DE2754645A1 - Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in fluessigkeiten - Google Patents
Verfahren zum nachweis und zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in fluessigkeitenInfo
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Description
— O —
TECHNICON INSTRUI-IENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA
Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in Flüssigkeiten
Die Erfindung betrifft die Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich von
biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, auf die Anwesenheit von Antigenen oder Antikörpern in diesen Flüssigkeiten. Im
folgenden werden mit "Ag" Antigene einschließlich Haptenen und anderen Substanzen, die durch Antikörper oder ähnliche
bindende Proteine gebunden werden können, mit "Ab" Antikörper einschließlich ähnlicher bindender Proteine und mit
"Ab:Ag" Komplexe aus Antikörper und Antigen bezeichnet.
Bekanntlich reagiert ein Antigen mit einem geeigneten Antikörper zu einem Komplex Ab:Ag, und von dieser Umsetzung
machen die meisten Immunoassay-Methoden Gebrauch. Ferner ist es bekannt, teilchenförmige Materialien, wie
Polystyrol (im allgemeinen als Latex bezeichnet) mit einem Antikörper oder Antigen zu überziehen und die beschichteten
Teilchen einer zu untersuchenden Probelösung auszusetzen, um festzustellen, ob und ggf. in welchem Ausmaß die Teilchen
agglutiniert werden. Die Agglutination weist auf die Anwesenheit eines Antikörpers bzw. Antigens in der Probe
hin, der bzw. das in der Lage ist mit zwei oder mehreren beschichteten Latexteilchen unter Agglutination zu reagieren.
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V/enngleich die Methode der Beobachtung der Agglutination
von beschichteten Teilchen in vielerlei Hinsicht zufriedenstellend ist, treten doch Schwierigkeiten auf,
wenn man kleine Antigene, d.h. Antigene, deren Molekulargewicht unter etwa 4000 liegt, bestimmen will. Derartige
Antigene sind im Verhältnis zu den verwendeten teilchenförmigen Materialien sehr klein, so daß häufig eine sichtbare
Agglutination nicht oder in nicht nennenswertem Umfang erfolgt. Das Verfahren ist daher für die Bestimmung kleiner
Antigene nicht völlig zuverlässig.
Es wurde nun ein verbessertes Verfahren zum Nachweis und gewünschtenfalls zur Bestimmung von Antikörpern
und Antigenen in einer Flüssigkeit gefunden, das sich insbesondere zur Bestimmung kleiner Antigene oder Antikörper
eignet und außerdem auch zur Bestimmung größerer Antigene oder Antikörper verwendet werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis bestimmter Antigene oder Antikörper in einer Flüssigkeit,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Gemisch aus der Flüssigkeit mit zwei unterschiedlichen mikroskopischen
oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenzien, die sich beim Bebrüten gegenseitig agglutinieren,
wobei das nachzuweisende Antigen oder der nachzuweisende Antikörper die gegenseitige Agglutination der beiden Reagenzien
inhibiert, herstellt und die Anwesenheit oder Abwesenheit des bestimmten Antigens oder Antikörpers aufgrund
des Ausmaßes der Agglutination oder Nichtagglutination der
beiden teilchenförmigen Reagenzien feststellt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines bestimmten Antigens
oder Antikörpers in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
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(a) ein Gemisch aus
(I) einer Probe aus der das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthaltenden
Flüssigkeit,
(II) einem ersten teilchenförmigen Reagenz aus einem |
teilchenförmigen Trägermaterial, das eine erste Substanz trägt, und
(III) einem zweiten teilchenförmigen Reagenz aus festem teilchenförmigen! Trägermaterial, das eine zweite
Substanz trägt, herstellt,
wobei die erste Substanz in der Lage ist, sich unter Agglutination der ersten und zweiten Substanz an die
zweite Substanz zu binden und mindestens die erste Substanz außerdem in der Lage ist, sich an das bestimmte
Antigen oder den bestimmten Antikörper in der Probe unter Inhibierung der Bindung zwischen der ersten und
der zweiten Substanz zu binden,
(b) das Gemisch bebrütet, um sich das Antigen oder den Antikörper an die erste Substanz binden und nicht an das bestimmte
Antigen oder den bestimmten Antikörper gebundene erste Substanz an die zweite Substanz binden zu lassen
und auf diese Weise eine Agglutination aus erstem und zweiten Reagenz zu bewirken, und
(c) das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination
der teilchenförmigen Reagenzien mißt und dadurch die Menge an in der Probe vorhandenem bestimmten Antigen
oder Antikörper bestimmt.
