JP2745683B2 - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法のう
ち、極めて感度の高い測定法に属するものであり、極微
量の検体から特定の抗体又は抗原を検出可能とする免疫
測定法に関するものである。
ち、極めて感度の高い測定法に属するものであり、極微
量の検体から特定の抗体又は抗原を検出可能とする免疫
測定法に関するものである。
従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が種々の疾
病の早期検出法や極微量の物質検出法として各種開発さ
れている。これは疾病の原因であるウイルスやポリペプ
チド等の抗原が生体内に侵入した際に生体内にて生成さ
れる抗体が、前記抗原と特異的に反応することで、生体
機能や構造を防御するいわゆる抗原抗体反応を活用し、
ウイルスやポリペプチド等の抗原又は生成された抗体を
検出しようとするものである。該目的のための従来技術
として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、
フォトイムノアッセイ、螢光イムノアッセイ、磁気イム
ノアッセイがある。これらの方法は、それぞれ、アイソ
トープ、酵素、微粒子散乱体、螢光、磁性体微粒子を、
抗原又は抗体に標識し、前記標識体と特異的に反応する
抗体又は抗原の定量を行うものである。例えば、フォト
イムノアッセイとして、ラテックス等の不溶性担体粒子
に担持させた抗原又は抗体と抗原又は抗体あるいはその
混合物とを液体媒体中で反応させ、その反応の進行に伴
う反応混合物の透過率の減少（すなわち吸光度の増加）
からその抗原抗体反応の速度を測定し、さらにその速度
から被検体中の抗原又は抗体の濃度を定量する方法が知
られている。（特公昭58−11575号公報）。
病の早期検出法や極微量の物質検出法として各種開発さ
れている。これは疾病の原因であるウイルスやポリペプ
チド等の抗原が生体内に侵入した際に生体内にて生成さ
れる抗体が、前記抗原と特異的に反応することで、生体
機能や構造を防御するいわゆる抗原抗体反応を活用し、
ウイルスやポリペプチド等の抗原又は生成された抗体を
検出しようとするものである。該目的のための従来技術
として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、
フォトイムノアッセイ、螢光イムノアッセイ、磁気イム
ノアッセイがある。これらの方法は、それぞれ、アイソ
トープ、酵素、微粒子散乱体、螢光、磁性体微粒子を、
抗原又は抗体に標識し、前記標識体と特異的に反応する
抗体又は抗原の定量を行うものである。例えば、フォト
イムノアッセイとして、ラテックス等の不溶性担体粒子
に担持させた抗原又は抗体と抗原又は抗体あるいはその
混合物とを液体媒体中で反応させ、その反応の進行に伴
う反応混合物の透過率の減少（すなわち吸光度の増加）
からその抗原抗体反応の速度を測定し、さらにその速度
から被検体中の抗原又は抗体の濃度を定量する方法が知
られている。（特公昭58−11575号公報）。
しかし、かかる従来技術においては、種々の制約、例
えばラジオイムノアッセイでのアイソトープの半減期に
関連する廃棄物処理問題、酵素イムノアッセイ、フォト
イムノアッセイ及び螢光イムノアッセイでの検出感度の
問題、磁気イムノアッセイでの測定環境の問題等が存在
し、さらに、従来技術における検出法では極小量の抗原
あるいは抗体を検出することは極めて困難なことがあ
る。
えばラジオイムノアッセイでのアイソトープの半減期に
関連する廃棄物処理問題、酵素イムノアッセイ、フォト
イムノアッセイ及び螢光イムノアッセイでの検出感度の
問題、磁気イムノアッセイでの測定環境の問題等が存在
し、さらに、従来技術における検出法では極小量の抗原
あるいは抗体を検出することは極めて困難なことがあ
る。
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討した
結果、前記諸方法の検出感度と同程度又はそれ以上の検
出感度を有する新しい免疫測定法を生みだした。
結果、前記諸方法の検出感度と同程度又はそれ以上の検
出感度を有する新しい免疫測定法を生みだした。
即ち、本発明の要旨は、 （ａ） 少なくともその表面に導電性層を有する基板上
に、抗原又は抗体を担持する工程 （ｂ） 該基板上の抗原又は抗体が担持されていない部
