die 0,5 μg Fibrinogen pro Liter enthält) und schüttelt während 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 250 Sehüttelvorgängen pro Minute, um die Antigen^Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen. An^ "schließend bestimmt man die Extinktion der Reakfionsmischung unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 μπι in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise, Zur Bestätigung der Reproduzierbarkeit der Messung wiederholt man die Maßnahmen drei weitere Male, Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Weiterhin wiederholt man die obige Bestimmungsmethode, mit dem Unterschied, daß man anstelle der Standard-Fibrinogenlösungen Seren verwendet, die man aus von Patienten gewonnenen Blutproben isoliert hat Man wiederholt dabei die gleiche Bestimmungsmethode viermal an verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Bestimmung der Körperflüssigkeit zu bestätigen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III angegeben.

Tabelle ΙΠ Extinktion

Standard-Fibrinogenlösung

Serum

1 2 3 4	0,582 0,565 0,562 0,545	0,294 0,280 0,306 0,287
Durchschnittswert	0,564±0,010	0,292±0,010
Varianz-Koeffizient	1,8%	3,4%

Wie aus den in der obigen Tabelle III angegebenen Werten zu ersehen ist, ist das erfindungsgemäße Verfahren hervorragend reproduzierbar sowohl bei der Bestimmung r|er Standard-Fibrinogenproben als auch bei der Bestimmung von tatsächlichen Proben von Körperflüssigkeiten (Serum).

Beispiel 3 Tabelle IV

Zu 5 ml einer Glycinpufferlösung gibt man 100 mg Siliciumdioxid in Form von Mikroteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,32 μΐη (obwohl 15% dieser Teilchen einen Durchmesser von 0,5 μπι oder mehr aufweisen) und unterzieht die Mischung Ultraschallschwingungen mit einer Frequenz von 28 kHz während 1 Stunde, um eine Suspension der Siiiciumdioxid-Mikroteilchen zu erreichen. Darm bereitet man nach der in Beispiel I₁ Abschnitt 1, beschriebenen Weise ein Reagens in Form einer Suspension von mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiertem Siliciumdioxid, mit dem Unterschied, daß man anstelle des in Beispiel l, Abschnitt 1, verwendeten Polystyrollatex mit einer Teilchengröße von 0,481 μπι die in dieser Weise hergestellte Suspension der Siiiciumdioxid-Mikroteilchen verwendet und mit dem Unterschied, daß man eine Rinderserumalbumin-Lösung mit einer anderen Konzentration (0,05 Gew.-%) verwendet Dann bestimmt man unter Verwendung lies Antifibrinogen-sensibilisiertep. Siliciumdioxid-Suspensionsreagens die Extinktion von Standard-Fibt-Jiogenlösungen in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle V

Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung (jag/ml)

Extinktion bei 1,2 μη

0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

0,028
0,126
0,287
0,460
0,631

Wie in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschrieben, bildet man durch Auftragen der obigen Werte eine Eichkurve, die in der Fig.8 dargestellt ist Aus der Fig.8 ist zu ersehen, daß eine deutliche geradlinige Beziehung zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der Extinktion dann besteht, wenn die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung 0^g/ml oder mehr beträgt

Dann unterwirft man unbekannte Proben (Urin, Serum und Brustfellraumflüssigke' i, die man von Patienten gewonnen hai, der in Beispiel !, Abschnitt 3, angegebenen Bestimmungsmethode, um den Fibrinogengehalt der unbekannten Proben zu ermitteln. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.

Patient	Unbekannte Probe	Verdünnungsfaktor	Gemessene	Fibrinogen-Konzentration in	■ RIA-
Nr.	Material		Extinktion	der unbekannten Probe (pg/ml)	Methode
				Erfindungsgemä	0,359
		X 1		ßes Verfahren	5,117
1	Urin	X 10	0,125	0,400	0,368
2	Urin	X 1	0,210	5,000	0,800
3	Urin	X 1	0,110	0,380	0,892
4	Serum	X 1	0,440	0,770
5	Serum		0,490	0,830
b	Canceröse Brust				197.4
	fellraumflüssig	X 400
	keit	0.211	200

Beispiel 4

Man bestimmt die Extinktion bei vVellenlängen des angewandten Lichts von 1,2 und 1.7 μπι nach der in Beispiel 1, Abschnitte 1 und 2, beschriebenen Weise, mit dem Unterschied, daß man anstelle des Polystyrollatex mit einem durchschnittlich an Teilchendurchmesser von 0,481 μπι einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilch ?ndurchmesser von 0,804 μπι mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-°/o und eine andere Konzentration des Rinderserumalbumins (0,1 Gew.-%) anwendet Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Aus den in der obigen Tabelle VI angegeöenen Zahlenwerten ist zu ersehen, daß eine deutliche Korrelation zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der Extinktion besteht, wenn die Wellenlänge des angewandten Lichtes um einen Faktor von mehr als 2 größer ist als der durchschnittliche Durchmesser des festen teilchenförmigen Trägermaterials (Polystyrollatexteilchen).

