JPS60242361A - 酸化還元酵素を用いる化学的分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は１対の特異的に結合する物質の−っを分析する
方法およびこの方法を実施するための装置および試薬の
キットに関する。

従来の技術 生物活性物質、とくに血液、唾液、尿のような体液に低
濃度で含まれている生物活性物質の急速、正確な分析は
、例えば妊娠や薬物の過大投与、新生児代謝異常、ホル
モン異常、糖尿病などの疾患の診断に有用でおる。この
種の分析法の多くは、分析される種［以下、リガンド（
Ｉ　ｉｇａｎｄ）という］と、リガンドと特異的に結合
する種（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）（以下、特異的結合体またはパートナ
−という）との間の錯体形成を利用している。その際、
錯体形成の範囲または程度は、存在するりガントの量の
関数である。

例えば化学的または生化学的標識を用いて、錯体形成の
範囲または程度をモニターすることによって、リガンド
を分析することができる。このために、ラジオアイソト
ープ、酵素、スピン、蛍光等の標識法が知られている。

ラジオアイソトープは広く用いられているが、たとえば
寿命が短いので、しばしば装置を再調整する必要があり
、また安全な取扱いについて法規上の要求がある。さら
に装置が複雑で手数がかかり、コストが高い。

この種の欠点のない方法として、酵素で標識（ラベル）
する方法が注目されている。この方法は均一系（ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ）と非均−系（ｈｅｔｅｒｏ？ｑｅｎ
ｅｏｕｓ）の二つの系に分かれる。非力−系分析法では
、錯体形成時にラベルされた試薬が特異的結合体（パー
トナ−）と結合されるかどうかに拘らず、酵素ラベルの
活性は基質に対して定常的であるから、従って錯化され
または錯化されない物質のラベルを測定する前に、反応
物を二分する必要がある。均一系分析法では、錯化反応
間に、試薬がその特異的結合体と結合することによって
、ラベルの活性が変化する。

分離工程は不必要である。基質に対する標識の活性は錯
体形成の結果変化する。従って活性の変化を調べること
によって、リガンドを調べることができる。

均一系分析法は一般的に高感度であって、ラジオアイソ
トープ標識の感度に相当する。非均−系法は簡単で急速
であり、この点において放射性物質の標識よりも優れて
いる。均一系分析法はとくに自動化に適している。均−
未決も不均一法も共に、法規上の制限のないこと、作業
のコストが安く、熟練を要しないことおよび試薬が安全
で安定であることにおいて、放射性同位元素よりも優れ
ている。

しかし酵素ラベルをモニターする従来の方法は、すべて
間接法でおる。たとえば分光測光法［基質の反応によっ
て、または第２次反応によって発色された色を調べる方
法で、この場合、基質反応の産物は、所望により第２抗
体の存在下に、色原体（クロモゲン）と反応する。液体
の色の変化で酵素活性を調べる方法である］、ネフエメ
トリ−［反応産物による溶液の濁度の増大は酵素活性に
比例する］、蛍光法または放射性物質の使用［蛍光また
は放射性標識の外観によってモニターする、　方法］あ
るいは溶液のＤＨの変化を調べる方法によって、酵素触
媒反応産物の外観を調べる方法が行なわれている。また
は、たとえば大気中の酸素と反応する酸化反応の場合、
反応体の消費をカス分析法で調べることかできる。

たとえば酵素標識として、グルコース・オキシダーゼ（
Ｅ、Ｃ，１，１，３，４，、＞（ＧＯＤ＞を用いる場合
、ＧＯＤはβ−Ｄ−グルコースの酸化によるＤ−グルコ
ノ−δ−ラク］〜ンの生成（副産物は過酸化水素）を触
媒する。標識は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと原色
体との存在下において、過酸化水素の還元によって（次
式で示される）モニターされる。

Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン十Ｈ２Ｏ２会 ４ヨ　（酸化さ担有色） この種の間接的モニター法は１次反応も２次反応も量的
に不充分であるか、または終点評価が不正確であり、感
度と特異性とが高くないので時代おくれである。使方に
おいて、放射性物質での標識は安全性と試薬の劣化とい
う欠点がある。

発明が解決しようとする問題点 本発明の主目的は、ラベルの使用や取扱いに上記の欠点
のない、直接的にモニターできる、高い感度と特異性と
を備えた、容易な酵素標識分析法を提供することにある
。

問題点を解決するための手段 本発明は、酵素標識の分析に電気化学的方法を応用する
ことによって、酵素標識の活性を直接的にモニターする
ことができるという知見に基いている。

本発明は、サンプル中のリガンドを分析する方法を提供
する。本発明の方法は、一つの電気を有する電気化学的
装置と次の成分または試薬とを用いることを特徴として
いる。

（ａ）サンプル （ｂ）リガンドに特異的に結合する一つのパートナ−（
特異的結合体という） （Ｃ）所望により、リガンド類似体（後記）と特異結合
体とから選ばれた１種以上の他の試薬［この場合、成分
（ｂ）と、そして成分（Ｃ）が存在するなら、成分（Ｃ
）とから選ばれた１種以上の成分は酵素で標識されてい
る］ （ｄ＞一つの酵素に対する基質 および （ｅ）一つの化学的種。この種は、電子か基質から電極
へ、基質の酸化によって生じる酵素を経由して、移動す
ることを助ける能力を有するか、あるいは電子が電極か
ら基質へ、基質を還元する能力を有する酵素を経由して
移動することを助ける能力を有している。

その際、本発明の方法は上記の電子の移動が錯体形成に
より、および（または）制御された外部因子の作用によ
り、変動されるかどうかを調べる工程を有している。所
望により、上記の変動の程度または範囲を調べる工程も
有するεとができる。

事前に調べられたデータを参照して変動を調べることに
よって、所望の結果を分析することができる。

本明細書において、リガンド類似体」 （Ｉｉｑａｎｄ　ａｎａｌｏｇｕｅ＞とは、分析される
リガンドと同一の特異的結合体またはパートナ−（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇｐａｒｔｎｅｒ）と錯化
する能力を有する種のことでおって、とくに分析される
リガンド種の既知の量を含んでいる。「酵素で標識（ラ
ベル）される」というのは、一つの酵素（真の酵素でも
、またはコファクター（ｃｏｆａｃｔｏｒ）の存在下に
活性化されるいわゆるアポ酵素でもよい）を上記の試薬
（ｂ）および（Ｃ）から選ばれた１種以上と結合するこ
とである。従って酵素とは真の酵素とアポ酵素のことで
ある。適当な酵素の例は、酸化還元酵素とくにフラボ蛋
白酵素およびキノ蛋白酵素（ｆｌａｖｏ−ａｎｄ　ｑｕ
ｉｎ。

ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ）たとえばグルコース
・オキシダーゼ、グルコース・デヒドロゲナーゼまたは
メタノール・デヒドロゲナーゼで、アポ酵素の例はアポ
グルコース・オキシダーゼである。

酵素を他の物質に結合するための常法により、試薬（ｂ
）および（Ｃ）に酵素を結合することができる。適当な
例は三官能試薬を用いる共有結合または非共有結合で、
このためにゲルタールアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、
Ｎ’−〇−フェニレンーシマレイミド、ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ビドロサクシンイミドのエステル、無
水コハク酸、無水物混合物またはカルボジイミド等が用
いられる。所望により、たとえばアジピン／ビオチンま
たは蛋白Ａ／ＩｇＧ錯体の交叉結合あるいは生成を利用
してもよい。一般的に、酵素の活性部位から離れた部位
において結合することによって、酵素活性の低下を防ぐ
ことができる。また酵素の結合が成分（ｂ）および（Ｃ
）の活性を害してはならない。

成分（ｅ＞の化学種は、たとえば電子移動媒体（ｅｌｅ
ｃ、ｔｒｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｄ　ｉ　ａｔｏｒ
）である。これは（基質が酸化する間に）電子を酵素か
ら受容し、これを電極に供与する能力を有するか、また
は電子を（基質の還元間に）電極から受容して酵素に供
与する能力を有する物質である。電子移動媒体の例は次
の通りである。

（Ｉ）次式で現わされるポリビオロゲンおよび誘導体、
たとえば側鎖アルキル誘導体［製法はｐｏｌｙｍｅｒ　
１−ｅｔｔｅｒｓ、９．　ｐｐ２８９−２９５　（１９
７１）参照］ （ＩＩ＞クロラニル、フルオニルおよびブロマニルから
選ばれた低分子化合物、たとえば○−タロラニル （Ｉ［Ｉ）フェロセン（ビスーη５−シクロペンタジ工
二ル鉄（ＩＩ）および誘導体、たとえばフェロセン・モ
ノカルボンｌ（ＦＭＣＡＬ、ジメチルアミノエチル・フ
ェロセンのような二官能化された誘導体、ポリマーとし
てポリフェロセン、たとえば（フェロセン）４またはポ
リビニール・フェロセンおよび小ロン・テトラフェロセ
ン［Ｂ（フェロセン）４］ （１■）適当な酵素活性を有する生物由来の化合物たと
えばビタミンＫ。

（Ｖ）Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチル−４−フェ
ニレンジアミンおよび （ＶＩ）フェナジン・メトスルフェートまたはフェナジ
ン・エトスルフェートの誘導体。

電子移動媒体は酵素と、基質反応のための活う位置は、
基質反応のための活性部位に近くても離れてもよく、ま
た試薬（ｂ）および（Ｃ）の結合部位に近くても離れて
もよい。試薬の結合部位の近くに酵素と電子移動媒体と
の相互作用の位置があると有利であって、これによって
リガンドまたはりガント類似体と特異的結合体くパート
ナ−）との間の錯化反応時における酵素と電子移動媒体
との間の電子の移動を予防することができ、従って前述
のような均−系的分析法を可能にする。

適当な電子移動媒体はフェロセンとその二官能化された
誘導体である。これらは比較的安価、安定で、毒性がな
く、容易に電気化学的に可逆的な系をつくることができ
、しかも還元されたＦｅ■■の状態において大気中の酸
素による酸化を受けない。

電子移動媒体を官能化すると、電極および（または）酵
素との間の相互作用を良好にすることができ、または媒
体の電気化学的特性その他の特性を良くすることができ
る。たとえばフェロセンのレドックス電位は対ＮＨＥ＋
４２２ｍＶであるが、啼　リング系に官能基を導入する
ことにより、この数値を＋３００から＋６５０ｍＶの間
で可変にすることができる。さらにカルボキシ置換され
たフェロセンの水溶性は、もとの化合物の水溶性よりも
大きい［Ｒ，５ｚｅｎｔｒ　ｉｍａｙ、１９７７Ａｍｅ
ｒ、　Ｃｈｅｍ、３ｏｃ、。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ、３旦。

１５４］。

従って、たとえばフェロセンの場合、たとえば次式で示
される一つ以上の側鎖を一つ以上のシクロベンタデニル
基に導入することににっで、フェロセン錯体を変性すべ
きである。

−（ＣＨＯ，−（ＣＨ２）　ｎＣ０ＯＨまたは−（ＣＨ
２＞ｍＮＲ’　Ｒ２（ｎとｍとはたとえばＯから６まで
の整数、Ｒ１とＲ２とは同一でも異なってもよく、それ
ぞれ水素または炭素数１−４のアルキル基、たとえばメ
チル基である）。

所望により、追加の官能基たとえば塩化水銀、ニトレン
およびカルベン類の前駆体、ジアゾ基またはヨウ素基の
ような基を側鎖に導入することもできる。フェロセン以
外の電子移動媒体の場合にも同様な官能化は有利である
。

他の方法として、成分（Ｃ）の化学種は、電極に固定化
された電子移動プロモーターであり得る。

それは前記の移動媒体と異なり、電子移動間の形式的荷
電を引受けるのではなくて、電極に接近した位置に酵素
を保持することによって、電子の流れを助ける。適当な
プロモーターの例はマグネシウム・イオンまたは４，４
′−ビピリジルで、後者はとくにラクターゼまたは超酸
化物ジスムターゼを金の作用電極と共に用いるのに適し
ている。

アポ酵素でラベルする場合、成分（Ｃ）の化学。

種は、たとえば電極に固定化されたアポ酵素のコファク
ターであり得る。アポ酵素が酸化還元型の場合、コファ
クターはたとえばＮＡＤ、ＮＡＤＨ。

ＮＡＤＰまたはＦＡＤであり得る。一般的に、コファク
ターはアポ酵素に作用するものである。従って、たとえ
ばアポグルコース・オキシダーゼで標識するときの成分
（Ｃ）は電極に固定化されたフラビン・アデニン・ジヌ
クレオチド（ＦＡＤ）である。

従って成分（ｅ）と酵素との間の相互作用は化的結合を
生じる。それは前述した標識酵素と成分（ｂ）および、
もしも（Ｃ）が存在するなら、（Ｃ）との結合と類似し
た相互作用でおる。または（ｅ）と酵素とが化学的に結
合しないで相互作用をする場合もあり得る。

電気化学的測定のデータを得るための作用電極は実用的
には固体電極であって、たとえば炭素（とくに熱分解性
グラファイトのようなグラファイト、銀、金または白金
のような金属からなる導電性作業面を有している。炭素
電極の場合、電極は前に成形された棒状でも、炭素粒子
のペーストで成形された電極でもよい。一般に電極の表
面は重要である。金属電極であれば表面を粗面とする。

炭素電極でおれば電極の表面を事前にオーブンで熱処理
して酸素弁を多くするか、または電気化学的に酸化させ
ると有利である。

電気化学的測定のデータを得るための作業電極の伯に、
補助電極（対電極）を設けることができ、所望により、
準電極を設けてもよい。

電極はポテンショスタットおよび高感度の電流計と接続
される。電気化学的装置はｉ）Ｈ緩衝液のような適当な
水性媒質を含有し、媒質昇温装置を有している。

適当な電気化学的装置を例示する縦断面同第　１ａ図に
おいて、作用電極１の銅製コア２は縦に長く、その作用
面３は熱分解性グラファイトからなり、エポキシ樹脂の
被膜４を有している。

補助電極（対電極）５は白金製である。カロメル標準電
極６は細い管７を経て電解槽に接続されている。電解槽
と標準電極とは水槽８に収容されている。

（ｉ）および時間（↑）の助変数の二つを測定する。た
とえば示差パルス・ポルタンメトリー、サイクリック・
ポルタンメトリーまたは矩形波ポルタンメトリーを用い
ることができる。

サイクリック・ポルタンメトリーの回路が第１ｂ図に例
示されている。図において、補助電極（対電極）はＣ１
作用電極はＷ、標準電極はＲで示されている。この装置
はたとえば第１ａ図の装置に接続される。電流（ｉ）を
測定するためにポテンショスタットを用いる。

均一系分析法によると、リガントと特異的結合体（パー
トナ−）との間の（拮抗的分析法の場合はりガント類似
体と非特異的結合体との間の）錯体形成によって、酵素
から電極へ（またはその反対方向へ）流れる電子の能力
が変化する。その結果、たとえば次のことか起きる。

１、錯体形成時に基質が酵素の活性部位に接近すること
が、または産物が活性部位から離れることが防げられる
。

２、錯体形成により酵素の配座が変化するので、酵素の
活性部位に入った基質を酵素で酸化または還元すること
かできない。

３、錯体形成により酵素の配座か変化するので、酵素と
電子移動媒体との距離が近くても、電子は両者間を自由
に移動できない。

または ４、錯体形成により酵素と電子移動媒体との接近が妨げ
られるので、電子の移動が妨げられる。

従って、均一系分析法では一般的に、錯体形成は溶液の
成分の電気化学的特性を変化させる。電気料学的特性を
測定する際に、被検材料の完全なポルタモグラムを調べ
る必要はない。たとえば、入念に選ばれた電位における
電流を調べるだけでよい。変動の程度は試料中のりガン
トの量に比例するので、公知量のリガンドを用いた、同
種の測定系から得られたデータと比較すればよい。

成分（ａ）（ｂ）［所望により成分（Ｃ）も］を電気化
学的装置に送入する順序は任意であるが、実用的には、
成分（ａ＞（ｂ＞　［および所望により（Ｃ）も］が送
入される前ではなくて後に錯体が形成されるようにする
。しかし錯体が最後の成分送入前に形成されるようにす
ることも可能であり、この場合は、最終の成分の錯化は
、錯体の一つの成分の置換によって行われる。成分（ｄ
）＃よび（ｅ）を加える前に前記の成分を一定時間昇温
下に保ち、これによって錯化反応を平衡化することが必
要である。成分（ｄｉｅよび（ｅ）の添加は錯化反応を
害してはならないが、（ｄ）（ｅ）は、作用電極におけ
る測定開始前に添加されねばならない。

いわゆるサンドインチ法を本発明に応用することもでき
る。この場合、多価のりカントを同相の特異的結合体で
不溶化し、酵素ラベルの担体としての成分（ｂ）に存在
する特異的結合体と反応させる。次に成分（ｄ）および
（ｅ）を添加することにより、酵素ラベルの活性を電気
化学的に測定することができる。本発明の方法によると
、錯化反応の順序に応じて反応を加速すること、逆相に
固定化するための常法によって行なうことができる。

本発明の方法により、時間（１）の助変数を測定すると
、錯体形成の結果として電気化学的特性の変動率を知る
ことができる。実用的には初期の変動率が測定される。

この種の方法を応用できるのは、たとえばリガンドと酵
素標識されたりガンド類似体とが特異的結合体に関して
拮抗する場合のような、拮抗的均一系分析法である。初
期の変動率は存在するりガントの濃度に比例するから、
初期変動率と存在するりカントの濃度とを比較すること
から、リガンドを分析することは容易である。

変動率の測定を非拮抗的均−系分析法に応用することも
できる。たとえば酵素標識されたりカントが存在せず、
しかも使用された特異的結合体が充分に標識されている
ので、すべてのりガントが錯化され得る場合である。

均一系および非均−系分析法の両者共に、たとえば標準
的な保温期間が過ぎてから、純粋な電気化学的電流の発
生を測定することは、分析を容易にし感度を高めるのに
有利である。