分を、該抗原又は抗体に不活性な物質で被覆する工程 （ｃ） 該基板上に担持された抗原又は抗体と試料中の
抗体又は抗原を反応させる工程 （ｄ） 抗原・抗体反応物に導電性微粒子を担持する工
程 （ｅ） 該基板にバイアス電圧を加えて、該基板の導電
性層に流れるトンネル電流を測定する工程 から成ることを特徴とする免疫測定法に存する。つま
り、その表面に導電性層を有する基板上の抗原・抗体反
応物に担持された導電性微粒子を、トンネル効果を利用
した測定機器、例えば、走査型トンネル顕微鏡（Scanni
ng Tunneling Microscope、以下、STMと略す）等を用い
て測定する免疫測定法であり、本発明によれば抗原抗体
反応で生じた複合体に標識した導電性微粒子を例えば、
STMで測定検出することにより、極微小かつ極微量の未
知の抗原又は抗体を測定検出することができる。例えば
STMのような測定機器の高感度及び高空間分解能特性を
利用するので、特に従来の検出法では測定の極めて困難
であった極小量の抗原あるいは抗体を検出することを可
能としている。
に、抗原又は抗体を担持する工程 （ｂ） 該基板上の抗原又は抗体が担持されていない部
分を、該抗原又は抗体に不活性な物質で被覆する工程 （ｃ） 該基板上に担持された抗原又は抗体と試料中の
抗体又は抗原を反応させる工程 （ｄ） 抗原・抗体反応物に導電性微粒子を担持する工
程 （ｅ） 該基板にバイアス電圧を加えて、該基板の導電
性層に流れるトンネル電流を測定する工程 から成ることを特徴とする免疫測定法に存する。つま
り、その表面に導電性層を有する基板上の抗原・抗体反
応物に担持された導電性微粒子を、トンネル効果を利用
した測定機器、例えば、走査型トンネル顕微鏡（Scanni
ng Tunneling Microscope、以下、STMと略す）等を用い
て測定する免疫測定法であり、本発明によれば抗原抗体
反応で生じた複合体に標識した導電性微粒子を例えば、
STMで測定検出することにより、極微小かつ極微量の未
知の抗原又は抗体を測定検出することができる。例えば
STMのような測定機器の高感度及び高空間分解能特性を
利用するので、特に従来の検出法では測定の極めて困難
であった極小量の抗原あるいは抗体を検出することを可
能としている。
以下、本発明を詳細に説明する。
はじめに、STMによる導電性粒子標識体の測定検出の
説明をする。第１図において、１はSTM等の探針で、２
の基板に吸着した抗原抗体複合体３、５に標識させた導
電性微粒子６を測定検出する。特定の又は未知の抗原又
は抗体の有無又は存在量の定量化処理は、第２図に示す
ように８の導電性粒子標識体のある基板を二次元（x,
y）的に７のSTM装置等で走査測定し、導電性粒子標識体
の形状を凹凸像として画像表示した後行われる。STM等
の装置で走査測定する環境はSTMの原理上、真空中、ガ
ス中、液中、大気中のいずれでも可能である。測定用ST
M等の機器の構成及び操作の簡易性の点では、大気中で
の測定が好ましい。
説明をする。第１図において、１はSTM等の探針で、２
の基板に吸着した抗原抗体複合体３、５に標識させた導
電性微粒子６を測定検出する。特定の又は未知の抗原又
は抗体の有無又は存在量の定量化処理は、第２図に示す
ように８の導電性粒子標識体のある基板を二次元（x,
y）的に７のSTM装置等で走査測定し、導電性粒子標識体
の形状を凹凸像として画像表示した後行われる。STM等
の装置で走査測定する環境はSTMの原理上、真空中、ガ
ス中、液中、大気中のいずれでも可能である。測定用ST
M等の機器の構成及び操作の簡易性の点では、大気中で
の測定が好ましい。
本発明方法において、基板としては、それ自体導電性
（電気伝導度１×10S/cm〜6.2×105S/cm）のもので表面
の平面性に優れているもの、例えば、高配向焼結グラフ
ァイト（Highly Oriented Pyrodytic Graphite;HOPG）K
ishグラファイト又はシリコンウエハー等、あるいは表
面あらさが、基板上の抗原抗体複合体に標識する導電性
微粒子の（望ましくは）平均粒径の半分以下程度である
もの、例えば、金薄板、黒鉛、或いは電子顕微鏡用の銅
製試料メシュ等が用いられ、それ自体導電性でないもの
（例えば、雲母シート、方解石薄板等）のときは、その
表面に導電性層を設ける。例えば、導電性物質として、