55

Beispiel 5

Konzentration der Standard-Fibrinegenlösung (ug/ml)

Extinktion bei
L2 μπϊ

1,7 μπι

0,127	0,083
0,258	0,198
0,418	0,452
0,388	0,592
0,258	0,622

Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, angegebenen Weise bereitet man ein mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, daß man anstelle des Antihumanfibrinogen-Antikörpers Antihumunchoriongönadoiropin-Antikörper (Anti-hCG) verwendet und den Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 μΐη durch einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 μπι ersetzt.

Unter Verwendung des in dieser Weise erhaltenen, mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens bestimmt man die Extinktion nach der in

Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 μηι, mit dem Unterschied, daB man anstelle der

Tabelle VH

Standard-Fibrinogenlösung eine Standard-Humancho^ riongonadotropinlösung einsetzt Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

Konzentration der Standard-	Extinktion bei 1,2 (im
Humanchorioogonadotropinlösung
(IE/ml)
0,1	0,04S
0,2	0,130
0,3	0,168
0,4	0,261
0,5	0,360
0,7	0,630
1,0	0,972

C^aiIIdIYTGI LG

man in der oben beschriebenen Weise eine Eichkurve. Andererseits gewinnt man von verschiedenen Patienten Urinproben, die man zur Bestimmung des im Urin

Tabelle Vm

wozu man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 3, beschriebenen Weise vorgeht Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

Patient Nr. Unbekannte Probe Gemessene

Material Verdünnungsfaktor Extinktion Humanchoriongonadotropin-Konzentration in den
unbekannten Proben (IE/ml)
Erfindungsgemäßes RIA-Verfahren Methode

1	Urin	Xl	0,400	0,564	0,482
2	Urin	Xl	1,122	0,966	1,120
3	Urin	Xl	0,955	0,944	0,857
4	Urin	Xl	0,990	0,952	0,925
			Beispiel 6

Man beschickt eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerüstet ist, mit 0,1 ml des gemäß Beispiel 2 bereiteten, mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens und 03 ml einer der Standard-Fibrinogenlösungen mit der in der folgenden Tabelle IX angegebenen Fibrinogen-Konzentration und überwacht die Extinktion der Reaktionsmischung kontinuierlich bei einer

Tabelle IX

Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 μπι nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise, um die Zeit zu ermitteln, die erforderlich ist, dnß die Extinktion einen Wert von 0,5 erreicht, wobei man den Rührstab mit einer definierten Geschwindigkeit von 200 Vibrationen pro Minute vertikal auf- und abbewegt Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.

Konzentration der Standard- Zeit bis zum Erreichen eines Fibrinogenlösung (mg/ml) Extinktionswertes von 0,5 (s)

2
4
6
8
10

26,9

11,3

6,4

4,7

2,9

Die obigen Werte trägt man auf doppelt logarithmischem Papier auf, wobei man die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung auf der Abszisse und die Zeit bis zum Erreichen eines Extinktionswertes von 0,5 auf der Ordinate aufträgt, und erhält eine Eichkurve. Die Eichkurve ist wie es aus der F i g. 9 zu ersehen ist eine gerade Linie.

Dann beschickt man eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerüstet ist, mit 0,3 ml irgendeiner unbekannten Probe (Urin, Serum und Brustfellraumflüssigkeit), die man von verschiedenen Patienten gewonnen hat, und dann mit 0,1 ml des obenerwähnten AntifibrinQgen-sensibilisierien Latexreagens und mißt in der oben beschriebenen Weise unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 μπι die Zeit, die

erforderlich ist, daß die Extinktion einen Wert von 0,5 erreicht, worauf man den Wert der Fibrinogen^Konzentration, der dieser Zeit entspricht, von der in der obigen

Tabelle X

Weise ermittelten Eichkurve abliest. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X angegeben.

