JP2745705B2 - 抗原・抗体の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗体又は抗原を担持した磁性体を含有する
不溶性担体粒子を利用した抗原・抗体測定法に関する。
特に医療における臨床検査の分野で、血清、血漿、尿等
に含まれるタンパク質およびその関連物質を定量的に測
定する方法に関する。

〔従来の技術〕

現在、臨床検査の免疫診断分野において、ラテックス
の如き不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させ、検体
中の抗原又は抗体と反応させて抗原又は抗体を測定する
方法として、 （イ）抗体を担持したラテックス粒子と検体中の抗原又
は抗体を反応させ、生じた凝集ラテックス粒子に特定波
長の光を照射して、散乱光若しくは透過光の強度を測定
し、その強度の増加から被検体中の抗原又は抗体を定量
する方法（たとえば、特公昭58−11175号公報）。

（ロ）検体中の抗原に対して、凝集性に持たない抗体
（モノクローナル抗体）を、磁性体を含有した不溶性担
体粒子に担持し、検体中の抗原と反応させ、更に、抗体
を担持した磁性体を含有しない不溶性担体粒子を反応さ
せた後（尚、抗体又は抗原を担持した不溶性担体粒子を
以下「感作不溶性担体粒子」という。）反応容器外部よ
り磁場を付与することにより、未反応の磁性体を含有す
る感作不溶性担体粒子と、磁性体を含有する感作不溶性
担体粒子を含む凝集塊を反応混合物から分離し、残存す
る磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子の粒子の量を
光学的に測定し、その濁度の減少から被検体中の抗原を
定量する方法（WO89/01161） 等がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記（ロ）に記載された様な、磁性体を利用した抗原
・抗体測定方法において、その反応混合物中には、理論
上、未反応の磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子
（以下Ａとする）、未反応の磁性体を含有する感作不溶
性担体粒子（以下Ｂとする）、磁性体を含有しない感作
不溶性担体粒子同士の凝集粒子（以下Ｃとする）、磁性
体を含有する感作不溶性担体粒子同士の凝集粒子（以下
Ｄとする）、磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子と
磁性体を含有する感作不溶性担体粒子との凝集粒子（以
下Ｅとする）が存在する。このうち、磁場を付与するこ
とにより、B,D,Eが除かれ、ＡとＣが残存し、光学的に
測定される。

ところで、従来、磁場体を含有しない感作不溶性担体
粒子として、平均粒径0.8μｍのラテックス粒子が使用
されている。しかしながら、使用粒子の平均粒径が１μ
ｍ以下の場合、検体成分の影響の少ない600nm〜1000nm
の波長で測定すると、残存粒子の内、Ｃは濁度の増加と
して検出される。Ｃの濁度増加は、濁度減少を測定して
定量する方法において、感度を著しく下げる要因とな
る。特に、磁性体を含有しない不溶性担体粒子に担持し
ている抗体又は抗原量が、磁性体を含有する不溶性担体
粒子に担持している抗体又は抗原量より極端に多い場
合、具体的には、磁性体を含有しない感作不溶性担体粒
子の使用割合が磁性体を含有する感作不溶性担体粒子よ
り著しく多い場合や、磁性体を含有する感作不溶性担体
粒子の平均粒径が磁性体を含有しない感作不溶性担体粒
子の平均粒径より著しく大きい場合等に、顕著に現われ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、従来の問題点を解決し、より一層高感
度の測定法を提供するため、鋭意検討した結果、磁性体
を含有しない感作不溶性担体粒子として、光学的に抗原
抗体反応を凝集反応として検知する方法として従来一般
に使用されていない平均粒径1.5μｍ〜３μｍという大
粒径の不溶性担体粒子と、磁性体を含有する感作不溶性
担体粒子として平均粒径0.1μｍ〜２μｍの粒子を1:4〜
4:1の割合で使用し、600nm〜1000nmの波長で光学的に測
定することにより、前述の問題点を解決することができ
ることを知得し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、磁性体を含有しな不溶性担体
粒子と磁性体粒子を含有する不溶性担体粒子に、夫々、
抗体又は抗原を担持させ、この担持した抗体又は抗原
に、抗原又は抗体或いはその混合物を溶液中で反応させ
た後、反応混合物に磁場を付与することにより、未反応
の磁性体を含有する不溶性担体粒子および磁性体を含有
する不溶性担体粒子を含む凝集塊を反応混合物から分離
し、残存する磁性体を含有しない不溶性担体粒子の量を
濁度或いは散乱光を光学的に検知することにより、溶液
中の抗原又は抗体を定量的に測定する方法において、上
記磁性体を含有しない不溶性担体粒子の平均粒径が1.5
μｍ〜３μｍの範囲であり、また、上記磁性体を含有す
る不溶性担体粒子の平均粒径が0.1μｍ〜２μｍの範囲
であって、且つ、両者の使用割合が1:4〜4:1の範囲であ
って、しかも、残存する磁性体を含有しない不溶性担体
粒子の量を600〜1000nmの波長で測定することを特徴と
する抗原・抗体測定法に存する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で使用する磁性体を含有する不溶性担体粒子と
しては、有機高分子及び無機物質が使用可能である。有
機高分子物質としては、ゼラチン粒子やポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体等のスチレン系重合体粒
子の如き乳化重合により得られる有機高分子物質のラテ
ックスがあり、特にポリスチレンラテックスが有用であ
る。

不溶性担体粒子中に含有させる磁性体としては、鉄及
び磁性酸化鉄が好ましく、これを５％〜100％好ましく
は30％〜50％含有するように調製されたものが用いられ
る。

本発明の磁性体を含有する不溶性担体粒子の平均粒径
は0.1μｍ〜２μｍ、好ましくは、0.5μｍ〜1.5μｍの
範囲内のものが用いられる。

平均粒径が0.1μｍより小さいと、磁場による分離に
時間がかかり実用的でない。また、平均粒径が２μｍよ
り大きいと、単位重量当りの抗体又は抗原の担持量が少
なくなり、磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子同士
の凝集を引き起しやすくなるので好ましくない。

磁性体を含有しない不溶性担体粒子としては、ゼラチ
ン粒子やポリスチレン、ポリビニルトルエン、スチレン
−ブタジエン共重合体粒子の如き乳化重合により得られ
る有機高分子物質のラテックスが用いられ、特に、ポリ
ビニルトルエンラテックスが有用である。

かかる不溶性担体粒子の粒径は、1.5μｍ〜３μｍの
範囲のものが用いられる。

平均粒径が1.5μｍより小さいと、単位重量当りの表
面積が大きくなり、抗体又は抗原担持量が多くなって、
磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子同士の凝集を引
き起しやすくなる。また、この磁性体を含有しない感作
不溶性担体粒子同士の凝集反応を検体成分の影響の少な
い600nm〜1000nmの波長で測定する場合、濁度の増加と
して検出され、感度低下の原因となるので好ましくな
い。

また、平均粒径が３μｍより大きいと、自然沈降が早
くなるので実用的でない。

これに対し、本発明に従い、磁性体を含有しない感作
不溶性担体粒子の平均粒径が1.5μｍ〜３μｍの粒子を
使用し、600〜1000nmの波長で測定すると、磁性体を含
有しない感作不溶性担体粒子同士の凝集は予期せぬこと
に濁度の減少として検出されるので、本来の濁度減少に
加算的に働き、磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子
同士の凝集が起っても感度は低下せず、むしろ高感度で
測定することができる。

上述の不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させる方
法は、磁性体を含有する不溶性担体粒子及び磁性体を含
有していない不溶性担体粒子共に共通であって、測定し
ようとする被検体中の抗原又は抗体に対する抗体又は抗
原を物理的に吸着させるか或いは化学的に担持させるこ
とにより実施される。

担持する抗体としてはポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体が使用され、その形態は、γ−グロブリ
ン、IgG、IgM、Ｆ（ab′）_２、Fab′等いずれであって
もよい。

また担持されるものとして抗原を用いる場合には、細
胞片、ハプテン、抗原タンパク、免疫複合体、天然又は
合成高分子抗原等が用いられる。

一般に担持される抗原又は抗体の量は２種類の不溶性
担体粒子とも共通であって、0.01mg/ml〜2mg/ml、好ま
しくは0.05mg/ml〜0.5mg/mlの範囲から選ばれる。

上記２種の不溶性担体粒子に担持する抗体又は抗原の
組合せは、目的に応じて種々とり得るが、抗体の場合、
例えば、次の様な組合せが挙げられる。

（１） 磁性体を含有した不溶性担体粒子にポリクロー
ナル抗体を担持し、磁性体を含有しない不溶性担体粒子
にポリクローナル抗体を担持する。

（２） 磁性体を含有した不溶性担体粒子にモノクロー
ナル抗体を担持、磁性体を含有しない不溶性担体粒子に
ポリクローナル抗体を担持する。

（３） 磁性体を含有した不溶性担体粒子にポリクロー
ナル抗体を担持し、磁性体を含有しない不溶性担体粒子
にモノクローナル抗体を担持する。

（４） 磁性体を含有した不溶性担体粒子にモノクロー
ナル抗体を担持し、磁性体を含有しない不溶性担体粒子
に認識部位の異なるモノクローナル抗体を担持する。

（５） 磁性体を含有した不溶性担体粒子に２種類以上
の認識部位の異なるモノクローナル抗体を担持し、磁性
体を含有しない不溶性担体粒子に磁性体を含有した不溶
性担体粒子に担持した抗体と同じモノクローナル抗体を
担持する。

上記の様にして抗体又は抗原を担持した不溶性担体粒
子は、いずれも0.1Mリン酸緩衝液（pH7）、0.1M Tris−
塩酸緩衝液（pH8.0）等の水溶媒中に0.01〜10重量％と
なるように分散され、懸濁液として使用する。

これら磁性体を含有しない感作不溶性担体粒子と磁性
体を含有する感作不溶性担体粒子の使用割合は、1:4〜
4:1の範囲から選ばれる。

上記範囲を越えて磁性体を含有しない感作不溶性担体
粒子の割合が多くなると、磁性体を含有しない感作不溶
性担体粒子同士の反応が増えるので好ましくない。ま
た、磁性体を含有する感作不溶性担体粒子の割合が多く
なると、磁性体を含有する感作不溶性担体粒子同士の反
応が専ら起り、感度低下の原因となるので好ましくな
い。

次に、具体的な測定方法について説明する。

（１） 磁性体を含有している感作不溶性担体粒子と磁
性体を含有していない感作不溶性担体粒子を、予め、混
合する方法。

まず、磁性体を含有する感作不溶性担体粒子と磁性体
を含有していない感作不溶性担体粒子を予め、前述の使
用割合で混合しておく。この混合懸濁液と測定しようと
する血漿、血清又は尿素に含まれる抗原または抗体（以
下検体とする）と反応させる。検体は0.1M Tris−塩酸
緩衝液（pH8）や0.1Mリン酸緩衝液（pH7）等の緩衝液で
希釈してもよい。反応は室温で平衡になるまで行なう。
また、反応速度を速めるために25〜50℃で恒温槽で反応
させてもよい。通常室温で反応が平衡に達するまで約30
分を必要とする。

（２） 磁性体を含有していない感作不溶性担体粒子と
検体を反応させ、続いて、磁性体を含有している感作不
溶性担体粒子を添加する方法。

まず、磁性体を含有していない感作不溶性担体粒子と
検体、又緩衝液で希釈した検体とを反応させる。反応は
測定する抗原又は抗体によって異なるが一般に室温で約
10分間行なう。反応時間は磁性体を含有していない感作
不溶性担体粒子に担持された抗体又は抗原と検体中の抗
原又は抗体との抗体・抗原反応が平衡に達しない時間が
選ばれる。続いて、磁性体を含有している感作不溶性担
体粒子が前述の使用割合で添加され、さらに抗体・抗原
反応を行なう。反応を室温で平衡になるまで行なう。ま
た反応速度を速めるために25〜50℃の恒温槽で反応させ
てもよい。

