JPH0750112B2 - レーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は極めて微量の検体から特定の抗体または抗原を
定量的に検出可能なレーザ磁気免疫測定方法に用いて好
適な検体調整方法に関するものである。

〔従来の技術〕

後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新
型ウイルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現
在、世界的規模で推進されている。

従来から知られる一次反応を利用した微量免疫測定方法
としては、ラジオイムノアッセイ（以下、RIA法と記
す）、酵素イムノアッセイ（EIA）、蛍光イムノアッセ
イ法等が既に実用化されている。これらの方法は、それ
ぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加し
た抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体
または抗原の有無を検出する方法である。

RIA法は、標識化されたアイソトープの放射線量を測定
することにより抗原抗体反応に寄与した検体量を定量す
るものであり、ピコグラム程度の超微量測定が可能な現
在唯一の方法である。しかしながら、この方法は放射性
物質を利用するので、特殊設備を必要とし、また、半減
期等による標識効果の減衰等を考慮しなければならない
ので、実施には大きな制約がある。更に、放射性廃棄物
処理が社会問題となっている現状を考慮すると、その実
施は自ずと制限される。

一方、酵素、蛍光体を標識として用いる方法は、抗原抗
体反応に寄与した検体量を、発色や発光を観測すること
により検出する方法であり、RIA法の如き実施上の制約
はない。しかしながら、発色あるいは発光を精密に定量
することは困難であり、検出限界はナノグラム程度であ
る。

また、レーザ光を利用して抗原抗体反応の有無を検出す
る方法として、例えば、主に肝臓癌の検出を目的として
開発されたAFP（アルファ・フェトプロテイン）を利用
した方法がある。

この方法は、AFPに対する抗体をプラスチック微粒子に
付加し、抗原抗体反応によってプラスチック粒子が凝集
して生じる質量変化から調べる方法であり、10^-10gの検
出感度を達成している。これは、従来のレーザー光を用
いた方法の百倍以上の感度であるが、RIA法に比較する
と百分の一以下に過ぎない。更に、この方法が水溶液中
における抗原抗体複合物のブラウン運動の変化を利用し
ているために、抗体を含む水溶液の温度、揺乱の影響あ
るいは水溶液に混在する不純物粒子の影響を極めて受け
易く、これ以上に検出感度を高めることは原理的に望外
のものである。また、このような本質的欠点があるた
め、多量の検体を必要としていた。

上述のように、従来の免疫測定手段においては、高い検
出感度を有するRIA法は、放射性物質を使用するため
に、その実施については多くの制約があり、一方、実施
の容易な酵素イムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法
等は感度が低く、精密な定量的測定ができなかった。

そこで、本発明者らは、従来の方法とは原理を異にする
免疫測定方法の研究を行ない、先に、特願昭61−224567
号、特願昭61−252427号、特願昭61−254164号、特願昭
62−22062号、特願昭62−22063号、特願昭62−152791
号、特願昭62−152792号、特願昭62−184902号、特願昭
62−264319号、特願昭62−267481号としてレーザ磁気免
疫測定方法及び測定装置についての発明を特許出願して
いる。これらの新しい免疫測定方法は標識材料として磁
性微粒子を用いる点に特徴があり、アイソトープを用い
ないでピコグラムの超微量検出が可能である。検出方法
は検体に照射したレーザ光の散乱光、透過光、反射光、
干渉光、回折光の何れを検出してもよい。本発明者らは
上述の特許に基づき、磁性微粒子を抗原あるいは抗体に
標識し、初めてウイルスの検出等を行なった。この新し
いレーザ磁気免疫測定方法は、従来最も検出感度が高い
とされているRIA法よりも検出感度が高いことが確認さ
れつつある。例えば、本発明者らが日本ウイルス学会第
35回総会（昭和62年11月 講演番号4011「新しく開発し
た免疫測定装置を用いたウイルスの検出実験」）で発表
したように、不活性化したインフルエンザウイルスＡ、
Ｂ型をウイルスのモデルとして用いて、ウイルス検出実
験を行なったところ、1ml中に１個程度のウイルスが存
在する場合でも検出できた。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで、一般に、RIA、EIA、FIA並びに本発明でのレ
ーザ磁気免疫測定方法のように標識物質を用いる方法は
検体調整の際に、検体と反応しなかった未反応の標識体
を分離・除去する必要がある。例えば、EIA法の一種で
あるELISA法では既知の抗原が固相化されたマイクロプ
レートに、検体溶液を反応させた後に洗浄を行なって、
未反応の検体溶液を除去し、次に酵素標識抗体を加えて
酵素標識を行なった後、さらに未反応の酵素標識抗体を
洗浄する方法がとられている。この洗浄工程は通常５〜
６回行う必要があった。洗浄工程を簡略化すればマイク
ロプレート上に標識酵素が残留し、測定に妨害を与える
ためである。