Erfindungsgemäß werden also zwei verschiedene teilchenförmige Reagenzien gleichzeitig verwendet, während
bei den bisherigen Verfahren lediglich ein teilchenförmiges Reagenz verwendet wird. Diese beiden Reagenzien werden derart
ausgewählt, daß sie beim Vermischen agglutinieren, jedoch
vor dem Vermischen nicht agglutiniert bleiben. Beispielsweise
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kann ein teilchenförmiges Reagenz ein Antigen oder Antigenkonjugat
und das andere einen Antikörper enthalten, der sich an das Antigen oder Antigenkonjugat bindet. Nach dem
Vermischen der beiden Reagenzien bindet sich der Antikörper an das Antigen oder Antigenkonjugat unter Agglutination der
Teilchen. Mindestens eines der teilchenförmigen Reagenzien wird jedoch derart gewählt, daß es sich auch an den Antikörper
oder das Antigen bindet, der bzw. das in der Flüssigkeit bestimmt werden soll. Die Bindung des teilchenförmigen
Reagenzes an den freien Antikörper oder das freie Antigen, die bestimmt werden sollen, blockiert die Bindungsstellen
an dem teilchenförmigen Reagenz, so daß es nicht mehr in der
Lage ist, sich an das andere teilchenförmige Reagenz unter Agglutination zu binden. Das Ausmaß der Agglutination in
dem Gemisch wird auf diese Weise im Vergleich zu dem Betrag, der erhalten würde, wenn das Antigen oder der Antikörper
nicht in der Flüssigkeit enthalten wäre, um einen Betrag verringert, der von der Menge des Antigens oder Antikörpers
abhängt, das bzw. der in der Flüssigkeit bestimmt werden soll. Durch Beobachten dieser Erscheinung kann das Vorhandensein
des einzelnen Antikörpers oder Antigens bestätigt werden, und durch Messen des Ausmaßes der Agglutination oder
Nichtagglutination kann die Menge des einzelnen Antikörpers oder Antigens bestimmt werden. Dies wird gewöhnlich am zweckmäßigsten
dadurch bewerkstelligt, daß man eine Standardkurve aufgrund von Ergebnissen aufstellt, die bei Anwendung bekannter
Konzentrationen von bestimmten Antikörpern oder Antigenen erhalten worden sind, und anschließend die Kurve zur Bestimmung
der vorher unbekannten Menge an Antikörper oder Antigen in einer zu untersuchenden Probe verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vermutlich für jedes Antigen angewandt werden, und es erfordert keinen spezifischen
Antikörper auf dem teilchenförmigen Reagenz, da die Spezifität durch das mit Antigen überzogene teilchenförmige
Reagenz eingeführt werden kann. Wenn beispielsweise die
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Antikörperbeschichtung auf einem teilchenförmigen Reagenz unspezifisch ist, so daß sie mit drei verschiedenen Antigenen
reagieren könnteund es erwünscht ist, in einer Flüssigkeitsprobe lediglich eines dieser Antigene, nämlich
Ag1 zu bestimmen, dann kann die Bestimmung von Ag1 dadurch
bewirkt werden, daß man ein mit Ag1 überzogenes teilchenförmiges
Reagenz zusammen mit dem mit dem Antikörper beschichteten Reagenz verwendet. Dieses Vorgehen kann auch
in analoger Weise für den Nachweis und die Bestimmung von Antikörper in einer Probe angewandt werden.
Die teilchenförmigen Reagenzien, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind von mikroskopischer
oder submikroskopischer Größe, d.h. sie sind im allgemeinen kleiner als 15/U und üblicherweise von der
Größenordnung einiger Micron oder unter einem Micron. Latexteilchen solcher Größen sind im Handel erhältlich. Es
ist bekannt, daß sich Antikörper oder Antigene an mikroskopische teilchenförmige Materialien, wie Latex, binden·
Dies wird normalerweise dadurch bewirkt, daß man das Teilchen mit einem reaktionsfähigen Überzug versieht und an
diesen den Antikörper oder das Antigen chemisch bindet oder adsorbiert. In bestimmten Fällen ist es auch möglich,
den Antikörper oder das Antigen unmittelbar an das Teilchen ohne dazwischenliegenden Überzug zu binden. Die Herstellung
der teilchenförmigen Reagenzien ist bekannt und bildet keinen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Beispiele für die Antigene und Antikörper, die an teilchenförmige Materialien, wie beispielsweise Latex,
für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gebunden werden können, sind: als Antikörper Immunglobulin G (IgG) aus
menschlichem, Kaninchen-, Ziegen- und Schafserum sowie ihre Fragmente F (ab)'; Immunglobulin M (IgM) von Kaninchen und
als Antigene menschliches Immunglobulin M (IgM) menschliches placentares Lactogen, menschliches ei -Fetoprotein,
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Menschliches Lactoferrin, menschliches Serumalbumin,
menschliches Transferrin, menschliches C-reaktives Protein
und das Fc-Fragment von menschlichem IgG; Rinder-IgG
und Rinderseruaalbumin, Pferdeferritin, IgG vom Menschen,
der Maus, der Ratte und dem Meerschweinchen sowie die gereinigten Unterklassen 1, 2, 3 und 4 von menschlichem IgG.
Ferner wurden gebunden: Thyroxinkonjugate von menschlichem
Serumalbumin, IgG und Transferrin, Rinderalbumin und -fibrinogen und Pferdeferritin; ferner Digoxinkonjugate von
menschlichem und Rinderalbumin und Rinder-IgG. Thyroxin kann unmittelbar an Polystyrollatexteilchen gebunden werden,
die an ihrer Oberfläche reaktionsfähige Carboxylgruppen tragen.
Vorzugsweise ist die Teilchengröße jedes teilchenförmigen Reagenzes praktisch gleichmäßig und, wie weiter
unten genauer beschrieben, die Teilchengröße des ersten teilchenförmigen Reagenzes von derjenigen des zweiten teilchenförmigen
Reagenzes verschieden, wobei die Teilchengröße des ersten Reagenzes vorzugsweise mindestens das Zweifache
derjenigen des zweiten Reagenzes beträgt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines bestimmten Antigens oder Antikörpers
ist es lediglich notwendig, festzustellen, ob eine Inhibierung der Agglutination erfolgt ist. Wenn in der
Probe verhältnismäßig große Mengen an nachzuweisendem Antigen oder Antikörper vorhanden sind, ist es möglich, die
Inhibierung der Agglutination mit dem bloßen Auge durch ein Mikroskop festzustellen, wobei das Gemisch auf einem
Objektträger ausgebreitet ist. Eine besonders bevorzugte Methode gemäß der Erfindung zum Nachweis von Progesteron
in Kuhmilch besteht darin, daß man ein Gemisch aus der Milch, einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen
Reagenz mit einem Gehalt an Progesteron oder einem Progesteronkonjugat und einem mikroskopischen oder
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submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz mit einem Gehalt an einem Antikörper, der sich sowohl an das Progesteron
als auch an das Progesteronkonjugat bindet, herstellt.
Die Untersuchung des Gemisches mit dem bloßen Auge läßt normalerweise feststellen, ob eine Inhibierung der
Agglutination vorliegt. Es ist natürlich bei den Verfahren zum Nachweis der Agglutinationsinhibierung auch möglich
sich eines der Verfahren zu bedienen, die im folgenden in Verbindung mit den quantitativen Bestimmungen beschrieben
werden.
Bei den quantitativen Bestimmungen gemäß der Erfindung ist es erforderlich, das Ausmaß der Agglutination
oder Nichtagglutination der teilchenförmigen Reagenzien zu bestimmen«, Das kann in unterschiedlicher Weise erfolgen.
Beispielsweise können die agglutinierten Teilchen von den
nicht agglutinierten abgetrennt und die Anzahl der letzteren bestimmt werden. Die Abtrennung kann beispielsweise durch
Filtrieren oder Zentrifugieren oder durch Säulenchromatografie erfolgen. Die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen
kann danach beispielsweise durch Abzählen oder durch Anwendung einer identifizierenden Markierung, wie beispielsweise
mit Hilfe eines radioaktiven Atoms an dem teilchenförmigen Reagenz oder den teilchenförmigen Reagenzien
bestimmt werden.
Im allgemeinen wird jedoch eine Abtrennungsstufe
vermieden, da sie zeitraubend ist und leicht zur Einführung von Irrtümern Gelegenheit gibt. Es wird daher bevorzugt,
die Messungen an dem Reaktionsgeraisch durchzuführen,
um das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination festzustellen. Dies kann zweckmäßig dadurch bewerkstelligt
werden, daß man sich bekannter selektiver Zähltechniken bedient. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich,
die Zahl an Teilchen in einem gegebenen Größenbereich zu zählen, wobei Teilchen, die eine Größe außerhalb dieses
Bereiches aufweisen, nicht mitgezählt werden.
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Eine bekannte Vorrichtung zur Durchführung dieser Art von Zählung ist der "Technicon Autocounter". In seiner
Grundform besteht diese Vorrichtung aus einem optischen System, bei dem Licht durch eine Fließzelle geleitet wird,
durch die die verdünnte Probe rechtwinklig zu dem Lichtstrahl indurchgepumpt wird. Am anderen Ende des optischen
Systems befindet sich eine Fotozelle, und unmittelbar hinter der Fließzelle ist eine Linse mit einem zentralen
schwarzen Fleck angeordnet, um zu verhindern, daß das Licht, das direkt durch die Fließzelle hindurchtritt, die
Fotozelle erreicht. Wenn sich ein Teilchen in dem Lichtstrahl befindet, wird ein Anteil des einfallenden Lichtes
derart gestreut, daß es an dem schv/arzen Fleck vorbeitritt und die Fotozelle erreicht. Diese registriert einen elektronischen
Impuls und durch Addition dieser Impulse kann eine Zählung der Teilchen in der Probe durchgeführt werden.
Bei der Verwendung einer selektiven Zähltechnik ist es von großem Vorteil, wenn die beiden teilchenförmigen
Reagenzien eine unterschiedliche Größe besitzen, so daß sie vom Zähler voneinander unterschieden werden können.
Zu diesem Zweck und bei Verwendung von Teilchen der Größenordnung von Micron oder unter einem Micron genügt normalerweise
eine Größendifferenz um den Faktor 2. Im folgenden wird eine Erläuterung in Form eines Betriebsbeispiels für
das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der selektiven Zählung gegeben. Die das zu bestimmende Antigen enthaltende
Probe wird mit dem ersten und dem zweiten teilchenförmigen Reagenz versetzt, deren Teilchengrößen 1 bzw.
0,1 /U betragen. Die Menge an zugesetztem ersten Reagenz
ist bekannt und beträgt mehr als die zur Bindung sämtlichen Antigens in der Probe notwendige Menge. Ein Teil des
ersten Reagenzes bindet sich an das Antigen und wird dadurch daran gehindert, sich an das zweite teilchenförmige
Reagenz zu binden. Diejenigen Teilchen des ersten Reagenzes
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jedoch, die nicht an das Antigen in der Probe gebunden sind, binden sich an das zweite teilchenförmige Reagenz
unter Agglutination. Das Gemisch enthält danach (1) Teilchen aus dem ersten Reagenz, die im nicht agglutinierten
Zustand an das Antigen aus der Probe gebunden sind, (2) überschüssiges zweites Reagenz (ebenfalls nicht agglutiniert)
und (3) agglutinierte Teilchen. Da eine Größendifferenz zwischen den nicht agglutinierten Teilchen des
ersten und des zweiten Reagenzes besteht, kann die Anzahl der nicht agglutinierten Teilchen des ersten Reagenzes
bestimmt werden, und aus der Zählung (und Standardergebnissen) kann die Menge an Antigen in der Probe errechnet
werden.
Es ist zwar bevorzugt, in dieser oder ähnlicher V/eise vorzugehen, jedoch ist es nicht wesentlich, erste
und zweite Reagenzien von unterschiedlicher Teilchengröße zu verwenden. Außerdem ist es möglich, die Gesamtzahl der
Teilchen oder gewünschtenfalls die agglutinierten Teilchen
in dem Gemisch zu zählen, wenngleich die Reproduzierbarkeit
der beim Zählen von Agglutinaten erzielten Ergebnisse nicht immer sehr zufriedenstellend ist.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders vorteilhaft zur Bestimmung von kleinen Antikörpern und
Antigenen. In diesem Zusammenhang sind Bestimmungen von Steroiden und Pharmaka von größter Bedeutung.
Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert.
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Beispiel 1
Bestimmung von Digoxin.
Bestimmung von Digoxin.
a) Herstellung eines mit Antikörper beschichteten Latex
Latexteilchen von 0,09/U Durchmesser aus Polystyrol der
Dow Chemical Co., die in Form einer 10-Gew.-%igen Suspension, wie geliefert, vorlagen, wurden auf das Zwanzigfache
mit verdünnter, mit Glycin gepufferter Kochsalzlösung (dGBS-20 m-molar in bezug auf Glycin, 3^ m-molar in
bezug auf NaCl, pH 9) mit einem Gehalt von 0,2 mg/ml an der in Rivanol löslichen Fraktion (hergestellt nach dem
Verfahren von Stastny und Horejsi, Clin. Chim. Acta (1961),
6, 782) vom Antidigoxinserum von Schafen, und 30 min bei Raumtemperatur bebrütet. Danach wurde 1/10 Volumenteil von
10 mg Rinderserumalbumin (bSA) je ml verdünnter Glycinpufferlösung
zugesetzt, um sicherzustellen, daß der Latex vollständig mit Protein überzogen war, und nach weiteren
30 min Bebrütungszeit wurde der beschichtete Latex zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und erneut in verdünnter
Glycinpufferlösung suspendiert. Schließlich wurde der beschichtete Latex erneut zu einer 0,5%igen Suspension in
Glycinpufferlösung (0,1 Mol Glycin, 0,17 Mol Kochsalz, pH 9) mit einem Gehalt von 1 mg Rinderserumalbumin/ml
suspendiert.
b) Herstellung von mit Antigen beschichtetem Latex
Das gleiche Verfahren, wie unter a) beschrieben, wurde mit der Abweichung durchgeführt, daß der verwendete Latex einen
Durchmesser von 1,1 /U besaß und die Bebrütung bei einer
Antigenkonjugat-Konzentration von 4/Ug/ml durchgeführt wurde,
wonach 1/10 Volumenteil von 10 mg/ml Transferrin zugegeben wurde.
Das Antigenkonjugat wurde hergestellt, indem man Digoxin
und Ethylenglycol oxidativ kuppelte und anschließend diesen Komplex reduktiv an das Protein kuppelte. 50 mg Digoxin,
in 2 ml absolutem Alkohol gelöst, wurden 25 min mit 2 ml
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0,1 molarer Natriumperchloratlösung bebrütet, wonach
60 /Ul Ethylenglycol zugesetzt wurden und das Ganze weitere 5 min bebrütet wurde. Dieses Reaktionsgemisch wurde
dann einer Lösung von 60 mg menschlichem Transferrin in 2 ml Wasser, die durch Zusatz von 5%iger Sodalösung auf
einen pH-Wert von 9,5 gebracht worden war, zugesetzt und das Ganze 45 min bebrütet. Danach wurden 30 mg Natriumborhydrid,
die frisch in 2 ml Wasser gelöst worden waren, zugegeben und das Ganze weitere 3 h bebrütet. Am Ende dieser
Periode wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zusatz von 1 molarer Ameisensäure auf 6,5 erniedrigt, um
nicht umgesetztes Natriumborhydrid zu zerstören, und nach einer weiteren Stunde Bebrütungsdauer wurde 1 molare Ammoniumhydroxidlösung
zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,5 zu erhöhen, wonach das Ganze zwei Tage lang bei 4 0C gegen
fließendes Wasser dialysiert wurde. (Sämtliche anderen Verfahrensschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt).
c) Bestimmung
Die für die Bestimmung von Digoxin verwendeten Seren wurden zunächst mit Säure erhitzt, um die Störung durch das Serum
zu vermindern. 25/ul Serum wurden mit 25/ul 0,1n Salzsäure
10 min auf 56 0C erhitzt und anschließend durch Zugabe von
10/Ul 2 molarer Sodalösung alkalisch gemacht. Diese erhitzten
Seren wurden mit 25/Ul Ab-Latex (verdünnt 1 : 10 mit Glycinpufferlösung mit einem Gehalt von 1 mg Rinderserumalbumin/ml)
sowie mit 25/Ul Konjugatlatex (verdünnt
1 : 4 mit Glycinpufferlösung mit einem Gehalt von 1 mg menschlichem Transferrin/ml) versetzt. Sie wurden anschließend
in senkrecht gestellten Röhren, die horizontal auf einem Schüttelbebrüter geschüttelt wurden, 15 min bei Raumtemperatur
bebrütet. Am Ende dieser Periode wurde der Inhalt der Gläser mit 5 ml Glycinpufferlösung verdünnt und nach
weiterer 20-fächer Verdünnung mit Glycinpufferlösung, die
0,01% Sorbimacrogollaurat (Tween 20) enthielt, durch die
Fließzelle eines Technicon Autocounter mit einer Geschwin-
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digkeit von 2 ml/min geleitet. Die relative Anzahl an
nicht agglutinierten (monomeren) Latexteilchen in jeder Probe wurde durch selektive optische Zählung bestimmt,
wie es auch mit der relativen Anzahl an agglutinierten Teilchen geschehen kann. In der folgenden Tabelle I sind
die erhaltenen Werte angegeben.
Tabelle I
Inhibierung der Agglutination durch Digoxin im Serum
Inhibierung der Agglutination durch Digoxin im Serum
Digoxinkonzentration Nichtagglutinierte Teilchen
im Serum (in % des Höchstwertes) (ng/ml)
0 35
0,31 AO
0,625 AA
1,25 63
2,5 90
5,0 100
Dieses Verfahren wurde ebenfalls mit Erfolg für die Bestimmung von Dinitrophenol (DIiP) unter Verwendung von
Antigenkonjugaten des Haptens mit Rinderserumalbumin angewandt.
Beim selektiven optischen Auszählen der Teilchen hängt die Menge an von einem Teilchen gestreutem Licht von der Teilchengröße
ab; der in der Fotozelle erzeugte elektronische Impuls ist wiederum proportional der Teilchengröße, und
Teilchen verschiedener Größe können getrennt voneinander gezählt v/erden. Aus der folgenden Tabelle II geht die Verbesserung
der Genauigkeit der Bestimmung (durch Schaffung eines größeren Bereichs für die Standardkurve) hervor, die
dadurch erzielt werden kann, daß man anstatt sämtliche Teilchen nur die nichtagglutinierten (monomeren) Teilchen zählt,
Aus der Tabelle geht weiter hervor, daß eine große Erhöhung
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der Empfindlichkeit erzielt werden kann, indem man das Verhältnis von nicht agglutinierten zu agglutinierten Teilchen
(Verhältnis Monomer/Polymer) ermittelt. Durch Zählen der Teilchen ganz allgemein kann eine Erhöhung der Empfindlichkeit
und der Genauigkeit erzielt werden, verglichen mit anderen Methoden der Endpunktbestimmung.
Vergleich | der Zählmethoden | für den Lateximmunoassay von | Gesamtteilchen | 1 | Monomere | fonomer/Polymer- |
menschlichem Placentarlactogen (hPL) | zahl | 100 | Verhältnis | |||
100 | 100 | 100 | ||||
ng hPL/ml | 100 | 98 | 81 | |||
0 | 100 | 94 | 68 | |||
2,5 | 97 | 82 | 55 | |||
5 | 90 | 62 | 30 | |||
10 | 78 | 46 | 13 | |||
20 | 67 | 36 | 8 | |||
AO | 57 | 30 | 6 | |||
60 | 50 | 22 | 5 | |||
80 | 40 | 5 | ||||
100 | ||||||
160 |
Jeder Wert ist als Prozentsatz von dem Wert ausgedrückt, der in Abwesenheit von hPL erhalten wurde.
In der folgenden Tabelle III ist ein Vergleich der Ergebnisse wiedergegeben, die durch Teilchenzählung
(nur Monomere) einerseits und Trübungsmessung (optische Dichte bei 400 mn) andererseits für eine Reihe von Proben
erhalten wurden, die eine Standardkurve für Digoxin repräsentieren.
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Tabelle | III | für | |
Vergleich von Zählung | gegenüber | Trübungsme s sung | |
Lateximmunoassay von | Digoxin | Trübung | |
Digoxinkonzentration | im Serum | Teilchenzählung | |
(ng/ml) | (Monomere) | 68 | |
0 | 35 | 74 | |
0,31 | 40 | 71 | |
0,625 | 44 | 82 | |
1,25 | 63 | 100 | |
2,5 | 90 | 100 | |
5,0 | 100 | ||
Jeder Wert ist in Prozenten des Wertes ausgedrückt, der in Anwesenheit von 5 ng Digoxin/ml (maximale Inhibierung)
gefunden wurde.
Bestimmung von Thyroxin.
a) Herstellung von mit Thyroxin gekuppeltem Latex
Latexteilchen von 0,857/U Durchmesser aus mit Carboxylat
modifiziertem Polystyrol der Dow Chemical Co. wurden in Form einer 10 Gew.-#igen Suspension, wie geliefert, auf das
Zwanzigfache mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS : 50 mM in bezug auf Natriumphosphat, 0,17 molar in bezug auf
Kochsalz, pH 6) verdünnt, 10 min bei 4 0C und 12000 g zentrifugiert
und in frischer phosphatgepufferter Salzlösung zu einer Suspension mit einer Konzentration von 2 Gew.-%
erneut suspendiert. Eine Lösung aus 25/Ug Thyroxin und 50/ug 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid
in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung wurde bei 0 0C hergestellt und mit 250/Ul der gewaschenen Latexsuspensionen
versetzt. Nach einstündiger Bebrütung bei 0 0C wurden 250 /Ul einer 259»igen Lösung von Ethanolamin in
phosphatgepufferter Salzlösung hinzugesetzt und die Bebrü-
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tung 30 rain weitergeführt. Danach wurde der Latex zweimal durch Zentrifugieren und erneutes Suspendieren in frischer
phosphatgepufferter Salzlösung (jedesmal 1 ml) gewaschen und danach 16 h "bei 4 0C gegen 1 1 phosphatgepufferte Salzlösung
dialysiert. Schließlich wurde er zentrifugiert und erneut in 1 ml glycingepufferter Salzlösung mit einem Gehalt
von 19b Rinderalbumin (bSA) suspendiert.
b) Bestimmung von Thyroxin durch gemischte Agglutination (I) Herstellung von mit Antikörper überzogenem Latex
Das Verfahren der Latexherstellung war genau dasselbe wie das in Beispiel 1 für die Bestimmung von
Digoxin beschriebene mit der Abweichung, daß der Antikörper von Antithyroxinserum (T^) von Kaninchen
stammte.
(il) Herstellung des mit Antigen beschichteten Latex
Siehe unter (a)
(III) Bestimmung
(III) Bestimmung
Die auf T^ zu untersuchenden Seren wurden zunächst
mit dem gleichen Volumen einer 1 mM Lösung von 1-Anilinonaphthalin-8-sulfonsäure
in 75 mM Natriumdiethylbarbituratlösung vom pH 9,2 vermischt. 50/ul dieses verdünnten Serums
wurden danach mit 25 /Ul 0,01?6iger Aufschlämmung von Ab-Latex
in glycingepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von Λ% Rinderserumalbumin
sowie 25/ul 0,1%iger Suspension von Ag-Latex
in demselben Puffer in der gleichen Weise bebrütet, wie in Beispiel 1 für die Bestimmung von Digoxin beschrieben. In
der folgenden Tabelle IV sind bei Anwendung dieses Systems erhaltene typische Ergebnisse zusammengefaßt.
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Tabelle IV ng T^/ml Serum Teilchenkonzentration (% des Höchstwertes)
0 48
10 51,5
50 59,5
200 89
Der Höchstwert war in diesem Falle der Wert für den Ag-Latex allein; sämtliche oben aufgeführten Werte wurden in
Gegenwart von Ag-Latex ebenso gefunden.
Beispiel 1 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß Latexteilchen der gleichen Größe und nicht von verschiedener
Größe verwendet wurden. Dabei wurden die in der folgenden Tabelle V zusammengefaßten Ergebnisse erhalten.
Inhibierung der Agglutination durch Digoxin in Serum
Nichtagglutinierte Teilchen
(in % des Höchstwertes)
Digoxinkonzentration | Latex gleicher |
im Serum (ng/ml) | Teilchengröße |
0 | 60 |
1 | 78 |
4 | 95 |
10 | 100 |
mit unterschiedlicher Teilchengröße
21
30
76
100
809825/0733
Claims (21)
- Pcrtantemwäli«r.-lEg. Wilhelm ßeichelipl-bj. \V:.;.::01ig Μώβϊ 8968ü Frankfurt ä. M. 1
Pcaksiraik» 13TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytovm, N.Y., VStAPatentansprüche, 1J Verfahren zum Nachweis von bestimmten Antigenen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus der Flüssigkeit mit zwei verschiedenen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenzien, die einander gegenseitig nach gemeinsamer Bebrütung agglutinieren, herstellt, wobei das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper die gegenseitige Agglutination der beiden Reagenzien inhibiert, und daß man das Vorhandensein oder die Abwesenheit des bestimmten Antigens oder Antikörpers aufgrund des Ausmaßes der Agglutination oder Nichtagglutination der beiden teilchenförmigen Reagenzien feststellt. - 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als die beiden verschiedenen teilchenförmigen Reagenzien solche wählt, die jedes aus ein Reagenz tragenden Latexteilchen bestehen.
- 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als das eine teilchenförraige Reagenz ein solches wählt, das ein Antigen oder Antigenkonjugat und als das andere teilchenförmige Reagenz ein solches wählt, das einen Antikörper enthält, der sich an das Antigen oder Antigenkonjugat bindet, und daß man als Antikörper oder Antigen oder Antigenkonjugat einen solchen bzw. ein solches wählt, der bzw. das sich an das zu bestimmende Antigen bzw. den zu bestimmenden Antikörper unter Inhibierung der Agglutination der beiden teilchenförmigen Reagenzien bindet.809825/0733275AbAS
- 4. Verfahren gemä;3 einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch auf einem Mikroskop-Objektträger ausbreitet und das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Beobachtung mit dem bloßen Auge oder durch ein Mikroskop bestimmt.
- 5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis A zum Nachweis von Progesteron in Kuhmilch,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus der Milch, einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz mit einem Gehalt an Progesteron oder an einem Progesteronkonjugat sowie einem mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz bildet, das einen Antikörper enthält, der sich sowohl an das Progesteron als auch an das Progesteronkonjugat bindet.
- 6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man(a) ein Gemisch aus den folgenden Komponenten bildet:(I) einer Probe der Flüssigkeit, die das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthält, (II) einem ersten teilchenförmigen Reagenz, das aus einem festen, teilchenförmigen Trägermaterial besteht, das eine erste Substanz trägt, und(III) einem zweiten teilchenförmigen Reagenz, das aus einem festen, teilchenförmigen Trägermaterial besteht, das eine zweite Substanz trägt,wobei die erste Substanz in der Lage ist, sich unter Agglutination des ersten und zweiten Reagenzes an die zweite Substanz zu binden, und mindestens die erste Substanz ebenfalls in der Lage ist, sich unter Inhibierung der Bindung zwischen der ersten Substanz und der zweiten Substanz an das bestimmte Antigen oder den bestimmten Antikörper in der Probe zu binden,809825/0733(b) daß man das Gemisch bebrütet, um sich das Antigen oder den Antikörper an die erste Substanz binden und nicht an das bestimmte Antigen bzw. den bestimmten Antikörper gebundene erste Substanz an die zweite Substanz binden zu lassen und damit eine Agglutination von erstem und zweitem Reagenz zu verursachen, und(c) daß man das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination der teilchenförmigen Reagenzien mißt und daraus die Menge an dem bestimmten Antigen bzw. Antikörper, die in der Probe vorhanden ist, bestimmt.
- 7. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Bestimmung eines bestimmten Antigens,dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Substanz einen Antikörper wählt, der sich an das zu bestimmende Antigen oder an ein Konjugat davon binden kann, und daß man als zweite Substanz dasselbe Antigen wie das, das bestimmt werden soll, oder ein Konjugat davon wählt.
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Bestimmung eines bestimmten Antikörpers,dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Substanz ein Antigen oder Antigenkonjugat wählt, das in der Lage ist, sich an den Antikörper zu binden, und daß man als zweite Substanz einen Antikörper wählt, der in der Lage ist, sich an das Antigen oder Antigenkonjugat zu binden.
- 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man für jedes teilchenförmige Reagenz eine Teilchengröße wählt, die praktisch gleichförmig ist.809825/0733
- 10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Teilchengröße für das erste teilchenförmige Reagenz eine solche wählt, die von derjenigen des zweiten teilchenförmigen Reagenzes unterschiedlich ist.
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Teilchengröße für das erste teilchenförmige Reagenz eine Größe wählt, die mindestens zweimal so groß wie diejenige des zweiten teilchenförmigen Reagenzes ist.
- 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Auszählen der agglutinierten und bzw. oder nichtagglutinierten Teilchen bestimmt.
- 13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Auszählen der Teilchen durchführt, während sie als Gemisch vorliegen.
- 14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man nichtagglutinierte Teilchen selektiv durch optische Methoden zählt.
- 15. Verfahren gemäß Anspruch 11 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man nicht agglutiniertes erstes teilchenförmiges Reagenz in dem Gemisch selektiv zählt und in Stufe (a) eine bekannte Menge an erstem teilchenförmigen! Reagenz in dem Gemisch vorhanden ist.809825A0733
- 16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) die agglutinierten Teilchen von den nicht agglutinierten abtrennt.
- 17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder als erstes oder als zweites teilchenförmiges Reagenz ein solches wählt, das eine identifizierende Markierung trägt und man das Ausmaß der Agglutination oder Nichtagglutination durch Bestimmung der Markierung in den abgetrennten Teilchen mißt.
- 18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines oder als beide der teilchenförmigen Reagenzien ein solches bzw. solche wählt, die einen Latex enthalten.
- 19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6 bis 18,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper bestimmt, das bzw. der ein Molekulargewicht von unter 4000 aufweist.
- 20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen ein Steroid oder ein Arzneimittel bestimmt.
- 21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6 bis 20,dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip automatisch durchführt.809825/0733
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