Patient Hr.

Unbekannte Probe Zeit bis zum Errei-

Material Verdünnungs- chen eines Exttak-

faktor tionswertes Von 0,5 (s)

Fibrinogen-Konzentration in der unbekannten Probe (yg/ml) Erfmdungs- RIA-gemäßes Methode Verfahren

1	Urin	X 1
2	Canceröse
	Brustfellraum
	flüssigkeit	X 50
3	Serum	X 1
4	Serum	X 1
5	Serum	X 1
6	Serum	X 1
	Beispiel 7

1. Herstellung eines mit Oxytocin
sensibilisierten Latexreagens

Man vermischt 1,0 ml einer Oxytocinlösung mit einer Konzentration von 2201E/ml in einer wäßrigen 0,1 η Essigsäurelösung mit 0,5 ml eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 μίτι, der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufwt.it und rührt die Mischung bei Raumtemperatur während 2 Stunden, wonach man sie während 20 Minuten unter Kühlen auf 2 bis 4°C (bei 12 000 min-') zentrifugiert Die Niederschläge trennt man durch Dekantieren ab und dispergiert die erhaltenen Oxytocin-sensibilisierten Latexteilchen in 4 ml einer Äthylendiamintetraessigsäure-Glycin-Pufferlösung, die 0,2 ¹GeW.-⁰/!) Rinderserumalbumin enthält, unter Bildung eines Oxytocin-sensibiüsierten Latexreagens, das die Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält

2. Bestimmung der optimalen Konzentration
von Oxytocin-Antiserum

Man vermischt einen aliquoten Anteil von 0,1 mi des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens mit 0,1 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung und 0,2 ml Oxytocin-Antiserum, das man mit einer isotonischen Natriumchloridlösung um den in der folgenden Tabelle XI angegebenen Faktor verdünnt hat Dann schüttelt man die Mischung auf einer sich hin- und herbewegenden Schütteleinrichtung, die bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute betrieben wird, während 12 Minuten und bestimmt dann die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 μηι in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI angegeben.

Tabelle XI

Verdünnungsfaktor des Oxytocin-Antiserums

Extinktion bei 1,2 μΐη

1,175
0,618

9,2

11 25 20 3,8 12 4,5

195
2,1
2,5
8,6
3,7

5,117

197,4 2.210 2,302 9,020 3,723

Verdiinnungsfaktor des Oxytocin-Antiserums

Extinktion bei 1,2 μίτΐ

X

X

X

30 XlOO 0,393 0,327 0,220 0,162

Aus den obigen Zahlenwerten ist ersichtlich, daß die optimale Konzentration des Oxytocm-Antiserums bei einem Verdünnungsfaktor von etwa 30 liegt.

3. Erstellung einer Eichkurve

Man beschickt eiin Kunststoffreagensglas mit 0,2 mi einer Lösung, die man durch Verdünnen des in Abschnitt 2 verwendeten Oxytocin-Antiserums um einen Faktor von 30 erhalten hat und 0,1 ml einer Standard-Oxytocinlösung (in wäßriger 0,1 n-Essigsäure) mit der in der folgenden Tabelle XII angegebenen Konzentration und mischt gut durch. Nachdem man die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur hat stehenlassen, gibt man 0,1 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Oxytocini-sensibilisierten Latexreagens in das Reagenzglas und schüttelt die erhaltene Mischung

so während 12 Minuten auf einer hin- und herbewegten Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die in dieser Weise erhaltene Flüssigkeit überführt man in eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 rnm und bestimmt die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 μηι in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XII zusammengestellt

⁶⁰ Tabelle ΧΠ

Konzentration der Standard- Extinktion

Oxytodnlösung (μΙΕ/ml) bei 1,2 [im

AD*

65

2000 1500 1000

0,395	0,183
0,450	0,128
0,483	0,095

Fortsetzung

Konzentration der Standard- Extinktion AD*

Oxytocinlösung (μΙΕ/ml) bei 1,2 μπι

♦AD =

0,525
0,550
0,578

0,053
0,028

= (Extinktion bei einer Konzentration der Standard-Oxytocinslöjung von Null) minus (Extinktion bei der angebe
Den Konzentration)

Wenn man die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte graphisch aufträgt, und zwar die Konzentration der Standard-Oxytocinlösung auf der Abszisse und den 4Z>Wert auf der Ordinate, so erhält man eine geradlinige Beziehung, wie aus der Fig. 10 zu ersehen ist Unter Anwendung der in dieser Weise ermittelten Eichkurve ist es möglich, die Bestimmung von Oxytocin in dem Serum von schwangeren Frauen zu erreichen.