また、マイクロプレートに抗原を固相化する従来の方法
は抗原抗体反応がマイクロプレートの表面に限られるこ
とから極微量の検体の検出には、抗原抗体反応時間を長
時間にする必要があった。

本発明は未反応の磁性体標識抗体の分離を１回の操作で
確実に行うと共に、抗原抗体反応の表面積を増やすこと
によって、検体と磁性体標識抗体の遭遇の機会を増や
し、極微量の検体をも確実に磁性体標識抗体で捕捉・標
識することによって、検出感度の向上並びに測定時間の
短縮を図ることを課題としている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、前記課題を解決するためになされたもので、
本発明によれば、 磁性体標識抗体よりも充分に大きな質量を有する非磁性
体粒子に検体を固定させる第１の工程と、前記検体と前
記磁性体標識抗体とを抗原抗体反応させる第２の工程
と、前記第２の工程で得られた磁性体標識検体複合体と
前記第２の工程で残存する未反応の前記磁性体標識抗体
とを遠心により分離することを特徴とするレーザ磁気免
疫測定方法を実施するための検体調整方法が提供され
る。

本発明の実施態様として、非磁性体粒子に検体を固定さ
せる前記第２の工程には、非磁性体粒子の表面を活性化
して検体を非特異的に吸着させる方法あるいは非磁性体
粒子の表面上に予め既知の抗体あるいは抗原を固定して
おき検体を抗原抗体反応によって特異的に結合させる方
法が目的に応じて選択できる。

〔作用〕

本発明に係るレーザ磁気免疫測定方法を実施するための
検体調整方法は、標識物質として磁性体微粒子を利用
し、この磁性体微粒子に抗体を結合して得られる磁性体
標識抗体よりも充分に大きな質量を有する非磁性体粒子
の表面上で検体を捕捉した後、前記磁性体標識抗体と検
体とを抗原抗体反応させる。検体を捕捉するための前記
非磁性体粒子は磁性体であってはならない。何故なら
ば、検体を捕捉後磁性体標識抗体で標識する意味が無く
なるからである。前記非磁性体微粒子としては、平均粒
径0.1〜10μｍ程度の微粒子が好ましい。0.1μｍ以下で
はウイルスや磁性体標識抗体の大きさと同程度になり、
次の工程の遠心分離に不都合になるからである。また、
10μｍ以上では表面積が小さくなるためウイルスの検出
感度並びにレーザ磁気免疫測定の際の測定精度が低下す
るためである。

前記非磁性体粒子は、例えばアクリルポリマー樹脂やポ
リスチレン樹脂等のプラスチック微小球、あるいはシリ
カやアルミナ等の無機コロイド粒子などが好ましい。さ
らに好ましくは、これらの非磁性体粒子は前記磁性体標
識体よりも密度が大きいことである。何故ならば、非磁
性体粒子は沈澱させ、未反応の磁性体標識抗体を上清と
して分離する遠心分離操作に有利になるからである。密
度の大きな非磁性体粒子を得る方法として、鉛等の非磁
性金属を核に持つ有機あるいは無機の複合材料から作製
する方法が好ましい。

非磁性体粒子の表面に検体を捕捉する方法の一つとし
て、非磁性体粒子の表面を活性化して検体を非特異的に
吸着する方法をとることができる。この方法は、スクリ
ーニング検査や、患者のうがい液からインフルエンザウ
イルスを検出するような場合に有効である。うがい液に
はウイルスは多くても数百個程度しか存在しないし、ま
た、Ａ型、Ｂ型等の複数の変異株があるから、まずウイ
ルスを特定せずに確実に前記非磁性体粒子に捕捉する目
的に適している。

もう一つの方法として、非磁性体粒子の表面上に予め既
知の抗体あるいは抗原を固定しておき検体を抗原抗体反
応によって特異的に結合させる方法がある。この方法
は、非特異反応をできる限り排除して特定のウイルスの
みを確実に検出する精密検査に適している。

さて、前記の検体捕捉工程の後、捕捉された検体と磁性
体標識抗体とを抗原抗体反応させる。この時、磁性体標
識抗体は、検体と確実に抗原抗体反応させるために、検
体よりも過剰に加えることが望ましい。例えば一例とし
て、ピコグラム台の検体を検出するためには磁性体標識
抗体10^-9g程度加えればよい。

次に、前記の抗原抗体反応工程で磁性標識された抗原抗
体複合体（磁性体標識検体複合体）と前記工程で残存す
る未反応の前記磁性体標識抗体とを分離させる。この分
離方法として、本発明の効果を最大に発揮させる遠心に
よる分離が最も望ましい。例えば、１μｍのアクリルポ
リマー樹脂を非磁性体粒子として用いた場合、非磁性体
粒子に捕捉された抗原抗体複合体は1500rpm、５分間の
低速遠心で沈澱する。一方、未反応の磁性体標識抗体は
沈澱せず、上清として留まる。沈澱物を採取して、例え
ば、HEPESのような緩衝液中に抗原抗体複合体を分散さ
せる。