金パラジウム、白金パラジウム又はカーボンあるいはそ
れらの組み合わせを用い、層形成方法として、例えば、
真空蒸着法を用いる。この層の厚みは、望ましくは蒸着
層の表面あらさが、基板上の抗原抗体複合体に標識する
導電性微粒子の平均粒径の半分以下程度である様になる
厚みである。
（電気伝導度１×10S/cm〜6.2×105S/cm）のもので表面
の平面性に優れているもの、例えば、高配向焼結グラフ
ァイト（Highly Oriented Pyrodytic Graphite;HOPG）K
ishグラファイト又はシリコンウエハー等、あるいは表
面あらさが、基板上の抗原抗体複合体に標識する導電性
微粒子の（望ましくは）平均粒径の半分以下程度である
もの、例えば、金薄板、黒鉛、或いは電子顕微鏡用の銅
製試料メシュ等が用いられ、それ自体導電性でないもの
（例えば、雲母シート、方解石薄板等）のときは、その
表面に導電性層を設ける。例えば、導電性物質として、
金パラジウム、白金パラジウム又はカーボンあるいはそ
れらの組み合わせを用い、層形成方法として、例えば、
真空蒸着法を用いる。この層の厚みは、望ましくは蒸着
層の表面あらさが、基板上の抗原抗体複合体に標識する
導電性微粒子の平均粒径の半分以下程度である様になる
厚みである。
上記基板上で検出の対象となる抗原又は抗体に関して
は、抗体はタンパク質で構成されており、抗原抗体反応
として生体内で生成されるいわゆる抗体そのもの又はそ
の抗体の一部であり、一方、抗原は、例えば、タンパク
質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、
ウイルス等、種々の物が挙げられる。上記基板のような
不溶性担体に抗体又は抗原を担持させる方法は、すでに
多くの方法が提案されている。物理的に吸着させる方法
と、化学的に共有結合させる方法があり、化学的に結合
させるには、例えば、担体をグルタルアルデヒドで処理
して、抗体又は抗原に結合させる。担持量は、用いる抗
原及び抗体の分子量により異なるが、１×1010〜１×10
17分子/cm2程度が好ましい。
は、抗体はタンパク質で構成されており、抗原抗体反応
として生体内で生成されるいわゆる抗体そのもの又はそ
の抗体の一部であり、一方、抗原は、例えば、タンパク
質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、
ウイルス等、種々の物が挙げられる。上記基板のような
不溶性担体に抗体又は抗原を担持させる方法は、すでに
多くの方法が提案されている。物理的に吸着させる方法
と、化学的に共有結合させる方法があり、化学的に結合
させるには、例えば、担体をグルタルアルデヒドで処理
して、抗体又は抗原に結合させる。担持量は、用いる抗
原及び抗体の分子量により異なるが、１×1010〜１×10
17分子/cm2程度が好ましい。
抗原又は抗体を担持させた後の基板の未結合部位に対
しては、免疫反応的に不活性な物質が被覆され、ウシ血
清アルブミン（以下、BSAと略す）のほかに、血清成
分、ゼラチン、ポリペプチド、ポリビニルピロリドンの
ようなポリマーや多糖類等が好ましい。通常は、物理吸
着により被覆を行う。
しては、免疫反応的に不活性な物質が被覆され、ウシ血
清アルブミン（以下、BSAと略す）のほかに、血清成
分、ゼラチン、ポリペプチド、ポリビニルピロリドンの
ようなポリマーや多糖類等が好ましい。通常は、物理吸
着により被覆を行う。
本発明の対象となる試料の種類としては、血液、血
清、血しよう、尿、糞便、汗、唾液等の体液、食品等か
ら目的物質を抽出した抽出液、細胞等の切片が該当す
る。反応方法としては、基板と上記の免疫反応物質を直
接反応させるか、或いは、抽出した液を反応させる。細
胞等の切片を用いる場合は基板に試料を直接固定化する
のが望ましい。
清、血しよう、尿、糞便、汗、唾液等の体液、食品等か
ら目的物質を抽出した抽出液、細胞等の切片が該当す
る。反応方法としては、基板と上記の免疫反応物質を直
接反応させるか、或いは、抽出した液を反応させる。細
胞等の切片を用いる場合は基板に試料を直接固定化する
のが望ましい。
上記の基板上の免疫反応物質に担持される導電性微粒
子の電気伝導度は通常１×103S/cm〜6.2×105S/cm、好
ましくは、4.5×104S/cm〜6.2×105S/cmであり、導電性
微粒子としては、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド
等の金属コロイド粒子等のほか、フェリチン等の金属原
子を含むタンパク質、アルミナ、フェライト等の金属酸
化物粒子、導電性有機高分子等も好ましい。導電性微粒
子の粒径は、通常1nm〜100nmであり、好ましくは、5nm
〜50nmである。担持方法は、物理的に吸着させる方法
と、化学的に共有結合させる方法があり、化学的に結合
させるには、例えば、担体をグルタルアルデヒドで処理
して、抗体又は抗原に結合させる。
子の電気伝導度は通常１×103S/cm〜6.2×105S/cm、好
ましくは、4.5×104S/cm〜6.2×105S/cmであり、導電性
微粒子としては、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド
等の金属コロイド粒子等のほか、フェリチン等の金属原
子を含むタンパク質、アルミナ、フェライト等の金属酸
化物粒子、導電性有機高分子等も好ましい。導電性微粒
子の粒径は、通常1nm〜100nmであり、好ましくは、5nm
〜50nmである。担持方法は、物理的に吸着させる方法
と、化学的に共有結合させる方法があり、化学的に結合
させるには、例えば、担体をグルタルアルデヒドで処理
して、抗体又は抗原に結合させる。
本発明においては、第一図に示すように、STM等の探
針１で、基板２に担持させた抗原抗体複合体３、５及び
導電性微粒子６と導電性探針１の間にバイアス電圧を印
加することによりトンネル現象を発生せしめ、トンネル
電流を生じさせるが、STM装置において、電気信号の測
定条件に関しては、望ましくは、バイアス電圧（VB）及
びトンネル電流（IT）が導電性微粒子標識体を含む試料
基板全体で、0.001V＜VB＜3V程度、及び、0.001nA＜1T
＜2nA程度であり、画像形成方法としてのSTMの走査モー
ドとしては、通常、定電流モード、弱サーボ電流イメー
ジモードが好ましく、その他、例えば、コンスタントハ
イトモードも考えられる。導電性探針としては、例え
ば、タングステン、白金、白金−イリジウム等の導電性
の良い金属探針等が好ましく、その他、例えば、カーボ
ンファイバよりなる探針、或いは、白金又は白金−パラ
ジウム或いはカーボン等の導電性金属薄膜で被覆された
ガラス片先端或いは電極又はダイヤモンド針も有用なも
のとして掲げられる。
針１で、基板２に担持させた抗原抗体複合体３、５及び
導電性微粒子６と導電性探針１の間にバイアス電圧を印
加することによりトンネル現象を発生せしめ、トンネル
電流を生じさせるが、STM装置において、電気信号の測
定条件に関しては、望ましくは、バイアス電圧（VB）及
びトンネル電流（IT）が導電性微粒子標識体を含む試料
基板全体で、0.001V＜VB＜3V程度、及び、0.001nA＜1T
＜2nA程度であり、画像形成方法としてのSTMの走査モー
ドとしては、通常、定電流モード、弱サーボ電流イメー
ジモードが好ましく、その他、例えば、コンスタントハ
イトモードも考えられる。導電性探針としては、例え
ば、タングステン、白金、白金−イリジウム等の導電性
の良い金属探針等が好ましく、その他、例えば、カーボ
ンファイバよりなる探針、或いは、白金又は白金−パラ
ジウム或いはカーボン等の導電性金属薄膜で被覆された
ガラス片先端或いは電極又はダイヤモンド針も有用なも
のとして掲げられる。
未知の抗原又は抗体の有無又は存在量の定量化は、第
２図に示すように８の導電性微粒子標識体のある基板を
二次元的に７のSTM等の装置で走査測定し、導電性微粒
子標識体の形状を凹凸像として画像化することで、抗原
又は抗体の有無が判定でき、定量化に関しては、導電性
微粒子標識体の凹凸像の個数を計数し、予め濃度既知の
試料により作製した抗原又は抗体の検量線を用いて行う
ことでできる。
２図に示すように８の導電性微粒子標識体のある基板を
二次元的に７のSTM等の装置で走査測定し、導電性微粒
子標識体の形状を凹凸像として画像化することで、抗原
又は抗体の有無が判定でき、定量化に関しては、導電性
微粒子標識体の凹凸像の個数を計数し、予め濃度既知の
試料により作製した抗原又は抗体の検量線を用いて行う
ことでできる。
実施例を２例、第３図と第４図のブロック図で説明す
る。
る。
実施例１ ヒトイムノグロブリン（以下、IgGと略す；抗原）とウ
サギ抗ヒトIgG（抗体）による抗原抗体反応検出（免疫
