JP2000503404A

JP2000503404A - 基準微小粒子を使用する検定

Info

Publication number: JP2000503404A
Application number: JP10521688A
Authority: JP
Inventors: スティール，ジェイムズ，エス．; ボドゥナー，アン，ジェイ．; コチャー，マニシュ，エス．; フォード，グレン，エム．; ハフ，ジョン，ピー．
Original assignee: シーナ・バイオテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-11-04
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2000-03-21
Also published as: CA2240293A1; EP0890102A4; WO1998020351A1; AU5165698A; US5858648A; AU724443B2; EP0890102A1

Abstract

(57)【要約】サンプルにおける少なくとも１つの被検体の存在を測定する検定方法が開示されており、この検定方法は、（ａ）サンプルを、第１の被検体に結合する結合分子が配置されている所定量の第１の試験微小粒子と混合して、反応混合物を形成するとともに第１の結合分子を第１の被検体と結合させる工程と、（ｂ）未反応の第１の試験微小粒子および基準微小粒子を計数する工程と、（ｃ）未反応の第１の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより第１の試験値を確立して、サンプルにおける第１の被検体の存在を測定する工程とを備える。好ましい実施の形態においては、第１の試験値は非反応のサンプルの対照値と比較され、変化値を算出する。更に、微小粒子を含む組成物とキットが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】基準微小粒子を使用する検定技術分野本発明は、診断の分野、より特定すると、検定により所定の流体中の問題の被検体の存在を検出する技術に関する。背景技術凝集反応は、種々のバクテリア、細胞面抗原、血清蛋白およびその他の臨床上重要な被検体の定性および定量検定に長い間使用されてきた。凝集は、抗体と問題の抗原との反応により種々の方法で検出されおよび／または測定される凝集体を形成することにより行われる。典型的な凝集検定フォーマットにおいては、（通常「ラテックス」("latex")として知られる）ポリスチレン微小粒子(micropar ticles)のような粒子に問題の抗原と結合する物質がコーティングされ、コーティングされた粒子を血液その他の体液のようなサンプルと混合する。粒状抗原によっては、相互作用により粒子が互いに凝集する場合もあり、あるいは凝集を妨げる場合もある。いずれの場合においても、粒子が体液と反応した後に存在する凝集粒子の数が、存在する抗原の量を示す。同じタイプの反応が、抗体と結合する対応する抗原の添加により引き起こされる凝集反応により特定の抗体を検出するのに利用されている。数多くの粒子ベースの免疫検定が、放射化学標識のような従来の診断方法学に関連する問題を避けながら抗原−抗体反応の特異性を活用するために開発されてきた。例えば、混濁度測定法および比濁法は、凝集溶液における多くの粒子から散乱される光を監視している。前者の技術は、粒子凝集体の懸濁液における光の透過を測定するものであり、後者の技術は、特定の方向へ散乱される光を直接測定するものである。これらの方法は、分離工程を必要としないという利点を発揮するが、サンプル中の１つの被検体の分析にのみ有効であると認識されている。サイズの異なる粒子を使用して前方に散乱される光を測定することにより、凝集体の形成または非凝集の程度を感知する光学流動粒子分析器を使用した幾つかの凝集検定が開発されている。サンプルにおける被検体の存在および／または量は、凝集の程度または未反応もしくは未凝集の粒子の数を測定することにより定められている。Masson等の米国特許第４，２７９，６１７号に開示されている凝集検定は、液体サンプルを、問題の抗原または抗体と結合して錯体を形成する第１の粒状試薬と混合する工程と、次いで、この混合物に、錯体に結合して凝集体を形成するが、遊離の第１の粒状試薬とは結合しない第２の別の粒状試薬を添加する工程とを含む。抗原または抗体の存在または量は、未凝集の第１または第２の粒状試薬を検定することにより測定される。かくして、この’６１７特許においは、定性検定を行うには、反応混合物において遊離状態にある第１の試薬粒子の数を計数し、次に、得られた結果を第１の工程において加えたかかる粒子の数と比較することが必要となるだけであると記載されている。Meth．Enzymnol.、第７４巻、第１０６−１４１頁（１９８１年）に掲載の、その後に公表された論文において、Masson等は、サンプル中に存在する被検体の存在を示すものとして遊離の即ち未反応の粒子の数を計数する凝集検定を説明するために頭字語であるＰＡＣＩＡ［particle counting immunoassay（粒子計数免疫検定）］を創出している。Massonは、全ての他の粒子を除外して、あるサイズ範囲内の未凝集粒子だけから前方へ散乱される光を測定するのに、オートカウンタ(AutoCounter)を使用している。しかしながら、ＰＡＣＩＡ法は、特に非特異凝集反応およびリウマチ因子干渉により引き起こされる不正確性により、使用が制限されてきた。An n．Clin．Biochem.、第２９巻、第２２−４２頁（１９９２年）に掲載のNewman 等の論文およびJ．Immunol．Meth.、第２８巻、第２５−３２頁（１９７９年）に掲載のLimetの論文を参照されたい。 Cambiaso等の米国特許第４，１８４，８４９号にも、互いに凝集するが、検定されている特定の抗体または抗原により凝集を抑制することができる２つの粒状試薬とサンプルを混合することにより、液体における抗体または抗原の存在を検出するようにした、凝集検定におけるオートカウンタのような光学計数系の使用が教示されている。サンプルに散在する抗原または抗体の量は、凝集または非凝集の程度を定めることにより測定することができ、後者は未凝集粒子を単に計数することによりまたは識別ラベルを使用することにより行われる。 UzgiriS等の米国特許第４，１９１，７３９号は、第１の所定のサイズを有する粒子だけを第２の所定のサイズを有する粒子と凝集させることにより形成される所定のサイズを有する粒子の多重線(multiplet)を、抵抗パルス分析により検出することにより、サンプルにおける蛋白質の存在を測定する凝集検定に関する。この方法は、非特異的に形成される多重線の初期の分布を示すことにより検定の精度を高めようとするものである。 Cohen等の米国特許第４，８５１，３２９号は、凝集粒子のクラスタサイズ分布を光学パルス粒子サイズ分析により測定する凝集検定に関する。標準定量関係は、粒子モノマの数に対する粒子ダイマの数の比率を測定することにより、あるいは既知の濃度の被検体の所定の連続する希釈体におけるクラスタサイズ分布を測定することにより確立することができる。これらの検定方法は、単一の被検体の分析に限定される。従って、所定のサンプルにおける複数の被検体を同時に分析することができるとともに、検定の結果に及ぼす希釈誤差、計測の不備などの影響を少なくして精度を一層向上させることができる凝集検定が依然として待望されている。発明の概要本発明の一の観点によれば、サンプルにおける被検体の存在を測定する検定方法が提供されており、この方法は、（ａ）サンプルと、被検体に結合する結合分子(binding molecule)が配置されている所定の量または比率の試験微小粒子と、被検体および結合分子とは非反応性の基準微小粒子(reference microparticle)とを混合して、液体反応混合物を形成するとともに結合分子を被検体と結合させる工程と、（ｂ）基準微小粒子と未反応試験微小粒子(non-reacted test microparticle) を計数する工程と、（ｃ）未反応の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することによりサンプルにおける被検体の存在を測定することができるように試験値を確立する工程とを備えている。好ましくは、この検定方法はまた、（ｄ）試験値を被検体を含まない非反応サンプル(non reactive sample)の対照値(control value)と比較する工程を含み、この場合には、サンプルにおける被検体の存在は、変化値(change value)を試験値および対照値から算出することにより測定する。より好ましい実施の形態においては、試験値は、未反応の試験微小粒子の数と反応後の工程（ｃ）において見出される基準微小粒子の数との比である。工程（ｄ）において見出される対照値は、未反応の試験微小粒子と、非反応サンプルと同じ手順を用いて得られる基準微小粒子の数との比である。かくして、対照値は、「対照比」("control ratio" )と云うことができ、試験値は「試験比」("test ratio")と云うことができる。変化値は、対照比と試験比との差を得て、この差を対照比で除することにより算出することができる。この結果は、百分率で表すことができる。より好ましい実施の形態においては、変化値は、対照比を試験比で除することにより算出され、この結果もまた百分率として表すことができる。本発明のこの観点に係る方法は、有意の利点を発揮する。試験値と対照値は、特定のサイズ範囲にある特定の凝集体の形成ではなく、非凝集粒子の損失を示しているので、大きなあるいは小さな凝集体の形成を原因とする不正確性を実質上なくすことができる。更に、試験値と対照値は、上記した試験比と対照比のような、非凝集試験微小粒子の数と不活性基準粒子の数との関係として計算されるので、反応混合物の希釈における不正確性と粒子計数の不正確性による誤差もまたなくすことができる。この方法はまた、各タイプの試験粒子の分離を高めることができるので、複数の同時試験を行うことができる。更に、本発明は、粒子の大きな凝集体の計数において固有の不正確性を少なくすることができる。基準微小粒子はまた、計測と検定方法自体の双方に関して全体的なオンボード診断として機能するので、本発明の検定の精度を高めることができる。検出される微小粒子のヒストグラムの幅または割合のような、基準微小粒子が発生する応答の質は、系の流体（例えば、詰まり）、電気または光学的な特徴に関連する系統的な乱れを示すことができる。所定の任意値を越える微小粒子の凝集、例えば、二量化、三量化などは、試験微小粒子の非特異的な結合を示すことができる。基準微小粒子はまた、計数される速度の関数として希釈精度を高めることができる。更に、基準微小粒子は、系のドリフトのような現象を識別しあるいは示すことができる。本発明の別の観点は、サンプルにおける少なくとも２つの被検体の存在を測定する検定方法が提供されており、この方法は、（ａ）サンプルを、所定の量または比率の、第１の被検体に結合する第１の結合分子が配置されている第１の試験微小粒子、第２の被検体と結合する第２の結合分子が配置されている第２の試験微小粒子並びに第１と第２の被検体および第１と第２の結合分子とは非反応性の基準微小粒子と混合して、反応混合物を形成するとともに、第１の結合分子を被検体と結合させかつ第２の結合分子を第２の被検体と結合させる工程と、（ｂ）未反応の第１の試験微小粒子、未反応の第２の試験微小粒子および基準微小粒子を計数する工程と、（ｃ）未反応の第１の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより第１の試験値を確立するとともに、未反応の第２の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより第２の試験値を確立して、サンプルにおける第１と第２の被検体の存在を測定する工程とを備えている。本発明のこの観点に係る方法は更に、第１の試験値を（第１の被検体を含まない）非反応サンプルの第１の対照値と比較して第１の被検体の存在を測定するとともに、前記第２の試験値を（第２の被検体を含まない）非反応サンプルの第２の対照値と比較して第２の被検体の存在を測定する工程（ｄ）を含むのが好ましい。この検定方法は、単一のサンプルの複数の被検体の同時分析を行うことができるとともに、上記した利点を発揮することができる。３つ以上の被検体を測定しようとする場合には、更なる試験微小粒子が使用される。本発明の更に別の観点によれば、サンプルにおける被検体の存在を測定する検定において使用するキットが提供されている。このキットは、（ａ）被検体に結合する結合分子が配置された試験微小粒子と、（ｂ）被検体、試験微小粒子および結合分子とは非反応の基準微小粒子とを備え、試験および基準微小粒子は前記キットの各反応容器に所定の量または比率で存在する構成に係る。更に、サンプルにおける複数の被検体の存在を測定する検定において使用するキットが提供されており、このキットは（ａ）第１の被検体に結合する第１の結合分子が配置された第１の試験微小粒子と、（ｂ）第２の被検体に結合する第２の結合分子が配置された第２の試験微小粒子と、（ｃ）第１および第２の被検体と第１および第２の結合分子とは非反応性の基準微小粒子とを備え、第１と第２の試験微小粒子と基準微小粒子は前記キットの各反応容器に所定の量または比率で存在するように構成されている。好ましい実施の形態においては、微小粒子は、乾燥された形態で提供され、サンプルとの混合を容易にするように適宜包装される。例えば、各乾燥された微小粒子の所定量を複数の溜めを有する封止された容器の溜めに別々に入れることができ、溜めに流体サンプルを添加すると、乾燥された微小粒子の再構成(reconst itution)と反応混合物の形成が行われ、被検体と各結合分子との特異の結合反応が生ずる。乾燥された微小粒子はまた、サンプル流体との接触により再構成することができる組成物の形態で混合物として提供することもできる。本発明の検定方法は、風疹、単純庖疹ウイルス（ＨＳＶ）、梅毒、サイトメガロウイルスおよびトキソプラズマに特異の抗体のような種々の被検体の存在を測定するのに有利に実施することができる。血液、並びに、その他の血清、血漿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿および固形分からの溶出液のような体液をはじめとする種々のサンプルを検定することができる。図面の簡単な説明図１は、本発明の好ましい実施の形態を実施することができる複数の溜めを有する容器の横断面図である。発明を実施するための最良の形態本発明は、問題の被検体の存在を検出するサンプル検定に関する。本明細書において使用されている「サンプル」("sample")なる語は、血液、血漿、血清、唾液、ＣＳＦおよび尿、並びに、その他の、問題の被検体を含むと考えられる流体、細胞または物質を含むものである。「細胞」("cell")とは、身体器官その他の組織、例えば、細胞懸濁体を得ることができる腫瘍から得られるサンプルを意味する。「被検体」("analyte")とは、特定の結合部材（即ち、被検体に結合する結合分子）が存在し、あるいは特定の結合部材を得ることができかつ検定においてこの特定の結合部材と結合する物質を意味する。代表的な被検体には、抗原、ハプテン、抗体およびこれらの組み合わせが含まれ、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、核酸およびこれらの代謝産物を含む。本発明に従って検出することができる問題の抗体、抗原または核酸には、結合分子との接触または反応により凝集を行うことができる抗体、抗原または核酸を含み、特に、生物学的サンプルにおける存在が炎症状態または疾病状態を示す抗体および抗原が含まれる。抗体には、例えば、ＨＳＶＩ抗体(anti-HSV I antibody )、梅毒抗体(anti-syphilis antibody)、サイトメガロウイルス抗体(anti-cytom egalovirus antibody)、トキソプラズマ抗体(anti−toxoplasma antibody)、真菌抗体(anti−fungal antibody)、寄生虫抗体およびＨＩＶ抗体が含まれる。問題の抗原には、例えば、ＴＳＨ、ＨＣＧ、Ｔ₄のようなホルモン、薬剤および微生物、例えば、バクテリア、ウイルスおよびプロトゾア並びにこれらの抗原フラグメント、例えば、ＨＢｓＡｇが含まれる。「ハプテン」("hapten")とは、単独ではほ乳類において抗体応答を形成することはできないが、それ自体で抗原性を有する物質と結合されたときに、抗体をつくることができるとともに抗体と反応することができる低分子量の生理学的に活性な物質を云う。代表的なハプテンには、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲストゲン、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、生理学的に活性なアミン、薬剤等が含まれる。「被検体に結合する結合分子」("binding molecule which binds the analyte")とは、対をなす分子の一方が、化学的または物理的手段を介して、第２の分子と特異的に結合し、かつ、その他の物質と無視しうる相互反応性を呈する特異結合対の部材を云う。代表的な結合分子には、抗原、抗原フラグメント、受容体、核酸、多クローン性または単クローン性抗体およびこれらのフラグメントまたは錯体が含まれる。所定の被検体に特有のかかる結合分子は、商業的な供給源から得ることができ、あるいは通常の手順に従って得ることができる。本発明の検定を行うには、被検体に結合する結合分子が配置されている微小粒子（以下、「試験微小粒子」という）並びに被検体および結合分子に対して不活性な、即ち、被検体および結合分子と非反応性の微小粒子（以下、「基準微小粒子」という）を提供することが先づ必要となる。試験微小粒子は、結合分子、例えば、抗原または抗体を配置させることができる天然または合成の材料からつくることができる。かかる材料即ち物質には、ガラス、アクリルアミドまたはメタクリルアミド、ナイロン、微細な酸化物粉末、ラテックス重合体材料およびこれらの磁性誘導体、例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルおよびポリブタジエン並びにこれらの誘導体およびコポリマのようなオレフィン系不飽和モノマのポリマ（例えば、１９８４年にインディアナポリスに所在するセラゲン(Seragen) から発行されたBangs，L.B.著の「均一ラテックス粒子(Uniform Latex Particle s)」および米国特許第４，３０５，９２５号参照）、デキストラン、セルロースおよびこれらの誘導体、更には赤血球細胞、花粉、リポソームおよびバクテリアのような天然の粒状物質が含まれる。基準粒子は、試験粒子と同じ物質から、あるいは異なる物質からつくることができる。更に、基準粒子は、試験粒子に配置される結合部質および被検体に対して実質上不活性（即ち、非反応性）でなければならない。基準粒子は、化学処理のような公知の処置に従って不活性にすることができる。基準粒子の好ましい材料は上記した通りである。好ましい実施の形態においては、試験および基準微小粒子の化学組成および／またはサイズは、これらの微小粒子が検出器の感度レベルで、末反応（即ち、未凝集）の試験微小粒子と基準微小粒子とが計数される所定の態様で、互いに分離することができる(resolvable)ように選定される。しかしながら、均一な検出器応答を発生することができる他の特性または測定可能な特性であっても、本発明の検定において使用する微小粒子を選定する適宜のかつ信頼性のある基準を提供するものである。好ましくは、試験微小粒子と基準微小粒子はそれぞれ、均一なサイズを有する。電子的および種々の光学的計数方法の場合のように、粒子のサイズによって異なる粒子に分離する(resolve)技術により粒子を計数しようとする場合には、試験粒子と基準粒子は異なるサイズにすべきである。更に、所定のサンプルにおける複数の被検体の存在を同時に検出する凝集検定の場合のように、幾つかの異なる試験粒子が使用される場合には、異なるサイズにすることができる。一般に、キャリヤ微小粒子のサイズは約０．１μ乃至約２０μの範囲にあり、一方、基準微小粒子のサイズは約０．１μ乃至約２０μの範囲にある。これらのサイズ範囲はまた、使用される計数技術および結合分子の特性にも依存する。光学計数技術を利用する検定でも、それぞれの屈折率に基づいて試験微小粒子と基準微小粒子とを分離しあるいは区別することができる。異なる組成の粒子が異なる方向へ別々に光を散乱させることは周知となっている。１９６９年にニューヨーク州に所在するアカデミックプレス(Academic Press)から発行されたM．Kerke r著の「光その他の電磁輻射線の散乱(The Scattering of Light and Other Elec tromagnetic Radiation)」およびHansen等の米国特許第５，３６９，０３７号を参照されたい。結合分子は、物理（受動）吸収、簡易（強制）吸収および共有結合のような標準的な技術に従って試験微小粒子に配置することができる。例えば、結合分子は、蛋白質を取着可能な化学官能基を用いて改質することにより、試験微小粒子の表面に共有結合させることができる。米国特許第４，０６４，０８０号には、末端アミノフェニル基を有するスチレンポリマとこれに結合されたタンパク質が開示されている。米国特許第４，１８１，６３６号には、水溶性活性剤を介して免疫学的に活性な物質に結合されるカルボキシル化ラテックスポリマが教示されている。米国特許第４，２１０，７２３号には、粒子表面に遊離のエポキシ基を有する直径が０．１５−１．５μｍのシェルコア(shell-core)ラテックスポリマが教示されている。米国特許第４，２６４，７６６号には、水溶性ポリヒドロキシ化合物が共有結合することができ、かつ、活性剤、例えば、カルボジイミドで処理すると、免疫活性剤に共有結合することができる、カルボキシル基およびアミノ基のような活性基を有するラテックスポリマが開示されている。更に、米国特許第４，５２１，５２１号および第４，３０５，９２５号を参照されたい。これらの特許に開示されている技術は、結合分子を試験微小粒子に取着するのに使用することができる。試験微小粒子がポリスチレンである好ましい実施の形態においては、粒子を安定にする硫酸塩帯電基を、粒子表面において、微小粒子の表面に結合分子を容易に配置（例えば、コーティングまたは吸着）させる、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン、アクリルアミドおよび重合カルボキシレート基のような種々の他の官能基により置換することができる。ワシントンＤ．Ｃ．２０００５に所在するヘルス・アンド・サイエンス・コミュニケーションズ(Health & Science Communications)発行（１９９０年）のSeamann G.V.F編集の「ラテックスをベースとする診断技術(Latex Based Technology in Diagnostics)」を参照されたい。結合分子をコーティングした試験微小粒子も商業的に入手することができる。試験微小粒子および基準微小粒子は、試験に容易に供することができるように一緒に包装するのが望ましい。好ましい包装体は、図１に示すようなカップである。カップ１０は、内面１３および外面１３’を有する壁１２により画成されている。カップ１０は、ポリプロピレン、ポリエチレンその他の熱可塑性材料のような不活性の重合体材料から形成するのが望ましい。内面１３の底部は、凹部または溜め１４および１６を有し、乾燥された試験微小粒子１４’および基準微小粒子１６’がそれぞれ収容される。カップは、取り外し自在または穿通自在のシール素子１９により閉止されており、シール素子は熱シールの金属フォイルその他の膜とすることができる。微小粒子は、乾燥後に溜めに入れることができる。より好ましくは、微小粒子はスラリとして別々の溜めに配給され、次いで、現場において溜めの中で乾燥される。溜めは、微小粒子を、乾燥前に互いに分離した状態に保持する。乾燥後に容器を取り扱う際には、微小粒子を互いに混合することができるが、かかる混合は、液体媒質がないので反応を誘起することはない。しかしながら、本発明のこの実施の形態は、かかる構成には限定されない。例えば別体をなす個々の溜めに配置されるべき個々の試験粒子および基準微小粒子を別々にする必要はない。検定は、凹部または溜めのない容器において行うのがより一層好ましい。更に、微小粒子は液体の形態で提供することができる。問題の被検体を含むと考えられるサンプルを、次に、所定量の被検体に結合する結合分子が配置された試験微小粒子および基準微小粒子と適宜の条件下で混合し、液体反応混合物を形成するとともに、結合分子と被検体との間で測定可能な反応を行わせる。サンプルがそれ自体で液体であるときには、微小粒子をサンプルに加えることができ、あるいはこの逆も行うことができる。あるいはまたは更には、サンプルと微小粒子を液体希釈剤、多くの場合には、水性希釈剤と混合することができる。好ましい実施の形態においては、反応は、図１に示す容器において行われる。反応を行わせるために、シール１９に穿通を行いまたはシールをカップのリップ１８から分離し、拡散あるいは攪拌または浸透のようなかき混ぜを適宜行いながら、試験しようとするサンプルを（所要の場合には水性希釈剤とともに）添加することにより微小粒子を再構成する。所要の場合には、再構成した微小粒子は音波処理される。測定可能な反応が進行する。この反応は、被検体の特性および使用されるサンプルと微小粒子の量に依存するが、一般には、約１分乃至約２時間の範囲にある。未反応の試験微小粒子と基準微小粒子が計数され、互いに比較されて試験値を確立する。本発明の好ましい実施の形態においては、これらの微小粒子は個々の粒子またはこれらの粒子の凝集体が電子または光学感知領域を個別に通過するときに粒子または凝集体のサイズを確認して粒子の凝集を検出する電子または光学流動粒子分析器（ＦＰＡ）に懸濁体を通すことにより、細胞測定法で(cytometri cally)計数される。電子タイプのＦＰＡは一般に、反応混合物を狭いオリフィスに通しかつ電気インピーダンスをオリフィスを介して測定することにより、反応混合物の電気インピーダンスを測定するようになっている。混合物中の液体が導電性でありかつ粒子が非導電性である場合には、オリフィスにおける電気インピーダンスは、粒子または粒子凝集体がオリフィスを通過するときに増大する。増加の程度は、微小粒子または凝集体のサイズと直接関係しており、異なるサイズの粒子を表す信号は互いに異なる。以下において述べるように、光学ＦＰＡは、個々の微小粒子の光散乱の種々の特性を測定することにより、粒子のサイズと微小粒子凝集体の形成を区別する。光学ＦＰＡの例が、米国特許第４，２７９，６１７号、第４，１８４，８４９号、第４，１９１９，７３９号、第５，２８６，４５２号、第５，３６９，０３７号および同時係属の共通の所有に係る米国特許出願第０８／４７３，１８７号に開示されている。光学ＦＰＡの使用、特に、米国特許第５，２８６，４５２号および第５，３６９，０３７号並びに米国特許出願第０８／４７３，１８７号に開示されているものを使用するのが好ましい。この実施の形態においては、未反応の試験微小粒子および基準微小粒子は、サイズおよび／または屈折率、蛍光あるいは吸光度に基づいて区別することができる。上記のように、異なるタイプの微小粒子および微小粒予の凝集体を計数する技術は周知であり、本発明のどの部分も形成するものではない。しかしながら、ＦＰＡを使用する粒子の計数および分類に関する以下の説明は、理解を容易にするためのものである。光学ＦＰＡを使用する本発明の検定は、反応混合物の細い流れを、レーザのような入射光源からの光線を照射したフローセル(flow cell)に通すことにより行われる。流動流の形状および光線の形状は、個々の微小粒子または個々の微小粒子凝集体が交互に光線を通過し、かつ、１つの微小粒子または凝集体だけが常に光線内にあるように選定される。各微小粒子または凝集体が入射光線を通過するときに各微小粒子または凝集体により散乱され、反射されまたは放出される光は、適宜のセンサにより検出され、各微小粒子または凝集体ごとに信号を発生する。個々の信号の特性は、異なるタイプの微小粒子および凝集体ごとに異なる。種々のタイプの微小粒子または凝集体は、特定のタイプの微小粒子または凝集体の代表として各信号を分類することにより計数される。例えば、光散乱ＦＰＡにおいては、各微小粒子または凝集体が発生する散乱光の強度は、粒子または凝集体のサイズおよび微小粒子または凝集体の屈折率と直接関係する。従って、ある強度範囲にある散乱光の信号は単独の未凝集試験微小粒子を示し、別の範囲の信号は未凝集基準微小粒子を示す。各範囲内の信号を計数することにより、反応混合物における末凝集試験微小粒子および未凝集基準微小粒子の数を計数することができる。更に別の強度範囲にある信号は、２つの試験微小粒子の凝集体（即ち、二量体）を示し、更に別の範囲にある信号は３つ以上の微小粒子の凝集体（即ち、三量体および多量体）を示す。更に別の強度範囲の信号は、２つの基準微小粒子の凝集体（即ち、二量体）を示し、別の範囲の信号は３つの基準微小粒子の凝集体（即ち、三量体など、一括して自己凝集体という）を表す。このようにして、試験微小粒子と基準微小粒子の数は、二量体および三量体のような自己凝集体の形態をなすこれらの微小粒子を計数することにより測定することができる。信号分類と計数処理は、各タイプの微小粒子から得られる光散乱の特定の特性（例えば、パルス波高）に基づいてヒストグラムのような統計分布を定めることにより行うことができる。ヒストグラムは、微小粒子の周波数分布を形成することにより、ＦＰＡにより検出される微小粒子の数とタイプの統計的な概要として機能する。本発明の好ましい実施の形態においては、ヒストグラムは、各照射された微小粒子が発生するパルスのピーク高さをアナログ／デジタル変換器によりデジタル化し、（例えば、ノイズによる誤ったトリガをなくすように）任意に確立された値よりも上にある（例えば、ボルトで表される）このようにデジタル化された各値をコンピュータプログラムに移すことにより形成される。この工程は、少なくとも１つのデータ収集サイクルを含む直接メモリアクセスのような適宜の収集スキームを使用して行うことができる。プログラムは、信号の数を、ボルトのようなデジタル化値の関数としてプロットする。パルス波高値の予期した拡がりを含む窓即ち範囲が、各タイプの微小粒子または凝集体ごとに画成される。収集スキームは、１つの窓ごとに所定数のカウントを確立するように変えることができる。より好ましい実施の形態においては、ヒストグラムが収集されると、異なる微小粒子集団が予め画成された窓を確立することにより、または自動的なピークの捜出と分類により識別される。ＦＰＡ操作と、粒子の分類および計数技術に関する上記説明は、単なる例示である。他のＦＰＡ技術として、蛍光粒子が放出する光または微小粒子が反射する光のような、散乱光以外の信号を利用するものがある。更に別の技術として、各粒子が放出する蛍光と、かかる粒子が散乱する光との関係のような、信号を区別する特性の組み合わせを利用するものがある。微小粒子を計数しかつ分類するこれら公知の技術は、いずれも利用することができる。次に、未反応試験微小粒子と基準微小粒子を画成する窓における計数（即ち、個々のデータ点）の合計を算出する。基準微小粒子の非特異凝集が生ずる程度まで、検定の精度を、かかる凝集体を計数しかつ各タイプの凝集体の個々の基準微小粒子に数を乗ずることにより更に高めることができる。次に、未反応の試験微小粒子の数を、基準微小粒子の数と比較して試験値を確立する。本発明の好ましい実施の形態においては、試験値は、未反応の試験微小粒子の数と基準微小粒子の数との比である。しかしながら、未凝集の試験微小粒子の数と基準微小粒子の数との差のような、これらの数に基づく他の試験値も使用することができる。好ましい実施の形態においては、試験値は、上記手順と同じ手順に従って定められる（被検体を含まない）非反応サンプルに関する対照値と比較され、更に変化値が試験値と対照値とから算出される。好ましい実施の形態においては、変化値は、（もとの所定の集団に対する）試験微小粒子の減少として算出される。試験値と対照値とが比であるこの好ましい実施の形態においては、変化比は試験比を対照比から減じ、この差を対照比で除し、１００を乗ずることにより算出される。本発明のより好ましい実施の形態においては、変化比は対照比を試験比で除することにより算出され、これにより、変化比は、サンプルに含まれる被検体の量が増加するにつれて増大する。変化値は、標準的な手順、例えば、公知の正および負のサンプルの試験に従って得られる限界値と比較することができる。例えば、変化値が上部限界値を越えている場合には、検定は正であると考え、流体サンプルにおける被検体の存在が確認される。逆に、変化値が下部限界値よりも下にある場合は、負の結果を示す。本発明の検定はまた、所定のサンプルにおける複数の被検体を検出するのに使用することもできる。この実施の形態に係る検定を行うには、測定されるべき各被検体に特有でありかつ互いに分離可能な試験微小粒子と、基準微小粒子とを所定の計数方法において提供することが必要となる。例えば、サンプル中の２つの被検体の存在を測定する検定の場合には、第１の被検体と結合する第１の結合分子が配置された第１の試験微小粒子と、第２の被検体に結合する第２の結合分子が配置された第２の試験微小粒子が配置された第２の試験微小粒子とを、基準微小粒子とともに提供することが必要となる。異なる未反応の各試験微小粒子の試験値は、同数の基準微小粒子に基づいて算出される。単一の被検体の測定の場合と同様に、多被検体検定の反応体は、乾燥粉末体またはタブレットに個別に処理され、あるいは一緒に混合物として処理されて組成物を形成することができる。あるいはまたは更に、反応体は、サンプルおよび液体希釈剤等のような任意の物質と混合したときに微小粒子を再構成し、かつ、結合分子と被検体との反応を行わせるのに適した容器を有することができるキットに包装することができる。サンプルの光学細胞測定分析(optical cytometric analysis)に関する上記した本発明の好ましい実施の形態においては、微小粒子または凝集体が生ずる散乱光のピーク高さは、未反応の試験微小粒子、基準微小粒子、試験微小粒子の凝集体などのような、特定のタイプに属する微小粒子または凝集体を分類する基準として使用される。パルス振幅、パルス幅、パルス振幅とパルス幅の積、積分されたパルス面積または同じあるいは異なる散乱角度におけるこれらのパラメータの一次または非一次関数をはじめとする他の光散乱特性も使用することができる。ＦＰＡを通過する各タイプの粒子が発生する光散乱信号は、前方方向へ低い角度（即ち入射光線の軸線から約３乃至約７度）で、約８５乃至約９５度（即ち、実質上側方散乱信号）で、または約９５乃至約１８０度（即ち、後方散乱信号）で測定することができる。しかしながら、より一般的には、本発明の検定は、抵抗パルス（インピーダンス）、キャパシタンスまたは抵抗のような反応混合物の電子特性を測定することにより、未反応の試験微小粒子および基準微小粒子を計数するようにして行うことができる。抵抗パルス技術においては、粒子を電解質溶媒に懸濁させ、孔に入る各粒子が溶媒の一部排除することにより、孔の導電率を変化させるようにする。導電率の変化は粒子の容積に比例するので、サンプルのサイズ分布は数千の粒子を孔を介して送ることにより蓄積される。測定およびその後の信号処理は迅速であるので、統計的に意義のある分布を、しばしば数分という短時間で得ることができる。例えば、米国特許第４，１９１，７３９号を参照されたい。キャパシタンスベースの検定系の例が米国特許第４，０７２，５７６号に開示されている。粒子の電気的測定に基づく他の検定系が、米国特許第５，２８４，７４８号に開示されている。本発明の方法はまた、画像分析のような非細胞測定技術を使用して実施することもできる。上記したように、試験微小粒子の凝集体を計数する必要はない。凝集の程度に関する情報は反応後に残留する未凝集試験微粒子の計数から得られ、これを基準微小粒子の数と比較することができる。しかしながら、凝集体が計数される場合には、計数は、検定に関する相互チェックとして使用することができる。かくして、反応混合物における未凝集試験微小粒子と基準微小粒子との比が、未反応対照混合物における対応する比よりも実質上低く、試験微小粒子の実質的な凝集を示している場合には、凝集した微小粒子の計数は高いものとなるはずである。そうでない場合には、コンピュータはエラー信号を出すことができる。本発明を、以下の実施例により更に説明する。これらの実施例は、例示を目的として提供されており、別に特定されていない限り限定するものではない。実施例実施例１トキソプラズマ、風疹ウイルスおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異の抗体の同時検出のための検定検定試薬の調製１．１μ、１．６μ、１．７μおよび１．９μの直径を有するポリスチレンラテックス粒子を、Interfacial Dynamics，Inc．（オレゴン州、ポートランド）から入手した。トキソプラズマ、風疹ウイルスおよびＣＭＶ抗原の調製体を、Ro ss Southern Laboratories（ユタ州、ソルトレークシテイ）、Viral Antigens ，Inc．（テネシー州、メンフィス）およびAdvanced Biotechnologies（メリーランド州、コロンビア）からそれぞれ入手した。これら３つのタイプの抗原を洗浄剤と音波処理により粉砕し、ｐＨ９．６の炭酸塩／重炭酸塩を用いて、５０μ ｇ／ｍｌのトキソプラズマ抗原、１０μｇ／ｍｌの風疹ウイルスおよび５０マイクログラム／ｍｌのＣＭＶとなるように希釈した。洗浄したポリスチレン粒子を同じ緩衝液に２％Ｗ／Ｖ濃度で懸濁させ、等部の粒子と抗原、即ち、１．６μの粒子とトキソプラズマ溶液、１．７μの粒子と風疹溶液および１．９μの粒子とＣＭＶ溶液を混合した。これらの混合物を室温で、トキソプラズマと風疹については２時問、ＣＭＶについては１時間振動させた。過剰の抗原を遠心分離により除去し、コーティングされた粒子の３つの懸濁体をそれぞれ、０．１ＭグリシンｐＨ７．０と、１％ＢＳＡと、５％スクロースと、０．１％アジ化ナトリウムとにおいて３回洗浄した。洗浄した粒子は、次に、１％Ｗ／Ｖの同じ緩衝液に再懸濁させた。内部基準粒子（ＩＲＰ）をつくるために、１．１μのポリスチレン粒子を洗浄し、０．１％ＳＤＳに再懸濁し、次に、１．５時間振動させた。次いで、粒子を炭酸塩／重炭酸塩中で洗浄し、次に、０．１ＭグリシンｐＨ７．０と、１％ＢＳＡと、５％スクロースと、０．１％アジ化ナトリウムとにおいて３回洗浄し、その後、１％Ｗ／Ｖの同じ緩衝液に再懸濁させた。次に、４種類のコーティングした粒子の混合物を個々のカップにおいて乾燥させた。各種類のコーティングした粒子を先づ簡単に音波処理して凝集体を分散させ、次いで、４種類の粒子の混合物をつくった。充填されるべき各カップに対して、１％Ｗ／Ｖのコーティングした粒子の懸濁体の下記のアリコートを混合した。ＩＲＰ３．５μｌ、トキソプラズマ１５μｌ、風疹１０μｌおよびＣＭＶ２０ μｌ。この混合物を遠心分離に供して、充填されるべきカップ当たり２０ｍｌに混合物を濃縮した。次に、混合物を簡単に音波処理し、凝集体を分散させた。次に、混合物２０μｌを、１５００のカップそれぞれに添加した。次に、粒子混合物を含むカップを３７℃の真空オーブンにおいて一晩乾燥させた。シールされたカップを、使用に供するまで室温で保管した。検定を行うために、所要数のカップをコパリス（商標)・ワン(Copalis One)免疫検定器具（最大カップ数は試験当たり２４個）に入れた。器具によりカップのシールに穿通を行い、１８０ｍｌの反応緩衝液（０．５Ｍ臭化カリウム、０．１Ｍグリシン、ｐＨ９．０、１％ＢＳＡ、０．２％アジ化ナトリウム、１．５％ポリエチレングリコール、分子量６０００−８０００）を加えた。器具により各カップを簡単に音波処理して凝集体を分散させ、次に、試験されるべきサンプル、即ち、人の血清または対照物質２０μｌを各カップに加えた。対照は、トキソプラズマ、風疹およびＣＭＶに特異の抗体が既知に存在しあるいは存在しないサンプルからなるものであった。反応性をもたないサンプル（１％β−ラクトグロブリン）を使用して、分析に関して以下において説明する負の反応対照の粒子の計数を得た。サンプルを各カップに加えてから、器具によりカップ内での攪拌棒の動作を開始し、１０分間の培養を始めた。結果の分析各カップの内容物を１０分間攪拌してから、器具により各カップからアリコートを取り出し、内部基準粒子に対してトキソプラズマ（表１において「A」で表示）、風疹(「Ｂ」）およびＣＭＶ（「Ｃ」）のそれぞれに関して、残留している未反応の粒子（即ち、モノマ）を計数した。各カップにおける未反応の試験粒子の計数は、１０，０００個の内部基準粒子が計数されたときに終了した。次に、これらの数を使用して、表１に示す計算を行った。表１［(A/10,000負の試験対照)/(A/10，000試験サンプル)］x100=トキソプラズマ抗体存在の結果［(B/10,000負の反応対照)/(B/10,000試験サンプル)］x100=風疹抗体存在の結果［(C/10,000負の反応対照)/(C/10,000試験サンプル)］x100=ＣＭＶ抗体存在の結果幾つかの既知の抗体負および抗体正のサンプルを使用して同じ手順を実施し、３つの抗体試験のそれぞれに関してカットオフ値即ち限界値を確立した。トキソプラズマ、風疹およびＣＭＶのカットオフ値を表２に示す。表２検定成分カットオフ値判定（ＣＴＲ）トキソプラズマ抗体＜１１１負 ≧１１１正風疹抗体＜１１４負 ≧１１４正ＣＭＶ抗体＜１１１負 ≧１１１正カットオフ値に基づく未知のサンプルの結果を表３に示す。表３サンプルの種類⁽¹⁾ トキソプラズマ風疹ＣＭＶ結果判定結果判定結果判定Ｔ−、Ｒ−、Ｃ− １００ − ９８ − １００Ｔ＋、Ｒ−、Ｃ− １４０＋１００ − ９９ − Ｔ−、Ｒ＋、Ｃ− １０６ − １５３＋１０３Ｔ−、Ｒ−、Ｃ＋９９ − １０７ − ２８６＋Ｔ＋、Ｒ＋、Ｃ− １５０＋１４４＋９９Ｔ−、Ｒ＋、Ｃ＋１０５ − ３５６＋１７５＋Ｔ＋、Ｒ−、Ｃ＋１５４＋１０６ − １９４＋Ｔ＋、Ｒ＋、Ｃ＋１６６＋２８０＋１９７＋凡例１．これらのサンプルの実際の抗体の状況は、トキソプラズマ、風疹およびＣＭＶの抗体を検出するための商業化された試験においてこれらのサンプルを試験することにより測定した。産業上の利用可能性本発明は、主として、感染または疾病を識別する診断手段としての利用性を有する。かくして、本発明は、医療技術者のような当業者が生物学的流体における被検体の存在を定めるのに有利に利用することができる。本発明はまた、環境のような他の源からの流体サンプルにも適応することができる。本明細書に掲げた刊行物および特許出願は、本発明の技術分野の当業者の技術レベルを示すものである。これらの刊行物および特許出願は、本明細書においては、所要の限度において引用してその説明に代える。本明細書において説明した本発明の種々の変更は、当業者に明らかなものである。かかる変更は、請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コチャー，マニシュ，エス. アメリカ合衆国20144メリーランド州コロンビア，サン・サークル・ウェイ・11650 (72)発明者フォード，グレン，エム. アメリカ合衆国20879メリーランド州ゲイサーズバーグ，ケイプハート・ドライブ・ 19118 (72)発明者ハフ，ジョン，ピー. アメリカ合衆国21048メリーランド州フィンクスバーグ，オールド・ギャンバー・ロード・3408

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプルにおける被検体の存在を測定する検定方法であって、（ａ）サンプルと、所定量の、被検体に結合する結合分子が配置されている試験微小粒子および被検体と結合分子とは非反応性の基準微小粒子とを混合して、液体反応混合物を形成するとともに結合分子を被検体と結合させる工程と、（ｂ）未反応試験微小粒子と基準微小粒子を計数する工程と、（ｃ）未反応の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより、サンプルにおける被検体の存在を測定することができるように試験値を確立する工程とを備えることを特徴とする検定方法。２．試験値を被検体を含まない非反応サンプルの対照値と比較する工程（ｄ）を更に備えることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３．前記比較工程（ｄ）は前記試験値と前記対照値とから変化値を算出する工程（ｅ）を備えることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の検定方法。４．前記工程（ｅ）は前記対照値と前記試験値との差を得る工程（ｆ）を備えることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の検定方法。５．前記工程（ｆ）は前記差を前記対照値で除する工程（ｇ）を備えることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の検定方法。６．前記工程（ｅ）は前記対照値を前記試験値で除する工程（ｈ）を備えることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の検定方法。７．前記工程（ｃ）は未反応の試験微小粒子の数と基準微小粒子の数との比を算出する工程（ｉ）を備えることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。８．前記計数工程（ｂ）は未反応試験微小粒子と基準微小粒子を電子的に計数することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。９．前記計数工程（ｂ）は前記反応混合物のインピーダンスを測定することを特徴とする請求の範囲第８項に記載の検定方法。１０．前記計数工程（ｂ）は前記反応混合物の抵抗を測定することを特徴とする請求の範囲第９項に記載の検定方法。１１．前記計数工程は前記反応混合物のキャパシタンスを測定することを特徴とする請求の範囲第８項に記載の検定方法。１２．前記計数工程は未反応の試験微小粒子と基準微小粒子の数を光学的に測定することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。１３．前記計数工程は未反応の試験微小粒子と基準微小粒子の光散乱特性を細胞測定法により測定することを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の検定方法。１４．前記計数工程は自己凝集体の形態をなす前記基準微小粒子の数を計数することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。１５．試験微小粒子、基準微小粒子または試験微小粒子と基準微小粒子の双方は重合体材料からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。１６．前記重合体材料はポリスチレンまたはその誘導体からなることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の検定方法。１７．ラテックスポリマはポリブタジエンまたはその誘導体からなることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の検定方法。１８．試験微小粒子は表面官能化学基を有する重合体材料からなることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の検定方法。１９．表面官能化学基はアクリルアミド基からなることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の検定方法。２０．前記被検体は抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。２１．結合分子は被検体に結合する抗原であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の検定方法。２２．被検体抗体は風疹抗体であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の検定方法。２３．結合分子は風疹ウイルスの不活性抗原フラグメントであることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の検定方法。２４．被検体抗体はＨＳＶＩ抗体であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の検定方法。２５．結合分子はＨＳＶＩの不活性抗原フラグメントであることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の検定方法。２６．被検体抗体は梅毒抗体であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の検定方法。２７．被検体抗体はサイトメガロウイルス抗体であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の検定方法。２８．結合分子はサイトメガロウイルスの不活性抗原フラグメントからなることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の検定方法。２９．被検体抗体はトキソプラズマ抗体であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の検定方法。３０．サンプルは血液からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３１．サンプルは血清からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３２．サンプルは血漿からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３３．サンプルは唾液からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３４．サンプルは脳脊髄液からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３５．サンプルは尿からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３６．サンプルは身体器官または組織から得られることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定方法。３７．サンプルにおける少なくとも２つの被検体の存在を測定する検定方法であって、（ａ）サンプルを、所定の量の、第１の被検体に結合する第１の結合分子が配置されている第１の試験微小粒子、第２の被検体と結合する第２の結合分子が配置されている第２の試験微小粒子並びに第１と第２の被検体および第１と第２の結合分子とは非反応性の基準微小粒子と混合して、反応混合物を形成しかつ第１の結合分子を第１の被検体と結合させるとともに第２の結合分子を第２の被検体と結合させる工程と、（ｂ）未反応の第１の試験微小粒子、未反応の第２の試験微小粒子および基準微小粒子を計数する工程と、（ｃ）未反応の第１の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより第１の試験値を確立するとともに、未反応の第２の試験微小粒子の数を基準微小粒子と比較することにより第２の試験値を確立して、サンプルにおける第１と第２の被検体の存在を測定する工程とを備えることを特徴とする検定方法。３８．サンプルにおける被検体の存在を測定する検定において使用するキットであって、（ａ）被検体に結合する結合分子が配置された試験微小粒子と、（ｂ）被検体および結合分子と非反応性の基準微小粒子とを備え、前記試験微小粒子および前記基準微小粒子は所定の比率で存在することを特徴とするキット。３９．前記試験微小粒子と、前記基準微小粒子と、サンプルとを混合する容器を更に備えることを特徴とする請求の範囲第３８項に記載のキット。４０．前記試験微小粒子と前記基準微小粒子は前記容器に配置されることを特徴とする請求の範囲第３９項に記載のキット。４１．前記容器は前記試験微小粒子と前記基準微小粒子を前記容器内にシールするシール手段を備えることを特徴とする請求の範囲第３９項に記載のキット。４２．前記試験微小粒子と前記基準微小粒子は乾燥された形態にあることを特徴とする請求の範囲第３８項に記載のキット。４３．サンプルにおける少なくとも２つの被検体の存在を測定する検定において使用するキットであって、（ａ）第１の被検体に結合する第１の結合分子が配置された第１の試験微小粒子と、（ｂ）第２の被検体に結合する第２の結合分子が配置された第２の試験微小粒子と、（ｃ）第１と第２の被検体および第１と第２の結合分子と非反応性の基準微小粒子とを備え、前記第１と第２の試験微小粒子と前記基準微小粒子は所定の比率で存在することを特徴とするキット。４４．流体サンプルにおける少なくとも１つの被検体の存在を測定する検定において使用する組成物であって、（ａ）第１の被検体を結合する第１の結合分子が配置された第１の微小粒子と、（ｂ）第１の被検体および前記第１の結合分子と非反応性の基準微小粒子とを備え、前記第１の試験微小粒子と前記基準微小粒子はそれぞれ前記組成物に所定の量が存在することを特徴とする組成物。４５．第２の被検体に結合する第２の結合分子が配置された所定量の第２の試験微小粒子（ｃ）を更に備え、前記基準微小粒子は前記第２の結合分子および第２の被検体とは非反応性であることを特徴とする請求の範囲第４４項に記載の組成物。４６．乾燥形態をなすことを特徴とする請求の範囲第４４または４５項に記載の組成物。