Beispiel 8

1. Bereitung eines

Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten
Latexreagens

In 5 ml 0,05 n-Chlorwasserstoffsäure löst man 7900 ΙΕ/ml Humanchoriongonadotropin (hCG) und hydrolysiert das Material während 1 Stunde bei 80⁰C. Nachdem man die Lösung dialysiert und durch Absaugen filtriert hat, löst man das hydrolysierte Humanchoriongonadotropin in 2 ml einer 0,05 m-Boratpufferlösung (mit einem pH-Wert von 8,7) und verdünnt auf ein Gesamtvolumen von 10 ml. Dann gibt man nach und nach unter Rühren einen aliquoten Anteil von 5 ml einer 2%igen Lösung eines Polystyrollatex mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-% und einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 zu der Lösung des hydrolysierten Humanchoriongonadotropins. Die erhaltenen Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexteilchen werden während 20 Minuten bei 13 000 min-' zentrifugiert wonach die abzentrifugierten sensibilisierten Latexteilchen abgetrennt und in 10 ml einer 0,2%igen Lösung von Rinderserumalbumin in der Boratpufferlösung suspendiert werden. Die Suspension wird dann zentrifugiert, worauf der Niederschlag durch Zentrifugieren mit der Boratpufferlösung gewaschen und schließlich in 10 ml der Pufferlösung suspendiert wird, so daß man ein Humanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens erhält, das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält

2. Ermittlung einer Eichkurve

Die optimale Konzentration des Antihumanchoriongonadotropinserums wird in der in Beispiel 7, Abschnitt 2, beschriebenen Weise ermittelt (die in diesem Fall einer Verdünnung um den Faktor 300 entspricht). Dann beschickt man ein Kunststoffreagenzglas mit 0,2 ml einer Antihumanchoriongonadotropin-Serumlösung, die man durch Verdünnen des Serums mit einer isotonischen Natriumchloridlösung um einen Faktor von 300 erhalten hat, und mit 0,1 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung in der in der folgenden Tabelle XIII angegebenen Konzentration und schüttelt während !0 Minuten. Anschließend gibt man 0,1 ml des entsprechend dem obigen Anschnitt 1 bereiteten Humanchoriongonadotropin-seasibilisierten

Latexreagens zu und schüttelt die Mischung während 10 Minuten auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die erhaltene Flüssigkeit wird in eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, worauf man die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,0 μπι in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise bestimmt Die erhaltenen Ergebe nisse sind in der folgenden Tabelle XIJl angegeben.

Tabelle Xffl

Konzentration der Standard- Extinktion bei

Humanchoriongonadotropin-LSsung (IE/ml) 1,0 μπι

10
1
0,1

0,140
0,208
0,271

Wenn man die obigen Zahlenwerte graphisch aufträgt, und zwar den Logarithmus der Konzentration der Standard-Huinanchoriongonadotropm-Lösung auf der Abszisse und die Extinktion auf der Ordinate, so erhält man eine Eichkurve, die, wie in der F i g. 11 dargestellt ist, in den Konzentrationsbereichen, in denen die Messung tatsächlich ausgeführt wird, einen geradlinigen Verlauf zeigt
Somit ist es möglich, unter Verwendung dieser Eichkurve Humanchoriongonadotropin im Serum von schwangeren Frauen zu bestimmen.

B e i s ρ i e 1 9

In einem Kunststoffreagenzglas vermischt man 0,1 ml des gemäß Beispiel 1, Abschnitt 1, bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens (wobei der durchschnittliche Durchmesser der Polystyrollatexteilchen 0,481 μπι beträgt und die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% vorliegen) und 03 ml einer Standard-Fibrinogenlösung (die in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,5 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält) in der in de? folgenden Tabelle XIV angegebenen Konzentration und schüttelt dann während 3 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Anschließend bestimmt man die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichts von 1,2 um in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIV zusammengestellt

Tabelle XIV

Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung (ng/ml)

Extinktion bei 1,2 μπι

10
20
40
60
80
100

0,048
0,125
0,324
0,540
0,718
0,802

Wenn man auf der Grundlage der obigen Zahlenwerte eine Eichkurve erstellt, so findet man eine eindeutige Korrelation zwischen der Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung und der Extinktion. Somit ist es

erfliidti'.igsgemäß möglich, extrem geringe Fibrinogenmengen im Bereich von Nanogram/Milliliter zu bestimmen und dies mit einer Empfindlichkeit, die vergieichbcr ist der Radioimmuntestmethode (RIA-Methode).