検査）モデル系 第３図に示す２の導電性基板（電気伝導度4.5×105S/
cm、金薄板）を1mg/mlのヒトIgGを含むリン酸緩衝生理
食塩水（10mMリン酸緩衝液、150mM塩化ナトリウム、pH
7.4;以下、PBSと略す）中で１時間、摂氏37度の条件で
浸しておき、３′で示すヒトIgGを導電性基板表面２に
付着させる。その後、基板面上の過剰のIgGをPBSで洗い
流す。
サギ抗ヒトIgG（抗体）による抗原抗体反応検出（免疫
検査）モデル系 第３図に示す２の導電性基板（電気伝導度4.5×105S/
cm、金薄板）を1mg/mlのヒトIgGを含むリン酸緩衝生理
食塩水（10mMリン酸緩衝液、150mM塩化ナトリウム、pH
7.4;以下、PBSと略す）中で１時間、摂氏37度の条件で
浸しておき、３′で示すヒトIgGを導電性基板表面２に
付着させる。その後、基板面上の過剰のIgGをPBSで洗い
流す。
上記基板の抗原未吸着表面部は、BSA1％を含むPBSに
１時間、摂氏37度で浸すことにより、４′で示すBSAで
ブロックされる。その後、基板を0.05％のTween20をふ
くむPBS（以下、PBSTと略す）で３度洗う。
１時間、摂氏37度で浸すことにより、４′で示すBSAで
ブロックされる。その後、基板を0.05％のTween20をふ
くむPBS（以下、PBSTと略す）で３度洗う。
前述と工程で作製された抗体検出用の基板は１％のBS
Aを含むPBST中の５′で示すウサギ抗ヒトIgGで抗原抗体
反応処理される。摂氏37度で、１時間インキュベイショ
ンした後、過剰の抗体は、PBSTで洗うことにより、除去
される。
Aを含むPBST中の５′で示すウサギ抗ヒトIgGで抗原抗体
反応処理される。摂氏37度で、１時間インキュベイショ
ンした後、過剰の抗体は、PBSTで洗うことにより、除去
される。
先に述べた工程で作製された基板の抗原抗体複合体を
STMにより、効率よく検出するために、６′で示す導電
性の金コロイド標識プロティンＡ（電気伝導度4.5×105
S/cm、平均粒度15nm）を、20mMトリス、150mM塩化ナト
リウム、0.1％BSA、0.1％Tween20、0.02％アジ化ナトリ
ウムからなる溶液中で、基板上の抗原抗体複合体と反応
させる。摂氏４度で、約12時間、インキュベイトした
後、不要な非特異的に吸着した金コロイドはPBSTで洗浄
することにより除去する。
STMにより、効率よく検出するために、６′で示す導電
性の金コロイド標識プロティンＡ（電気伝導度4.5×105
S/cm、平均粒度15nm）を、20mMトリス、150mM塩化ナト
リウム、0.1％BSA、0.1％Tween20、0.02％アジ化ナトリ
ウムからなる溶液中で、基板上の抗原抗体複合体と反応
させる。摂氏４度で、約12時間、インキュベイトした
後、不要な非特異的に吸着した金コロイドはPBSTで洗浄
することにより除去する。
掛かる工程により作製されたヒトIgG（抗原）とウサ
ギ抗ヒトIgG（抗体）による抗原抗体反応検出（免疫検
査）モデル系試料は、第２図に示す７のSTM測定機器
（バイアス電圧0.025V、トンネル電流0.5mA）と試料８
の構成で測定検出される。
ギ抗ヒトIgG（抗体）による抗原抗体反応検出（免疫検
査）モデル系試料は、第２図に示す７のSTM測定機器
（バイアス電圧0.025V、トンネル電流0.5mA）と試料８
の構成で測定検出される。
実施例２ Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の検出 第４図に示す２の導電性基板（電気伝導度１×103S/c
m、HOPGグラファイト）はまず始めに、２％の３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランを含むアセトン溶液で、
２時間インキュベイトされた後、アセトンと純水で、順
次、洗浄される。その後、２％のグルタルアルデヒドを
含むPBSで、室温で３時間インキュベイトされ、250mMの
リン酸緩衝液（以下PBと略す）で洗われる。この前処理
後、基板は、９で示すウサギの抗Ｂ型肝炎表面抗原（以
下、HBsAgと略す）Ｆ（ab′）２を含むPBS溶液で、室温
下15時間インキュベイトされ、基板上の過剰の抗体は25
0mMのPBで、洗い流される。上記基板の未反応表面部
は、３％のウサギ血清を含むPBSに２時間、室温で浸す