このようにして、本発明のレーザ磁気免疫測定方法を実
施するための検体調整がなされる。

本発明の検体調整方法を適用した後、本発明者らが先に
出願したレーザ磁気免疫測定方法及び測定装置に技術開
示している方法で極微量のウイルスあるいは工程の検出
を行うことができる。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述する
が、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発
明の技術的範囲を何等制限するものではない。

〔実施例１〕 第１図は本発明の検体調整方法の一実施例を説明する工
程図であって、図中（ａ）は非磁性体を液中分散する工
程、（ｂ）は検体を捕捉する工程、（ｃ）は磁気標識工
程、（ｄ）は遠心分離工程、（ｅ）は測定工程である。

本実施例においては実験上安全性の高い不活性化したイ
ンフルエンザウイルスを用いて本発明の検体調整法の検
出限界を調べる目的で実施した。

平均粒径１μｍのアクリルポリマーからなる非磁性体粒
子１の表面には、ウサギを免疫して得られたインフルエ
ンザウイルスに対する高度免疫抗血清が抗体２として固
相化されている。凍結乾燥保存されている前記非磁性体
粒子１は工程（ａ）において反応容器に入れられPBS緩
衝液中に分散される。

前記工程（ｂ）はモデル検体として既知の濃度のインフ
ルエンザウイルス（A/石川（H2N2））を前記までの工程
で得られた非磁性体粒子分散液に加えて、前記インフル
エンザウイルスを捕捉する工程である。本実施例ではウ
イルスの検出限界を調べるために濃度１〜１千万個/ml
の範囲で10倍段階稀釈した各濃度のウイルス溶液を用い
た。

前記工程（ｃ）は、磁性体標識抗体４を添加して、検体
との間で抗原抗体反応させ、磁気標識する工程であっ
て、磁性体標識抗体４はデキストランで被覆した平均粒
子40nmのマグネタイトからなる磁性微粒子4aにフェレッ
トを免疫して得られる抗血清から単離したIgG抗体4bを
共有結合したものである。前記磁気標識は35℃、2.5時
間のインキュベートの条件で行った。

前記工程（ｄ）は、前記までの工程で得られた抗原抗体
複合体（磁性体標識検体複合体）５と未反応の磁性体標
識抗体４とを分離する工程であって、1500rpm、５分間
の遠心によって、前記抗原抗体複合体５は沈澱し、未反
応の磁性体標識抗体４は上清として得られた。

前記工程（ｅ）は前記までの工程で得られた沈澱物を採
取してレーザ磁気免疫測定装置で測定する工程であっ
て、HEPES緩衝液1mlで前記沈澱物を加え、本発明者らが
先に発明した干渉法（特願昭62−184902号）でウイルス
の検出を行なった。その結果、ウイルス１個程度を検出
することが出来た。

第２図は比較対照例であって、現在、エイズ抗体検査等
に広く用いられているELISA法の検体調整工程図であ
る。ELISA法の場合、（ａ）固相化工程、（ｂ）検体捕
捉工程、（ｃ）洗浄工程、（ｄ）酵素標識工程、（ｅ）
洗浄工程、（ｆ）気質反応工程、（ｇ）反応停止工程、
（ｈ）測定工程、等の数多くの工程を経て検体調整され
る。すなわち、既知の抗原10をマイクロプレート11に固
相化し（ａ）、この固相化されたマイクロプレート11に
検体３の溶液を反応させ（ｂ）、その後に洗浄を行なっ
て未反応の検体３の溶液を除去し（ｃ）、次に酵素標識
抗体12を加えて酵素標識を行ない（ｄ）、その後、さら
に未反応の酵素標識抗体12を洗浄、除去し（ｅ）、前記
までの工程で得られた標識検体複合体13に気質14を反応
させ（ｆ）、この反応を停止液で停止（ｇ）させた後
に、紫外線を照射して測定（ｈ）していた。これらの工
程のうち、洗浄工程は通常、５〜６回反覆洗浄されてい
る。洗浄が不完全な場合、測定工程においてバックグラ
ンドが上昇するので、検出感度の低下あるいは誤判断の
原因になる。本発明の方法とELISA法とを比較すると、
本発明の方が３工程短縮できる利点がある。

本発明の場合、表面積の大きな非磁性体粒子の表面で３
次元的に検体を捕捉し、磁性体標識抗体と抗原抗体反応
するから、従来の２次元的に反応させる方法よりも反応
時間を短縮することができる。また、この特徴のため、
極微量の検体の捕捉にも有利である。捕捉・反応過程で
攪拌処理を併用すれば更に捕捉・反応処理時間の短縮が
できる。また、本発明の場合、遠心力によって分離する
から、洗浄よりも確実な分離が行なわれる。遠心条件は
使用する非磁性体粒子と磁性体標識抗体との比重差に応
じて最適な条件が決められる。

〔実施例２〕 本実施例は患者のうがい液からインフルエンザウイルス
を検出する実験例である。

患者のうがい液を30ml採取し、まず、前処理として3000
rpm、10分間の遠心にかけて異物等を沈澱させて除去し
た後、上清を20000rpm、30分間超遠心機にかけインフル
エンザウイルスを沈澱させ、沈澱物1mlを採取して検体
とした。

次に、ウイルスが非特異的に付着するように活性化した
アクリルポリマーからなる非磁性体粒子を用いて35℃、
10時間インキュベートの条件で検体を捕捉した。検体を
捕捉処理後、前記非磁性体粒子のウイルスが付着してい
ない表面をBSAで被覆し前記非磁性体粒子を不活性化し
た。この後の検体調整工程は実施例１の（ｃ）以降と同
じ方法で行なった。検体調整を終えた検体を前記レーザ
磁気免疫測定方法で測定したところ、Ａ型のインフルエ
ンザウイルスが検出された。

従来、インフルエンザウイルスを検出するためには、う
がい液中の微量なウイルスを鶏卵で培養し、１千万個以
上にまでウイルスを増殖した後、血液凝固法で検出する
方法が採られていた。従来法では検査結果が出るまで１
カ月程度かかっていた。本発明の方法は、ウイルスを培
養せずに、直接検出できる感度を有しているから、本実
施例のインフルエンザウイルスに限らず、あらゆるウイ
ルスにも適用できる。例えば、ウイルスの培養が困難で
ある未知のウイルスの検出にも適用できる。

〔発明の効果〕

以上詳述のように、本発明に係るレーザ磁気免疫測定方
法を実施するための検体調整方法は、検体を捕捉するた
めの非磁性体粒子と標識物質として磁性微粒子を用い
て、遠心分離によって検体を調整することが特徴であ
る。RIA法以上の検出感度を有しているから、従来不可
能であった感染直後の抗原検査が実施できる。更に、非
磁性体粒子、標識体として用いる磁性超微粒子は、放射
線あるいは毒性の点では問題なく、検体に対して安定な
ものを容易に入手できる。

本発明は、実施例に上げたウイルスの検出に止まらず、
癌の早期診断、アレルギー、細菌等の検査や従来RIA法
が適用されていたペプチドホルモン等の種々のホルモン
あるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定にも応
用することが可能である。従って、従来は限定された施
設でRIA法によらなければ実施できなかった精密な測定
を、一般的な環境で広く実施することが可能となる。集
団検診等のような一般的な状況で、各種のウイルス、癌
等のスクリーニング検査等の精密な測定が広く実施でき
れば、癌あるいはウイルス性疾患等の早期診断が可能と
なり、有効な早期治療を的確に実施することが可能とな
る。このように、本発明が医学・医療の分野で果たす効
果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の検体調整方法の一実施例を説明する工
程図であって、（ａ）は非磁性体粒子を液中分散する工
程図、（ｂ）は検体を捕捉する工程図、（ｃ）は磁気標
識工程図、（ｄ）は遠心分離工程図、（ｅ）は測定工程
図である。 第２図は比較対照例であって、現在、エイズ抗体検査等
に広く用いられている、ELISA法の検体調整工程図であ
る。ELISA法の場合、（ａ）は固相化工程図、（ｂ）は
検体捕捉工程図、（ｃ）は洗浄工程図、（ｄ）は酵素標
識工程図、（ｅ）は洗浄工程図、（ｆ）は基質反応工程
図、（ｇ）は反応停止工程図、（ｈ）は測定工程図であ
る。 １……非磁性体粒子、２……抗体、３……検体、４……
磁性体標識抗体、５……抗原抗体複合体（磁性体標識検
体複合体）。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−79070（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−132060（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−152954（ＪＰ，Ａ) 米国特許4115535（ＵＳ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】磁性体標識抗体よりも充分に大きな質量を
   有する非磁性体粒子に検体を固定させる第１の工程と、
   前記検体と前記磁性体標識抗体とを抗原抗体反応させる
   第２の工程と、前記第２の工程で得られた磁性体標識検
   体複合体と前記第２の工程で残存する未反応の前記磁性
   体標識抗体とを遠心により分離することを特徴とするレ
   ーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。
2. 【請求項２】前記第１の工程が非磁性体粒子の表面上に
   固定された既知の抗体と検体とを抗原抗体反応によって
   特異的に結合させることを特徴とする請求項１記載のレ
   ーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。