Beispiel 10

Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man Antifibrinogen-sensibilisierte Latexreagenzien, die die Antifibrinogen-sensibilisierten Latexteilchen in Konzentrationen von 0,75 Gew.-%, 1,0 Gew.-% bzw. 2,0 Gew.-% enthalten, mit dein Untcr-

schied, daß man einen anderen Polystyrollatex Mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmessef von 0,35 μπι verwendet. Für jedes in dieser Weise bereitete Antifibrinogen-sensibilisierte Latexreagens nimmt man

nach der in Beispiel I₁ Abschnitt 2, beschriebenen Weise eine Eichkurve auf (bei einer Wellenlänge des angewandten Lichts von 1,2 μπι und bei eii^r Schüttelzeit von 10 Minuten). Diese Eichkürven sind in der Fig. 12 dargestellt. Wie aus der Fig, 12 zu ersehen ist,

ίο nimmt die Nachweisempfindlichkeit für Fibrinogen mit der Konzentration der sensibilisierten Latexteilchen in dem Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens zu.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern durch Fixieren eines Antikörpers oder eines Antigens an unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι, um die unlöslichen Trägerteilchen zu sensibilisieren, Umsetzen des auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörpers und/oder Antigens mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper '" oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium, Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht und Messung der Extinktion der Reaktionsmischung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilrhen, bestrahlt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι, vorzugsweise von 0,2 bis 0,8 μπι, aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man alt, Trägerteilchen ein feines Pulver aus hochmolekularem Polystyrollatex verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung während einer vorheroestimmten Zeitdauer unter spezifischen Bedingungen dm chführ and anschließend die Extinktion der Reaktionsmischung mißt

5. Verfahren nach Anspruc; 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zeitdauer bestimmt, die erforderlich ist, daß die Extinktion der Reaktionsmischung einen vorbestimmten Wert erreicht.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,8 μπι bis 1,8 μπι, vorzugsweise von 1 bis 1,4 μπι, anwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurcn gekennzeichnet, daß man Licht mit einer Wellenlänge anwendet, die um einen Faktor von mindestens 2 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trägerteilchen in einer solchen Menge verwendet, daß die Konzentration des Trägermaterials in der Reaktionsmischung υ bis 1 Gew.-% betlägt

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges Medium Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst ein Antigen oder einen Antikörper zu einer zu untersuchenden Flüssigkeit, die den zu bestimmenden Antikörper oder das zu bestimmende Antigen enthält, zusetzt und damit umsetzt und anschließend eine Suspension der unlöslichen Trägerteilchen, an die ein besonderes Antigen oder ein besonderer Antikörper fixiert ist, zugibt und mit der bei der ersten Reaktion 6i gebildeten Reaktionsmischung umsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern durch Fixieren eines Antikörpers oder eines Antigens an unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι, um die unlöslichen Trägerteilchen zu sensibilisieren, Umsetzen des auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörpers und/oder Antigens mit einem entsprechenden Antigrn oder Antikörper oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium, Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht und Messung der Extinktion der Reaktionsmischung.

Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren zur schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise Antigenen und Antikörpern, die in extrem geringen Konzentrationen vorliegen. Es besteht außerdem ein starkes Bedürfnis dafür, die Anwesenheit von Drogen oder Arzneimitteln in Körperflüssigkeiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diagnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege von dem Körper synthetisiert werden oder in den Körper eingeführt worden sind.

Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene halbquanitfativ dadurch naenzuweisen, daß man Latexteilchen, an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glasplatte umsetzt und visuell den Ag^hitinationszustand beobachtet

Aus den folgenden Veröffentlichungen ist es bekannt. Antigene und Antikörper unter Verwendung der obenerwähnten Latexteilchen quantitativ zu bestimmen, indem man einen Antikörper oder ein Antigen an den Latexteilchen fixiert, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper umsetzt, um die Latexteilchen zu agglutinieren oder zusammenzuballen, und die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Antigen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinationsphänomens des als Reagens verwendeten Latex zu bestimmen: