JPH0619349B2

JPH0619349B2 - 体液成分分析方法およびその装置

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Publication number: JPH0619349B2
Application number: JP58219753A
Authority: JP
Inventors: 伸吾住江
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1983-11-22
Filing date: 1983-11-22
Publication date: 1994-03-16
Anticipated expiration: 2009-03-16
Also published as: JPS60111963A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明は、蛋白質などの体液成分の分析方法と、この
方法に使用する分析装置とに関するものである。

従来例の構成とその問題点主に血液中に含まれる体液成分は極めて微量なものが多
いが、水分の調節，物質の輸送，免疫など生命維持に重
要な役割を果たしている。

現在まで、これら体液微量成分の測定には、沈降反応，
凝集反応（本質的には沈降反応と同じであるが主に受身
凝集反応を指す）などの免疫学的手法が用いられてき
た。

沈降反応の代表的なものに免疫電気泳動法，一元放射状
免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）などがあり、近年になってラ
ジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法），レーザネフェロメ
トリ法（ＬＮ法），エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩ
Ａ法）等が開発されている。そして、ＲＩＡ法，ＥＩＡ
法がナノグラム単位、ＳＲＩＤ法，ＬＮ法がミリグラム
単位の測定法としてルーチン化されている。

免疫電気泳動法，ＳＦＩＤ法は長時間（１日から数日）
かけてゲル内での拡散沈降を見るもので、他の微粒子の
影響や変性等の誤差要因の混入機会が多く精度，再現性
に難があった。

ＲＩＡ法，ＥＩＡ法は感度が高く精度も高いが、放射
線，酵素を使用するため、試薬の調製に時間と労力を要
し、また保管，保存上にも規制があり、細かい配慮を要
求さされるので、ノンアイソトピック的な、より簡便な
方法が求められている。

凝集反応の代表的なものとして、１９５６年にSingerと
Plotzらによって開発されたラテックス凝集反応があ
る。この測定法は、反応そのものの感度は非常に高いの
に反し、目視法であるため半定量法であるという弱点が
あり、沈降反応法の種々の欠点が解決されていない実情
にもかかわらず沈降反応法に比較して凝集反応法の発展
は遅れていた。

１９７０年以降、ラテックス凝集を光学的に定量する方
法が開発されるようになった。

ら、Ｆ．Hoffman,Lakoche&Co Aktiengesellschaftら
（英国特許1384399）、日本における沢井らによるもの
は著名である（Latex Agglutination System）。

近年のＬＡシステム，ＬＰＩＡシステムと呼ばれる機器
がそれらの流れをくむものであり、測定レンジが広く、
迅速で精度もよく、新しい体液成分測定器として注目さ
れている。それらはラテックス凝集法（ＬＡ法）とも呼
ばれる。

しかしながら、懸濁試料液全体に近赤外線あるいは可視
光を照射して、グロスで比濁によって定量するため、Ｌ
Ｎ法と同様、乳び血清，ビリルビン血清，溶血血清（ヘ
モグロビン）等の試料の色相や状態差が比濁値に影響す
るなどの誤差要因が避けられない。ＬＡ法は、ＬＮ法に
比べ希釈率も高く、短時間の能率的な測定法なので、こ
れらによる誤差はかなり緩和されているが、高濃度（ヘ
モグロビン０.２５ｇ／dl、ビリルビン２５mg／dl以
上）の場合は前記と同様に測定誤差を生ずる。

また、ＬＡ法，ＬＰＩＡ法の非直線性は誤差発見を困難
にし、測定範囲に制限を与える。また、測定前の自然凝
集差による較正誤差（濃度変換誤差）や凝集モード差に
よる較正誤差も精度向上の面から無視できない誤差要因
である。それは保存中に自然凝集が起こり得るからであ
る。

発明の目的この発明の目的は、非凝集粒子、２個凝集粒子、３，
４，５個凝集粒子を個々に直接計数し、凝集の実態を把
握することによって、上記の欠点をカバーし、迅速，簡
単に、より高精度な体液成分測定を可能にする体液成分
分析方法およびその装置を提供することである。

発明の構成第１の発明の体液成分分析方法は、体液中に含まれる抗
原もしくは抗体と特異的に反応する抗体もしくは抗原を
付着した不溶性担体を含む試薬と試料を混合して抗原抗
体反応を起こさせる過程と、前記抗原抗体反応ずみの試
料液を流しながらこの試料液に含まれている粒子につい
ての凝集程度別の粒子数を求める過程と、式（ただし、ｎは凝集数，Ｐ_ｎは凝集数ｎの粒子の数、Ｔ
は粒子総数、ｋは２以上の任意の自然数）から凝集率
Ｙを求める過程とを含むものである。

粒子を大きく（凝集数）によってふるい分け、大きさ別
ごとの粒子数を求め、上式(1)によって凝集率Ｙを求め
るから、すなわち、粒子１つずつについてデータを得る
ことを基本においているから、個別データ，総合データ
ともに極めて高精度なものとなる。比濁法の場合の色相
差，吸光，散乱，干渉等による誤差の問題は生じない
し、また、測定前の自然凝集による誤差の問題も生じ
ず、自然凝集が進行中のものも測定対象とでき、再現性
が高い。

なお、式(1)の計算は、計算機を用いて自動車に、また
手動で行うほか、筆算で行ってもよい。

第２の発明の体液成分分析装置は、抗原抗体反応ずみの
試料液を送出する試料液送出手段と、この送出された試
料液を受入れて試料液中の粒子を列状に通過させる検出
管と、この検出管に投光し粒子による散乱光を受光して
粒子通過およびその通過粒子の大きさを検出する粒子検
出手段と、この粒子検出手段による検出信号をその大き
さ（凝集数）別に弁別する弁別手段と、弁別した粒子大
きさの信号の数を計数する計数手段と、粒子大きさ別の
信号数に基づき式(1)から凝集率Ｙを算出する演算手段
と、その算出結果を表示する表示手段とを備えたもので
ある。

この場合、全系が自動化されているので、測定精度が高
いこともさることながら、とりわけ極めて迅速な処理が
行えるという利点がある。

第３の発明の体液成分分析装置は、第２の発明におい
て、粒子検出手段による検出信号を対数的に増幅する増
幅手段を付加し、この増幅手段による増幅信号を弁別手
段によりその信号の大きさ（凝集数）別に弁別させるよ
うに構成したものである。

すなわち、通常のリニアな増幅手段を用いた場合には、
２個凝集，３個凝集・・・と進むにつれて振幅中心と振
幅のばらつきが対数的に広がるため（第３図参照）、凝
集数（信号大きさ）別の比較が困難となる。この対策と
してこの第３の発明の対数的増幅手段を採用すると、そ
の広がりが抑えられ、振幅中心と振幅とについて凝集数
別で均一化が図られるため（第４図参照）その比較が容
易，正確に行われ、これによって、測定精度を一層高い
ものにできる。

実施例の説明体液成分分析装置の一実施例を第１図ないし第６図にお
いて説明する。この体液成分分析装置は、第１図に示す
ように、試料液移送と粒子検出機能をもつ粒子検出ブロ
ックＡと、ノイズ除去と関数増幅機能をもつ信号処理ブ
ロックＢと、パルス振幅弁別とパルス計数表示機能をも
つデータ処理ブロックＣとからなる。

粒子検出ブロックＡは、 (1)気泡抜き用電磁弁２を有する検出管１と、検出管１
に計数試料液を圧入するように管接合され、撹拌用モー
タ３と恒温装置４とを備えた反応タンク５と、抗体ある
いは抗原を付着処理したポリスチレンラテックス粒子の
浮遊液をタンク５内に注入するよう管接合されたシリン
ダ６と、検出管１内で計数試料液をシース状（鞘状）に
包んで流すためのシース液を圧入するよう管接合された
シース液タンク７と、シリンダ６のピストンを駆動する
ＤＣモータ１８と、試料液，シース液を直接あるいは一
段調圧器８を通して圧送するためのポンプ１７と、この
モータ１８，ポンプ１７などをコントロールする制御回
路１９よりなる駆動制御装置９からなる試料液送出手段
Ｄ（タンク５，シリンダ６およびシース液タンク７の各
液を補充する弁とパイプは図示を省略）および、 (2)前記検出管１の中心を一列に流れる粒子に、流れ方
向１０μｍ，直角方向３００μｍの楕円集束光を照射す
るための発光用半導体レーザ（レーザ発生器）１１と、
シリンドリカルなレンズ系１２と、透過光を遮断するビ
ームストッパ（遮光手段）１３と、粒子散乱光を導くレ
ンズ系１４と、迷光遮光板１５と、粒子散乱光を受光し
電気信号に変換するフォトダイオード（光電変換手段）
１６とからなる光学式粒子検出手段Ｅから構成されてい
る。

信号処理ブロックＢは、微小信号増幅回路（アンプ）２
１と、パルス信号をクランプ，クリップするレーザノイ
ズ除去回路（リミッタ）２２と、切換スイッチＳｗによ
って切換えられるリニア増幅器２３ａと対数（ログ）増
幅器（対数的増幅手段）２３ｂからなる関数増幅回路２
３と、フィルタ，バッファよりなる出力回路２４から構
成されている。

データ処理ブロックＣは、パルス振幅弁別回路（すなわ
ち、粒子大きさ（凝集数）の弁別手段）２５と、弁別し
た粒子大きさ別の信号の数を計数する手段Ｆ、粒子大き
さ別の信号数から凝集率を算出する演算手段Ｇ、この算
出された凝集率から試料液濃度を算出する演算手段Ｈ、
および、前記粒子検出ブロックＡの駆動制御回路１９を
凝集数１の粒子（モノマー）の単位時間当たりの計数値
の減少，増加に応じて試料液送出し量を増加，減少する
ように制御する制御手段Ｉなどを内蔵したマイクロコン
ピュータ２６と、粒子大きさ別の信号の数，凝集率，試
料液濃度などのデータをアナログ的またはディジタル的
に表示するための表示回路２７、および、前記のデータ
を印字するための印字回路２８とからなる広義の表示手
段Ｊとから構成されている。

被検査血清を緩衝液（Ｔ．Ｔ．Ｂ：トリストリンシンバ
ッファ）で希釈して（Ｉｇ−Ｇの場合４万倍）、抗体を
付着処理したポリスチレンラテックス（０.２〜５μｍ
直径）を懸濁したラテックス粒子液（Ｌ・Ｐ液０.０１
％）と混合し、恒温装置４付きの反応タンク５に入れ、
モータ３でスクリューを回して沈降を防ぎ、凝集を助長
するために撹拌を行う。

混合と同時にポンプ１７により０.３kg／cm²程度の陽圧
をかけ、調圧器８を通じシースタンク７にも陽圧をか
け、シース液（０.８％生理食塩水）と凝集サンプル液
（反応タンク５内液）を検出管１に圧送する。

検出管１は、反応タンク５からの凝集サンプル液を中心
にシース液が周囲を鞘状に包み５ｍ／sec程度の速さで
流れるようにセットされている。上部に気泡抜き用電磁
弁２を設け、シース方向を重力方向にしている。これは
シース形成口の気泡付着を避け、シース流の形成に気泡
が影響しないようにするためである。また、シース液が
乱れ（形成損ない）、粒子が検出管１内に残ったとして
も、ラテックス粒子は比重がシース液より僅かに重いた
め、逆向き時のように検体が代わっても底に粒子が残留
することなく速やかに排出され、したがって、コンタミ
（汚染）が生じない。

検出管１内のシース流形成によって粒子はほぼ一列に連
なった状態で、半導体レーザ１１の光がシリンドリカル
レンズ系１２によって集束された焦点（粒子流れ方向に
短径１０μｍ、長径は直角方向に３００μｍの楕円状）
の中を高速に通過する。受光側は顕微鏡の暗視理法の原
理で、粒子のない時はビームストッパ１３で遮光される
ため受光出力がなく、粒子が通過すると散乱された光が
迷光遮光板１５を経てフォトダイオード１６に受光され
る。

発光源の半導体レーザ１１は従来のＨｅ−Ｎｅレーザと
比べ、形状，価格とも機器組込用に最適であるが、レー
ザノイズが多い欠点があるので実用には工夫を要する。
本装置では、受光光軸を粒子の流れる方向と直角とし、
発光光軸を受光光軸と６度角度をずらすことによって発
光の一部が反射して戻ることを防ぎ、戻り光によって雑
音が誘起され雑音が増すことのないように反射による戻
り光を避けている。

第２に、直進光のノイズ成分は信号に比べてはるかに強
大であるので、先頭の受光レンズ１４ａ上のレーザ光直
進光の当たる光軸下半分、つまり半導体レーザ１１の存
在側とは反対側の半分を、第２図のように遮光するビー
ムストッパ１３で、粒子が無い時は受光面に一切光が入
らないようにしている。この結果、直進光のノイズ成分
による誤差を避けることができ、測定精度を高めること
ができる。

第３に、粒子からの散乱光以外の色々の角度からの迷光
を遮断し粒子による散乱光のみを通すための０.４mm直
径のピンホールを有する迷光遮光板１５を設けている。

第４に、なお残留する散乱光のノイズ成分は、周波数の
低い誘導波を除去し、信号のベース電圧を定電圧にクラ
ンプした後、ベース電圧上に重畳したノイズをクリップ
するレーザノイズ除去回路（リミッタ）２２を使うこと
でノイズ問題を解決している。

フォトダイオード１６の出力は、信号処理ブロックＢの
増幅回路２１で６０ｄＢ増幅され、レーザノイズ除去回
路２２でノイズを除去された後、リニア増幅器２３ａを
通して増幅後の波形を、横軸にパルス振幅、縦軸に粒子
数（パルス頻度）を取って表現したものが第３図であ
る。リニア増幅器２３ａの代わりに対数（ログ）増幅器
２３ｂを通した後の波形を同じように表現したものが第
４図である。

２個凝集，３個凝集と進むにつれて振幅中心と増幅のば
らつきが対数的に広がることが判る。同じ弁別処理をし
て２個凝集，３個凝集・・・の凝集モード別の比較が困
難となる。本装置では対数増幅器２３ｂを使用すること
によってこの問題を解決している。

弁別回路２５では隣接凝集モード電圧のピーク値を与え
る２電圧の中間に弁別電圧を設定し、各弁別電圧で弁別
されたパルスを隣接２弁別電圧毎にエクスクルーシブオ
ア回路を通し、各出力を凝集モード別計数値として計数
し、マイクロコンピュータ２６に送る。

マイクロコンピュータ２６は弁別回路２５から未凝集
（モノマー），２個凝集（タブレット），３個凝集（ト
リプレット），４個凝集，５個以上凝集，ラテックス以
外の計数値（サテライト）の６モードパルス列信号を受
け、所定のカウンタ（計数手段Ｆ）で所定のゲート時間
（５秒）内の計数を行う。

次に、演算手段Ｇにより凝集率として次の値を演算し、
結果を所定記憶部に送る。

Ｙ＝（Ｐ_２＋Ｐ_３＋Ｐ_４＋Ｐ_５）／ＴＸ：凝集率、Ｔ：粒子総数（検出された全パルス数）、
Ｐ_２：ダブレット数、Ｐ_３：トリプレット数、Ｐ_４：４
個凝集数、Ｐ_５：５個以上凝集数第５図および第６図の（Ａ）ないし（Ｃ）は、記憶部の
データから最終結果としての濃度計算までをフローチャ
ートと検量線の取り方とで示したものである。

すなわち、ステップで、時刻０での凝集率（自然凝集
率）を測定・算出し、ステップで、時刻ｔ_１での凝集
率を測定算出し、ステップで、時刻ｔ_２での凝集率を
測定・算出し、以降同様のことをくり返してステップ
で、時刻ｔ_ｎでの凝集率を測定・算出する。以上の結果
として、ステップで、凝集成長曲線を求める〔第６図
（Ａ）参照〕。次いでステップで、自然凝集を減じて
真の成長曲線を求める。〔第６図（Ｂ）参照〕。ステッ
プでは、測定項目（蛋白質の種類）で最もＳ／Ｎ比の
良い時刻Ｔでの凝集率を既知の標準の凝集率と比較す
る。そして、ステップで、既知の蛋白質濃度と凝集率
との相関関係から、ステップで求めた凝集率に基づい
て求めるべき蛋白質濃度に変換する〔第６図（Ｃ）参
照〕。上式による演算は再現性が高いものである。

また、モノマー数を次のように一定にして検量線の直線
性を改善し、測定濃度幅を拡大することができる。ま
た、誤差混入の発見に役立つ。すなわち、モノマーパル
ス列信号を積分回路を通してアナログ電圧としパルス数
が減るとモータ１８が速く回転するように制御手段Ｉか
ら制御回路１９へフィードバックを行う。

あるいは、反応タンク５にかかる移送圧を、制御回路１
９のポンプ用圧力センサのバイアスを変化させることに
よって前記モノマー数の減少に応じて高くし、検出管１
の試料液量とシース液量の比を連続的に変化させること
ができる。それによって、試料液の移送量を増して見か
け上凝集反応速度を早め、凝集成長曲線をより直線的に
することができる。

なお、印字回路２８，表示回路２７への出力型式の一例
をあげると、ＡＦＰ（α−フェトプロティン）：２ｍｇ／ｍｌ，ＣＥＡ（ガン胎児性抗原）：０.５μｇ／ｍｌ，Ｉｇ−Ｇ（免疫グロブリンＧ）：１０ｍｇ／ｍｌなどで
ある。

上記実施例には下記の事項が含まれている。

関数増幅回路２３が、スイッチにより切換えられるリ
ニア増幅器２３ａと対数増幅器２３ｂを含むものに構成
されている。

光学式粒子検出手段Ｅが、発光光軸と受光光軸との間
に角度をもたせてあり、また、発光レンズ１４ａにビー
ムストッパ１３を設けたものに構成されている。

マイクロコンピユータ２６の制御手段Ｉから粒子検出
ブロックＡの駆動制御回路１９にフィードバックをかけ
て、粒子モノマー数減少時に試料液送出し量を増加させ
ることによりモノマー数を一定に保ち検量線の直線性を
改善している。

第２の発明の実施例として、上記〜のうちの何れ
も、あるいは何れか２つまたは１つを含まないものが考
えられる。

第３の発明の実施例として、上記，のうち何れか１
つまたは両方を含まないものが考えられる。また、に
おいてスイッチＳｗとリニア増幅器２３ａを除いたもの
が考えられる。

また、方法の発明である第１の発明に関しては、粒子検
出手段は光学式のものに限らないし、試料液の流し方も
第１図のものに限定されない。また、凝集率Ｙの自動演
算も限定するものではない。もちろん、上記〜の有
無も問題とならない。

発明の効果体液成分分析方法に関する第１の発明は、粒子１つずつ
について凝集程度のデータを得ることを基本においてい
るため、測定精度を極めて高いものとできるという効果
を有する。

また、第１の発明は、粒子総数を分母として凝集率を算
出しているので、凝集率が０から１までの範囲に収ま
り、ポリマー数を分母として凝集率を算出する場合のよ
うに、凝集率が無限大に発散することがない。したがっ
て、例えば腫瘍マーカ等を測定する場合には、他の検査
よりもきわめて幅の広いダイナミックレンジが要求され
るが、本願の場合には凝集率が０から１の範囲に収ま
り、ポリマー数を分母として凝集率を算出する場合に比
べて測定誤差の影響を受けにくく、抗原または抗体の量
を精度よく測定できる。

特に、高濃度の検体においては、凝集率の求め方の違い
が測定精度の差として大きく現れることになり、本発明
のように、粒子総数を分母にすることがポリマー数を分
母にするのに比べて有効である。

また、体液成分分析装置に関する第２および第３の何れ
の発見も、測定を極めて高精度かつ迅速に遂行すること
ができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は体液成分分析装置の一実施例の構成概念図、第
２図はその遮光手段の正面図、第３図および第４図はパ
ルス振幅と粒子数との相関グラフ、第５図はフローチャ
ート、第６図の（Ａ），（Ｂ）は凝集成長曲線のグラ
フ、第６図の（Ｃ）は蛋白質濃度と凝集率との相関グラ
フである。１……検出管、１１……半導体レーザ、１４ａ……受光
レンズ、１３……ビームストッパ、１６……フォトダイ
オード、２３ｂ……対数増幅器（対数的増幅手段）、２
５……弁別回路、Ｄ……試料液送出手段、Ｅ……粒子検
出手段、Ｆ……計数手段、Ｇ……演算手段、Ｉ……制御
手段、Ｊ……表示手段

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】体液中に含まれる抗原もしくは抗体と特異
的に反応する抗体もしくは抗原を付着した不溶性担体を
含む試薬と試料を混合して抗原抗体反応を起こさせる過
程と、前記抗原抗体反応ずみの試料液を流しながらこの
試料液に含まれている粒子についての凝集程度別の粒子
数を求める過程と、式（ただし、ｎは凝集数、Ｐ_ｎは凝集数ｎの粒子の数、Ｔ
は粒子総数、ｋは２以上の任意の自然数）から凝集率Ｙ
を求める過程とを含む体液成分分析方法。
【請求項２】抗原抗体反応ずみの試料液を送出する試料
液送出手段と、この送出された試料液を受入れて試料液
中の粒子を列状に通過させる検出管と、この検出管に投
光し粒子による散乱光を受光して粒子通過およびその通
過粒子の大きさを検出する粒子検出手段と、この粒子検
出手段による検出信号をその大きさ（凝集数）別に弁別
する弁別手段と、弁別した粒子大きさ別の信号の数を計
数する計数手段と、粒子大きさ別の信号数に基づき式（ただし、ｎは凝集数、Ｐ_ｎは凝集数ｎの粒子の数、Ｔ
は粒子総数、ｋは２以上の任意の自然数）から凝集率Ｙ
を算出する演算手段と、その算出結果を表示する表示手
段とを備えた体液成分分析装置。
【請求項３】抗原抗体反応ずみの試料液を送出する試料
液送出手段と、この送出された試料液を受入れて試料液
中の粒子を列状に通過させる検出管と、この検出管に投
光し粒子による散乱光を受光して粒子通過およびその通
過粒子の大きさを検出する粒子検出手段と、この粒子検
出手段による検出信号を対数的に増幅する増幅手段と、
この増幅手段による増幅信号をその大きさ（凝集数）別
に弁別する弁別手段と、弁別した粒子大きさ別の信号の
数を計数する計数手段と、粒子大きさ別の信号数に基づ
き式（ただし、ｎは凝集数、Ｐ_ｎは凝集数ｎの粒子の数、Ｔ
は粒子総数、ｋは２以上の任意の自然数）から凝集率Ｙ
を算出する演算手段と、その算出結果を表示する表示手
段とを備えた体液成分分析装置。