ことにより、10で示すウサギ血清でブロックされる。そ
の後、基板をPBSTで３度洗う。
m、HOPGグラファイト）はまず始めに、２％の３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランを含むアセトン溶液で、
２時間インキュベイトされた後、アセトンと純水で、順
次、洗浄される。その後、２％のグルタルアルデヒドを
含むPBSで、室温で３時間インキュベイトされ、250mMの
リン酸緩衝液（以下PBと略す）で洗われる。この前処理
後、基板は、９で示すウサギの抗Ｂ型肝炎表面抗原（以
下、HBsAgと略す）Ｆ（ab′）２を含むPBS溶液で、室温
下15時間インキュベイトされ、基板上の過剰の抗体は25
0mMのPBで、洗い流される。上記基板の未反応表面部
は、３％のウサギ血清を含むPBSに２時間、室温で浸す
ことにより、10で示すウサギ血清でブロックされる。そ
の後、基板をPBSTで３度洗う。
前述の工程で作製された抗原検出用の基板は11で示す
HBsAgを含む検体で抗原抗体反応処理される。摂氏37度
で、１時間インキュベイションした後、PBSTで洗う。こ
の基板は更に、12で示す二次抗体としてウサギの抗−HB
sAgIgGを含む溶液で、摂氏37度にて、２時間インキュベ
イションされる。過剰の二次抗体は、PBSTで洗うことに
より、除去される。
HBsAgを含む検体で抗原抗体反応処理される。摂氏37度
で、１時間インキュベイションした後、PBSTで洗う。こ
の基板は更に、12で示す二次抗体としてウサギの抗−HB
sAgIgGを含む溶液で、摂氏37度にて、２時間インキュベ
イションされる。過剰の二次抗体は、PBSTで洗うことに
より、除去される。
前述の工程で作製された基板上の抗体−抗原−抗体複
合体をSTMにより効率よく検出するために、13で示す導
電性の金コロイド標識プロティンＡ（電気伝導度4.5×1
05S/cm、平均粒径15nm）を、20mMトリス、150mM塩化ナ
トリウム、0.1％BSA、0.1％Tween20、0.02％アジ化ナト
リウムからなる溶液中で、基板上の抗原抗体複合体と反
応させる。摂氏４度で、約12時間、インキュベイトした
後、不要な、非特異的に吸着した金コロイドは、PBSTで
洗浄することにより除去する。
合体をSTMにより効率よく検出するために、13で示す導
電性の金コロイド標識プロティンＡ（電気伝導度4.5×1
05S/cm、平均粒径15nm）を、20mMトリス、150mM塩化ナ
トリウム、0.1％BSA、0.1％Tween20、0.02％アジ化ナト
リウムからなる溶液中で、基板上の抗原抗体複合体と反
応させる。摂氏４度で、約12時間、インキュベイトした
後、不要な、非特異的に吸着した金コロイドは、PBSTで
洗浄することにより除去する。
掛かる工程により作製されたＢ型肝炎ウイルス表面抗
原の検出（免疫検査）試料は、第２図に示す７のSTM測
定機器（バイアス電圧0.025V、トンネル電圧0.5mAと試
料８の構成で測定検出される。
原の検出（免疫検査）試料は、第２図に示す７のSTM測
定機器（バイアス電圧0.025V、トンネル電圧0.5mAと試
料８の構成で測定検出される。
以上詳述したように本発明によれば、基板上に、検体
液中にある抗原あるいは抗体を吸着することで、検体液
中に分散する極めて希薄な抗原あるいは抗体を検出する
ことができる（濃縮検出）。更に、STM等の高空間分解
能を利用するので、基板上の極小量の抗原あるいは抗体
を検出することができる（高分解能検出）。濃縮検出と
高分解能検出の相乗効果により従来のいかなるイムノア
ッセイ法より簡便に、安全に、安価に、効率良く、極め
て高感度にイムノアッセイを行える。
液中にある抗原あるいは抗体を吸着することで、検体液
中に分散する極めて希薄な抗原あるいは抗体を検出する
ことができる（濃縮検出）。更に、STM等の高空間分解
能を利用するので、基板上の極小量の抗原あるいは抗体
を検出することができる（高分解能検出）。濃縮検出と
高分解能検出の相乗効果により従来のいかなるイムノア
ッセイ法より簡便に、安全に、安価に、効率良く、極め
て高感度にイムノアッセイを行える。
第１図はこの発明の１実施例を示すブロック図、第２図
は、第１図の実施例の動作説明のための装置のブロック
図、第３図は、第１図における試料を作製する工程の第
１例を示す図、第４図は、第１図における試料を作製す