代表的な均一系分析法では、路体形成は成分の電気化学
的特性の変動を生じない（変動してもわずかである）。

従って、この場合、制御された外埼　部因子の作用によ
って変動を発生させまたは強化することが一般的に必要
である。この種の人工的な変動発生または強化はとくに
均一系分析法に望まれることである。この場合に制御さ
れた外部因子の作用は、錯化相と未銘化相とが分離され
た後に導入される。外部因子の作用により変動の振幅が
多少変ることもあり得るから、本年の変動と一致するよ
うにしなければならないが、いずれにしても変動に生じ
るすべての変化がリガント対特異的結合体の関係の関数
でおることに変りはない。

実用的な人工的な変動の発生または強化法は、未結合の
酵素標識された成分に対して錯体の置換（除去）によっ
て行なわれ、例えば成分（ｂ）（特異的結合体）を、固
相支持体に常法によって結合された不溶解性の形とし、
次に遊離した酵素ラベルまたは結合された酵素ラベルを
電気化学的に測定することによって行われる。あるいは
錯体を固相支持体と結合された一つの種（この錯体と特
異的に結合し得るもの）とさらに錯化させ、次に支持体
と結合された分子とを置換することもできる。極端な場
合には、置換は電気化学的装置から錯体を完全に除去す
ることであるが、一般的には装置内で置換される。

この目的に用いられる支持体は、置換または分離を容易
にするために磁性体または磁化可能な物質とすることが
できる。支持体の実用的な例は、たとえば粒状またはビ
ード状の磁性支持体であって、強磁性または常磁性材料
からなる。材料の例は、鉄、ニッケル、コバルトのよう
な金属、アルミニウム、ニッケル、コバルトおよび銅合
金、鉄、クローム、ニッケル、マンガンの類の金属酸化
物、磁性亜ナマリ酸塩または固液体（例、酸化第二鉄と
磁鉄鉱）。とくに良いのはマグネタイトまたはへマタイ
トである。粒子はコロイド状または非コロイド状でもよ
い（本出願人の英国特許出願８５０００９２号参照）。

支持体の置き換えは、たとえば支持体を電極の近所に移
動することによって行われる。粒子のような磁性支持体
には、本出願人の英国特許出願８４１７５３８号記載の
方法が適している。従ってたとえば電極石または永久磁
石からなる磁性電極を用いることができる。または非磁
性電極でもよいが、この場合は外部の磁力の作用で磁性
粒子を電極の近くに移動させて保持する。

成分くｂ）（非特異的結合体）を直接に磁性支持体中に
固定化することができ、または一つ以上のスペーサー分
子を介して固定化することもできる。スペーサーは特異
的結合体でおってもよい。

試薬の固定化は一般的に常法によることができ、たとえ
ば吸着、共有結合または交叉結合によるか、あるいはこ
れらの方法の組合せ（たとえば化合物を一つ以上の官能
基で吸収した後に試薬を共有結合または交叉結合する）
によることもてきる。所望により非化学的手段を用いて
もよい。適当な固定化方法は公知である。

人工的に変動を発生または強化する他の方法の例として
、過剰の未錯化標識試薬を装置から排出するか、または
これを適当な同相支持体に結合した後に支持体を装置か
ら除いてもよい。

前述の均一系分析法の説明は、直接法、拮抗法、サンド
インチ法および置換法を含んでいる。そこでは純粋の変
動よりもむしろ変動率を測定する。

これらの説明は非均−系分析法にも応用することができ
る。

非均−系分析法では、錯化反応が生じた後、錯化相と未
錯化相との分離が必要である。この分離法の例として、
鉛化相を同相に固定化して磁力で分離することができる
。本発明による非均−系分析法においては、人工的に変
動を発生または強化することが望まれる。実用的には、
成分の電気化学的特許を測定する際に、固定化された成
分を含む粒子を磁力で分離した後、粒子を磁力で、置き
かえる（これによって変動が発生または強化される）。

本発明の方法は一般的に公知方法よりも簡単である。本
発明の方法によれば酵素ラベルを直接的にモニターする
ことができ、分析工程前に未錯化相と錯化相とを分離す
る工程が省略される。

電極に固定化された成分を用いることによって、方法を
さらに簡単にすることができ、電気化学的装置に成分を
追加する必要はない。さらに電極に固定化された成分と
電極との間の直接的相互作用の結果、変動の測定か改良
される。　次に本発明は、前述サンプル中のりカントを
分析する方法を提供する。

この方法は成分（ｂ）、（Ｃ）および（ｅ）から選ばれ
た１種以上の成分が作用電極に固定されていることを特
徴としている。

固定化された成分を作用電極の作用面に、または電極の
他の部分に結合することができる。

固定化された成分（ｂ）または（Ｃ）は、たとえば固定
化された特異的結合体であってもよく、その例は、サン
ドインチ・イムノアッセイ法に用いられるキャプチュア
（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体である。固定化によって成分（
ｂ）または（Ｃ）の特異的結合性が害されない限り、成
分を常法により電極に固定することができる。

電極に固定される成分（Ｃ）は、固定化された電子移動
媒体、電子移動プロモーターまたはコファクターであり
得る。従って、たとえばポリビオロゲンを金属電極に固
定することができる。ポリビオロゲン分子は大きいので
、電極の表面から突出する。このことは酵素との相互作
用に有利であろう。またはクロラニルおよび（または）
フルオラニルを炭素粒子からなる電極の表面によく散布
してもよい。あるいはアポ酵素のコファクターを、たと
えば直接結合することよって、またはコファクターおよ
び（または）電極を変性することによって、炭素電極に
固定化することができる。たとえばＷｉ　ｔｔ　ｉ　ｇ
型反応によって、フラビン・コファクターを炭素電極に
固定することができる［［３ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　＆ Ｂ　ｒ　ｏｅｎｇ　１ｎｅｅｒ　ｉｎｇＳｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ　Ｎｏ、８　（１９７８）ｐｐ、４８３−４８７］
。

成分（ｂ）、（Ｃ）および（ｅ）の２種以上を作用電極
に固定化することもできる。この場合、各成分を直接に
電極に結合してもよいし、または他の成分を経て電極に
結合してもよい。たとえば酵素標識された特異的結合体
を、酵素の１部または非酵素の１部を経て、電極に固定
化された電子移動媒体に結合する場合、成分（ｂ）また
は（Ｃ）は成分（Ｃ＞を経由して電極に結合されるので
ある。

実用的な分析系の一例は、熱分解性グラファイトのよう
な炭素電極と、電極の滑面に固定化されたフェロセンま
たはフェロセン誘導体、たとえば１．１゛−フェロセン
・ジカルボン酸、１，１′−ジメチル・フェロセン（Ｄ
ＭＦ＞またはポリビニール　フェロセン、平均分子量約
１６０００からなる被膜とを有し、前述の通り、標識さ
れた成分と相互作用をする。この場合、炭素電極の芯を
本体と共に形成してもよいし、または炭素粒子の固いペ
ーストで形成してもよい。フェロセンまたはフェロセン
誘導体と電極の表面との結合を次に例示するような各種
の方法で行なうことができる。

（ａ）フェロセンまたはフェロセン誘導体の七ツマ−を
、容易に蒸発する液体、たとえばトルエ”放 ンのような有機溶媒の溶液から析出する。

（ｂ）フェロセン誘導体のポリマー、たとえば平均分子
量約１６０００のポリビニールフェロセン［製法は公知
。Ｊ、Ｐｏｌｙｍｅｒ　３ｃｉ、。

（Ｃ）ポリマー化し得るフェロセンモノマーを本来の場
所で電気化学的方法で重合する。たとえば温度約１Ｍの
第３級ブチル・アンモニウム・バークロレートを含む有
機溶媒液にビニールフェロせる。

（ｄ）炭素電極と共有結合する。たとえばフェロセンま
たはフェロセン誘導体を炭素電極にカルボジイミドを用
いて交叉結合する。

所望により、電極に固定化される成分を作用面以外の電
極の１部に結合することができる。この場合、効果的な
分析を行なうために、固定化された成分と電極の作用面
とが充分に接近するように、電極を形成する。

・　第２（ａ）図（縦断面図）に例示した電極は「サン
ドイッチ」イムノアッセイに好適である。

この場合、固定化された成分は、未標識の特異的結合体
たとえばキャプチュア抗体である。

第２（ａ）図において、電極の作用面１は容器の底面に
上向きに位置している。電極本体から突出したポリエチ
レン製の壁２に、適当な特異的結合体をたとえば吸着に
よって固定化することができる。銀を含むエポキシ樹脂
４で絶縁電線３を電極の下側に固定する。下側の部分は
エポキシ樹脂５で充填され、ポリエチレン６で封じられ
ている。

成分（ｂ）が電極に固定化されている場合、産生される
錯体を置換することによって、変動を発生または強化す
ることができない。しかし、たとえば溶液に残存する未
錯化の酵素標識された成分を、この成分と特異的に錯化
する化学種（固相支持体に結合されている）と錯化させ
た後、支持体と結合した分子とを置換することによって
、人工的に変動を発生させまたは強化することができる
。

さらに本発明は、本発明の方法を実施するための試薬お
よび装置のキットを提供する。適当なキットは、（ａ）
作用電極、補助電極（対電極）および所望により標準電
極を有する電気化学的装置、（ｂ）適当な成分を含む水
性の分析用媒質（溶液の形でもまたは作用電極に固定化
されていてもよい）とからなる。実用的には、他の成分
（たとえばその他の試薬等）と分析されるべきサンプル
とを装置の入口を通じて装置に送入する。

装置を自動化することによって、所定の順序で成分を送
入し、保温条件を制御することができる。

事前に装置を目盛し校正することによって、成分の電気
化学的特性の変動をサンプル中のりカントの量として直
接に請むことかできる。本発明の方法によって分析でき
るリガントの例を第１表に示す。そこには、それぞれに
適当な特異的結合体も示されている。

第１表 抗原　特異抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモン受容体 ホルモン受容体　ホルモン ポリヌクレオチド・　補体ポリヌクレオチド・ストラン
ド　ストランド アビジン　ビオチン ビオチン　アビジン 蛋白質Ａ　免疫グロブリン 免疫グロブリン　蛋白質Ａ 酵素　酵素コファクター 酵素コファクター　酵素 レクチン　特異性炭水化物 レクチンの特異性　レクチン 炭水化物 本発明の方法の応用範囲は極めて広いか、例えば次の成
分の分析にとくに有利である。

ホルモン類、例えばペプチドホルモン［例、甲伏線刺激
ホルモン（ＴＳＨ＞、黄体形成ホルモン（ＬＨ）　、卵
胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　、インスリンおよびプロラ
クチン］または非ペプチドホルモン［例、コルチゾール
、エストラジオール、プロゲステロンおよびテストステ
ロン］おるいはチロキシン（Ｔ４）およびトリョードザ
イロニンのような甲状腺ホルモン］、蛋白質［例、ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、がん胎児性抗原（
ＣＦＡ）およびアルファフエ１へプロティン（ＡＦＰ）
］、薬品（例、ジゴキシン）、糖類、毒素またはビタミ
ン類。

本明細書において、抗体は次のものである。

（ａ＞例えば羊、ウサギ、山羊、マウス等の常用動物由
来のＩＣＩＧ、ＩＣＩＭのような免疫グロブリンの各分
類または下位分類。

（ｂ）モノクローン性抗体。

（Ｃ’　）モノクローン性またはポリクローン性抗体の
完全な分子または断片（フラグメント〉。その際断片は
、抗体の結合部位も含んだものて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’　
、Ｆ　（ａｂ’　＞２　（７）ようなＦＣ部分を欠く断
片または完全な抗体の重鎮部を結合する二硫化物納合部
の還元分割によって得られた、いわゆる「半分子」断片
である。

抗体断片の製法は周知であるから説明を省略する。

本明細書において、抗原は永久的に抗原性を有する種（
例、蛋白質、細菌、細菌断片、細胞、細胞断片およびウ
ィルス〉および適当な条件下に抗原性を示すハプテンで
ある。

酵素で抗体を標識する方法は周知であるから説明を省略
する（たとえば■ｓａｋａｗａ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ ＩｍｍｕｎｏａｓｓａＶ、４　（１９８３）２０９−３
２７参照コ。グルコース・オキシダーゼとじトＡＦＰと
の共役化合物の製法はＭａｉｏｌｉｎｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ
ｌ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、８゜２２３−２３４
　（１９７５）参照。グルコース・・オキシダーゼで抗
体をラベルする他の方法は“１１）ｒｏｔｉｄｅｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄｓ”。

ｐｒＯｃ、’２４ｔｈ　ＣＯＩＩＯＣＣ０ｌｌ０Ｃ１ｌ
Ｊｊｕ］ｅ（ＰｅｅｔｅｒＳ　Ｈ，ｅｄ）１９７６、　
ｐｐ、７８７−７８４参照。

ラベルされた抗体を公知方法で精製した後に用いること
かできる。グルコース・オキシダーゼでラベルされたＩ
ｇＧをセファデックスＧ−２００で精製する方法はＪ、
ＩｍｍＵｎＯｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　（前記）参照。抗原を標識する方法も
公知で必る（ＣｌｉｎｉＣａ Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、８ユ、　ｐｐ。

１−４０　（１９７７）　ｐ、４］。ラベルされた抗原
の精製法の例は、透析、密度勾配超遠心分析法、ゲル濾
過法（セファデックスＧ−２５またはＧ−２００）、イ
オン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファデックス
）等である。

抗体または抗原に標識を付ける場合、酵素および抗体ま
たは抗原の分子構造の１部を経由することができるが、
前者の触媒活性と後者の免疫活性とを害してはならない
。

抗体または抗原および酵素標識された成分を作業電極に
取ける方法は、同相支持体に抗体、抗原または酵素を固
定化するための常法によることができる。同様に、固相
（所望により磁性）支持体上の試薬を置換することによ
って人工的変動を発生または強化するために、まはたは
同相（所望により磁性）支持体を用いて非均−系分析法
における分離を行なうために、これらの試薬を固定する
ための常法を用いることができる。抗原、抗体または試
薬の酵素部分を経由する固定化も可能である。

所望により、ラベルされた試薬を、成分（ｅ）を経由し
て電極に固定化することかできる。あるいは、ラベルさ
れた試薬を、固定化された成分（ｅ）と別個に電極に固
定化することもできる。

成分（ｅ）を、たとえば標識された試薬の試薬部分また
はラベルを経由して共役結合することかできる。標識と
相互作用をする成分（ｅ）は電極に固定化されても、ま
たは溶液であってもよく、電極に固定化される場合には
、固定前または固定後に標識された試薬と共役結合する
ことができる。

成分（ｅ）を抗体の分子構造に導入することが望まれる
場合、たとえばフェロセンで例示すると、次の方法によ
ることができる。

（Ｉ＞活性部分を抗体の分子構造と結合する能力を有す
る一つ以上の官能基をフェロセンに提供する。

（ＩＩ）交叉結合基を用いる。

（１）アビジン／ビオチン結合を用いる。たとえばアビ
ジンを有する抗体をビオチンを有するフェロセン分子と
結合するが、またはピオチンを有する抗体をアビジンを
有するフェロセンと結合する。

（１ｖ）フルオレセイン・イソシアネート（ＦＩＴＣ）
のような試薬と共役結合された抗体を、この試薬に対す
る第２抗体（側坑ＦＩＴ）　Ｃ抗体）と結合し、これに
フェロセンを結合する。

（Ｖ）フェロセンで標識された第２抗体を用いる。

同様の方法で、抗原分子にフェロセンを導入することが
できる。この種の方法は周知でおるから詳しい説明を省
略する。たとえば、フェロセンをある種のステロイドに
導入する方法についてはＪｏｒｎａｌ　ｏｆ ｏｒｇａｎｏｍｅｔａ　ｌ　ｌ　ｉ　ＣＣｈｉｍｉｓｔ
ｒｙ、１６０（１９７８）。

ｐｐ、２２３−２３０参照。

従って、本発明の均一系または非均−系分析法によって
、たとえば拮抗的または直接的に抗原または抗体を分析
することができる。これに対して公知方法は、酵素標識
を間接的にモニターする方法でおる。

発明の効果 本発明の方法によると、酵素標識を直接的にモニターす
ることができ、しかも分析工程前に錯化相と未錯化相と
を分離する工程は不必要でおるから、公知方法よりも簡
単である。

本発明の方法では、既知のデータを参照して、作用電極
における所望の電気化学的特性を測定することから、酵
素活性を直接的にモニターすることができる。電気に固
定化された成分を用いると、方法をさらに簡単化するこ
とができ、成分と電極との相互作用が改良される。

理論的な考察とは別に、本発明の効果は、次の要素の組
み合せから得られるものである。

（１）電極への、および電極からの電子の移動を助ける
化学種を使用する。

（２）錯化物の形成による電子移動の変動を測定する。

（３）制御された外部因子の作用による電子移動の変動
を測定する。

（４）電子移動を助けるために、電子移動媒体を使用す
る。

（５〉電子移動を助けるために、電子移動プロモーター
を使用する。

（６）電子移動を助けるために、アポ酵素のコファクタ
ーを電極に固定化する。

（７）電子移動の変動率を測定する。

（８）作用電極に１種以上の試薬を固定化することによ
って、上記の要素を応用する。すなわち、上記の要素の
いずれかを応用して、抗原リガンドを測定する。この場
合、抗体が電極に固定化される。および （９）抗原または抗体のイムノアッセイに上記の要素の
いずれかを応用する。

実施例 下記の実施例は、電子が基質から電極へ、酵素を経由し
て流れる場合のものでおるが、本発明の方法において、
電子が電極から基質へ、酵素を経由して流れるようにす
ることもできることは、自明である。

（１）直接的均一系抗体分析 第９−１図参照［図において、Ｓは酵素基質、ｅは電子
、◇は抗原（Ａｃ＋＞、ｌは電極、ｐは酵素の産物、Ｍ
は電子移動媒体、Σは抗体（Ａｂ＞　、ＧＯＤはグルコ
ース・オキシダーゼを現わす。以下の図も同様である］
。

抗原と結合された酵素（△（Ｊ−ＢＯＤ＞の電気化学的
活性を電気化学的にモニターする。分析系に抗体を加え
ると、抗体／抗原／酵素の錯体（Ａｂ−Ａｑ−ＢＯＤ）
が生成されるので、△Ω−ＢＯＤの活性がいくらか抑制
される。変動量は抗体濃度に対応する。

（２）拮抗的均一系抗原分析 第９−２図参照。抗原−酵素試薬に抗原サンプルを加え
、次に既知量の抗体を加えることによって、拮抗的抗原
分析かできる。抗体に対する抗原−酵素結合体（Ａｃ＋
−Ｂ（］））と抗原（Ａにｌ）との間の拮抗が、Ａｇ−
ＢＯＤと抗体どの結合をいくらか抑制するので、電気化
学的信号が変動づる。

（３）刀Ｍ勺非均−系抗原分析 第９−３図においてシ〈は固相に結合された抗体を睨わ
づ−０ ＝１−　・　ｆ楯佛告４泊酵素云結合告ＧＯＤ＞を含む
電気化学的装置に加える。電気化学的信号は不変である
。添加された固相に結合された抗体は一抗原およびＡｇ
−ＧＯＤに対して拮抗する。固相の除去によって、いく
らかの八〇−ＧＯＤが装置から除去されるので、電気化
学的信号が変動する。

（４）直接的均一系抗原分析 第９−４図参照。酵素標識された抗体（Ａｂ−ＧＯＤ＞
の電気化学的活性をモニターする。抗原サンプルを系に
加えると酵素か抑制され、電気化学的信号が変動する。

酵素で標識された抗体は溶液でもよく、電極に固定化さ
れていてもよい。

（５）拮抗的均一系抗体分析 第９−５図参照。抗体−酵素結合物（△ｂ−ＧＯＤ＞の
電気化学的特性をモニターした１麦、抗体サンプルを系
に加える。既知量の抗原を加えると、抗体とＡｂ−ＧＯ
Ｄとは抗原に対して拮抗する。いくらかの抗体がＡｂ−
ＧＯＤに結合するのて、電気化学的信号が変動する。

（６）拮抗的非均−系抗体分析 第９−６図参照。Ａｂ−ＧＯＤの電気化学的特性をモニ
ターし、次に抗体サンプルを加える。既知量の抗原を系
に加え、次に抗体または同相を加える。同相と結合され
た抗体を系力冒ら除去をすることによって、いくらかの
Ａｂ−ＧＯＤが除去されるので、電気化学的信号が変化
する。

下記の実施例によって本発明をさらに説明する。

実塵例ユ 酵素変性された類似体を用いるチロシン（Ｔ４）の分析
。

一定数の抗原決定部位を有する変性抗原と未変性抗原間
の拮抗後に遊離酵素で変性された抗原を分析した。

原料の調製 （Ｉ＞チロキシン（Ｔ４）とグルコース・オキシダーゼ
との結合および変性グルコース・オキシダーゼの調製 （１）メチル・チロキシネートＨＣ１の調製マグネシウ
ムから蒸溜された乾燥メタノールを、２５０−３００’
　Ｃで活性化された分子ふるい３人上に置き、塩素ガス
で飽和させチロキシン（１ｇ〉を溶解した。混合物を室
温に一装置いた。

エステル沈澱物の収量は約９０％であった。これをアセ
トンで洗浄した後、真空デシケータ−中に保存して使用
した。

（２）無水コハク酸誘導体（産　２）の調製メチル・チ
ロキシネートＨＣＥ　（３００ｍＣＩ）と無水コハクｔ
ｉ　（５００ｍｃ＋）とをテトラヒドロ７ラン（丁１−
Ｉ　Ｆ　）　／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０
：５０ｖ／ｖ）に溶解し、トリエチルアミン（０，６ｍ
！−）を加え、３０分間反応後過剰の蒸溜水を加えて産
物を沈澱させ、濾別し、次に産物をアセトンに溶解し、
ヘキサンで沈澱させた。

（３）産物２とグルコース・オキシダーゼとの結合 乾燥下ＨＦ（４ｍｌ＞を−５°Ｃに冷却し、かくはん下
に産物２（１，０ｍｇ＞を加え、次にトリエチルアミン
（１５μｌ）とイソブチルクロロホルメート（１３μＬ
〉とを加えた。混合物を一５°Ｃで乾燥下に３０分間か
くはん後、至濡でさらに６０分間かくはんした。グルコ
ース・オキシダーゼ（１１０ｍｑ）を０．１Ｍ重炭酸ナ
トリウム溶液（５０ｍｌ＞に溶解し、かくはん下にＴＨ
Ｅ溶液を消和し２４時間室温でかくはんした。

次にグリシン溶液（１Ｍ；　５０ｍＡ＞を加えて１時間
かくはん後、遠心処理で固形物を除いた。上清にフラビ
ン（ＦＡＤ）を加え、トリスＨＣｌ−緩衝液（２０ｍＭ
；ｐＨ７，５；０．１ＮａＣｆｌを含む）で透析後、適
量に濃縮濾過し、同じ緩衝液を用いてゲル濾過（Ｓ−，
２００）Ｌ、た。

（ＩＩ）抗チロキシン抗体の調製と精製高分子蛋白質と
共役結合されたチロキシンで羊を免疫し、常法による多
クローン性抗体を得た。

抗血清１０ｍ１−に５Ａ酸ナトリウム１．８ｍＣｌを加
え、室温で３０分間かくはん後、室温で３０分間、　遠
心処理（１６００ｇ）した。上清を除き、沈澱物を水（
１０ｒｒＪ）に溶解し、上記の方法をくり返した。トリ
スＨ（４緩衡液（１０ｍＭ　；　ｐ）−１７，４）で平
衡化されたＧ−２５を用いてゲル濾過法により、抗体を
精製した。

（ＩＩＩ）　チロキシン標準溶液の調製チロキシン（ナ
トリウム塩、英国シグマ・ロンドン・ケミカル社製）を
水酸化ナトリウム溶液（０，１Ｍ＞に溶解し、１〜リス
ＨＣ，Ｌ緩衝液（１０ｍＭ；　Ｉ）Ｈ７，４＞で所望濃
度に希釈した。

熱分解性グラファイトの作用電極を備えた３電極の電気
化学的容器でサイクリック・ポルタンメトリー（加電圧
電流法）を行った。第１（ａ）図と第１（ｂ）図に装置
が例示されている。

（Ｖ）Ｔ４の検出 グルコース・オキシダーゼで標識されたチロキシン（Ｔ
４−ＧＯＤ＞の電気化学的測定を熱分解性グラファイト
電極において、電子移動媒体（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｔｒ
ａｎＳｆｅｒｍｅｄ　ｉ　ａｆｏｒとしてのフェロセン
・モノカルボン酸（ＦＭＣＡ）と抗Ｔ４抗体の存在下お
よび不存在下で行った。トリスＨ（４緩衡液（５０ｍＭ
；ｐｌ−１７，４＞中Ｔ４−ＧＯＤを３０分間２０’Ｃ
に保ち、濃度を高くした。−３０分後にβ−Ｄグルコー
スとＦＭＣＡ　（各最終濃度１５μＶ）を加え、サイク
リック・ポルタモグラムを−１。

求めた（電圧走査速度２ｍＶｓ、Ｏ−＋５００ｍＶ入第
３図のポルタッグラムの電流のピークは＋３００ｍＶで
記録されたもので、すべての電流値は非触媒的バックグ
ラウンド電流の変化に関して補正されている。第３図の
曲線Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、それぞれ［グルコース・オキシ
ダーゼ＋ＦＭＣＡ＋グルコース］、［ＦＭＣＡ＋グル］
−ス　コ　、　［Ｔ４−ＧＯＤ　（１０２，５ｎ　ｇ下
４．　ｍＬ　’）＋ＦＭＣＡ＋グルコース＋緩衡液］お
よび［Ｔ４−ＧＯＤ　（１０２，５ｎｑＴ４　ｒｒｌ　
’　）＋ＦＭＣＡ＋グルコース＋緩衡液　＋抗Ｔ４抗体
］のサイクリック・ポルタモグラムである。

（ＶＩ）天ｌ七乙ｄ功逝迭 １対の試料を用いて分析した。チロキシン・グルコース
類似体（１０μ辷２．３Ｘ１０　”’Ｍ）にチロキシン
標準溶液（１０μＰ、）を加え、電気化学的容器内でか
くはん後、抗チロキシン抗体（１００μ里）を加えた。

次に混合液を３０分間３７°Ｃに保ち、電子移動媒体（
トリスＨＣゑ緩衝液１０ｍＭ：　ｐＨ７，４：フエロセ
ンモノカルボン酸６．０ｍＭを含む）、５０μ尤の酵素
基質［β−Ｄグルコース（モル）、塩化マグネシウム１
００ｍＭを含む］およびトリスＨＣ１緩衡液（１０ｍＭ
：ｐＩ−１７，４＞を加えた。熱的平衡に達した後、Ｏ
ｍＶから４５０ｍＶまで（対標準カロメル電極）でサイ
クリック・ポルタモグラムを作製した。電圧走査速度５
ｍＶｓ’）。ピーク電流から次式によって電気化学的信
号をめた。

信号−（ｉ−ｉｏ）／ｉ（。

（ｉは試料に対する電気化学的電流のピーク、ｉｏはゼ
ロ標準に対する電気化学的ピーク電流である）。

第４図は、チロキシン濃度と電気化学的信号との関係を
現わす曲線で、任意の単位で測定された電気化学的信号
を縦軸、チロキシン濃度（ｎｃ］／ｍｌ）を横軸に現わ
している。

実施例２ 酵素変性された抗体を用い、かつ制御された外部因子を
用いて変動を強化した、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ
ｃＧ）の測定 原料の調製 （Ｉ）酵素的に変性された抗ｈＣＧ単りローン性杭体 公知方法［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　＆　Ｋｏｈｌｅ）’。

旧ヨＮａｔｕｒｅ、２５６，４９５−４９７（１９７５
）］によって、マウス腹水から単クロ抗体を産生するも
のをめ、ｈＣＧに対して最高の親和力を示す抗体を分析
に用いた。抗体Ａ６ｍｃ］　（１００ｍＭ　；　１）Ｈ
７，４の燐酸塩緩衛液２ｍＬ中）にβ−メルカプトエタ
ノールアミン（１００ｍＭ）とエチレンジアミンテトラ
酢酸（２ナトリウム塩、１０ｍＭ＞との水溶液（２００
μＬ）を加え、３７°Ｃに９０分間保った後、燐酸塩緩
衝液で平衡化されたゲル濾過材（ＴＳＫ３０００ＳＷ）
で抗体を脱塩した。

グルコース・オキシダーゼ（１４ｍｃ＋）を燐酸塩緩衝
液に溶解した後、ジオキサンに溶解された１　５ｍＣ］
のサクシニイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）２０
μμを加えてかくはんした。

次にＳＭＣＣのアリコート２０．ｃｌを５分間隔で加え
、ジオキサンの中のＳＭＣＣの全量を１８０μ工とした
。混合液を３０’Ｃに２時間保ち、反応終了後、燐酸塩
緩衝液１００ｍＭ：　ｐＨ７，Ｏ：ＥＤＴＡｌｏｏｍＭ
を含む）で平衡化されたゲル濾過材（Ｇ−２５＞で溶液
を脱塩した。

等モルの酵素と抗体とを混合し、アルゴンふんい気中で
４°Ｃで６８時間しんとうした。酵素と抗体との共役体
をゲル濾過法で精製して得られた産物は、抗体分子当り
酵素１モルを含有した。

＜ＦＩＴＣ）と共役結合された抗ＨＣＧ抗体（抗体Ｂ）
の調製 ＦＩＴＣと単クローン性抗体（抗体Ｂ）との共役結合の
ために、ＦＩＴＧ（英国シグマ・ロンドン・ケミカル社
製＞２００μｑと抗体５ｍｇとを重炭酸ナトリウム緩衝
液（１，４ｍ、ｌ；０．２Ｍ：ｐＨ９，０＞中室温で１
８時間反応させた後、セファデックスＧ−２５スーパー
フアイン（スエーデン国、アアルマシア・ファイン・ケ
ミカルス社製）でゲル濾過した。精製産物１ま抗体１モ
ル当り平均６モルのＦＩＴＣを含有した。

（ＩＩＩ）磁気固相体と共有結合された抗ＦＩＴＣ抗体
の調製 キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌ
ｅ　ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎ　ｉ　ｎ）と共役結合されたＦＩＴ
Ｃで羊を免疫して、常法により抗ＦＩＴＣ多クローン抗
体を得た。これを磁気セルロース粒子と共有結合した後
、シアノーゲン・ブロマイドでセルロースを活性化した
［Ａｘｅｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ、２１４．１３０２−１３０４（１９６７
）］。磁気セルロース粒子は粒径３ミクロンで、約５０
％の酸化鉄（Ｆｅ３０４）を含む組成物であった［Ｆｏ
ｒｅｓｔ　＆　Ｒａｔｔｌｅ、“Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐ
ａｒｔｉｃｌｅＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
”　ｉｎＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｑｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐｐ。

１４７−１６２．Ｈｕｎｔｅｒ　＆ Ｃｏｒｒ　ｉ　ｅ、Ｃｈｕｒｃｈ　ｉ　ｌ　ｌ。

１ｉｖ：ｎｇｓ↑Ｏｎ、　Ｅｄ　ｉ　ｎｂｕｒｇｈ（１
９８３）］、２２ｍの抗血清と１ｇの磁気セルロース粒
子との比で結合された。結合体１０ｍｇをトリスＨＣＲ
緩衡液１ｒ＋Ｊで希釈した（１ＯＮｍＭ／ｌ　；Ｉ）Ｈ
７，４＞。

（ＩＶ）ｈＣＧ標準溶液の調製 第１版国際標準調製法（７５１５３７）によって補正さ
れた凍結乾燥ｈＣＧ（イタリー国ミラノ。

Ｂ　ｉ　ｏｄａｔａ社製）をトリスＨＣ旦緩衡液（１０
ｍＭ：ｐＨ７，４＞で所望濃度に希釈した。

（Ｖ）電気化学的測定装置 実施例１参照 （ＶＩ）ｈＣＧ分析法 グルコース・オキシダーゼで変性された抗ＫＣＧ単ク単
一ローン性抗体いたイムノメトリー法でｈＣＧを分析し
た。１対の試料を用いた。

ｈＣＧ標準溶液５０μＬを抗体Ａ５０μＭ（蛋白・　９
．４μｇ／ｍ且）および抗体Ｂ（蛋白６μｇ／ｒｒｌ）
と混合し、室温に３０分間保ち、次に磁気固相セルロー
ス粒子１００μ！を加えて、かくはんした。混合物を室
温に５分間保ち、その後、外部の永久磁石を電極に接触
させることによって結合された成分と未結合成分とを分
離させた。固体を回収し、蒸溜水２５０μＬで２回洗浄
し、トリスＨＣ４緩衡液（１００μｌ；　１０ｍＭ；　
ｐＨ７，４）に懸濁し電気化的容器に送入した。この容
器は電子移動媒体４０μ、Ｌ［ＦＭＣＡ６．７ｍ１ｖ’
ｌを含むトリスＨＣＪｌ緩衡液＜１ｏｏｕ、ｌ：１０ｍ
Ｍ；ｐＨ７，４＞］、酵素基質４０ｕｆＬ［１００ｍＭ
の塩化マグネシウムを含むグルコースのモル溶液］およ
びトリスＨＣＲ緩衡液（１０ｍＭ；　ｐＨ７，４；　１
７０μｆ１．）を含んティた。

外部の永久磁石を電極に接触させることによって、磁気
同相粒子を電極表面に集めて、濃縮させた。

熱的平衡（３７±１°Ｃ）に達した後、結合されたグル
コース・オキシダーゼの活性による電気化学的電流を測
定するため、サイクリック・小ルタモグラムが作られた
（標準カロメル電極に対して電圧＋１２０ｍＶから＋４
２０ｍＶまで、電圧走査速度２ｍＶｓ’）。第５図は電
気化学的信号とｈＣＧ濃度との関係を示す曲線でおる。

次式によって信号を計算した。

［（試料に対するピーク電流）−（ＦＭＣＡハックグラ
ウンド電流のピーク）］／［ゼロ標準に対するピーク電
流）−（ＦＭＣＡパックグランド電流）］。

第５図の縦軸は、任意単位で電気化学的信号を目盛し、
ｍ、１当りの国際単位で示したｈＣＧ濃度を横軸に示し
た。

実施例３ 酵素変性された抗体を用い、かつ制御された外部因子の
作用で変動を強化した、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ
ＣＧ）の測定 原料の調整 （Ｉ＞酵素変性された単クローン性抗体実施例２参照 ハ 実施例２参照 （ＩＩＩ）磁性同相粒子に共有結合された抗ＦＩＴＣ抗
体の調製 実施例２参照 （ＩＶ）ｈＣＧ標準溶液の調整 実施例２参照 （Ｖ）里気化学似衝定葱！ 実施例１参照 （ＶＩ）ｈＣＧ分析法 グルコース・オキシダーゼで変性された抗ｈＣＧ単りロ
ーン性抗体を用いるイムノメトリー法でｈＣＧを分析し
た。１対の試料を用いた。ｈＣＧ標準溶液５０μ工を抗
体Ａ５０μ辺（蛋白１０μｃａ／ｒｒｌ）および抗体８
５０μｋ（蛋白６μに／ｍｆＬ＞と混合し、室温に３０
分間保った。次に混合液に１００ｕｌ、の抗ＦＩＴＣ抗
体を加えて、はげしくかきまぜた後、室温に５分間保っ
た。外部の磁力の作用で未結合成分と結合された成分と
を分けた。上清を除き、固形物を回収し、これを２００
μｍのトリスＨ（４緩衡液（１０ｍＭ；ｐＨ７，４；０
．９％Ｖ／Ｖの塩化ナトリウムヲ含む）で３回洗浄後、
トリスＨＣ尤緩衡液（１００μｌ；　１０ｍＭ；　Ｉ）
Ｈ７，４）に再懸濁介 した。固形ｒを電気化学的容器に移した。この容器は電
子移動媒体４０μＬ［ジメチルアミノメチル・フェロセ
ン０．６ｍＭを含むトリスＨＣ↓緩衡液１０ｍＭ、ＤＨ
７，４］、酵素基質４０ｕＬ［塩化マグネシウム１００
ｍＭを含むグルコースのモル溶液］および１７０μ臭の
トリスＨＣＪ緩衡液（１０ｍＭ；ｐＨ７，４＞を含んテ
ィた。永久ｆ１１石を作用電極に接触させることによっ
て、作用電極上で同相粒子が濃縮された。熱的平衡（３
７±１°Ｃ）に達した後、結合されたグルコース・オキ
シダーゼの活性によって生じた電気化学的電流を調べる
ために、ＯｍＶから＋５００ｍＶまで（対標準カロメル
電＠）（電圧走査速度５ｍＶｓ−１）でサイクリック・
ポルタモグラフを作製した。

第６図は電気化学的信号とｈＣＧの濃度との関係を示す
曲線である。信号は次式により計算した。

縦軸は任意の単位で現わされた電気化学的信号で、横軸
はｍｙ当りの国際単位で現わされたｈｃｃＪ度である。

信号−（ｉ−ｉｏ）／ｉ０ 但しｉは（試料に対するピーク電流）−（電子移動媒体
のピーク電流）で、ｉｏは（ゼロ標準のピーク電流）−
（電子移動媒体のピーク電流）でおる。

大庖駕Ａ 電極に固定化された抗体と、酵素で変性された第２抗体
とを用いる、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のサ
ンドインチ分析。

原料の調製 （Ｉ）酵素で変性された抗ｈＣＧ単りローン性抗体 実施例２の抗体への通り （ＩＩ＞作用電極の構造 第２ａ図に例示された電極の構成は次の通りである。絶
縁された電線３が熱分解性グラファイト製の直径４ｍｍ
の円板１に銀を含むエポキシ樹脂４で固定された。次に
円板はポリスチレン製のマイクロタイター用ウェル２の
底部にエポキシ樹脂で固定された。ポリスチレン製ウェ
ルに固定されたポリスチレン製の長い管６はハンドルの
作用をする。

（ＩＩＩ＞電極に固定化された抗体 筒２の単クローン性抗体（実施例２の抗体Ｂ）を作用電
極の壁に次の方法で固定した。抗体ＢをトリスＨ（４緩
衡液（１０ｍＭ、ＰＨ７，４）で濃度３３．９ｕＱ／ｍ
ｆｌに希釈し、その３３０μＬを電極の壁に加え、室温
で１時間放置することによって、抗体が電極の壁に吸着
された。電極をトリスＨＣ１緩衡液で１０回洗浄した。

次に３００μｍのオバルブミン溶液［０，１％Ｖ／Ｖの
ノイデットＰ４０洗浄剤を含む１０ｍＭのトリスＨＣＩ
緩衡液（１）Ｈ７，４＞１ｍＡ中ニオハルブミン５ｍｇ
を含む１で１時間処理することによって、電極壁の伯の
部分にお（プる不必要な蛋白の吸着をブロックした。ト
リスＨＣＡ緩衡液（１０ｍＭ；ｐＨ７，４＞で電極表面
を洗浄後、直径０．３μｍのアルミナと水との混合スラ
リーで電極を研磨して使用する。

（ＩＶ）ｈＣＧ標準溶液の調製 実施例２参照 （Ｖ）電気化学的測定装置 前記の作用電極と白金製の対電極とを有する装置（２電
極）を用いた。第２ｂ図参照。図において、作用電極Ｗ
は分析される試料を含む容器をなし、走査電圧発生装置
１（マイナス側は接地されている）の陽極側に接続され
ている。白金型＠Ｃは電流計２のプラス側に接続され、
電流計のマイナス側は接地されている。

（ＶＩ）ｈＣＧ分析法 グルコース・オキシダーゼで変性された抗ｈｃＧ単りロ
ーン性抗体を用いるイムノメトリー法でｈＣＧを測定し
た。

使用電極のウェルに１００μ２のｈＣＧ標準溶液を１０
０μＬの抗体と共に入れ、混合後、室温に３０分間保ち
、次に液を除き、電極を３５０ｕＬのトリスＨＣｆｌ緩
衡液（１０ｍＭ；ｐＨ７，４；塩化ナトリウム０．９％
Ｖ／Ｖを含む〉で３回洗浄した）麦、アルミナスラリー
で研磨した。

電極のウェルにトリスＨＣ！緩衡液’１６０ｕＪＬ（１
０ｍＭ；　＋）Ｈ７，４＞　、電子移動媒体２０ａｎ（
１０ｍＭのトリスＨＣ，１緩衡液１）Ｈ７，４に０．６
ｍＭのジメチルアミノメチル・フェロセンを含む）およ
び２０μ支の酵素基質（グルコースのモル溶液で１００
ｍＭのは塩化マグネシウムを含む）を加え、アルゴンで
ガス俵きした。サイクリック・ポルタモグラム（ＯｍＶ
〜＋６５０ｍＶ、電圧走査速度５ｍＭ５−１＞によって
電気化学的信号を計算した。

各測定後、電極のウェルをトリスＨＣＬ緩衡液（１０ｍ
Ｍ、　ｐＨ７，４＞で洗浄し、３５０μｍの２Ｍ塩化マ
グネシウム溶液を容器に加えた。２分後に容器内の液を
除き、緩衝液で洗浄してから再使用した。

測定結果を第７図に示す。電気化学的信号は（＋　＋　
）／＋０で示される。ただしｉは（試料のピーク電流）
−（電子移動媒体のピーク電流）で、ｉｏは（ゼロ標準
の□ピーク電流）−（媒体のピーク電流）である。

第７図に電気化学的信号とｈＣＧ濃度との関係を示す。

曲線のめ方は第６図と同様である。

実施例仝 電極に固定化された抗体と酵素で変性された第２抗体と
を用いる、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの他の分析法 夙料の遷脳 （Ｉ＞酵素変性された単クローン性抗体実施例２参照 （■）電極に固定化された抗体 第２の単クローン性抗体（実施例２の抗体Ｂ）を公知方
法［Ｂｏｕｒｄｉｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｔ。

Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０２゜（１９８
０）４２３１−４２３５　＆　Ｃａ５ｓｅｔ　ａｌ、　
Ａｎａｌ、Ｃ，ｊｅｍ、、５６゜（１９８４）６６７−
６７１１によって熱分解性グラファイト製作用電極に固
定した。アルミナと水とのスラリー（アルミナ粒径０．
３μｍ）で研磨した後、作用電極を電気化学的に（標準
カロメル電極に対して＋２．２Ｖ）１０％硝酸（重クロ
ム酸カリウム２，５％Ｗ／Ｖ含有）中で１０秒間酸化さ
せた。０．６３ｍ１の１−シクロへキシル−３＝（２−
モルホリノエチル〉−カルボジイミド−ｐ−メチルトル
エンスルホネート（英国シグマ・ロンドン・ケミカフ１
社＞（０，１モル、ｐＨ４，５のアセテート緩衛液中０
．１５モル）で８０σ分間２０’Ｃで処理し、水洗後、
電極をアセテート緩衝液（０，１モル、　ｐＨ９−５；
抗体ＢＯ，４９ｒｌ／ｒｒｌ含有）に９０分間２０’Ｃ
で浸漬した。電極を水洗し、オバルブミン溶液［０，１
１％Ｖ／ＶのノイデットＰ４０洗浄剤を含む１０ｍＭト
リスＨＣ，２緩衡液ＤＨ７，４中に５ｍｇ／ｍ、Ｒ含ま
れている］で９０分間２０’Ｃで処理し、残りの蛋白結
合部位をブロックした。水洗後、電極を１０ｍＭ、ＤＨ
７，４のトリスＨ（Ｊ緩衛液中に４°Ｃで保存し、再使
用した。

（ＩＩＩ）肛Ω旦橙見直柩辺贋智 実施例２参照 （ＩＶ）里気上単似皿定葱鳳 実施例２参照 （Ｖ）ｈＣＧ分析法 グルコース・オキシダーゼで変性された抗ｈｃＧ単りロ
ーン性抗体を用いて、次の通りイムノメトリー法を行っ
た。

１０ｍＭ、ＤＨ７，４めトリスＨｅｎ緩衛液中でサイク
リック・ポルタモグラム（標準カロメル電極対、ＯｍＶ
から＋４８０ｍＶまで、電圧走査時＝１ 間５ｍＶＳ　、温度３７±１°Ｃ〉を行ない、雷浜ル咽
Ｒｔ−つＦ　ｔｔ　Ｏのｈρｍ引住遺辿に９Ｒμｍの抗
体Ａとを混合して、電極に固定化された抗体Ｂに加え、
電極を１５分間２０’Ｃに保った。

電極を水洗し、次に’ｌｏｍＭ、ｐＨ７，４のトリスＨ
Ｃｆ緩衡液（０，９％Ｗ／Ｖの塩化ナトリウム含有）で
洗浄、さらに水洗の後、電気化的容器に装入した。容器
は４００μ又のトリスＨＣゑ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７
，４）、５０ｔｕＬの電子移動媒体（１０ｍＭ、ｐＨ７
，４のトリスＨ（、Ｌ緩衝液で、０．３ｍＭのアミノメ
チル・フェロセン含有）および５００ｆＬの基質溶液（
１００ｒｒ＋Ｍの塩化マグネシウムを含む１モルのグル
コース溶液）を含んでいた。熱的平衡（３７±１°Ｃ）
に達した後、Ｏｍ■と＋４８０ｍＶの間でサイクリック
・ポルタモグラムをめ、荷電量を調べた。

電極を水洗後、２モルの塩化マグネシウム溶液に２分間
浸漬することにより、抗体／抗原の結合を破壊した。ざ
らに水洗後、電極を再使用した。

測定結果を第８図に示す。任意単位での電気化学的信号
は縦軸に、ｍｆｌ当りの国際単位でのｈＣＧ濃度は横軸
に示されている。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は本発明に用いる電気化学的装置の縦断面図、
第１ｂ図は第１ａ図の装置を用いるサイクリック・ホル
タンメ１〜リーの回路図、　第２ａ図はサンドインチ・
イムノアッセイ用電極の縦断面図、第２ｂ図は第２ａ図
の電極を用いる回路図、第３図と第４図とは実施例１の
方法で得られたサイクリック・小ルタモグラム、第５．
６．７図はそれぞれ実施例２．３．４の方法で得られた
サイクリック・小ルタモグラム、第８図は実施例５の方
法で得られたｈＣＧａ度と電気化学的信号との関係を示
す図、第９−１図から第９−６図までは、本発明による
分析系の説明図である。 第１ａ図および第１ｂ図において、１・・・作用電極、
２・・・コア、３・・・作用面、４・・・被膜、５・・
・補助電極、６・・・標準電極、７・・・細管、８・・
・水槽、Ｃ・・・補助電極、Ｗ・・・作用電極、Ｒ・・
・標準電極、ｉ・・・電流を現わす。 第２ａ図において、１・・・作用面、２・・・壁、３・
・・絶縁電線、４・・・銀を含むエポキシ樹脂、５・・
・エポキシ樹脂、６・・・ポリエチレン製管を現わす。 第２ｂ図において、１・・・走査電圧発生装置、２・・
・電流計、Ｃ・・・白金電極、Ｗ・・・作用電極を現わ
す。 第３図において、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄはサイクリック・小ル
タモグラムの曲線を現わす。 第９−１図〜第９−６図において、Ｓ・・・酵素基質、
ｅ・・・電子、◇・・・抗原（ＡＣＩ＞、ｑ・・・電極
、Ｐ・・・酵素の産物、Ｍ・・・電子移動媒体、λ・・
・抗体（Δｂ）　、ＧＯＤ・・・グルコース・オキシダ
ーゼ、ト（・・・固相に結合された抗体を現わす。 特許出願人　セロノ・ディアグノスチックス図１ｎ■の
浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、２ｂ ｈＣＧ蟲及（ｉｉａ″ｖｆ−４７ｍＬ）　→ｈＣＧ禾及
（簡辣魁ｉ／ｍ１） ＦＩＧ、９−１ ＦＩＧ、９−３ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号庁内１１ ＠発　明　者　シモノ・ジョーン・ラ　イギリス国イッ
トル　ツキンガムシ・ ９ ０発　明　者　グレンビル・アーサ　イギリス国イーＯ
ロビンソン　ンドン、アー ／グランド、エイチピ−２２４ビーエル、バ？＋、　ク
エイントン、ロウアー・ストリート／グランド、ダブリ
ュー１３９ワイイー、ロリング、バーナム・ウェイ　２
３ 手続補正書 昭和６０年６月１４日 昭和６０　年　特　許　願第１２３４４　号２　発明の
名称　分析法 ３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 代表者　シー・パーンセン ４、　代　理　人　電話　０３−３５３−５５２１５　
補正命令の日付　昭和６０年４月１０日（同年４月３０
日発送）（１）別紙の通り、発明者の氏名及び住所、特
許出願人の住所及び代表者を記載した願誓な提出する。 （２）別紙の通り、浄書した明細書を提出する（内容に
変更なし）。 （３）　別紙の通り、浄書した図面を提出する（内容に
変更なし）。 （４）　別紙の通り、委任状同訳文を提出する。 （５）　別紙の通り、譲渡証書同訳文を提出する。 （自発的）手続補正書 昭和６０年６月１９日 １　事件の表示 昭和６０年　特許　願第１２３４４号 ２　発明の名称　分析法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４　代　理　人　電話　０３−１１５３−５１５２１明
細瞥を次の通り補正する。 （１）第１１頁１行、「リガンｒ類似体」ＪをＦ　ｒ　
ＩＪガンｒ類似体」占に補正する。 （２）第１２頁７行、「−Ｎ−２２口」を「−Ｎ−ヒド
ロ」に補正する。 （３）第１４頁下から４行、「電子移動媒体・・・・・
・・・・・・・活う」を「電子移動媒体と酵素との結合
」に補正する。 （４）第２４頁５行、「本年」を「本来」Ｋ補正する。 （５）第２７頁９行、「特許」を「特性」Ｋ補正する。 （６）　第４８頁下から２行、「ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｊ
　Ｏ後に「）」を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）電極を有する電気料学的装置と分析用成分とを用
   いてサンプル中のりガントを分析する方法において、 （イ）成分として（ａ＞サンプル、（ｂ）リガンドに対
   する特異的結合体、（Ｃ）所望により、リガンド類似体
   と特異的結合体とから選ばれた１種以上の別の成分、（
   ａ）酵素に対する基質および（ｅ）基質の酸化によって
   生じる酵素を経由して電子が基質から電極へ移動するこ
   とを助ける能力を有するか、または基質還元能をもつ酵
   素を経由して電子が電極から基質へ移動する能力を有す
   る化学種を用い、その際上記の成分（ｂ）と（Ｃ）とか
   ら選ばれた１種以上の成分は酵素で標識されること、お
   よび（ロ）錯体形成の作用と制御された外部因子の作用
   とから選ばれた１種以上の作用によって、上記の電子の
   移動が変動される程度を測定する工程を有する方法であ
   ること、を特徴とする分析法。 （２）上記成分（ｅ）が（ａ）電子を酵素から受容し、
   これを電極に供与する能力または電子を電極から受容し
   、これを酵素に供与する能力を有する電子移転媒体、（
   ｂ）酵素を電極のすぐ近くに保持する能力を有するが、
   電子移動間に帯電しない電子移動プロモーターまたは（
   Ｃ）電極に固定化されたアポ酵素のコファクターである
   特許請求の範囲第１項による分析法。 （３）制御された外部因子が、形成された錯体を未結合
   の酵素標識された成分に対して置換することである特許
   請求の範囲第１項による分析法。 （４）成分（ｂ）（Ｇ）および（ｅ）の１種以上が作用
   電極に固定化されている特許請求の範囲第１項による分
   析法。 （５）成分（ｅ）がフェロセンまたはフェロセン誘導体
   で形成されている特許請求の範囲第１項による分析法。 （６）フェロセン誘導体が式−〇ＨＯ。 −（ＣＨ２）、Ｃ０ＯＨまたは １２ −（ＣＨ２）ｍＮ、ＲＲ（但し自とｍとはそれぞれＯか
   ら６までの整数で、Ｒ１とＲ２とは同一でも異なっても
   よく、水素または炭素数１−４のアルキ′２ｐ基である
   ）で現わされる一つ以上の側鎖を有している特許請求の
   範囲第５項による分析法。 （７）所定の電位を成分に与えたときに観察されるピー
   ク電流の変動から電子移動の程度を調べる特許請求の範
   囲第１項による分析法。 （８〉リガントが抗原または抗体である特許請求の範囲
   第１項による方法。 （９）（イ）分析用成分として（ａ）サンプル（ｂ）リ
   ガントに対する特異的結合体、（Ｃ）所望により、リガ
   ンド類似体と特異的結合体とから選ばれた１種以上の別
   の成分（ｄ）酵素に対する基質および（ｅ）基質の酸化
   によって生じる酵素を経由して、電子が基質から電極へ
   移動することを助ける能力を有するか、または基質還元
   能を持つ酵素を経由して電子が電極から基質へ移動する
   ことを助ける能力を有する化学種を用い、その際上記の
   成分（ｂ）と（Ｃ）とから選ばれた１種以上の成分は酵
   素で標識されていること、および（ロ）錯体形成の作用
   と制御された外部因子の作用とから選ばれた１種以上の
   作用によって上記の電子の移動が変動される程度を測定
   する工程を有することを特徴とする、電極を有する電気
   化学的装置と分析用成分とを用いてサンプル中のりガン
   トを分析する方法、実施するための、上記成分および装
   置の組合せ。 （１０）（ａ）二つ以上の電極と（ｂ）酵素で標識され
   または標識されない成分を有する水性の分析用媒質とか
   ら選ばれた１種以上を有し、その際上記媒質は溶液であ
   るかまたは作用電極に固定されている媒質である特許請
   求の範囲第９項による成分および装置の組合せ。