（３） 反応系を測定目的とする抗体に対する抗原（又
は抗原に対する抗体）を一定量添加し、この添加抗原
（又は抗体）と測定目的とする検体中の抗体（又は抗
原）を予め反応させた後（或は同時に）、磁場体を含有
しない感作不溶性担体粒子と、磁性体を含有する感作不
溶性担体粒子を前述の（１）、又は（２）と同様の方法
で反応を行う方法。

例えば、検体中に含まれる抗体を測定しようとした場
合、目的とする抗体に対する抗原を一定量含む緩衝液
（例えば0.1M Tris−塩酸pH8）を予め調製する。検体中
の抗体とこの緩衝液を反応させ、次に抗体を担持した磁
性体を含有する感作不溶性担体粒子と抗体を担持した磁
性体を含有しない感作不溶性担体粒子を上記（１）又は
（２）と同様の手順で混合し、反応させる。この時検体
中の抗体と緩衝液と２種類の不溶性担体粒子を同時に配
合し、競合的に反応を行ってもよい。反応時間は室温で
平衡になるまで行う。また、反応速度を速めるために、
25℃〜50℃の恒温槽で反応させてもよい。

（１），（２），（３）の方法共に反応は一般に分光
器用セル、96穴マイクロプレートの内で行なわれ、反応
が平衡に達した時、容器の外部から磁場をかけるか、又
は反応混合物中に磁性体粉又は磁性体小片を投入又は挿
入することにより、容器の測光をさえぎらない位置に磁
性体を含有する感作不溶性担体粒子と磁性体を含有しな
い感作不溶性担体粒子との凝集塊及び未反応の磁性体を
含有する感作不溶性担体粒子を集める。磁石として永久
磁石、電磁石等を使用する。反応液中に浮遊している磁
性体を含有していない感作不溶性担体が残存する。この
残存量は抗原測定の場合は検体中の抗原量に、抗体測定
の場合は検体中の抗体量に依存する。この残存量を外部
より600nm〜1000nm、好ましくは、800nm〜1000nmの範囲
にある一定波長の光の吸光度又は散乱光強度を測定する
ことにより求める。本発明方法においては目的とする既
知の濃度の異なるレベルの検体についての吸光度、又は
散乱光の強度を測定することにより、検量線を作製して
おき、この検量線を用いて未知濃度検体の吸光度、又は
散乱光強度より未知濃度の抗原又は抗体の濃度を定量す
ることができる。

（発明の効果） 本発明方法は、従来の磁性体を含有した粒子を用いた
技術と比較し、次のような利点がある。

即ち、本発明においては、磁性体を含有しない感作不
溶性担体粒子に平均粒径1.5μｍ〜３μｍという従来使
用されていない平均粒径の不溶性担体を使用することに
より、磁性体を含有しな感作不溶性担体粒子同士の反応
による感度の低下といった問題がなく、従来よりも高感
度の測定が可能になった。また、本発明は操作が非常に
簡単で短時間を行なうことができる。これらの利点はシ
ステムの自動化に最適であり、多検体処理に有望であ
る。

〔実施例１〕 AFPの検出 （試薬の調製法） ・磁性体含有抗AFP感作ラテックスの調製法。

10％（W/V）の0.7μｍの磁性ラテックス（ローヌプー
ラン社製エスタポールSML266）から分離したラテックス
１％を分散させた0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1cc
に、ヒトAFP（アルファフェトプテイン）を動物に免疫
して得られる抗AFP特異抗体0.25mgを加え、約１時間撹
拌し、感作した後、遠心分離（16,000rpmで10分間）
し、上清を除き、分離されたラテックスを0.3％牛血清
アルブミン/0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）に再分散
させ、更に１時間撹拌する。再度遠心分離（16,000rpm
で10分間）を行なった後上清を除き、0.1Mリン酸緩衝液
（pH7）に再分散させる。

・磁性体を含有しない抗AFP感作ラテックスの調製法。

10％（W/V）の2.02μｍのポリビニルトルエン（Dow社
製）から分離したラテックス１％を分散させた0.1MのTr
is−塩酸緩衝液（pH8.0）1ccに、抗AFP特異抗体1.0mg/m
lを加え、約１時間撹拌し、感作した後遠心分離（16,00
0rpmで10分間）し、上清を除き、分離されたラテックス
を0.1％牛血清アルブミン/0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH
8.0）に再分散させ、１時間撹拌する。再度遠心分離（1
6,000rpmで10分間）を行なった後、上清を除き0.1Mをリ
ン酸緩衝液（pH7）に再分散させる。

（操作方法） １％の磁性体含有抗AFP感作ラテックスと１％の磁性
体を含有しない抗AFP感作ラテックスを1:1の割合で混合
した後、0.1Mリン酸緩衝液で８倍に希釈する。これをラ
テックス調製試薬とする。

APF標準品（250ng/ml、ダイアヤトロン社製）をAFPの
含まれていない人血清で30ng/mlになるように希釈した
後、２倍希釈した系列を作製し、これを検体とする。

LPIA100用セル（三菱化成株式会社製）に検体10μ
、緩衝液（0.1M Tris−塩酸（pH8.0））250μ、ラ
テックス調製試薬50μを加え、よく混合した後、１時
間室温で反応させる。次に、永久磁石をセルの底部より
あて、底に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応磁
性体含有ラテックスを集める。約10分で磁性体を含有す
る凝集塊及び未反応磁性体含有ラテックスを集めること
ができる。そして、このマイクロプレート上に残存して
いる磁性体を含有していない不溶性担体粒子の濃度を全
自動免疫診断装置LPIA100（三菱化成株式会社製）によ
り、波長950nmで、その吸光度を測定することにより測
定した。図１に反応強度比とAFP濃度との関係を表す検
量線データを示す。同図の本発明との比較データはEIA
（小野イムノボール：小野薬品株式会社製）、LPIA−10
0（エルピアエースAFP;三菱化成株式会社製）それぞれ
市販品を使用した。

〔実施例２〕 HBsの検出 （試薬の調製法） ・磁性体含有抗HBs感作ラテックスの調製法。

10％（W/V）の0.7μｍの磁性ラテックス（ローヌプー
ラン社製エスタポールSML266）から分離したラテックス
１％を分離させた0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1cc
に、ヒトHBs adw抗原を動物に免疫して得られる抗HBsポ
リクローナル抗体0.25mgを加え、約１時間撹拌し、感作
した後、遠心分離（16,000rpmで10分間）し、上清を除
き、分離されたラテックスを0.3％牛血清アルブミン/0.
1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）に再分散させ、更に１
時間撹拌する。再度遠心分離（16,000rpmで10分間）を
行なった後上清を除き、0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に再
分散させる。

・磁性体を含有しない抗HBs感作ラテックスの調製法。

10％（W/V）の2.02μｍのポリスチレンラテックス（D
ow社製）から分離したラテックス１％を分離させた0.1M
のTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1ccに、抗HBs（ｄタイ
プ）モノクローナル抗体0.1mg/mlを加え、約１時間撹拌
し、感作した後遠心分離（16,000rpmで10分間）し、上
清を除き、分離されたラテックスを1.0％牛血清アルブ
ミン/0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）に再分散させ、
１時間撹拌する。再度遠心分離（16,000rpmで10分間）
を行なった後、上清を除き0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に
再分散させる。

（操作方法） １％の磁性体含有抗HBs感作ラテックスを１％の磁性
体を含有しない抗HBs感作ラテックスを1:1の割合で混合
した後、0.1Mリン酸緩衝液で８倍に希釈する。これをラ
テックス調製試薬とする。

HBs標準品570U/ml（三菱化成株式会社製）を正常ウサ
ギ血清で２倍希釈した系列を作製し、これを検体とす
る。

96穴マイクロプレート（Falcon社製 Flexible Assa
y Plate 平底）に検体50μ、緩衝液（0.1M Tris−
塩酸（pH8.0））50μ、ラテックス調製試薬50μを
加え、よく混合した後30分室温で反応させる。次に、永
久磁石をマイクロプレートの検体分注部測面に外部より
あて、測面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応
磁性体含有ラテックスを集める。約10分で磁性体を含有
する凝集塊及び未反応磁性体含有ラテックスを集めるこ
とができる。そして、このマイクロプレート上に残存し
ている磁性体を含有していない不溶性担体粒子の濃度を
マイクロプレートリーダ（日本インターメット社製NJ20
00）により、波長620nmで、その吸光度を測定すること
により測定した。図２に吸光度とHBs濃度の検量線デー
タを示す。

〔実施例３〕 TSH検出 （試薬の調製法） ・磁性体含有抗TSH感作ラテックスの調製法。

10％（W/V）の0.7μｍの磁性ラテックス（ローヌプー
ラン社製エスタポールSML266）から分離したラテックス
１％を分離させた0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1cc
に、抗ヒトTSHモノクローナル抗体0.25mgを加え、約１
時間撹拌し、感作した後、遠心分離（16,000rpmで10分
間）し、上清を除き、分離されたラテックスを0.3％牛
血清アルブミン/0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）に再
分散させ、更に１時間撹拌する。再度遠心分離（16,000
rpmで10分間）を行なった後上清を除き、0.1Mリン酸緩
衝液（pH7）に再分散させる。

・磁性体を含有しない抗ヒトTSH感作ラテックスの調製
法。

10％（W/V）の2.02μｍのポリスチレンラテックス（D
ow社製）から分離したラテックス１％を分離させた0.1M
のTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1ccに、抗ヒトTSHモノク
ローナル抗体（hTSH,hTSHβ−chain）0.1mg/mlを加え、
約１時間撹拌し、感作した後遠心分離（16,000rpmで10
分間）し、上清を除き、分離されたラテックスを0.1％
牛血清アルブミン/0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）に
再分散させ、１時間撹拌する。再度遠心分離（16,000rp
mで10分間）を行なった後、上清を除き、0.1Mリン酸緩
衝液（pH7）に再分散させる。

（操作方法） １％の磁性体含有抗ヒトTSH感作ラテックスと１％の
磁性体を含有しない抗ヒトTSH感作ラテックスを1:1の割
合で混合した後、0.1Mリン酸緩衝液で８倍に希釈する。
これをラテックス調製試薬とする。

ヒトTSH標準品（25μIU/ml、シグマ社製）をpH80.1mT
ris−塩酸緩衝液（0.1％BSAを含む）で２倍希釈した系
列を作製し、これを検体とする。

96穴マイクロプレート（Falcon社製 Flexible Assa
y Plate 平底）に検体50μ、緩衝液（0.1M Tris−
塩酸（pH8.0））50μ、ラテックス調製試薬50μを
加え、よく混合した後90分室温で反応させる。次に、永
久磁石をマイクロプレートの検体分注部測面に外部より
あて、測面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応
磁性体含有ラテックスを集める。約10分で磁性体を含有
する凝集塊及び未反応磁性体含有ラテックスを集めるこ
とができる。そして、このマイクロプレート上に残存し
ている磁性体を含有していない不溶性担体粒子の濃度を
マイクロプレートリーダー（日本インターメット社製NJ
2000）により、波長620nmで、この吸光度を測定するこ
とにより測定した。図３に吸光度とヒトTSH濃度の検量
線データを示す。

〔実施例４〕 ATLAGP24抗体の検出 （試薬の調製法） ・磁性体含有抗ATLAGP24感作ラテックスの調製法 10％（W/V）の0.7μｍの磁性ラテックス（ローヌプー
ラン社製エスタポールSML266）から分離したラテックス
１％を分散させた0.1MのTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1cc
に、成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原GP24組換え品（トラ
イトン社製）を動物に免疫して得られる抗ATLAGP24抗体
0.25mgを加え、約１時間撹拌し、感作した後、遠心分離
（16,000rpmで10分間）し、上清を除き、分離されたラ
テックスを0.3％牛血清アルブミン/0.1MのTris−塩酸緩
衝液（pH8.0）に再分散させ、更に１時間撹拌する。再
度遠心分離（16,000rpmで10分間）を行なった後上清を
除き、0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に再度分散させる。

・磁性体を含有しない抗ATLAGP24感作ラテックスの調製
法。

10％（W/V）の2.02μｍのポリスチレンラテックス（D
ow社製）から分離したラテックス１％を分散させた0.1M
のTris−塩酸緩衝液（pH8.0）1ccに、抗ATLAGP24抗体0.
1mg/mlを加え、約１時間撹拌し、感作した後遠心分離
（16,000rpmで10分間）し、上清を除き、分離されたラ
テックスを0.1％牛血清アルブミン/0.1MのTris−−塩酸
緩衝液（pH8.0）に再分散させ、１時間撹拌する。再度
遠心分離（16,000rpmで10分間）を行なった後、上清を
除き0.1Mリン酸緩衝液（pH7）に再分散させる。

（操作方法） １％の磁性体含有抗ATLAGP24感作ラテックスと１％の
磁性体を含有しない抗ATLAGP24感作ラテックスを1:1の
割合で混合した後、0.1Mリン酸緩衝液で８倍に希釈す
る。これをラテックス調製試薬とする。

ゼラチン凝集法及びEIA法陽性検体をpH80.1M Tris−
塩酸緩衝液（0.1％BSAを含む）で２倍希釈した系列を作
製し、これを検体とする。

LPIA100用セル（三菱化成社製）に検体10μ、GP24
組換えタンパク50mg/ml含む緩衝液（0.1M Tris−塩酸
（pH8.0））250μ、ラテックス調製試薬50μを加
え、よく混合した後30分室温で反応させる。次に、永久
磁石をセルの底部に外部よりあて、底部に磁性体を含む
ラテックス凝集塊及び未反応磁性体含有ラテックスを集
める。約10分で磁性体を含有する凝集塊及び未反応磁性
体含有ラテックスを集めることができる。そして、この
マイクロプレート上に残存している磁性体を含有してい
ない不溶性担体粒子の濃度をLPIA100（三菱化成社製）
により、波長950nmで、その吸光度を測定することによ
り測定した。図４に吸光度と検体希釈倍率のDose resp
onse curveを示す。

【図面の簡単な説明】

図１は、本法,EIA法及びLPIA法（ラテックス凝集反応
法）によるAFP抗原検出試薬の検量線を示した図であ
る。図中の反応強度比（％）は、次のように定義され
る。 ただし本法においては、他法との比較を容易にするため
に、反応強度＝（AFPゼロ濃度時における吸光度）−
（各AFP濃度における吸光度）を示し、最大反応強度＝
（AFPゼロ濃度時における吸光度）−（AFP最大濃度（飽
和濃度）における吸光度）として反応強度比（％）を算
出した。 図２は本法におけるHBs抗原検出試薬の検量線を示す図
である。 図３は本法におけるヒトTSH抗原検出試薬の検量線を示
す図である。 図４は本法における抗ATLAGP24（成人Ｔ細胞白血病抗原
タンパク）抗体のDose response curveを示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−128168（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504828（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501647（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】磁性体を含有しない不溶性担体粒子と磁性
   体粒子を含有する不溶性担体粒子に、夫々、抗体又は抗
   原を担持させ、この担持した抗体又は抗原に、抗原又は
   抗体或いはその混合物を溶液中で反応させた後、反応混
   合物に磁場を付与することにより、未反応の磁性体を含
   有する不溶性担体粒子および磁性体を含有する不溶性担
   体粒子を含む凝集塊を反応混合物から分離し、残存する
   磁性体を含有しない不溶性担体粒子の量を濁度或いは散
   乱光を光学的に検知することにより、溶液中の抗原又は
   抗体を定量的に測定する方法において、上記磁性体を含
   有しない不溶性担体粒子の平均粒径が1.5μｍ〜３μｍ
   の範囲であり、また、上記磁性体を含有する不溶性担体
   粒子の平均粒径が0.1μｍ〜２μｍの範囲であって、且
   つ、両者の使用割合が1:4〜4:1の範囲であって、しか
   も、残存する磁性体を含有しない不溶性担体粒子の量を
   600〜1000nmの波長で測定することを特徴とする抗原・
   抗体測定法。