る工程の第２例を示す図である。 図中、１はSTM装置等の探針の最先端の拡大模式図、２
は導電性基板、３は抗原、４は試料、５は抗体、６は導
電性微粒子、７はSTM等の装置、８は導電性粒子標識体
のある基板を示し、図３で３′はヒトIgG、４′はウサ
ギ抗ヒトIgG、６′は導電性の金コロイド標識プロティ
ンＡを示す。図４で、９はウサギの抗Ｂ型肝炎表面抗原
（HBsAg）Ｆ（ab′）２、10はウサギ血清、11はHBsAg、
12はウサギの抗−HBsAgIgG、13は導電性の金コロイド標
識プロティンＡである。
は、第１図の実施例の動作説明のための装置のブロック
図、第３図は、第１図における試料を作製する工程の第
１例を示す図、第４図は、第１図における試料を作製す
る工程の第２例を示す図である。 図中、１はSTM装置等の探針の最先端の拡大模式図、２
は導電性基板、３は抗原、４は試料、５は抗体、６は導
電性微粒子、７はSTM等の装置、８は導電性粒子標識体
のある基板を示し、図３で３′はヒトIgG、４′はウサ
ギ抗ヒトIgG、６′は導電性の金コロイド標識プロティ
ンＡを示す。図４で、９はウサギの抗Ｂ型肝炎表面抗原
（HBsAg）Ｆ（ab′）２、10はウサギ血清、11はHBsAg、
12はウサギの抗−HBsAgIgG、13は導電性の金コロイド標
識プロティンＡである。
Claims (1)
- 【請求項１】（ａ） 少なくともその表面に導電性層を
有する基板上に抗原又は抗体を担持する工程 （ｂ） 該基板上の抗原又は抗体が担持されていない部
分を、該抗原又は抗体に不活性な物質で被覆する工程 （ｃ） 該基板上に担持された抗原又は抗体と試料中の
抗体又は抗原を反応させる工程 （ｄ） 抗原・抗体反応物に導電性微粒子を担持する工
程 （ｅ） 該基板にバイアス電圧を加えて該基板の導電性
層に流れるトンネル電流を測定する工程 から成ることを特徴とする免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13677489A JP2745683B2 (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13677489A JP2745683B2 (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | 免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH032566A JPH032566A (ja) | 1991-01-08 |
| JP2745683B2 true JP2745683B2 (ja) | 1998-04-28 |
Family
ID=15183204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13677489A Expired - Fee Related JP2745683B2 (ja) | 1989-05-30 | 1989-05-30 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2745683B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04113257A (ja) * | 1990-09-04 | 1992-04-14 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 濃度測定方法 |
| CA2100683A1 (en) * | 1991-02-28 | 1992-08-29 | Stephen D. Stroupe | Scanning probe microscopy immunoassay |
| JP5419012B2 (ja) * | 2010-01-12 | 2014-02-19 | 独立行政法人理化学研究所 | プローブが固定された基体の製造方法及び製造装置 |
-
1989
- 1989-05-30 JP JP13677489A patent/JP2745683B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH032566A (ja) | 1991-01-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |