DE69219686T2

DE69219686T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Verwendung in spezifischen Bindungstests

Info

Publication number: DE69219686T2
Application number: DE69219686T
Authority: DE
Inventors: Toshinori Kanamori; Masahiro Nobuhara; Tadakazu Yamauchi
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-07-28
Publication date: 1997-09-11
Anticipated expiration: 2012-07-29
Also published as: EP0525723B1; US5516644A; US6218134B1; DE69219686D1; CA2074752A1; JPH05264552A; EP0525723A3; EP0525723A2; JP2930809B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay für eine einfache und schnelle qualitative und quantitative Analyse von zu untersuchenden Substanzen in Testproben und eine Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay für die Durchführung des Verfahrens.
Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Assayverfahren und eine Vorrichtung, die geeignet sind für die Anwendung in dem Verfahren, in dem
(1) die Verteilung eines Markers (Signalsubstanzerzeuger) korrelativ zu einer Detektionsvorrichtung in Abhängigkeit von der Konzentration einer zu untersuchenden Substanz in einer Matrix verändert werden kann, in der eine spezifische Bindungssubstanz, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, immobilisiert oder eingeschlossen ist, über mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit der spezifischen Bindungssubstanz, wobei eine spezifische, auf eine Bindungsreaktion bezogene Substanz als Markierung (Signalsubstanzerzeuger) verwendet wird, die an eine spezifische Bindungsubstanz in Wettstreit mit der zu untersuchenden Substanz bindet oder an die zu untersuchende Substanz direkt und spezifisch bindet ohne Bindung an die spezifische Bindungssubstanz und die Signalsubstanzen direkt oder indirekt erzeugen kann und
(2) Signale, die in der Detektionsvorrichtung beobachtet werden können, in Abhängigkeit von der Entfernung zwischen der Markierung und der Detektionsvorrichtung moduliert werden können (d.h., der Diffussionslänge einer Signalsubstanz) unter Verwendung einer Signalsubstanz, die von dem Marker freigesetzt wird (Signalsubstanzerzeuger) und die direkt oder indirekt Signale erzeugt, die nur durch die Detektionsvorrichtung nachweisbar sind.
Es gibt eine Vielzahl von bekannten spezifischen Verfahren für Bindungsassays, wie z.B. einen Immunoassay, bei dem eine Antigen-Antikörperreaktion verwendet wird, einen Rezeptorassay, bei dem ein Rezeptor verwendet wird und einen Nukleinsäuresonden-Assay, bei dem eine Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresequenzen verwendet wird. Aufgrund der hohen Spezifität werden diese Assayverfahren häufig in verschiedenen Gebieten verwendet, einschließlich der klinischen Inspektion und ähnlichem.
Im allgemeinen sind diese Verfahren in ein heterogenes Verfahren unterteilt, das einen Schritt für die Isolierung von Substanzen nach spezifischen Bindungsreaktionen benötigt, die nicht reagiert haben und ein homogenes Verfahren, das einen solchen Isolierungsschritt nicht benötigt.
Das heterogene Verfahren ist nützlich für die Messung von Proben mit einer relativ hohen Sensitivität und kann als allgemeines Anwendungsverfahren betrachtet werden, da es eine Menge der spezifischen Bindungsreaktion nachweisen kann, ohne auf eine Interferenz von den Substanzen zu reagieren, die nicht reagiert haben. Dieses Verfahren benötigt jedoch eine komplexe Verarbeitung für die Entfernung von Substanzen, die nicht reagiert haben und verlangt in einigen Fällen besonderes Handwerkzeug oder Instrumente, wie z.B. eine Waschvorrichtung. Deshalb ist es immer noch notwendig, dieses Verfahren in bezug auf seine Einfachheit und Schnelligkeit zu verbessern.
Mit dem Ziel der Verbesserung der Verarbeitungsleichtigkeit des homogenen Assayverfahrens sind verschiedene Verfahren entwickelt worden, wie die, die das Agglutinationsverfahren umfassen, das EMIT-Verfahren, das "Proximal Linkage Immunoassay", wie z.B. ein Enzymkanalisierungsverfahren, das immunchromatographische Assay und ähnliches. Diese Verfahren sind jedoch den heterogenen Verfahren hinsichtlich der Effizienz und der allgemeinen Verwendbarkeit immer noch unterlegen.
Zum Beispiel weisen die Agglutinationsverfahren, die durch die Bildung von Aggregaten durch eine Antigen-Antikörperreaktion ausgelöst werden oder durch die Inhibition der Aggregatbildung, wie z.B. ein Geldiffusionsverfahren, das Erythrocyten- Agglutinationsverfahren, das Latex-Agglutinationsverfahren und ähnliches eine deutlich verringerte Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich mit anderen Verfahren auf, in denen Marker, wie z.B. Enzyme, verwendet werden.
Beispiele für Verfahren des homogenen Typs, die durch die Verwendung von Markern, wie z.B. Enzymen, durchgeführt werden, umfassen: EMIT-Verfahren und ähnliche, die durch die Modulierung einer Enzymaktivität durchgeführt werden, die selbst auf einer spezifischen Bindungsreaktion basiert; und das "Proximal Linkage Immunoassay", bei dem eine Signalmodulierung auftritt, wenn sich zwei Arten von Markern mit einer wechselseitigen Beziehung, aufgrund einer spezifischen Bindungsreaktion, nahekommen. Im Fall des EMIT-Verfahrens und verwandten Techniken ist es notwendig, ein Enzym oder einen Coenzymbestandteil, einen Enzyminhibitor oder ähnliches mit der zu untersuchenden Substanz (oder einem Analog der zu untersuchenden Substanz) zu modifizieren, während die Aktivität des Enzyms oder ähnlichem konstant gehalten wird und es ist notwendig, eine signifikante Modulation der Enzymaktivität über eine Bindungsreaktion des modifizierten Erzeugnisses mit einer spezifischen Bindungssubstanz zu induzieren. Aufgrund dieser Bedürfnisse ist dieses Verfahren anderen Verfahren im Hinblick auf Sensitivität und allgemeine Anwendung unterlegen und kann in einigen Fällen nicht verwendet werden, aufgrund der physikalischen Eigenschaften (Molekulargewicht, Konfiguration, Löslichkeit und ähnliches) und chemischen Eigenschaften (Reaktivität, Position der funktionalen Gruppen und ähnliches) der zu untersuchenden Substanz. Andererseits kann der "Proximal Linkage Immunoassay" manchmal durch verschiedene Markierungsverfahren durchgeführt werden, die im allgemeinen in dem heterogenen Verfahren verwendet werden und ist daher dem EMIT-Verfahren und ähnlichen im Hinblick auf die allgemeine Verwendbarkeit überlegen. Zusätzlich kann ein Anstieg der Sensitivität und eine Abnahme der Meßzeit erwartet werden, wenn die Konzentration der spezifischen Bindungssubstanzen, einschließlich der Markersubstanzen zunimmt, vom Standpunkt der spezifischen Bindungsreaktion und der Detektion von Signalen. Solch eine Konzentrationszunahme vermehrt jedoch die zunehmende Häufigkeit von Markern, unabhängig von der spezifischen Bindungsreaktion. Solche Eigenschaften, die sich widersprechen, werden ein wichtiger Faktor, der die Sensitivität begrenzt. Ein Beispiel für den "Proximal Linkage Immunoassay" ist die Enzymkanalisierungstechnik, bei der zwei Arten von Enzymen verwendet werden, die fortgesetzt zwei Reaktionen katalysieren, wie z.B. die Bildung eines Erzeugnisses durch ein erstes Enzym und die Verwendung des Erzeugnisses durch ein zweites Enzym als sein Substrat. Verfahren in Beziehung auf eine solche Technik wurden z.B. in der GB 2018986, EP 32286, EP 75379, Analytical Biochemistry (Band 106, S. 223-229, 1980) und ähnlichen offenbart. Jedoch basiert jedes dieser Verfahren auf der Modulation der Gesamtenzymreaktionsrate, was durchgeführt wird durch eine Differenz zwischen einer Zeit, zu der ein markiertes Enzym im freien Zustand existiert und einer Zeit, zu der eine mikroskopische Umgebung durch einen Nachbarschaftseffekt von Markern durch eine spezifische Bindungsreaktion gebildet wird, so daß die Kanalisierung der markierten Enzyme durchgeführt werden kann, oder, wenn das markierte Enzym einer spezifischen Bindung an einen dispersionsartigen diskreten Teilchenträger unterliegt (Dextranteilchen oder ähnliches) oder einen nichtdispersionsartigen Träger (Filterpapier oder ähnliches), der eine kanalisierende Umgebung zur Verfügung stellt. Im Ergebnis könnte ein freies, markiertes Enzym in der flüssigen Phase die feste Phase durch freie Diffusion erreichen und seine nichtspezifische Reaktion würde Probleme erzeugen, wenn die Konzentration des markierten Enzyms hoch ist. Es ist ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens, daß sich Reaktionsprodukt des ersten Enzyms innerhalb des Meßsystems anhäuft, wenn keine Umgebung für seine Kanalisierung mit dem zweiten Enzym gebildet ist, da das erste Enzym seine Reaktion unabhängig von seinem Nachbarschaftsgrad zu einem zweiten Enzym fortsetzen kann. Eine solche Anhäufung des durch die Reaktion des ersten Enzyms gebildeten Produkts verursacht auch eine Beschleunigung von nicht-spezifischen Reaktionen. Um solche Probleme zu lösen, wird ein Produktfänger verwendet, der überflüssige Mengen des ersten Reaktionsprodukts entfernen kann. Jedoch verursacht die Zufügung eines Produktfängers in effektiver Menge einen gewissen kompetitiven, inhibitorischen Effekt auf die Gesamtreaktion. Die Anwendung eines solchen Produktfängers kann deshalb nicht als allgemeine Gegenmaßnahme angesehen werden.
Es wurde von einer anderen Art von Assayverfahren berichtet, die einen Schritt enthält, bei dem eine Testprobe, die die zu untersuchende Substanz vermutlich enthält, zusammen mit oder getrennt von einer markierten, spezifischen Bindungssubstanz in einem chromatographischen Bereich, der einen porösen oder teilchen-gepackten Träger enthält, an den eine spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist, permeiert und entwickelt wird. Ein solches Verfahren oder ein immunochromatographischer Assay, ist in einigen Fällen vom Standpunkt der Sensitivität und der Meßzeit vorteilhaft, aufgrund des großen, immobilisierbaren, wirksamen Oberflächenbereichs und der relativ hohen Kollisionseffizienz zwischen den Reaktionsmolekülen, die eine spezifische Bindungsreaktion induzieren können im Vergleich mit einer Reaktion in flüssiger Phase. In diesem Fall kann ein Marker selbst eine Signalsubstanz sein oder ein Signal erzeugen und außerdem, anstelle der Erzeugung eines Signals durch den Marker selbst, kann eine Signalsubstanz, die bei der Erzeugung eines Signals betroffen ist, durch einen anderen Marker erzeugt werden. Beispiele für die frühere Art von Markern umfassen ein radioaktives Isotop, eine Färbesubstanz, eine fluoreszierende Substanz, eine lumineszierende Substanz und ähnliches, und diejenige der späteren Art von Markern umfassen Enzyme und ähnliches. Verfahren für den immunochromatographischen Assay, bei dem die früheren Marker verwendet werden, sind z.B. in der DE 2729872, der WO 8808534, der EP 323605 offenbart und diejenigen, in denen die späteren Marker verwendet werden, sind z.B. in dem EP 100619, der WO 8505451 und dem US-Patent 4,956,275 offenbart. Die späteren Marker können im allgemeinen vorteilhaft sein, wenn es wünschenswert ist, eine Sensitivität zu erhalten ohne daß ein radioaktives Isotop verwendet wird. Im Falle der Verwendung der späteren Marker wird eine Signalsubstanz durch den Kontakt eines Bestandteils, der notwendig ist für die Erzeugung der Signalsubstanz (z.B. ein Enzymsubstrat, ein Färbestoff oder ähnliches) mit einem Marker (einem Enzym oder ähnlichem) erzeugt. Aufgrund dieser Tatsache benötigt ein solches Verfahren einen zusätzlichen Schritt, um die eben beschriebene Kontaktreaktion zu bewirken (die hiernach als "Entwicklungsschritt" bezeichnet wird), der nach dem Permeations-Entwicklungsschritt einer Testprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz und die markierte, spezifische Bindungssubstanz enthält, durchgeführt wird, was das Problem einer komplexen Verarbeitung mit sich bringt.
Zusätzlich weisen diese immunochromatographischen Assayverfahren ein allgemeines Problem auf, das immer noch ungelöst ist. Dieses liegt darin begründet, daß die spezifische Bindungsreaktion mindestens von der Reaktionshäufigkeit von zwei Molekülen abhängt, wenn eine markierte, spezifische Bindungssubstanz und eine flüssige Testprobe einer chromatographischen spezifischen Bindungsreaktion in einem spezifischen Bindungsreaktionsbereich unterzogen werden. Aufgrund dieser Tatsache nimmt die Bindungsverteilung der markierten, spezifischen Bindungssubstanz in der chromatographischen Richtung in dem spezifischen Bindungsreaktionsbereich mehr oder weniger ein leicht gekrümmtes Muster an, wie z.B. ein Gradientenmuster oder ein sigmoides Muster. Wenn die Konzentration einer zu untersuchenden Substanz in einer flüssigen Testprobe geändert wird, ändert sich die Reaktionshäufigkeit und die Bindungsverteilung eines Markers in dem spezifischen Bindungsreaktionsbereich, zeigt aber immer noch im ganzen ein gekrümmtes Verteilungsmuster. Aufgrund dieser Tatsache wird die Grenzlinie zwischen gefärbten und nicht-gefärbten Bereichen in vielen Fällen unklar, was zu erheblichen Fehlern führt, wenn z.B. die Konzentration der zu untersuchenden Substanz in einer flüssigen Testprobe qualitativ oder quantitativ, basierend auf der Länge oder der Position eines gefärbten Bereichs nach dem Entwicklungsschritt, bestimmt wird, d.h. aufgrund einer Entfernung oder der Position zum Endpunkt der Bindungsverteilung eines Markers. Um die Meßgenauigkeit zu verbessern ist es notwendig, eine Quantifizierung der Bindungsverteilung des Markers in dem spezifischen Bindungsreaktionsbereich durchzuführen, indem er gesamt verstanden wird. Das US-Patent 4,956,275 offenbart eine Anordung von einer Vielzahl von Detektionsvorrichtungen in einem Detektionsbereich, der auch als spezifischer Bindungsreaktionsbereich verwendet wird. Durch eine solche Anordung einer Vielzahl von Detektionsvorrichtungen im Detektionsbereich wird das Verstehen der Genauigkeit der Bindungsverteilung eines Markers in dem spezifischen Bindungsreaktionsbereich im Vergleich zu dem Fall verbessert, bei dem eine einzelne Detektionsvorrichtung verwendet wird. Jedoch ist eine solche Verbesserung nicht wesentlich, da die Assayvorrichtung komplex wird und die Anzahl der Detektionsvorrichtungen, die hier angeordnet wird, eine Grenze hat. Das eben zitierte Patent offenbart auch, daß ein Signalerzeugungssystem, das auf Enzymkanalisierung basiert, im Detektionsbereich angeordnet werden kann. Gemäß der Beschreibung bedeutet jedoch der Detektionsbereich einen Bereich, in dem immobilisierte Antikörpermoleküle lokalisiert sind und die Beschreibung erklärt nur, daß nur ein existierender Teil eines markierten zweiten Enzyms ein Signal durch Immobilisierung eines ersten Enzyms zusammen mit dem Antikörper an den Detektionsbereich erzeugen kann und indem ein Substrat des ersten Enyzms der Entwicklungslösung hinzugefügt wird. Im Ergebnis kann das Verfahren des eben zitierten Patents den Entwicklungsschritt vereinfachen, kann jedoch die oben genannten Probleme im Hinblick auf die Meßgenauigkeit und Sensitivität nicht lösen.
Eine spezifische Bindungsassayvorrichtung, die vielschichtige, analytische Materialien enthält, ist als andere Art des immunochromatographischen Assays bekannt. Verfahren in bezug auf diese Art von Verfahren sind z.B. in dem EP 51183, dem EP 66648, der DE 3227474 und dem EP 236768 offenbart. Von diesen offenbart sowohl die EP 51183 als auch dieEP 66648 ein Verfahren, in dem eine spezifische Bindungsschicht ein poröses Material enthält, das eine spezifische Bindungssubstanz immobilisiert und auf eine Detektionsschicht aufgelagert ist und, nach Beendigung der spezifischen Bindungsreaktion, wird eine markierte Substanz, die in die Detektionsschicht permeiert ist, mit einem Reagenz detektiert, das in der Detektionsschicht enthalten ist. Diese Patente offenbaren außerdem, daß eine Lichtschutzschicht zwischen der Detektionsschicht und der spezifischen Bindungsschicht zwischengelagert ist, um die schlechten Einflüsse von Signalen zu verhindern, die von der markierten Substanz stammen, die an die spezifische Bindungsschicht gebunden ist. Wenn jedoch ein Signalprodukt durch die Reaktion einer markierten Substanz mit einem Reagenz in der Detektionsschicht gebildet wird, z.B. in dem Fall, in dem der Marker ein Enzym ist, kann die Lichtschutzschicht nicht die schlechten Einflüsse von inverser Diffusion des Reagenzes in die spezifische Bindungsschicht und die Permeation eines Enzymreaktionsprodukts, das in der spezifischen Bindungsschicht gebildet wird, in die Detektionsschicht verhindern. Sowohl die DE 3227474 als auch die EP 236768 offenbaren eine spezifische Bindungsassayvorrichtung, die vielschichtige, analytische Materialien enthält, in die ein Prinzip des homogenen Verfahrens eingeführt ist, oder in der ein immobilisiertes Enzymsubstrat in eine spezifische Bindungsschicht eingeführt ist. Jedoch können beide dieser Vorrichtungen die Begrenzungen des homogenen Verfahrens, wie oben beschrieben, nicht vermeiden und die nachteiligen Wirkungen, die durch das gekrümmte Bindungsverteilungsmuster des Markers in der spezifischen Bindungsschicht erzeugt werden, sind sehr ernst zu nehmen aufgrund der kurzen und dünnen chromatographischen Schicht.
Wie oben beschrieben, wurde eine Anzahl von verschiedenen spezifischen Bindungsassayverfahren entwickelt mit dem Ziel, die einfache Handhabung und Schnelligkeit zu verbessern, aber sozusagen nichts wurde über ein hochsensitives, spezifisches Bindungsassayverfahren berichtet, das für verschiedene Zwecke verwendbar ist und eine zu untersuchende Substanz semiquantitativ oder quantitativ mit hoher Genauigkeit bestimmen kann.
Mit der in letzter Zeit zunehmenden häuslichen und regionalen medizinischen Versorgung und den wachsenden Bedürfnissen an notfallklinischen Untersuchungen, wurde ein deutliches Augenmerk auf die Entwicklung eines spezifischen Bindungsassayverfahrens gerichtet, durch das eine zu untersuchende Substanz schnell, einfach und genau auch durch Personen gemessen werden kann, die keine Kenntnis über klinische Untersuchungen haben. Unter solchen Umständen sind verschiedene Arten von Sensoren entwickelt worden, einschließlich elektrochemischen Sensoren. Im Gebiet der biochemischen Assayverfahren wurden einfache und schnelle Meßverfahren entwickelt, die Enzymsensoren und ähnliches verwenden und sind z.B. schon offenbart in der JP-B-02- 59424 (die Bezeichnung "JP-B", wie hier verwendet, bedeutet eine "geprüfte japanische Patentveröffentlichung") und der EP 125136. Obwohl positive Versuche unternommen wurden, solche Meßverfahren auf das spezifische Bindungsassayverfahren anzuwenden, wurde sozusagen nichts über die Entwicklung eines Assayverfahrens für allgemeine Zwecke berichtet, das einfach bearbeitet werden kann. Von diesen Sensoren aus dem Stand der Technik zur Verwendung in dem spezifischen Bindungsassay werden die elektrochemischen Sensoren, die durch die Verwendung von relativ hoch sensitiven Markern, wie z.B. Enzymen, erzeugt werden, im folgenden beschrieben.
Die EP 125136 offenbart eine spezifische Bindungsreaktion an der Oberfläche einer Elektrode, auf die eine Enzym(katalase)- markierte Antikörperpräparation aufgebracht ist. Die EP 125136 offenbart auch eine kompetitive, spezifische Bindungsreaktion an der Oberfläche einer Elektrode, auf die eine Enzym(Glucoseoxidase)-markierte Substanz aufgebracht ist. Da eine spezifische Bindungssubstanz an der Oberfläche einer Elekrode immobilisiert ist, die in ihrer Größe begrenzt ist, beinhaltet jeder dieser Sensoren in diesen Offenbarungen eine Begrenzung in der Immobilisierungswirksamkeit. Aufgrund dieser Tatsache und da die Reaktion in flüssiger Phase durchgeführt wird, weisen alle diese Sensoren Nachteile im Hinblick auf Sensitivität und Meßzeit auf.
Die EP 125136 offenbart einen Enzymaktivität-Detektionssensor, der ein Oxidations-Reduktionsenzym (Glucoseoxidase oder ähnliches) enthält, sowie einen Elektronenüberträger (ein Ferrocenderivat oder ähnliches), wobei das Ausmaß einer spezifischen Bindungsreaktion entweder unter Verwendung des Enzyms oder des Elektronenüberträgers als Marker gemessen wird, indem (a) das effektive Niveau des Elektronenüberträgers geändert wird, (b) das effektive Niveau des Enzyms geändert wird, (c) die effektiven Niveaus des Elektronenüberträgers und des Enzyms gleichzeitig geändert werden und (d) der effektive Bereich der Elektrode geändert wird. Gemäß dieser Offenbarung wird die spezifische Bindungsreaktion auf der Oberflche einer Festphase (Gefäßwand oder Elekrode) (heterogenes Verfahren) oder in Lösung durchgeführt, in der die Elektrode vorliegt (homogenes Verfahren). Ähnlich wie im Falle von anderen Verfahren des heterogenen Typs benötigt das heterogene Verfahren gemäß dieser Offenbarung einen Schritt für die Isolation oder das Waschen von den Substanzen, die nicht reagiert haben. Zusätzlich hierzu stehen nur die Oberfläche der Gefäßwand oder der Elektrode als Träger für die Immobilisierung zur Verfügung. Dieser Sensor kann daher die Meßwirksamkeit und die einfache Handhabbarkeit des heterogenen Verfahrens nicht verbessern. Das homogene Verfahren gemäß dieser Offenbarung ist außerdem im wesentlichen identisch zu jedem anderen vorher genannten homogenen Verfahren, so daß die Probleme, die den homogenen Verfahren inneliegen, ungelöst bleiben. Zum Beispiel sollte in dem homogenen Verfahren, bei dem ein Liganden-modifizierter Elektronenüberträger verwendet wird, der Elektronenüberträger eine Kapazität haben, um einen Elektronentransfer durchzuführen, indem er nahe an das Redoxzentrum des Enzymmoleküls herankommt. Jedoch wird die Funktion des Elektronenüberträgers, wenn er mit einem Liganden modifiziert ist, in einigen Fällen abhängig von dem Typ des zu verwendenden Liganden zerstört, was zu einer begrenzten Verfügbarkeit von Liganden führt, sowie zu einem Nachteil im Hinblick auf die Sensitivität. Eine ähnliche Technik wurde in der EP 402126 offenbart, die ebenfalls eine Begrenzung im Hinblick auf die Bindung eines Elektronenüberträgers und eines Liganden an Trägermoleküle aufweist.
Ähliche Techniken sind z.B. auch in der EP 142301, der EP 125139, der EP 150999, der JP-A-63-139248 (die Bezeichnung "JP-A", wie hier verwendet, bedeutet eine "nicht geprüfte veröffentliche, japanische Patentanmeldung"), dem US-Patent 4,963,245, dem US-Patent 5,066,372, Anal. Chem. (Band 56, S. 2355-2360, 1984) und Clin. Chem. (Band 31, S. 1449-1452, 1985) offenbart. Von diesen Offenbarungen offenbart sowohl das US- Patent 4,963,245 und das US-Patent 5,066,372 ein semihomogenes Verfahren, wobei die Messung nach einer spezifischen Bindungsreaktion durchgeführt wird, ohne daß ein Schritt für das Waschen von Substanzen benötigt wird, die nicht reagiert haben, indem spezifische Bindungssubstanz-immobilisierte magnetische Teilchen auf der Oberfläche einer Elektrode magnetisch getrennt werden. Jedoch benögtigt diese Art von Verfahren eine Vorrichung zur magnetischen Trennung, um den magnetischen Teilchenträger physikalisch zu trennen. Außerdem kann zusätzlich, ähnlich wie im Fall des obengenannten "Proximal Linkage Immunoassay" (Enzymkanalisierungsverfahren oder ähnliches) ein markiertes Enzym, das in der flüssigen Phase frei vorliegt, die Elektrode durch freie Diffusion erreichen und die daraus resultierende, nicht-spezifische Reaktion wird zu einer Quelle von Problemen.
Die EP 223541 offenbart ein heterogenes elektrochemisches spezifisches Bindungsassayverfahren, bei dem ein Enzym (alkalische Phosphatase) als Marker verwendet wird, der eine Umwandlung eines inaktiven Elektronenüberträger-Vorläufers (ein Ferrocen-verbundenes Substrat) in einen aktiven Elektronenüberträger katalysiert. Eine PCT-Anmeldung (WO 89-05454) offenbart ein heterogenes, spezifisches Bindungsassayverfahren, in dem ein Enyzm (alkalische Phosphatase), das die Umwandlung einer Vorstufe (NADP&spplus;) in das Oxidations-Reduktionspaar (NAD&spplus;) katalysiert, als Marker verwendet und die Menge des gebildeten Oxidations-Reduktionspaars wird unter Verwendung eines elektrochemischen Enzymsensors gemessen. Auch offenbart die JP-A- 02-112752 ein Verfahren, in dem biologische Zellen, die von einem Tiefenfilter festgehalten werden, mit Enzym-markierten Antikörpern auf dem Filter reagieren können, wobei Moleküle von dem markierten Antikörper, die nicht reagiert haben, durch Waschen entfernt werden und wobei die biologischen Zellen dann durch Messung der Aktivitäten des markierten Enzyms unter Verwendung einer Elektrode nachgewiesen werden.
Die EP-A-284 232 offenbart eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Assay für einen analytischen Stoff, die einen festen Träger enthält, der mindestens einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich aufweist, wobei die ersten und zweiten Bereiche in einer kapillaren Flußverbindung miteinander stehen, wodurch das Material durch Kapillarkräfte vom ersten Bereich in den zweiten Bereich fließen kann und wobei der zweite Bereich einen Bindungsstoff enthält, der immobilisiert ist, wobei der Bindungsstoff ein Bindungsstoff für mindestens einen Analyten ist; außderdem einen Tracer, der aus einem Ligandenbereich und einem detektierbaren Markerbereich besteht, der mit dem Ligandenbereich verbunden ist, wobei der Tracer von dem festen Träger des ersten Bereichs gestützt wird, wodurch, wenn der erste Bereich mit einer flüssigen Probe angefeuchtet wird, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält und wobei Tracer und alle Analyte durch Kapillarkräfte zum zweiten Bereich für einen Kontakt mit dem Bindungsstoff fließen. Weiterhin beschreibt diese Referenz ein Assayverfahren für einen Analyten, das den Schritt der Kontaktierung einer Probe enthält, von der angenommen wird, daß sie den zu untersuchenden Analyten enthält mit einem ersten Bereich der obengenannten Vorrichtung; und der Bestimmung von mindestens einem Tracer, der in dem zweiten Bereich gebunden oder nicht gebunden vorliegt.
Da sie jedoch typische heterogene Verfahren sind, können diese Verfahren die Meßdurchführung und Einfachheit der Handhabung der konventionellen heterogenen Verfahren nicht verbessern.
Es ist ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren für allgemeine Zwecke vorzusehen, das nützlich ist für eine schnelle, qualitative oder quantitative Analyse und das auf dem Prinzip des spezifischen Bindungsassays basiert, das jedoch keinen Schritt für die Trennung (das Waschen) von Substanzen benötigt, die nicht reagiert haben, sowie eine spezifische Bindungsassayvorrichtung, die geeignet ist für die Durchführung des Verfahrens.
Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren für allgemeine Zwecke in der Verwendung von spezifischen Bindungsassays vor, sowie eine Vorrichtung, die geeignet ist für die Durchführung dieses Verfahrens, das
(1) geeigneterweise für verschiedene Sensortechniken anwendbar ist, die eine Messung möglich machen unter Verwendung von einer relativ kleinen und einfachen Meßvorrichtung,
(2) das geeigneterweise für verschiedene immunochromatographische Assayträger anwendbar ist, die handlich sind und wovon eine Verbesserung der Sensitivität erwartet werden kann,
(3) das die behindernden Wirkungen, die dem immunochromatographischen Assay, aufgrund der Krümmungstendenz in der Bindungsverteilung von Markern innewohnen, minimieren kann,
(4) das geeigneterweise Signalsubstanzerzeuger (Enzyme und ähnliches) verwenden kann, die eine Messung mit relativ hoher Sensitivität möglich machen und
(5) das keine Begrenzungen, wie sie spezifisch für das homogene Verfahren sind, aufweist, sondern vielmehr geeigneterweise Markierungsverfahren und Immobilisierungsverfahren anwenden kann, die in den konventionellen allgemeinen Immunoassayverfahren verwendet werden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt für einen spezifischen Bindungsassay, bei dem eine zu untersuchende Substanz in einer Testprobe qualitativ oder quantitativ durch mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit einer spezifischen Bindungsstubstanz bestimmt wird, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, das folgende Schritte aufweist:
(1) Einführung einer Testprobe, die die zu untersuchende Substanz vermutlich enthält, in eine Matrix,
(2) Bildung einer Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers in der Matrix durch eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit der spezifischen Bindungssubstanz,
(3) Erzeugung einer Signalsubstanz von dem Signalsubstanzerzeuger, der die Verteilung bildet,
(4) Diffusion der Signalsubstanz von dem Signalsubstanzerzeuger zu einer Detektionsvorrichtung,
(5) und Messung der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix als Grad der Signalmodulation an der Detektionsvorrichtung über eine Signalsubstanz, die direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das nur an der Detektionsvorrichtung nachweisbar ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine elektrochemische, spezifische Bindungsassayvorrichtung zur Verfügung gestellt, zur Messung der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer flüssigen Testprobe, die Mittel zur Einführung der Probe enthält (a), eine Matrix (b), eine Detektionsvorrichtung (c), die fähig ist, eine Veränderung in der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix als ein Signal nachzuweisen, das durch den Massetransfer der von dem Signalsubstanzerzeuger erzeugten Signalsubstanz in der Menge begrenzt und, falls nötig, eine Absorptionsvorrichtung (d).
Andere Ziele und Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung werden sich aus dem Wortlaut der Beschreibung ergeben.
Es soll festgehalten werden, daß jede Bezeichnung einer Substanz, eines Vorläufers, eines Substrats, eines Erzeugers und eines Elektronenüberträgers, wie hier verwendet, in Singularform, nicht eine einzählige Anzahl bedeutet, sondern als Überbegriff einer odermehrerer Arten in Einzahl oder Vielzahl gedacht ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein konzeptioneller Graph, der ein Prinzip des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt.
Fig. 2 ist ein Graph, der eine Beziehung zwischen der Signalstärke und der Zeit, die nach Beginn der Messung vergangen ist, zeigt.
Fig. 3 ist ein konzeptioneller Graph, der ein Prinzip gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 4 ist ein Graph, der theoretisch vorhergesagte Veränderungen in Stromstärkesignalen zeigt, die durch eine Detektionsvorrichtung (c) in Abhängigkeit von der Entfernung L detektiert werden, basierend auf der in Fig. 3 gezeigten Annahme.
Fig. 5 ist ein konzeptioneller Graph, der ein Prinzip des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 6 ist ein konzeptioneller Graph, der ein Prinzip des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 7 ist ein Graph, der eine Beziehung zwischen der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe und der Signalstärke zeigt.
Fig. 8 ist ein konzeptioneller Graph, der ein Prinzip des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 9 ist eine Seitenansicht oder eine Aufsicht, die ein Beispiel der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 10 ist ein perspektivisches Diagramm, das ein Beispiel der Matrixform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung, die das Experiment, wie durchgeführt in Beispiel 2, zeigt.
Fig. 12 ist ein Graph, der die Ergebnisse des Experiments, wie durchgeführt in Beispiel 2, zeigt.
Fig. 13 ist eine schematische Darstellung, die eine Assayvorrichtung, wie verwendet in Beispiel 3, zeigt.
Fig. 14 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Messung, wie durchgeführt in Beispiel 3, zeigt.
Fig. 15 ist eine schematische Darstellung, die eine Assayvorrichtung zeigt, hergestellt wie in Beispiel 4(2).
Fig. 16 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Messung, wie durchgeführt in Beispiel 4(3), zeigt.
Fig. 17 ist eine schematische Darstellung, die eine Assayvorrichtung, hergestellt wie in Beispiel 4(4), zeigt.
Fig. 18 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Messung, wie durchgeführt in Beispiel 4(5), zeigt.
Fig. 19 ist eine schematische Darstellung, die eine Assayvorrichtung, präpariert wie in Beispiel 4(6), zeigt.
Fig. 20 ist eine schematische Darstellung, die eine Assayvorrichtung, wie hergestellt in Beispiel 4(7), zeigt.
Fig. 21 ist ein perspektivisches Diagramm, das eine Assayvorrichtung, präpariert wie in Beispiel 5(3), zeigt.
Fig. 22 ist ein Anordnungsdiagramm, das eine Assayvorrichtung zeigt, hergestellt wie in Beispiel 8.
Fig. 23 ist ein perspektivisches Diagramm (A) oder eine Teilansicht (B), die die Bedingungen der Assayvorrichtung der Fig. 22 zum Zeitpunkt der Messung zeigen.
In diesen Figuren sind die Vorrichtungen, Substanzen, Bedingungen und ähnliches durch die folgenden Kennzeichen angezeigt: a, Vorrichtung für die Probeneinführung; b, Matrix; c, Detektionsvorrichtung; d, Absorptionsvorrichtung; e, Träger (oder Basis); f, Abdeckung; g, Loch; s, Signal; 1, spezifische Bindungsassayvorrichtung; 11, Signalsubstanzerzeuger; 12, Substanz, beteiligt an der Erzeugung der Signalsubstanz; 13, Signalsubstanz; 14, zu untersuchende Substanz; 15, Substanz, beteiligt an der Signalerzeugung; 20, Permeationsrichtung der flüssigen Testprobe; 21, Probeneinführungsloch; 22, obere Platte; 23, Verbindungsmittel; 24, Gegen/Referenzelektrode; 25, Arbeitselektrode; 26, Referenzelektrodenende; 27, Arbeitselektrodenende; 28, Versiegelungsmittel; 29, Durchbohrung und 30, Probeneinführungsfilter.
Zunächst werden die technischen Bezeichnungen, die in der Beschreibung dieser Erfindung verwendet werden, erklärt.
Die Bezeichnung "zu untersuchende Substanz", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die qualitativ oder quantitativ durch das Verfahren oder die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird. Beispiele für solche Substanzen umfassen diejenigen, die funktionell fähig sind, als Antikörpermoleküle und Antigene, wie z.B. Proteine, Polypeptide, Glycoproteine, Polysaccharide, komplexe Glycolipide, Nukleinsäuren, Effektormoleküle, Rezeptormoleküle, Enzyme, Inhibitoren und ähnliches zu fungieren. Im einzelnen dargestellt, umfassen solche Substanzen: Tumormarker, wie z.B. α-Fötoprotein, carcinoembryonisches Antigen (CEA), CA 125, CA 19-9 und ähnliche; verschiedene Proteine, Glycöproteine und komplexe Glycolipide, wie z.B. β&sub2;-Mikroglobulin (β&sub2; m), Ferritin und ähnliche; verschiedene Hormone, wie z.B. Östradiol (E&sub2;), Östriol (E&sub3;), menschliches Choriongonadotropin (hCG), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Plazentalactogen (hPL) und ähnliche; verschiedene virusbezogene Antigene und virusbezogene Antikörpermoleküle, wie z.B. HBs-Antigen, Anti-HBs-Antikörper, HBc- Antigen, Anti-HBc-Antikörper, Anti-HCV-Antikörper, Anti-HIV- Antikörper und ähnliche; verschiedene Allergene und ihre korrespondierenden IgE-Antikörpermoleküle; narkotische Arzneimittel und medizinische Arzneimittel und deren metabolische Produkte; und Nukleinsäuren mit virus- und tumorbezogene Polynukleotidsequenzen.
Die Bezeichnung "Analog einer zu untersuchenden Substanz", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die ein ähnliches Verhalten wie die zu untersuchende Substanz in einer Bindungsreaktion mit einer spezifischen Bindungssubstanz zeigt. Im allgemeinen bedeutet es eine Substanz, die mit den zu untersuchenden Substanzen strukturell analog ist. Darstellende Beispiele umfassen verschiedene Arten von Strukturanalogen der zu untersuchenden Substanzen. In der vorliegenden Erfindung werden diese Strukturanaloge als Zusammensetzungs-Elemente von Signalsubstanzerzeugern verwendet, die später beschrieben werden, insbesondere, wenn eine zu untersuchende Substanz ein geringes Molekulargewicht hat und seine spezifische Bindungsreaktion durch ein kompetitives Verfahren herbeigeführt wird.
Die Bezeichnung "Testprobe", wie hier verwendet, bedeutet ein flüssiges Material, das eine zu untersuchende Substanz enthält oder wahrscheinlich enthält. Darstellende Beispiele umfassen Urin, Seren, Blutplasma, Gesamtblut, Speichel, Tränenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, sekretorische Flüssigkeiten aus Brustdrüsen und ähnliches. Ebenfalls umfaßt sind feste, gel- oder solartige Substanzen, wie z.B. Mucus, Körpergewebe, Zellen und ähnliche, die in flüssigen Materialien wie Puffern, Extraktionsmitteln, Lösungsmitteln und ähnlichen suspendiert oder gelöst sind.
Die Bezeichnung "spezifische Bindungssubstanz", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die eine spezifische Affinität für eine bestimmte Substanz aufweist, wie z.B. eine zu untersuchende Substanz, d.h. eine Substanz, die fähig ist, eine spezifische Bindungsreaktion mit einer spezifischen Substanz durchzuführen. Beispiele für Kombinationen der spezifischen Substanz mit der spezifischen Bindungssubstanz umfassen: Antigene mit korrespondierenden Antikörpermolekülen, eine Nukleinsäuresequenz mit ihrer komplementären Sequenz, Effektormoleküle mit Rezeptormolekülen, Enzyme mit Inhibitoren, Zuckerketten-enthaltende Verbindungen mit Lectinen, ein Antikörpermolekül mit einem anderen Antikörpermolekül, das spezifisch für den ersteren Antikörper ist, Rezeptormoleküle mit korrespondierenden Antikörpermolekülen und ähnliche Kombinationen. Andere Beispiele der spezifischen Bindungssubstanzen umfassen eine Verbindung, die in einem solchen Grad chemisch modifiziert wurde, daß ihre spezifische Bindungsaktivität noch intakt ist, und einen komplexen Körper einer Verbindung, die mit dem anderen Bestandteil verbunden ist. Beispiele für solche Kombinationen von spezifischen Bindungssubstanzen mit den spezifischen Substanzen umfassen: ein chemisches Biotinmodifiziertes Antikörpermolekül oder Polynukleotid mit Avidin, ein Avidin-gebundenes Antikörpermolekül mit Biotin und ähnliche Kombinationen.
In der Beschreibung gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Substanz, die einen Bereich aufweist, der als spezifische Bindungsstubstanz wirkt, auch als spezifische Bindungssubstanz verwendet werden, so wie der folgende Signalsubstanzerzeuger.
Die Bezeichnung "Signalsubstanzerzeuger", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die (1) an einer spezifischen Bindungsreaktion teilnimmt, wie z.B. der Bindung an eine spezifische Bindungssubstanz in Kompetition mit einer zu untersuchenden Substanz oder die spgzifische Bindung an die zu untersuchende Substanz, (2) ein Signal direkt oder indirekt erzeugt und (3) Verteilungsveränderungen in einer Matrix zeigt, und eine Korrelation zu der Menge der zu untersuchenden Substanz aufrechterhält.
In anderen Worten ist ein Signalsubstanzerzeuger eine markierte, spezifische Bindungssubstanz, die aus einem Bereich besteht, der als spezifische Bindungssubstanz agiert und einem anderen Bereich, der zu der Bildung einer Signalsubstanz beiträgt, wie später beschrieben werden wird.
In diesem Fall weist der Bereich, der als spezifische Bindungssubstanz wirkt, eine Struktur als spezifische Bindungssubstanz für eine zu untersuchende Substanz auf, oder er weist eine Struktur der zu untersuchenden Substanz oder ihres Analogs auf und der andere Bereich, der zu der Bildung einer Signalsubstanz beiträgt, besteht aus verschiedenen Arten von Enzymen oder ähnlichen, die konventionell als Markierungsmittel in Immunreaktionen und ähnlichem verwendet werden.
Das heißt, daß der Signalsubstanzerzeuger eine Substanz ist, die auf der einen Seite an der spezifischen Bindungsreaktion einer zu untersuchenden Substanz mit einer korrespondierenden spezifischen Bindungssubstanz teilnimmt, wodurch ihre Verteilung in einer Matrix in Abhängigkeit von der Menge der zu untersuchenden Substanz sich verändert und die andererseits zu der Bildung einer Signalsubstanz beiträgt.
Die Bezeichung "Signalsubstanz", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die durch eine Signalsubstanz-Erzeugungsreaktion gebildet wird und die ein bestimmtes Signal entweder selbst erzeugt oder eine andere Substanz dazu veranlaßt, ein Signal zu erzeugen.
Die Bezeichung "Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist", wie hier verwendet, kann den Signalsubstanzerzeuger umfassen, wenn die Bezeichnung wörtlich interpretiert wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet sie jedoch eine Substanz, die nicht der Signalsubstanzerzeuger ist, wie z.B. den Vorläufer einer Signalsubstanz oder eine Substanz, die an der Umwandlung des Vorläufers in seine korrespondierende Signalsubstanz mitwirkt.
Die Bezeichnung "Elektronenüberträger", wie hier verwendet, bedeutet, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, eine allgemeine Bezeichnung für Oxidations-Reduktionsverbindungen, die zwischen einer Enzymreaktion und einer Elektrodenre aktion die Verbindung herstellen, wodurch sie den Elektronentransfer zwischen beiden Reaktionen ermöglichen. Solche Verbindungen umfassen eine Substanz, die keine im wesentlichen irreversiblen Nebenprodukte in beiden Reaktionen erzeugt, und die fähig ist, einem Kreislauf zwischen den beiden Reaktionen zu unterliegen.
Die Bezeichnung "Substanz, beteiligt an der Erzeugung eines Signals" bedeutet eine Substanz, die zu der Erzeugung eines Signals beiträgt, ausgeschlossen die Signalsubstanz, wenn die Signalsubstanz ein Signal nicht direkt erzeugt, sondern andere Substanzen dazu bringt, ein Signal zu erzeugen, oder wenn die Signalsubstanz ein Signal zusammen mit einer anderen Substanz erzeugt.
Beispiele für solche Signale umfasssen Elektronentransfer, der elektrochemisch meßbar ist, eine Fluoreszenz, die unter Verwendung eines Fluorophotometers meßbar ist, Lumineszenz, die unter Verwendung eines Luminometers meßbar ist und eine Färbung, die durch visuelle Überprüfung oder unter Verwendung eines Farbdifferenzgeräts meßbar ist.
Die spezifische Bindungssubstanz, der Signalsubstanzerzeuger, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligte Substanz und die an der Erzeugung eines Signals beteiligte Substanz, können in dem Reaktionssystem schon vorher enthalten sein, oder in das Reaktionssystem vor, gleichzeitig mit oder nach der Einführung einer Testprobe eingeführt werden.
Wenn diese Substanzen in dem Reaktionssystem bereits vorher enthalten sind, können sie gleichmäßig im Reaktionssystem verteilt sein oder in spezifischen Stellungen in dem Reaktionssystem angeordnet sein, so daß sie diffundieren können, wenn eine flüssige Testprobe oder eine Entwicklungslösung, die sich von der Probe unterscheidet, eingeführt wird.
Gemäß der Assayvorrichtung der vorliegenden Erfindung bedeutet die Bezeichnung "Probeneinführungsvorrichtung", wie hier verwendet, einen Bereich, in dem eine Testprobe eingeführt wird.
Die Bezeichung "Matrix", wie hier verwendet, bedeutet einen Bereich, in dem eine zu untersuchende Substanz und ein Signalsubstanzerzeuger entwickelt werden, z.B. einen Bereich, in dem eine spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist und eine spezifische Bindungsreaktion auftritt mit einer Verteilung entlang der Flußrichtung einer Testprobe. In einem darstellenden Beispiel eines solchen Bereichs führen eine zu untersuchende Substanz und ein Signalsubstanzerzeuger eine spezifische Bindung an eine spezfische Bindungssubstanz in einer kompetitiven Weise durch oder die zu untersuchende Substanz bindet an eine spezifische Bindungssubstanz und dann bindet der Signalsubstanzerzeuger an die zu untersuchende Substanz in einem Sandwich-Bindungstyp, bei dem die spezifische Bindungsreaktion mit einer Verteilung entlang der Flußrichtung einer Testprobe auftritt.
Die Matrix, in der die spezifische Bindungsreaktion und ähnliches auftreten, mit einer Verteilung entlang der Flußrichtung einer Testprobe, ist nicht auf den Fall beschränkt, in dem eine spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist, sondern kann ein Bereich sein, in dem Veränderungen im Molekulargewicht und ähnlichem, die durch die spezifische Bindungsreaktion ausgelöst werden, nachgewiesen und als Verteilung gezeigt werden.
Die Bezeichnung "Detektionsvorrichtung", wie hier verwendet, bedeutet einen Bereich, in dem ein Signal detektiert wird und ein Grad der Signalmodulation durch visuelle Beobachtung gemessen wird oder unter Verwendung eines geeigneten externen Meßinstruments, abhängig von den Signaleigenschaften.
Die Bezeichnung "Absorptionsvorrichtung", wie hier verwendet, bedeutet einen Teil, der ein Wasser-absorbierbares Material enthält und wo, wenn nötig, die obengenannte, an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligte Substanz und ähnliche Substanzen festgehalten werden. Diese Vorrichtung trägt auch zu der Absorption und dem Halten der eingeführten flüssigen Testprobe bei.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben unter Verwendung der so definierten Bezeichnungen.
Das spezifische Bindungsassayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine spezifische Bindungsreaktion in einer Matrix bewirkt wird und daß ein Signal, das über eine Signalsubstanz gebildet wurde, die durch einen Signalsubstanzerzeuger erzeugt wurde, dessen Verteilung in der Matrix durch die spezifische Bindungsreaktion verändert wird, nur durch eine Detektionsvorrichtung nachgewiesen werden kann, ohne daß ein B/F (gebunden/frei) Trennungsschritt benötigt wird. In diesem Fall bedeutet die Bezeichnung "spezifische Bindungsreaktion" eine Reaktion einer zu untersuchenden Substanz mit einer spezifischen Bindungssubstanz (enthält einen Signalsubstanzerzeuger), die eine spezifische Affinität für die zu untersuchende Substanz aufweist, eine Reaktion einer spezifischen Bindungssubstanz, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz mit einem Signalsubstanzerzeuger bindet oder eine ähnliche Reaktion. Im einzelnen wurden das spezifische Bindungsassayverfahren und die Vorrichtung, die geeignet ist für die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung auf der Basis der folgenden Feststellungen ermöglicht: (1) Signale, die an einer Detektionsvorrichtung bemerkt werden, können in Abhängigkeit von der Entfernung zwischen einem Marker und der Detektionsvorrichtung (d.h. der Diffusionslänge einer Signalsubstanz) moduliert werden, im Falle der Verwendung einer Signalsubstanz, die durch den Marker eines Signalsubstanzerzeugers erzeugt wird und die direkt oder indirekt Signale erzeugt, die nur an der Detektionsvorrichtung nachweisbar sind; und (2) Die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers (Marker), im Verhältnis zu der Detektionsvorrichtung kann in Abhängigkeit von der Konzentration einer zu untersuchenden Substanz über mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit einer Substanz (spezifische Bindungssubstanz), die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, verändert werden.
Gemäß dem spezifischen Bindungsassayverfahren der vorliegenden Erfindung wird die Längenverteilung des Signalsubstanzerzeugers zur Detektionsvorrichtung in Abhängigkeit von der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe über die spezifische Bindungsreaktion verändert und die sich ergebenden Veränderungen in der Verteilung werden gemessen.
Im folgenden wird ein Verfahren für die Veränderung der Verteilung beschrieben, obwohl dies nur ein Beispiel unter verschiedenen möglichen Techniken ist.
In diesem Fall können vorzugsweise die folgenden Faktoren (A) bis (C) erfüllt sein, um die Messung der Verteilung zu bewirken.
(A) Die Verteilung, die abhängig ist von der Menge der zu untersuchenden Substanz, der Länge der Signalsubstanzerzeuger zu der Detektionsvorrichtung sollte sich in einem derartigen Größenmaß ändern, daß der Massetransfer eines Signalmaterials der Geschwindigkeits-bestimmende Schritt bei der Erzeugung eines Signals wird. Wie sich später in den Beispielen 3 und 4 bestätigen wird, liegen solche Größen in den Fällen eines Enzym- Substrats und eines Enzym-Substrat-Elektronenüberträger- Reaktionssystems in der Größenordnung von L (siehe Fig. 3) = ungefähr 0 bis 500 µm bzw. L = ungefähr 0 bis 1000 µm als lineare Distanz zwischen der Detektionsvorrichtung und dem Signalsubstanzerzeuger. Es soll aber festgehalten werden, daß die Größen, abhängig von den Materialien, aus denen eine Matrix besteht, wechseln können, und ebenso abhängig von den Eigenschaften einer Signalsubstanz oder eines Signalsubstanzerzeugers, den Materialien der Detektionsvorrichtung und den Eigenschaften eines Detektionsverfahrens.
(B) Damit Veränderungen in der Längenverteilung in Abhängigkeit von der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe gemessen werden können, sollten freie Enzymmoleküle in Bereichen des Signalsubstanzerzeugers soweit wie möglich verringert werden. Dann wird der Signalsubstanzerzeuger zu einer Konzentration hinzugefügt, die äquivalent der Sensitivität der Detektionsvorrichtung ist. Wie später in den Beispielen 1(1), 5(1) und 8(1) bestätigt werden wird, werden freie Enzymmoleküle entfernt, wenn ein Signalsubstanzerzeuger (Enzymmarkierte Antikörper) hergestellt wird.
(C) Ein Element, das essentiell ist für die Detektion eines Signales, das direkt oder indirekt von einer Signalsubstanz erzeugt wird, oder mindestens ein Teil des Gliedes, sollte im wesentlichen an die Detektionsvorrichtung immobilisiert sein. Wie später in den Beispielen 1, 5, 6 und 8 bestätigt werden wird, bestehen die geeigneten Elektroden oder Enzymelektroden, die in den Beispielen verwendet werden, aus den an der Elektronenvorrichtung immobilisierten Materialien.
Im folgenden wird ein Prinzip des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, basierend auf der Darstellung, dargestellt in Fig. 1, beschrieben. In diesem Fall ist die Vorrichtung, dargestellt in Fig. 1, derartig konstruiert, daß eine Testprobe, die in eine Vorrichtung zur Probeneinführung (a) eingeführt wird, in eine Matrix (b) geführt wird und dann zu einer Detektionsvorrichtung (c), wo der Flüssigkeitsfluß im wesentlichen gestoppt wird.
Fig. 1 zeigt die Position eines Signalsubstanzerzeugers 11 zu der Zeit, wenn er in die Matrix (b) geführt wird und seine spezifische Bindungsreaktion vollendet ist. In dieser Figur zeigt 12 eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist und die Pfeile bezeichnen die Flußrichtungen der Testprobe und ähnlichem.
Fig. 1-(1) zeigt einen Zustand, in dem der Signalsubstanzerzeuger 11 im oberen Teil der Matrix (b) festgehalten wird oder am oberen Teil der Matrix (b) aufgrund seiner geringen Reisegeschwindigkeit gestoppt wird und Fig. 1-(2) zeigt einen Zustand, in dem der Signalsubstanzerzeuger 11 einen tieferen Teil der Matrix (b) erreicht hat.
Wenn sich der Signalsubstanzerzeuger 11 im Zustand der Fig. 1- (1) befindet, erreicht zumindest ein Teil der Substanz 12, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, den Signalsubstanzerzeuger 11 durch Diffusion über die Distanz x&sub1;, und die Substanz 12, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, wird durch die Wirkung des Signalsubstanzerzeugers 11 zu einer Signalsubstanz 13. Daraufhin erreicht mindestens ein Teil der Signalsubstanz 13 die Detektionsvorrichtung (c) durch Diffusion über die Distanz y&sub1; und erzeugt ein Signal an der Detektionsvorrichtung (c).
Wenn sich der Signalsubstanzerzeuger 11 andererseits im Zustand der Fig. 1-(2) befindet, ist die Diffusionsentfernung x&sub2;, die notwendig ist, damit mindestens ein Teil der Substanz 12, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, den Signalsubstanzerzeuger 11 erreicht, kürzer als im Falle der Distanz x&sub1; und die Diffusionsentfernung y&sub2;, die notwendig ist, damit mindestens ein Teil der erzeugten Signalsubstanz 13 die Detektionsvorrichtung (c) erreicht, ist ebenfalls kürzer als im Falle der Entfernung y&sub1;. Daher ist im Vergleich mit dem früheren Fall, bei dem sich der Signalsubstanzerzeuger 11 im Zustand der Fig. 1-(1) befindet, die Wahrscheinlichkeit, daß die Signalsubstanz 13 die Detektionsvorrichtung (c) erreicht, sehr hoch und die Häufigkeit einer Signalerzeugung (Signalstärke) und/oder die Geschwindigkeit der Signalerzeugung sind ebenfalls hoch.
In dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Menge oder die Gegenwart einer zu untersuchenden Substanz gemessen unter Verwertung einer Differenz in der Häufigkeit der Signalerzeugung (Signalstärke) und/oder der Geschwindigkeit der Signalerzeugung zwischen einem Signal, das den Signalsubstanzerzeuger 11 betrifft, der sich im Zustand, wie dargestellt in Fig. 1-(1), befindet und einem anderen Signal, das den Signalsubstanzerzeuger 11 betrifft, der sich im Zustand der Fig. 1-(2) befindet.
Wenn die Signalsubstanz 13 kein Signal direkt erzeugt, muß eine Substanz 15, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist, einen Bereich in der Nähe der Detektionsvorrichtung (c) erreichen oder in dem Bereich, wie dargestellt in Fig. 8, anwesend sein obwohl das zugrundeliegende Prinzip dasselbe ist wie das im Falle der Fig. 1.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel der Beziehung zwischen der Signalstärke, wie gemessen durch das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und der vergangenen Zeit nach dem Beginn der Einführung des Signalsubstanzerzeugers 11 in die Matrix (b). Zum Beispiel ist die anfängliche Rate der Erzeugung eines Signals, das den Signalsubstanzerzeuger 11 betrifft, der sich im Zustand der Fig. 1-(1) befindet, geringer als im Falle eines Signals, das den Signalsubstanzerzeuger 11 betrifft, der sich im Zustand der Fig. 1-(2) befindet. Wie später beschrieben werden wird, wird die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 in der Matrix (b) durch die Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe reguliert. Das heißt, daß sich das Verhältnis des Signalsubstanzerzeugers 11 im Zustand der Fig. 1-(1) zu dem Signalsubstanzerzeuger 11 im Zustand der Fig. 1-(2) abhängig von der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe ändert. Signale, die an der Detektionsvorrichtung (c) nachgewiesen werden, werden als Gesamtsumme von Signalen gemessen, die den Signalsubstanzerzeuger 11 in den Fig. 1-(1), Fig. 1-(2) und ähnlichen Zuständen betreffen. Wie dargestellt in Fig. 2 wird die anfängliche Rate der Signale gering, wenn das Verhältnis des Signalsubstanzerzeugers 11 im Zustand der Fig. 1-(1) hoch ist und die anfängliche Rate von Signalen wird schneller, wenn das Verhältnis des Signalsubstanzerzeugers im Zustand der Fig. 1-(2) hoch ist. Demzufolge kann die Menge einer zu untersuchenden Substanz durch Messung der anfänglichen Rate von Signalen und durch Umwandlung der gemessenen Rate in Veränderungen in der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in einer Testprobe kalkuliert werden.
Wie dargestellt in Fig. 2 können Signale, basierend auf der Signalstärke bei einer optionalen Zeit t (s&sub1; oder s&sub2;) oder als Zeit t gemessen werden, bis die Signalstärke ein bestimmtes Niveau erreicht, wie angedeutet durch die schrägen Linien in Fig. 2, als ein integrierter Wert der Signalstärke bis zur Zeit t. Die Signalmessung kann auch durch eine Messung der Signalstärken zu zwei bestimmten Zeiten durchgeführt werden und einer Kalkulation der Differenz zwischen den beiden Signalstärken. Jedes andere Verfahren kann für die Messung von Signalen angewendet werden, vorausgesetzt, daß es die Modulation von Signalen messen kann, die durch Veränderungen in der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 in der Matrix (b) ausgelöst werden.
Im folgenden wird die mathematische Verarbeitung der obigen Beschreibung und die Schätzung der Signalmodulation beschrieben.
Fig. 3 ist ein konzeptioneller Graph zur Verwendung für die Erklärung eines Prinzips des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem ein Signalsubstanzerzeuger 11 in einer Position angeordnet ist, die von der Detektionsvorrichtung (c) durch eine Distanz L entfernt ist. In der Figur ist ein Signalsubstanzerzeuger 11, wie z.B. eine Enzym-markierte Substanz, an einer Position lokalisiert, die von einer Detektionsvorrichtung (c), wie z.B. einer Elektrode, durch eine Distanz L (µm) entfernt ist und eine Signalsubstanz 13 wird kontinuierlich bei einer Reaktionskonstante k (1/s) pseudo-erster-Ordnung erzeugt. Die so erzeugte Signalsubstanz 13 hat eine Diffusionskonstante D (cm²/s) und die gesamte Signalsubstanz 13, die die Oberfläche der Detektionsvorrichtung durch Diffusion erreicht, erzeugt ein Signal s, wie z.B. einen Stromstärkewert. Dies ist ein stark vereinfachtes Modell, da die Erzeugung der Signalsubstanz 13 vermutlich eine Reaktion pseudo-erster-Ordnung ist, da nicht beachtet wird, daß der gesamte Teil der Signalsubstanz 13, der die Oberfläche der Detektionsvorrichtung erreicht ein Signal s erzeugt, die Gegenwart von anderen Elementen, wie z.B. einer Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist und eine Substanz, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist und die Bedingung der Signalsubstanz nach der Signalerzeugung nicht in die Betrachtung miteinbezogen wird. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf dieses hypothetische Modell beschränkt ist, scheint es, daß dieses Modell sehr wohl die grundlegende Bedingung für die vorliegende Erfindung reflektiert, d.h. "Veränderungen in der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 in der Matrix wird gemessen als Grad der Modulation des Signals s an der Detektionsvorrichtung (c) über die Signalsubstanz 13, die durch den Signalsubstanzerzeuger 11 erzeugt wird und die ein Signal erzeugt, das nur an der Detektionsvorrichtung detektierbar ist (c)". Wie in Fig. 4 dargestellt, können theoretische Vorhersagelinien von Stromstärkesignalen, gemessen an der Detektionsvorrichtung (c), in Abhängigkeit von der Entfernung L, basierend auf der Annahme, wie dargestellt in Fig. 3, hergestellt werden, wenn die Signalsubstanz 13 eine Oxidations-Reduktionsreaktion auf der Oberfläche einer Detektionsvorrichtung (Elektrode) herbeiführt, wenn eine ausreichende Überspannung angewendet wird und eine elektrische Stromstärke I als Signal s gemessen wird und eine Modulation der Stromstärkesignale, wie dargestellt in Fig. 4, kann basierend auf der Entfernung L, vorhergesagt werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine Möglichkeit einer solchen Signalmodulation vorhergesagt, bestätigten die Möglichkeit durch Experimente, wie z.B. diejenigen, wie gezeigt in Beispielen 3 und 4, und stellten fest, daß die Anwendung einer solchen Signalmodulation auf ein spezifisches Bindungsassayverfahren eindeutig nützlich war. Auf diesem Wege wurde die erfindungsgemäße spezifische Bindungsassayvorrichtung entwikkelt.
In dem vorstehenden Beispiel wurde eine deutlich ausgerichtete Verteilung angenommen, bei der der Signalsubstanzerzeuger 11 an einer spezifischen Position lokalisiert war und eine Signalmodulation durch Veränderung der Entfernung zwischen der lokalisierten Position und einer Elektrode durchgeführt wurde. Da jedoch eine Massediffusion, wie die Diffusion der Signalsubstanz 13 und ähnliches im allgemeinen überlappt werden kann, kann die kontinuierlich gekrümmte Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 in dem immunochromatographischen Assay durch Unterteilung der Verteilung in mikrokubische Inhalte (microcubic contents) behandelt werden. Da ein Signal s, das von dem Signalsubstanzerzeuger 11 stammt, in jedem mikrokubischen Inhalt das vorstehende Verhalten zeigt, wurde das Signal s im Falle der kontinuierlich gekrümmten Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 die Gesamtsumme von jedem Signal s, das von dem Signalsubstanzerzeuger 11 in jedem der mikrokubischen Inhalte stammte, die die Verteilung bilden. Im Ergebnis kann die Gesamtsumme des Signals s durch Veränderung der kontinuierlich gekrümmten Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 durch eine spezifische Bindungsreaktion moduliert werden. Im Gegensatz kann eine ausgezeichnete spezifische Bindungsassayvorrichgung durch Anordnung der Detektionsvorrichtung (c) an einer spezifischen Position erzeugt werden, wo Veränderungen in einer solchen Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 als eine Signalmodulation mit hoher Sensitivität detektiert werden können. Darstellende Beispiele solcher Vorrichtungen werden später in den Beispielen 1, 5, 6 und 8 beschrieben, obwohl die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist, da viele andere Modifikationen im Hinblick auf die Art der Matrix (b) und die positionale Beziehung zwischen der Matrix (b) und der Detektionsvorrichtung (c) denkbar sind. Obwohl Signale durch elektrochemische Mittel in der obigen Beschreibung detektiert werden und auch in den Beispielen, kann jedes andere Signal s für das Assayverfahren und die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden, vorausgesetzt, daß die Signalsubstanz 13 das Signal s direkt oder indirekt an der Detektionsvorrichtung (c) erzeugen kann.
Weiterhin werden im folgenden die Veränderungen in der Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers in einer Matrix in Abhängigkeit von der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe beschrieben, in der Praxis des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei eine Antigen- Antikörperreaktion angewendet wird, unter Verwendung der hier beigefügten Zeichnungen.
Fig. 5 ist ein Aspekt des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, der die Verteilung einer zu untersuchenden Substanz 14 und eines Signalsubstanzerzeugers 11 in einer Matrix (b) zeigt, wenn die zu untersuchende Substanz 14 durch ein kompetitives Verfahren gemessen wird. In diesem Fall sind die zu untersuchenden Substanzen 14 Antigene und Antikörpermoleküle, die spezifisch für das Antigen sind, d.h. eine erste spezifische Bindungssubstanz, ist in der Matrix (b) immobilisiert. Auch sind die Signalsubstanzerzeuger 11 markierte Antigene, die mit der zu untersuchenden Substanz um die erste spezifische Bindungssubstanz kompetitieren und der Signalsubstanzerzeuger 11 wird in die Matrix (b) zusammen mit einer Testprobe eingeführt.
Fig. 5-(1) zeigt einen Fall, in dem die zu untersuchende Substanz 14 nicht in einer Testprobe enthalten ist. In diesem Fall reagiert der Signalsubstanzerzeuger 11 mit dem Antikörper, der an einem oberen Teil immobilisiert ist (stromabwärts gelegene Seite im Hinblick auf die Flußrichtung einer Testprobe) der Matrix (b) und wird an dem oberen Teil der Matrix (b) festgehalten. Da die Entfernung zwischen dem Signalsubstanzerzeuger 11 und der Detektionsvorrichtung (c) in diesem Fall sehr weit ist, sind die gemessenen Signale nach (bis zu) einer vorherbestimmten, abgelaufenen Zeit sehr klein oder gleich Null.
Fig. 5-(2) und Fig. 5-(3) zeigen einen Fall, bei dem die zu untersuchende Substanz 14 in einer Testprobe enthalten ist. Wie sich deutlich aus der Figur ergibt, ist die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 in 5-(3) größer als in 5-(2).
In diesem Fall reagieren der Signalsubstanzerzeuger 11 und die zu untersuchende Substanz 14 (Antigen) in kompetitiver Weise mit dem Antikörper, der in der Matrix (b) immobilisiert ist. Wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 ansteigt, steigt die Inhibitionshäufigkeit der Bindung des Signalsubstanzerzeugers 11 an dem immobilisierten Antikörper ebenfalls an. Im Ergebnis wird der Signalsubstanzerzeuger 11 in einem Bereich festgehalten, der sich vom oberen Teil bis zum mittleren Teil erstreckt (im Falle der Fig. 5-(2)) oder von dem oberen Teil bis zum unteren Teil (Fig. 5-(3)) der Matrix (b). Wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 groß ist wird ein Teil des Signalsubstanzerzeugers 11 nicht festgehalten, sondern erreicht die Detektionsvorrichtung (c).
Im Fall der Fig. 5-(2) ist die Entfernung zwischen dem Signalsubstanzerzeuger 11 und 4er Detektionsvorrichtung (c) eine mittlere bis lange Entfernung, während im Fall der Fig. 5-(3) sie eine kurze bis lange Entfernung ist. Dementsprechend sind die Signale, die nach (bis zu) einer vorbestimmten, abgelaufenen Zeit gemessen werden, mittelgroß im Fall von Fig. 5-(2) und groß im Fall von Fig. 5-(3).
In anderen Worten wird die Signalstärke groß im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz 14, wie dargestellt in Fig. 7-(1).
Fig. 6 zeigt einen anderen Aspekt des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, der die Verteilung einer zu untersuchenden Substanz 14 und eines Signalsubstanzerzeugers 11 in einer Matrix (b) zeigt, wenn die zu untersuchende Substanz 14 durch ein Sandwichverfahren gemessen wird. In diesem Fall sind die zu untersuchenden Substanzen 14 Antigene und Antikörpermoleküle, die spezifisch für das Epitop A des Antigens sind, d.h. eine erste spezifische Bindungssubstanz, ist in der Matrix (b) immobilisiert. Auch sind die Signalsubstanzerzeuger 11 markierte Antikörpermoleküle, die durch Bindung eines Markierungsmaterials an Antikörpermoleküle, die spezifisch für das Epitop B des Antigens sind, hergestellt werden oder eine zweite spezifische Bindungssubstanz, und der Signalsubstanzerzeuger 11 wird in die Matrix (b) zusammen mit einer Testprobe eingeführt.
Fig. 6-(1) zeigt einen Fall, bei dem die zu untersuchende Substanz 14 nicht in einer Testprobe enthalten ist. In diesem Fall, da die Antigene wie auch die zu untersuchende Substanz 14 nicht in der Matrix (b) festgehalten werden, wird der Signalsubstanzerzeuger 11 nicht in der Matrix (b) festgehalten, sondern erreicht einen unteren Teil (stromabwärts gelegene Seite im Hinblick auf die Flußrichtung einer Testprobe) der Matrix (b). Da die Entfernung zwischen dem Signalsubstanzerzeuger 11 und der Detektionsvorrichtung (c) in diesem Fall kurz ist, sind die Signale, die nach (bis zu) einer vorbestimmten, abgelaufenen Zeit gemessen werden, groß.
Die Fig. 6-(2) und 6-(3) zeigen einen Fall, bei dem eine zu untersuchende Substanz 14 in einer Testprobe enthalten ist. Wie sich deutlich aus der Figur ergibt, ist die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 in 6-(3) größer als in 6-(2).
In diesem Fall bindet ein Teil des Signalsubstanzerzeugers 11, der im Verhältnis steht zur Menge der zu untersuchenden Substanz 14 (Antigen), die in der Matrix (b) über den Antikörper festgehalten wird, an die zu untersuchende Substanz 14 und wird hauptsächlich im oberen Teil der Matrix (b) festgehalten. Ein überschüssiger Teil des Signalsubstanzerzeugers 11 wird jedoch nicht in der Matrix (b) festgehalten, sondern erreicht einen unteren Teil der Matrix (b).
Im Ergebnis wird der Signalsubstanzerzeuger 11 in einem Bereich festgehalten, der zwischen dem oberen Teil bis zum mittleren Teil oder vom oberen Teil bis zum unteren Teil der Matrix (b) im Fall der Fig. 6-(2) reicht, bei der die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 geringer ist als die Menge des Signalsubstanzerzeugers 11.
Auch wird der Signalsubstanzerzeuger 11 hautsächlich im oberen Teil der Matrix (b) im Fall der Fig. 6-(3) festgehalten, in dem die zu untersuchende Substanz 14 in einer geeigneten Menge gegen die Menge des Antikörpers vorliegt, der in der Matrix (b) immobilisiert ist und der Menge des Signalsubstanzerzeugers 11.
Wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 groß ist, wird die zu untersuchende Substanz 14 in der Matrix (b) festgehalten, in einem Bereich vom oberen Teil bis zum unteren Teil und im Ergebnis wird der Signalsubstanzerzeuger 11 ebenfalls in der Matrix (b) festgehalten, von ihrem oberen Bereich bis zu ihrem unteren Bereich. Demzufolge nähert sich die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers 11 dem Fall der Fig. 6-(2) an, der sich außerhalb des Meßbereichs befindet.
Im Fall der Fig. 6-(2) ist die Entfernung zwischen dem Signalsubstanzerzeuger 11 und der Detektionsvorrichtung (c) eine mittlere-bis-lange Entfernung oder eine kurze-bis-lange Entfernung, während sie im Fall der Fig. 6-(3) eine lange Entfernung ist. Im Ergebnis sind die Signale, die nach (bis zu) einer vorbestimmten, abgelaufenen Zeit gemessen werden, mittelgroß im Fall der Fig. 6-(2) und sehr klein oder Null in Fig. 6-(3).
In anderen Worten, wird, wie dargestellt in Fig. 7-(2), die Signalstärke klein im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz 14, aber sie steigt wieder an, wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz 14 den meßbaren Bereich übersteigt.
Auf diese Weise wurde die Beziehung zwischen der Menge der zu untersuchenden Substanz 14 und den Verteilungsbedingungen des Signalsubstanzerzeugers 11 in der Matrix (b) im Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Weiterhin werden Beispiele der immunologischen Reaktion (spezifischen Bindungsreaktion) in der Matrix (b) beschrieben, bei der ein Bestandteil des immunologischen Reaktionssystems die zu untersuchende Substanz ist, die am meisten geeignet ist für das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ein erstes Beispiel ist ein Fall, der bevorzugt wird, wenn die zu untersuchende Substanz eine Hapten-ähnliche, niedrigmolekulare Substanz ist. In einem solchen Fall wird eine Substanz (oder ein Analog davon), die mit der zu untersuchenden Substanz identisch ist in der Matrix (b) immobilisiert, eine Verbindung, die erhalten wird, indem ein Markierungsmittel (z.B. ein Enzym, das an der Erzeugungsreaktion einer Signalsubstanz teilnimmt) an einen Anti-Hapten-Antikörper als eine spezifische Bindungssubstanz gebunden wird, wird als der Signalsubstanzerzeuger verwendet und die zu untersuchende Substanz in einer Testprobe und die immobilisierte, zu untersuchende Substanz (oder ein Analog davon) läßt man eine kompetitive Bindung an den Antikörperbereich des Signalsubstanzerzeugers eingehen. Im Ergebnis zeigt die Beziehung zwischen der Menge der zu untersuchenden Substanz und der Signalstärke ein Muster gemäß Fig. 7-(1).
Ein zweites Beispiel ist ein Fall, der vorzuziehen ist, wenn die zu untersuchende Substanz eine hochmolekulare Substanz ist, die an eine Vielzahl von Antikörpern zur selben Zeit binden kann. In einem solchen Fall wird ein Antikörper, der spezifisch ist für das Epitop A als erste spezifische Bindungssubstanz der zu untersuchenden Substanz in der Matrix (b) immobilisiert, den so immobilisierten Antikörper läßt man mit der zu untersuchenden Substanz reagieren und dann läßt man die zu untersuchende Substanz mit einem Signalsubstanzerzeuger 11 reagieren, der eine Verbindung ist, die erhalten wird durch eine Bindung eines Markierungsmittels an einen Antikörper, der spezifisch ist für das Epitop B als zweite spezifische Bindungssubstanz der zu untersuchenden Substanz. Im Ergebnis zeigt die Beziehung zwischen der Menge der zu untersuchenden Substanz und der Signalstärke ein Muster gemäß Fig. 7-(2).
Ein drittes Beispiel ist ebenso ein Fall, der bevorzugt wird, wenn die zu untersuchende Substanz eine Hapten-ähnliche niedrigmolekulare Substanz ist. In einem solchen Fall wird ein Anti-Hapten-Antikörper als erste spezifische Bindungssubstanz in der Matrix (b) immobilisiert, eine Verbindung, die durch Bindung eines Markierungsmittels an eine Substanz (oder ein Analog davon) erhalten wird, die identisch mit der zu untersuchenden Substanz ist und mit der zu untersuchenden Substanz um die erste spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, wird als Signalsubstanzerzeuger verwendet und man läßt die zu untersuchende Substanz in einer Testprobe und den Signalsubstanzerzeuger einer kompetitiven Bindung an den immobilisierten Anti- Hapten-Antikörper untergehen. Im Ergebnis zeigt die Beziehung zwischen der Menge der zu untersuchenden Substanz und der Signalstärke ein Muster gemäß Fig. 7-(1).
Ein viertes Beispiel ist ein Fall, der vorzuziehen ist, wenn die zu untersuchende Substanz eine Hapten-ähnliche niedrigmolekulare Substanz ist. In einem solchen Fall wird eine Substanz (oder ein Analog davon), die mit der zu untersuchenden Substanz identisch ist und mit der zu untersuchenden Substanz um eine spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, in der Matrix (b) immobilisiert, in der ein Anti-Hapten-Antikörper im freien Zustand als spezifische Bindungssubstanz eingeschlossen ist und man unterzieht die zu untersuchende Substanz in einer Testprobe und die zu untersuchende, immobilisierte Substanz (oder ein Analog davon) einer kompetitiven Bindung an den freien Anti-Hapten-Antikörper, gefolgt von einer Bindungsreaktion eines Signalsubstanzerzeugers, der durch Bindung eines Markierungsmittels an einen Anti-Antihapten-Antikörper (zweiter Antikörper) erhalten wurde. Im Ergebnis zeigt die Beziehung zwischen der Menge der zu untersuchenden Substanz und der Signalstärke ein Muster gemäß Fig. 7-(1).
In der obigen Beschreibung wurden Antikörpermoleküle in der Matrix (b) immobilisiert und ein Signalsubstanzerzeuger, eine zu untersuchende Substanz und ähnliches ließ man an den immobilisierten Antikörper direkt oder indirekt binden. Es ist jedoch auch möglich, die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix (b) im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz zu verändern, ohne daß man den Signalsubstanzerzeuger, die zu untersuchende Substanz und ähnliches an die Matrix (b) erlaubt, d.h. ohne daß der Antikörper in der Matrix (b) immobilisiert wird. Ein solcher Fall ist ebenfalls vom Umfang des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Zum Beispiel in dem Fall, in dem die zu untersuchende Substanz ein Mikroorganismus (ein pathogener Pilz oder ähnliches) ist und der Signalsubstanzerzeuger eine markierte, spezifische Bindungssubstanz ist, die erhalten wurde durch Bindung eines Markierungsmittels an einen Anti-Mikroorganismus-Antikörper (anti-pathogener Pilz-Antikörper oder ähnliches), ist die Flußgeschwindigkeit oder der Ankunftspunkt eines Komplexes der zu untersuchenden Substanz und des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix (b) deutlich unterschiedlich von dem des Signalsubstanzerzeugers im freien Zustand, da die Größe der zu untersuchenden Substanz (Mikroorganismus) im Vergleich mit dem Signalsubstanzerzeuger eindeutig groß ist. Ein solcher Unterschied im Ankunftspunkt wird deutlicher, wenn ein poröses Material als Matrix (b) verwendet wird und seine Mesh (Poren) Größe richtig gewählt ist oder, wenn ein Gel- oder Solträger als Matrix (b) verwendet wird und seine Viskosität richtig im Verhältnis zu der Größe des Mikroorganismus gewählt ist. Demzufolge wird die zu untersuchende Substanz nicht an die Matrix (b) binden, aber ihre Verteilung in der Matrix (b) ist lokalisiert und der Signalsubstanzerzeuger, der einer spezifischen Bindungsreaktion mit der zu untersuchenden Substanz unterzogen werden kann, ist in der Matrix (b) im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz in der Matrix (b) verteilt. Im Ergebnis kann die zu untersuchende Substanz quantitativ durch Messung von Signalen bestimmt werden, die im Verhältnis zu dem Signalsubstanzerzeuger im freien Zustand stehen, der eine Position nahe an der Detektionsvorrichtung (c) erreicht hat.
Als anderes Beispiel, kann die Messung bewirkt werden unter Verwendung der Bildung (Gelimmunopräzipitationsreaktion) eines spontanen Präzipitationskomplexes (Immunopräzipitat) eines markierten Antikörpers und einer zu untersuchenden Substanz, die sich beide im freien Zustand befinden. In einem solchen Fall ändert sich die Menge des gebildeten Immunopräzipitats im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz und das gebildete Immunopräzipitat wird in einem oberen Bereich der Matrix (b) festgehalten, die ein poröses Material und/oder einen Gelträger enthält, während der markierte Antikörper im freien Zustand, der nicht an der Immunopräzipitationsreaktion teilgenommen hat, in die Matrix (b) wandern kann. Im Ergebnis ändert sich die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe.
Alternativ, wenn ein Material mit einer geeigneten Größe von Löchern als Matrix (b) verwendet wird, kann eine zu untersuchende Substanz (Mikroorganismus) im oberen Bereich der Matrix (b) festgehalten werden, wodurch eine Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers in der Matrix (b) im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz erzeugt wird, in einer Weise, wie dargestellt in Fig. 6.
Weiterhin wird die Erzeugung von Signalen in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Im folgenden wird ein typisches Beispiel beschrieben, bei dem eine Enzym-markierte spezifische Bindungssubstanz als Signalsubstanzerzeuger verwendet wird, basierend auf den Fig. 1 und 8 und Tabelle 1. Tabelle 1 Reaktionstypen der Signalerzeugung Teil 1
*¹ Substanz, beteiligt an einer Signalsubstanzerzeugung; *² 4-Imino-2,5-cyclohexadien-1-on Tabelle 1 Reaktionstypen der Signalerzeugung Teil 2
*¹ Substanz, beteiligt an einer Signalsubstanzerzeugung
Tabelle 1 zeigt fünf typische Beispiele der Signalerzeugung im Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. In jeder Spalte der Tabelle zeigt die obere Reihe ein Beispiel der Signalerzeugungsschritte unter Verwendung der Terminologie dieser Erfindung und die untere Reihe erklärt die Schritte unter Verwendung von beispielhaften Bezeichnungen.
Der Typ 1 ist ein Beispiel, bei dem eine Elektrode als Detektionsvorrichtung (c) verwendet und eine Elektronenübertragung als Signal verwendet wird. Im folgenden wird dieser Typ von Signalerzeugung basierend auf Fig. 1 erklärt.
In diesem Fall wird die Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz 12 beteiligt ist, wenn eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz (p-Aminophenyl-α-D- galactosid) 12 einen Signalsubstanzerzeuger (α-Galactosidasemarkierte spezifische Bindungssubstanz) 11 in einer Matrix (b) erreicht, in eine Signalsubstanz (p-Aminophenol) 13 umgewandelt. Wenn die Signalsubstanz 13 eine Detektionsvorrichtung (Elektrode) (c) durch Diffusion erreicht, wird die Signalsubstanz 13 in p-Benzochinon-Monoimin durch Oxidation umgewandelt und gleichzeitig erzeugt sie eine Oxidationsstromstärke (Elektronentransfer) als Signal. Danach werden Werte, bezogen auf das Elektronenübertragungssignal, als Quantität von Elektrizitäts- oder Stromstärkewerten gemessen.
Der Typ 2 ist ein Beispiel, bei dem eine Elektrode als Detektionsvorrichtung (c) verwendet wird, Elektronenübertragung als Signal verwendet und ein Elektronenüberträger für die Übertragung des Elektrons verwendet wird. Im folgenden wird dieser Typ von Signalerzeugung basierend auf Fig. 1 beschrieben.
In diesem Fall, wenn eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist (eine Kombination von Glucose und Ferricinium-Ion als Elektronenüberträger) 12 einen Signalsubstanzerzeuger (Glucoseoxidase-markierte spezifische Bindungssubstanz) 11 in einer Matrix (b) erreicht, wird das Ferricinium-Ion in eine Signalsubstanz (Ferrocen) 13 umgewandelt. Wenn die Signalsubstanz 13 eine Detektionsvorrichtung (Elektrode) (c) durch Diffusion erreicht, wird die Signalsubstanz 13 oxidiert (in den oxidierten Zustand des Ferricinium-Ions rückumgewandelt) und zur gleichen Zeit erzeugt sie eine Oxidationsstromstärke (Elektronentransfer) als Signal. Danach werden die Werte, die das Elektronenübertragungssignal betreffen, als Quantität von Elektrizität- oder Stromstärkewerten gemessen. In diesem Fall kann eine Diffusionsübertragung des Elektrons selbst zwischen Elektronenüberträgern durch Elektronen-Hopping oder ähnliches und die Messung des resultierenden Signals (Elektronenübertragung), das an der Detektionsvorrichtung (c) erzeugt wird, auch anwendbar sein.
Typ 3 ist ein Beispiel, bei dem eine Enzymelektrode als Detektionsvorrichtung (c) verwendet wird und eine Elektronenübertragung als Signal verwendet wird. In diesem Fall ist es möglich, einen Elektronenüberträger und/oder eine elektrisch leitende, hochmolekulare Verbindung (Polypyrrol, Polythiophen oder ähnliches) als Bestandteilselemente in dem Enzymelektrodenteil zu verwenden, um die Leistung der Enzymelektrode zu verbessern. Die Reaktion einer Signalsubstanz mit einer Detektionsvorrichtung (Enzymelektrode) und die resultierende direkte oder indirekte Erzeugung eines Signals (Elektronentransfer) werden durch diese Bestandteilselemente nicht nachteilig beeinflußt. Bevorzugte Beispiele der Signalsubstanz umfassen ein Substrat, einen Cofaktor, ein Coenzym und ähnliches, die mit der Enzymelektrode korrespondieren. Wenn die Signalsubstanz ein Signal zusammen mit einer anderen Substanz erzeugt, d.h., wenn die Enzymelektrode ein Signal in Gegenwart der Signalsubstanz erzeugt und einer Substanz, die an der Signalerzeugung teilnimmt, kann die an der Signalsubstanzerzeugung beteiligte Substanz auf der Detektionsvorrichtung (c) und/oder in einem Bereich, nahe der Detektionsvorrichtung (c) lokalisiert sein. Im folgenden wird diese Art von Signalerzeugung, basierend auf Fig. 8, beschrieben.
In diesem Fall, wenn eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist (eine Kombination von Glucose und gelöstem Sauerstoff) 12 einen Signalsubstanzerzeuger (Glucoseoxidase-markierte spezifische Bindungssubstanz) 11 in einer Matrix (b) erreicht, wird eine Signalsubstanz (Wasserstoffperoxid) 13 gebildet. Wenn die Signalsubstanz 13 eine Detektionsvorrichtung (Peroxidaseelektrode) (c) erreicht, erhält die Signalsubstanz 13 ein Elektron von der Elektrode, übertragen oder nicht übertragen durch einen Elektronenüberträger und reagiert mit einer Substanz, die an der Erzeugung eines Signals (Wasserstoffion) 15 beteiligt ist. Auf diese Weise wird die Signalsubstanz 13 reduziert und gleichzeitig wird ein Signal (Elektronenübertragung) an der Detektionsvorrichtung (Peroxidaseelektrode) (c) erzeugt.
Der Typ 4 ist ein Beispiel, bei dem die Detektionsvorrichtung (c) ein Teil ist, an dem ein Enzym (Peroxidase) im wesentlichen immobilisiert ist und Lumineszenz als Signal verwendet wird. In diesem Fall erzeugt eine Signalsubstanz 13 nicht selbst das Signal. Im folgenden wird diese Art der Signalerzeugung, basierend auf Fig. 8, beschrieben.
In diesem Fall, wenn eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz (einer Kombination von Glucose und gelöstem Sauerstoff) 12 beteiligt ist, einen Signalsubstanzerzeuger (Glucoseoxidase-markierte spezifische Bindungssubstanz) 11 in einer Matrix (b) erreicht, wird-eine Signalsubstanz (Wasserstoffperoxid) 13 gebildet. Wenn die Signalsubstanz 13 eine Detektionsvorrichtung (Peroxidase-immobilisierter Teil) (c) erreicht, zusammen mit einer Substanz, die an der Erzeugung eines Signals (Luminol) 15 beteiligt ist, wird die Substanz, die an der Erzeugung eines Signals 15 beteiligt ist, verändert und gleichzeitig wird ein Signal (Lumineszenz) erzeugt. Danach wird die Lumineszenzstärke nach oder bis zu einer vorbestimmten, abgelaufenen Zeit gemessen.
Der Typ 5 ist ein Beispiel, bei dem die Detektionsvorrichtung (c) ein Teil ist, bei dem ein Enzym (Peroxidase) im wesentlichen immobilisiert ist und eine Färbung als Signal verwendet wird. In diesem Fall erzeugt eine Signalsubstanz 13 nicht selbst das Signal. Im folgenden wird dieser Typ von Signalerzeugung, basierend auf Fig. 8, beschrieben.
In diesem Fall, wenn eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist (eine Kombination von Urat und gelöstem Sauerstoff) 12 einen Signalsubstanzerzeuger (Uricasemarkierte spezifische Bindungssubstanz) 11 in einer Matrix (b) erreicht, wird eine Signalsubstanz (Wasserstoffperoxid) 13 gebildet. Wenn die Signalsubstanz 13 eine Detektionsvorrichtung (Peroxidase-immobilisierter Teil) (c) zusammen mit einer Substanz, die an der Erzeugung eines Signals (Orthodianisidin) 15 beteiligt ist, wird die Substanz, die an der Erzeugung eines Signals 15 beteiligt ist, erreicht, in einen gefärbten Körper verändert und gleichzeitig ein Signal (Färbung) erzeugt. Danach wird die Färbung nach oder bis zu einem vorbestimmten Zeitablauf gemessen, indem eine Absorption oder reflektiertes Licht der Farbe nachgewiesen wird oder die Farbe visuell überwacht wird.
Bei den obengenannten Typen 4 und 5 können entweder die an der Signalerzeugung beteiligte Substanz (Enzymreaktionssubstrat) und die immobilisierte Substanz (Enzym), die die Detektionsvorrichtung (c) bildet, als Substanz verwendet werden, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist. In diesem Fall wird die restliche Substanz als immobilisierte Substanz verwendet, die die Detektionsvorrichtung (c) bildet. In anderen Worten, sind Substrat und Enzym gegenseitig austauschbar. Als Veränderung kann die Detektionsvorrichtung (c) so konstruiert sein, daß sowohl das Substrat als auch das Enzym immobilisiert sind. In jedem Fall kann eine ausgezeichnete Reaktionseffizienz erzielt werden, wenn zumindest das Enzym immobilisiert ist.
Es ist bei den obigen Typen 1 bis 5 auch möglich, die Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist (die mit einem Enzymreaktionssubstrat korrenspondiert, aber nicht mit dem gelösten Sauerstoff) und die markierte Substanz (Enzym) auszutauschen, die den Signalsubstanzerzeuger bildet. In diesem Fall ist es jedoch vorzuziehen, das Enzym als markierte Substanz in Hinsicht auf eine ausgezeichnete Reaktionseffizienz zu verwenden.
Die folgende Tabelle 2 zeigt ein Beispiel von einer Kombination eines Enzyms (einen Marker, ein Bestandteilselement des Signalsubstanzerzeugers in Tabelle 1), das geeignet ist zur Verwendung bei der Erzeugung einer Signalsubstanz, mit seinem Substrat (eine Substanz, die an der Erzeugung der Signalsubstanz in Tabelle 1 beteiligt ist). Tabelle 2
Jede der Kombinationen, die in Tabelle 2 dargestellt sind, kann auf die Signalerzeugungstypen 1, 3, 4 und 5, wie oben beschrieben, angewendet werden. Es ist jedoch vorzuziehen, im Falle des Typs 1, bei dem ein Signal durch eine Oxidations- Reduktionsreaktion einer Signalsubstanz an einer Elektrode erzeugt wird, eine solche Kombination zu verwenden, daß p- Aminophenol, Hydrochinon, p-Cresol oder ähnliches als Signalsubstanz erzeugt wird. Eine Elektronenübertragung von einer solchen Signalsubstanz auf eine Elektrode tritt auf, wenn ein elektrisches Potential von + mehreren Hundert mV angelegt wird, basierend auf einer Ag/AgCl-Elektrode.
Im Fall der Signalerzeugung des Typs 2 wird eine Oxidations- Reduktionssubstanz (Oxidationszustand), bekannt als Elektronenüberträger, anstelle von O&sub2; verwendet. Durch die Verwendung einer solchen Substanz, wird die Reaktion, wie dargestellt in Tabelle 1, bewirkt, bei der eine Signalsubstanz (ein Elektronenüberträger im reduzierten Zustand) erzeugt wird, Elektronen von der Signalsubstanz an eine Elektrode freigesetzt werden, die mit einem elektrischen Potential geladen ist, das mit dem Elektronenüberträger in derselben Weise korrespondiert wie im Fall des Typs 1 und der Elektronenüberträger selbst kehrt in seinen oxidierten Zustand zurück.
Eine Anzahl von Substanzen sind bekannt als Elektronenüberträger, die z.B. Metallionen, Ruthenium-Komplexverbindungen, Ferrocenverbindungen, Chinonverbindungen, Viologenverbindungen, Porphyrinderivate und Proteine, wie z.B. Cytochrom c, umfassen. Ebenfalls umfaßt sind Verbindungen, die an Enzymreaktionen als Wasserstoffdonoren teilnehmen. Typische Beispiele für Elektronenübertrager sind in Tabelle 3 dargestellt, obwohl chemisch modifizierte Produkte dieser Beispiele oder andere geeignete Elektronenüberträger ebenfalls verwendet werden können. Zusätzlich sind die Elektronenüberträger nicht auf diejenigen begrenzt, die vom oxidierten Zustand in den reduzierten Zustand wechseln, sondern umfassen auch diejenigen, die eine Funktion des Wechsels vom reduzierten Zustand zum oxidierten Zustand aufweisen. Tabelle 3 Typische Elektronenüberträger
Merke: bpy, Bipyridyl; phen, o-Phenanthrolin; im, imidazol
Im folgenden werden Substanzen beschrieben, die an der zweiten Reaktionsstufe der zweistufigen Enzymreaktionen bei der Signalerzeugung der Arten 3 bis 5, wie dargestellt in Tabelle 1, teilnehmen, wobei eine Signalsubstanz durch eine Enzymreaktion erster Stufe gebildet wird und mit einer anderen Substanz reagiert, um ein Signal zu erzeugen.
Der Typ 3 gemäß Tabelle 1 zeigt ein Beispiel, bei dem eine Enzymelektrode als Detektionsvorrichtung (c) verwendet wird. In diesem Fall sind die Arten von Enzymen, die in der Enzymelektrode verwendbar sind, begrenzt, abhängig von den Arten der Signalsubstanz, die durch die Reaktion der ersten Stufe gebildet werden.
Zum Beispiel kann, wenn die Signalsubstanz, die durch die Reaktion der ersten Stufe gebildet wird, Wasserstoffperoxid ist, eine Enzymelektrode verwendet werden, an die eine Peroxidase, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase oder ähnliches immobilisiert wurde, als Detektionsvorrichtung (c) verwendet werden. Enzymelektroden dieser Art sind z.B. durch J.E. Frew et al. (J. Electroanal. Chem., Band 201, S. 1-10, 1986), von R.M. Paddock und E.F. Bowden (J. Electoanal. Chem., Band 260, S. 487-494, 1989) und von Ulla Wollenberger et al. (Analytical Letters, Band 23, S. 1795-1808, 1990) offenbart worden. Wenn die Signalsubstanz NAD&spplus; oder NADH ist, kann eine Enzymelektrode, an die Diaphorase I eines thermophilen Bakteriums immobilisiert wurde (siehe K. Miki et al., Analytical Sciences, Band 5, S. 269-274, 1989) als Detektionsvorrichtung (c) verwendet werden.
Wenn diese Enzymelektroden als Detektionsvorrichtung (c) verwendet werden, wird ein in einigen Fällen ein Elektronenüberträger als Substanz verwendet, die an der Erzeugung eines Signals, wie dargestellt in Tabelle 1, beteiligt ist. Beispiele für den Elektronenüberträger sind schon in Tabelle 3 dargestellt.
Chemisch modifizierte Elektroden sind als analoge Mittel für die Enzymelektrode bekannt, die z.B. durch R.W. Murray (Chemically Modified Electrode, Electroanalytical Chemistry, Band 13, S. 191-368, Marcel Dekker, Inc., New York, 1084), von K. Nakamura, M. Aizawa und O. Miyawaki (Electroenzymology Coenzyme Regeneration, Springer-Verlag, Berlin, 1988) und von V.J. Razumas, J.J. Jasaitis und J.J. Kulys, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Band 12, S. 297-322, 1984) offenbart wurden.
Wenn das Signal eine Fluoreszenz oder Lumineszenz ist, wie im Fall des Typ 4-Signalerzeugungssystems, wie dargestellt in Tabelle 1, sind die Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion teilnehmen (ein Enzym und eine fluoreszierende oder lumineszierende Substanz als Substrat des Enzyms) abhängig von den Arten Signalsubstanz, die im ersten Schritt der Reaktion gebildet wurde, begrenzt.
Zum Beispiel, wenn das Signal eine Fluoreszenz und die Signalsubstanz Wasserstoffperoxid ist, kann eine typische Kombination der Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion beteiligt sind, Peroxidase mit 4-Hydroxyphenylacetat oder 3-(4- Hydroxyphenyl)propionat sein.
Wenn das Signal eine Lumineszenz und die Signalsubstanz ATP ist, kann eine typische Kombination der Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion beteiligt sind, Leuchtkäfer- Luciferase mit Luciferin und Mg²&spplus; sein.
Wenn die Signalsubstanz NADH ist, kann die Kombination der Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion beteiligt sind, NAD(P)H:FMN Oxidoreduktase und eine Luciferase mit Ursprung aus einem Leuchtbakterium mit FMN und einem gesättigten, langkettigen, aliphatischen Aldehyd, wie z.B. Tetradecanal, sein.
In diesen Beispielen kann die Detektionsvorrichtung (c) so konstruiert sein, daß mindestens eine der Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion teilnehmen, immobilisiert sind, aber vorzugsweise ein Enzym im Hinblick auf die Reaktionseffizienz.
Wenn eine Fluoreszenz oder Lumineszenz als Signal verwendet wird, ist es möglich, das Signal durch eine Signalsubstanz selbst zu erzeugen, wie im Fall des Typ 1-Signalerzeugungssystems, dargestellt in Tabelle 1.
Zum Beispiel wird Luciferin als Signalsubstanz gebildet, wenn ein Luciferinderivat, wie z.B. D-Luciferin-o-Phosphat als die Substanz verwendet wird, die an der Signalsubstanzerzeugung beteiligt ist und alkalische Phosphatase als Markierungsmittel verwendet wird, das den Signalsubstanzerzeuger bildet und die Lumineszenz (Signal) wird erzeugt, wenn die Signalsubstanz (Luciferin) mit Luciferase in Gegenwart von ATP und Mg²&spplus; behandelt wird. In diesem Fall kann die Detektionsvorrichtung (c) durch Immobilisierung von mindestens einem von ATP, Mg²+ und Luciferase konstruiert werden, aber vorzugsweise Luciferase im Hinblick auf eine gute Reaktionseffizienz.
Wenn das Signal eine Färbung ist, wie im Fall des Typ 5- Signal-Erzeugungssystems, wie dargestellt in Tabelle 1, sind die Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion teilnehmen (ein Enzym und ein Vorläufer eines Farbkörpers als Substrat des Enzyms) ebenfalls, abhängig von den Typen der Signalsubstanz, begrenzt, die durch die erste Stufe der Reaktion gebildet werden.
Zum Beispiel kann, wenn die Signalsubstanz Wasserstoffperoxid ist, eine typische Kombination der Substanzen, die an der zweiten Stufe der Reaktion beteiligt sein, Peroxidase mit einem Vorläufer einer Farbsubstanz, wie z.B. eine Mischung von 5-Aminosalicylsäure, o-Dianisidin, 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)diammoniumsalz (ABTS), 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon (MBTH) und 3-(Dimethylamino)benzoesäure (DMAD) oder o-Tolidin, 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 1,2-Phenylendiamin, 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidin oder ähnliches sein.
Wenn die Signalsubstanz NADH ist, kann die Kombination der Substanzen, die an dem zweiten Schritt der Reaktion beteiligt sind, eine Diaphorase sein mit einem Farbsubstanzvorläufer, wie z.B. Iod-Nitrotetrazolium-Violett.
Bei diesen Beispielen kann die Detektionsvorrichtung (c) durch Immobilisierung von mindestens einer der Substanzen konstruiert sein, die an der zweiten Stufe der Reaktion teilnehmen, aber vorzugsweise von einem Enzym, im Hinblick auf die Effizienz der Reaktion.
So wurden darstellende Beispiele des Mechanismusses der Signalerzeugung in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben, diese ist aber nicht insbesondere auf diese Beispiele begrenzt.
In dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden Signale in der vorstehenden Weise erzeugt und dann durch geeignete Mittel gemessen. Zum Beispiel kann die Messung durch die Verwendung von elektrischen Meßinstrumenten, wie z.B. einem Potentiostaten, einem Coulombmeter, einem Amperemeter und ähnlichem gemessen werden, wenn das Signal ein Elektronentransfer ist, einem Fluöreszenzmesser, wenn das Signal Fluoreszenz ist, einem Lumineszenzmesser, wenn das Signal Lumineszenz ist, wobei die Messungsmöglichkeiten jedoch nicht insbesondere auf diese beschränkt sind. Wenn das Signal eine Färbung ist, kann diese durch visuelle Beobachtung gemessen werden oder durch Verwendung eines Farbunterschiedsmessers, eines Absorptiometers, eines Reflektometers oder ähnlichem.
Obwohl eine Endpunktmessung anwendbar ist, ist es vorzuziehen, die Modulation der Signalstärke über eine bestimmte Zeitspanne zu messen, da die Signale normalerweise kontinuierlich auftreten. Die Konzentration einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe wird kalkuliert, indem ein Grad der gemessenen Modulation für eine unbekannte Konzentration der zu untersuchenden Substanz mit einem Modulationsgrad, der mit einer bekannten Konzentration der zu untersuchenden Substanz korrespondiert, verglichen wird. In diesem Fall ist es möglich, Modulationsgrade für bekannte Konzentrationen der zu untersuchenden Substanz in einen Rechner im voraus einzugeben um die Messung zu vereinfachen.
Im folgenden wird die spezifische Bindungsassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die für die Praxis des vorstehenden erfindungsgemäßen Assayverfahrens verwendbar ist, beschrieben.
Die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zur Probeneinführung (a), eine Matrix (b) und eine Detektionsvorrichtung (c) oder eine Probeneinführungsvorrichtung (a), eine Matrix (b), eine Detektionsvorrichtung (c) und eine Absorptionsvorrichtung (d). Wenn nötig ist die vorstehende Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, an einem geeigneten Testproben-Flußteil der Assayvorrichtung lokalisiert.
Im folgenden wird die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Seitenansichten von Beispielen der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung sind in den Fig. 9(1) bis (5) und (7), (8) und eine Aufsicht auf ein Beispiel in Fig. 9(6) dargestellt.
Wie dargestellt in der Figur kann die Probeneinführungsvorrichtung (a) als unabhängige Vorrichtung angeordnet sein [siehe Fig. 9(1), (2), (4), (5), (7) und (8)] oder ein Bereich der Matrix (b) kann als Probeneinführungsvorrichtung (a) verwendet werden [siehe Fig. 9(3) und (6)].
Die Matrix (b) ist eine Stelle, die stromabwärts von der Probeneinführungsvorrichtung (a) angeordnet ist, wo eine spezifische Bindungsreaktion durchgeführt wird. Wenn die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung außerdem die Absorptionsvorrichtung (d) enthält [siehe Fig. 9(2), (4) und (8)], kann die Absorptionsvorrichtung (d) von der Matrix (b) [siehe Fig. 9(2) und (8)] getrennt sein oder ein stromabwärts gelegener Bereich der Matrix (b) kann als Absorptionsvorrichtung (d) [siehe Fig. 9(4)] verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Absorptionsvorrichtung (d) nicht als Feld der spezifischen Bindungsreaktion dient.
Die Detektionsvorrichtung (c) kann an einer Position angeordnet sein, wo die Wirkung der Signalmodulation, die von den Verteilungsänderungen eines Signalsubstanzerzeugers in der Matrix (b) herrührt, hoch ist. Im allgemeinen kann die Detektionsvorrichtung (c) an der am meisten stromabwärts gelegenen Seite der Matrix (b) [siehe Fig. 9(1), (2), (3), (4), (6) und (7)] oder an der am meisten stromaufwärts gelegenen Seite [siehe Fig. 9(8)] angeordnet sein.
Die Detektionsvorrichtung (c) kann als unabhängiger Bereich angeordnet oder ein Teil der Matrix (b) sein oder die Absorptionsvorrichtung (d) kähn so verarbeitet sein, daß sie als Detektionsvorrichtung (c) verwendbar ist. Eine solche Verarbeitung kann auf jedes der Beispiele, wie dargestellt in Fig. 9(1), (2), (3), (6) und (7), angewendet werden.
Die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem einen Träger enthalten (oder eine Basis) (e) und eine Abdeckung (f) [siehe Fig. 9(7) und (8)].
Im folgenden wird jeder Teil der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Wenn die Probeneinführungsvorrichtung (a) eine unabhängige Vorrichtung ist, kann sie aus einem porösen Filter gebildet werden, wie z.B. Cellulose-Filterpapier, einem Glasfaser- Filterpapier, einem nicht gewebten Stoff oder ähnlichem, der eine geeignete Größe aufweist, die mit der Menge der Testprobe korrespondiert. Eine unabhängige Verwendung der Probeneinführungsvorrichtung (a) ist vorzuziehen, da die Hinzufügung einer Testprobe dann einfach durchführbar ist, die Testprobe in die Matrix (b) gleichmäßig permeiert und interferierende Elemente in der Testprobe, wie z.B. hochmolekulare Aggregate, Teilchen und ähnliches bis zu einem bestimmten Grad entfernt werden können.
Die Matrix (b) kann z.B. aus einem porösen Träger oder einem Gelträger bestehen. Im Falle eines Gelträgers ist es vorzuziehen, ein Material zu verwenden, das in den Zustand eines Gels oder Sols übergeht, wenn es mit einer Testprobe in Berührung kommt. Alternativ kann ein poröser Träger mit einer wasserlöslichen, hochmolekularen Verbindung imprägniert und dann zur Verwendung als Matrix (b) getrocknet werden.Ein Material, in dem eine feste Substanz in dem porösen Träger und ähnlichem enthalten ist, kann auch als Matrix (b) verwendet werden.
Darstellende Beispiele der porösen Träger umfassen: poröse Membranen, bestehend aus Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Nylon und ähnlichem; Filterpapiere, bestehend aus Glasfasern, Cellulosefasern und ähnlichem; und poröse Keramiken und ähnliches. Darstellende Beispiele der Gelträger umfassen Agar, Agarose, Dextran, Polyacrylamid und ähnliches. Darstellende Beispiele der wasserlöslichen, hochmolekularen Verbindungen umfassen Stärke und Derivate davon, Mannan, Galactan, Agar, Agarose, Natriumalginat, Gummiarabicum, Dextran, Gelatine, Casein, Collagen, Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC), Hydroxyethylcellulose (HEC), Carboxymethylcellulose (CMC), Polyvinylalkohol (poval), Natriumpolyacrylat und ähnliches. Darstellende Beispiele der Festsubstanz, wie oben beschrieben, umfassen poröse Partikel, wie z.B. Dextran und ähnliches, Latexe, bestehend aus Polystyrol und ähnlichem und feine Partikel, wie z.B. Glas und ähnliches oder modifizierte Produkte davon, die durch die Hinzufügung von aktiven Gruppen zur Bindungsverwendung erzeugt werden.
Da die Matrix (b) eine Stelle ist, an der eine spezifische Bindungsreaktion, wie oben beschrieben, durchgeführt wird, übt die Zusammensetzung dieses Teils einen großen Einfluß auf die Detektionsergebnisse aus. Demzufolge ist es wünschenswert, die Matrix (b) in einer derartigen Weise zu bilden, daß sie geeignete Eigenschaften zeigt, abhängig von der Art der zu untersuchenden Substanzen, des Typs der spezifischen Bindungsreaktionen (z.B. Inhibitionstyp, kompetitiver Typ und Sandwichtyp) und ähnlichen Bedingungen. Das heißt, die Verteilungsbedingungen eines Signalsubstanzerzeugers und die Diffusionsgeschwindigkeiten einer Signalsubstanz und ähnliches werden gegebenenfalls kontrolliert, indem ein geeignetes Material für die Matrix (b) ausgewählt wird und indem ihre Größe (Dicke), Porengröße und Viskosität angepaßt werden, wenn ein Gelmaterial oder ähnliches angewendet wird.
Eigenschaften der Matrix (b) können einfach kontrolliert werden, wenn sie aus einem laminierten Körper gebildet wird. Zum Beispiel kann die unterschiedene Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers nach einer spezifischen Bindungsreaktion abhängig von der Menge einer zu untersuchenden Substanz deutlicher detektiert werden, wenn ein Material mit einer kleinen Porengröße an der stromabwärts gelegenen Seite (Detektionsvorrichtungs(c)-Seite) der Matrix (b) verwendet wird und ein anderes Material mit einer großen Porengröße an der stromaufwärts gelegenen Seite (Probeneinführungsvorrichtungs-(a)Seite) verwendet wird. Eine solche Wirkung kann durch die Verwendung von einem Polyacrylamid-Gradientengel oder laminierten, porösen Membranen realisiert werden, die unterschiedliche Porengrößen aufweisen.
Wenn eine spezifische Bindungssubstanz für eine zu untersuchende Substanz in der Matrix (b) eingeschlossen oder immobilisiert ist, kann sie gleichmäßig im gesamten Bereich der Matrix eingeschlossen oder immobilisiert sein oder einen Konzentrationsgradienten in der Matrix bilden, z.B. indem die spezifische Bindungssubstanz in einer großen Menge im stromaufwärts gelegenen Bereich (Seite der Probeneinführungsvorrichtung (a)) der Matrix vorliegt und in einer kleinen Menge im stromabwärts gelegenen Bereich (Seite der Detektionsvorrichtung (c)).
Die Immobilisierung einer spezifischen Bindungssubstanz für eine zu untersuchende Substanz in der Matrix (b) kann erreicht werden, indem sie auf einen porösen Träger oder einen Gelträger über kovalente Bindung oder Absorption immobilisiert wird. Zusätzlich kann die Immobilisierung einer spezifischen Bindungssubstanz, wenn die Matrix (b) aus einem porösen Träger und einer wasserlöslichen, hochmolekularen Verbindung konstruiert ist oder aus einem porösen Träger oder ähnlichem und einer Substanz im festen Zustand, die im Träger oder ähnlichem enthalten ist, auf alle Matrix-bildenden Elemente oder einen Teil von ihnen angewendet werden.
Wenn die Matrix (b) durch Immobilisierung einer spezifischen Bindungssubstanz, die spezifisch für die zu untersuchende Substanz ist, konstruiert ist, kann die Matrix (b) nur aus einer Substanz im festen Zustand bestehen, in der die spezifische Bindungssubstanz immobilisiert wurde. Zum Beispiel kann die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie dargestellt in Fig. 10(6), konstruiert sein, indem die Substanz im festen Zustand in einen Hohlzylinderträger (e) gepackt ist und eine Detektionsvorrichtung (c) am stromabwärts gelegenen Ende des Trägers bildet.
Die Länge in Flußrichtung einer Testprobe der Matrix (b) der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 10 µm bis einigen mm, da die notwendige Menge einer flüssigen Testprobe durch Reduktion des Matrixvolumens minimiert werden kann, aber Veränderungen in der Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers im Verhältnis zu der Menge einer zu untersuchenden Substanz in der Testprobe werden undeutlich, wenn das Matrixvolumen zu gering ist.
Obwohl diese nicht besonders begrenzt ist, kann die Matrix (b) der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verschiedene Formen annehmen, wie z.B. einen flachen Körper, ein Laminat flacher Körper, ein Cuboid, einen zylindrischen Körper, eine kapillare Art, einen konischen Körper und ähnliche oder Kombinationen davon. Perspektivische Diagramme von einigen Beispielen der Form der Matrix der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung sind in Fig. 10 dargestellt.
Die Detektionsvorrichtung (c) kann ebenfalls verschiedene Konstitutionen aufweisen.
Zunächst wird die Konstitution beschrieben, wenn die Detektionsvorrichtung (c) eine Elektrode ist.
Verschiedene Arten von Elektroden können verwendet werden, wie z.B. eine Platinelektrode, eine Goldelektrode, eine Kohlenstoffelektrode und ähnliches, von denen eine mit Kohlenstoff bedruckte Elektrode (carbon print electrode) insbesondere bevorzugt wird im Hinblick auf die Produktion. In diesem Fall kann eine Flüssigkeits-undurchlässige Platte, wie z.B. eine Vinylchloridplatte oder eine Flüssigkeits-permeable Platte (Figc 9(2), d), wie z.B. ein Filterpapier, als Elektrodensubstrat verwendet werden (Fig. 9(7) e).
Wenn eine genaue Elektrodenkonstitution benötigt wird, kann eine Mikroarrayelektrode unter Verwendung von photographischen Techniken hergestellt werden.
Eine Ag/AgCl-Elektrode oder ähnliches kann als Referenzelektrode der obengenannten Elektrode verwendet werden, die hergestellt werden kann unter Verwendung von Drucktechniken und ähnlichem.
Die Spezifität und Sensitivität der Elektrodenreaktion kann verbessert werden, indem eine Enzymelektrode als Detektionsvorrichtung (c) verwendet wird. In diesem Fall fungiert eine Signalsubstanz als Substrat oder Cofaktor der Enzymelektrode und ein Signal wird detektiert, wenn eine Elektronenübertragung an der Elektrode bewirkt wird. Verschiedene Arten der Enzymelektrode sind in den Gebieten der biochemischen Analyse und der analytischen Chemie bekannt.
Wenn die Detektionsvorrichtung (c) sich an einer Stelle befindet, an der Fluoreszenz, Lumineszenz, Färbung oder ähnliches nachgewiesen wird, ist die Detektionsvorrichtung (c) tatsächlich ein Fluoreszenzerzeugungsteil, an dem eine Substanz, die mindestens an einer Signalerzeugung teilnimmt, die notwendig für die Fluoreszenzreaktion ist, im wesentlichen immobilisiert ist, ein Lumineszenzerzeugungsteil, an dem eine Substanz, die an mindestens einer Signalerzeugung teilnimmt, die notwendig für die Lumineszenzreaktion ist, im wesentlichen immobilisiert ist oder ein Farberzeugungsteil, an dem eine Substanz, die an mindestens einer Signalerzeugung teilnimmt, die für die Frbereaktion notwendig ist, im wesentlichen immobilisiert ist.
Gemäß den Signalerzeugungstypen 4 und 5, wie dargestellt in Tabelle 1, ist die zu immobilisierende Substanz als Bestandteil der Detektionsvorrichtung (c) Luminol und/oder Peroxidase (Typ 4) oder Orthodianisidin und/oder Peroxidase (Typ 5). Es ist jedoch im Hinblick auf die Reaktionseffizienz vorzuziehen, die Detektionsvorrichtung (c) durch Immobilisierung von mindestens dem Enzym zu konstituieren.
Wenn die Detektionsvorrichtung (c) an einer Stelle ist, an der die Fluoreszenz, Lumineszenz, Färbung oder ähnliches nachgewiesen wird, kann die Detektionsvorrichtung (c) hergestellt werden, indem die vorgenannte, an der Signalerzeugung beteiligte Substanz in einem Bereich der vorstehenden Matrix (b) oder einer Absorptionsvorrichtung (d), die später beschrieben werden wird, oder an einer Basis (e) immobilisiert ist, wenn die Basis (e) an der stromabwärts gelegenen Seite der Detektionsvorrichtung (c) angeordnet ist, wie es der Fall, wie dargestellt in Fig. 9(7), ist. In diesem Fall kann die Immobilisierung durch verschiedene Mittel durchgeführt werden, z.B. indem ein Enzym von Interesse unter Verwendung von Glutaraldehyd an die Oberfläche einer Glasbasis gebunden wird, die mit 3- Aminopropyl-Triethoxysilan behandelt wurde.
Wenn eine Absorptionsvorrichtung (d) verwendet wird [siehe Fig. 9(2), (4) und (8)], ist die Absorptionsvorrichtung (d) mit einem porösen Träger, einem Gelträger oder ähnlichem konstruiert, die im vorstehenden in bezug auf die Matrix (b) beschrieben wurden. Sie kann auch zu einem laminierten Körper geformt sein. In jedem Fall ist eine spezifische Bindungssubstanz, die spezifisch für eine zu untersuchende Substanz ist, im allgemeinen nicht eingeschlossen oder in der Absorptionsvorrichtung (d) immobilisiert, wenn die spezifische Bindungssubstanz in der Matrix (b) eingeschlossen oder immobilisiert ist.
Zusätzlich zu den vorstehenden Bestandteilselementen kann die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung einen Teil aufweisen, der mit einer Träger pder einer Basis (e) korrespondiert und/oder einen Teil, der mit einer Abdeckung (f) korrespondiert. Der Träger oder die Basis (e) kann z.B. im stromabwärts gelegenen Bereich der Detektionsvorrichtung (c), wie im Fall der Fig. 9(7), angeordnet sein, oder indem die Vorrichtung von dem Träger oder einer Basis (e), wie im Fall Fig. 10(6), umgeben ist. Die Abdeckung (f) kann z.B. im stromaufwärts gelegenen Bereich der Probeneinführungsvorrichtung (a), wie im Fall der Fig. 9(7) und (8), angeordnet sein. Zusätzlich kann eine Pore (g) an der Abdeckung (g) zur Verwendung bei der Einführung in einer Testprobe angeordnet sein.
In diesem Fall bedeutet die Bezeichnung "Träger oder Basis (e)" einen Teil, der aus einem wasserundurchlässigen Material hergestellt wurde und einen Teil, der aus einem wasserdurchlässigen Material hergestellt wird, wird als Absorptionsvorrichtung (d) verwendet. Auch bedeutet die Bezeichnung "Abdeckung (f)" einen Teil, der aus einem wasserundurchlässigen Material hergestellt wurde und ein aus einem wasserdurchlässigen Material hergestellter Teil wird als Probeneinführungsvorrichtung (a) verwendet.
Beispiele für die Konstruktionsmaterialien des Trägers oder der Basis (e) und der Abdeckung (f) umfassen Polyvinylchlorid, Glas, Acrylharz, Polystyrol, ABS-Harz, Epoxyharz und ähnliches, die transparent oder opak sein können. Jedoch können der Träger oder die Basis (e) transparent sein, wenn die Matrix (b) die Konstitution der Fig. 9(7) aufweist und das Signal Fluoreszenz, Lumineszenz, Färbung oder ähnliches ist.
In der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Substanz, die an der Erzeugung von mindestens einer Signalsubstanz beteiligt ist, in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b) oder der Detektionsvorrichtung (c) oder in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) lokalisiert. Eine solche Substanz wurde bereits im vorstehenden im Hinblick auf das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Diese Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, ist in der vorstehenden Weise lokalisiert, da, wenn eine Testprobe in die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, diese Substanz mit dem Probenfluß in einen Bereich weggetragen wird, der in der Nähe der Detektionsvorrichtung (c) oder in der Absorptionsvorrichtung (d) liegt. Das heißt, die Substanz 12, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, wird zu der Position, wie dargestellt in den Fig. 1 oder 6, oder der Position der Absorptionsvorrichtung (d), wie dargestellt in den Fig. 9(2) oder (4), übertragen. Es ist jedoch im Hinblick auf die Genauigkeit vorzuziehen, die Substanz 12 in einem Bereich nahe der Detektionsvorrichtung (c) und/oder in der Absorptionsvorrichtung (d) zu lokalisieren.
So wurde die Konstitution der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Zusätzlich zu diesem können andere Substanzen als die Substanz 12, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist und die notwendig sind für die Reaktion in dem Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch in geeigneten Bereichen der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung lokalisiert sein (oder fest angeordnet sein).
Darstellende Beispiele solcher Substanzen umfassen: einen Signalsubstanzerzeuger; eine Substanz, die an der Erzeugung eines Signals im Fall des Typ 3-Signalerzeugungssystems, wie gezeigt in Tabelle 1, beteiligt ist; und eine Substanz, die nicht für die Bildung der Detektionsvorrichtung (c) im Fall des Typs 4 oder 5 in Tabelle 1 immobilisiert ist, d.h., entweder ein Enzym oder sein Substrat, das nicht immobilisiert ist.
Wenn diese Substanzen nicht in der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung lokalisiert sind, werden sie in die Vorrichtung zusammen mit einer Testprobe oder vor oder nach der Einführung der Testprobe eingeführt. Es ist jedoch wünschenswert, diese Substanzen zuvor in geeignete Bereiche der Assayvorrichtung einzuführen, da dadurch der Schritt für ihre Einführung in die Vorrichtung ausgelassen werden kann. In diesem Fall kann die besonders wünschenswerte Assayvorrichtung alle notwendigen Substanzen für die Reaktion im Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, außer einer zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe und einer Substanz, die im allgemeinen in einer Testprobe enthalten ist (z.B. gelöster Sauerstoff). Durch die Verwendung einer solchen Vorrichtung kann ein spezifischer Bindungsassay nur durch Einführung einer Testprobe und Bewertung der Ergebnisse durchgeführt werden.
Wenn diese Substanzen, die notwendig für den spezifischen Bindungsassay sind, in der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung lokalisiert sind, wie im Fall der vorstehenden Substanz, die an der Erzeugung von mindestens einer Signalsubstanz beteiligt ist, sind andere Substanzen als der Signalsubstanzerzeuger in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b) oder der Detektionsvorrichtung (c) oder in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), in der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) lokalisiert.
Der Signalsubstanzerzeuger ist dagegen in der Probeneinführungsvorrichtung (a) und/oder in einem stromaufwärts gelegenen Bereich der Matrix (b) der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung lokalisiert, da man ihn einer spezifischen Bindungsreaktion unterzieht und da er in der Matrix (b) im Verhältnis zu der Menge der zu untersuchenden Substanz in einer Testprobe verteilt werden soll.
Obwohl eine Assayvorrichtung mit einer einzigen Detektionsvorrichtung (c) oder einer Vorrichtung, die mit einer einzigen zu untersuchenden Substanz korrespondiert, im vorstehenden beschrieben wurde, kann die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von Detektionsvorrichtungen (c) aufweisen. Wenn z.B. ein Vielzahl von Detektionsvorrichtungen (c) angeordnet sind und die Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers an einer Vielzahl von Detektionsstellen gemessen wird, wird sich die Genaugigkeit des Assays deutlich verbessern. Auch können verschiedene Arten von Signalen nachgewiesen werden und daher eine Vielzahl von zu untersuchenden Substanzen gemessen werden, wenn eine Vielzahl von Detektionsvorrichtungen angeordnet sind.
Die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann so wie sie ist verwendet werden, wenn ein Signal durch visuelle Beobachtung detektiert wird, aber sie sollte verwendet werden, indem sie mit einem geeigneten Detektionselement (einem Meßinstrument), abhängig von der Art der Signale, verbunden wird. Solche Detektionselemente oder Meßinstrumente sind bereits im vorstehenden im Hinblick auf das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben worden.
Im folgenden werden Anwendungsverfahren der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Wenn die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung alle notwendigen Substanzen für die Reaktion enthält, kann ein spezifischer Bindungsassay bewirkt werden, indem eine vorbestimmte Menge einer Testprobe in die Probeneinführungsvorrichtung (a) eingeführt wird und indem Signale nach einer vorherbestimmten Zeitspanne gemessen werden oder kontinuierlich, bis zum Ablauf einer vorherbestimmten Zeitspanne.
Wenn eine Testprobe geladen wird, permeieren die flüssigen Bestandteile in der Testprobe in Richtung der Detektionsvorrichtung (c) durch Gelpermeation, Diffusion oder Kapillarkräfte. In diesem Fall werden eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist und eine Substanz, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist, zusammen mit der Testprobe durch Diffusion zu der stromabwärts gelegenen Seite der Matrix (b) oder der Absorptionsvorrichtung (d) getragen und dann in der Reaktionsvorrichtung durch Umkehrrichtung verteilt, unabhängig von ihrer ursprünglichen Lokalisierung in der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d). Andererseits reagieren eine zu untersuchende Substanz und ein Signalsubstanzerzeuger miteinander, während sie in die Matrix (b) wandern oder werden in einem bestimmten Bereich in der Matrix (b) festgehalten, wenn eine spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist. Wenn die Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, die einmal bis zu einem Bereich nahe der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) getragen wurde, zum Signalsubstanzerzeuger übertragen wird, wird sie in eine Signalsubstanz umgewandelt und die Signalsubstanz wird daraufhin zur Detektionsvorrichtung (c) durch einen Massetransfer (Diffusion) übertragen und erzeugt direkt oder indirekt durch ihre Reaktion mit der Substanz, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist, ein Signal.
Wenn die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung einige notwendige Substanzen nicht aufweist, werden diese fehlenden Substanzen der Assayvorrichtung vor, gleichzeitig mit oder nach Einführung einer Testprobe zugeführt. Im allgemeinen werden die Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist und die Substanz, die an der Erzeugung eines Signals beteiligt ist, in einer geeigneten Pufferlösung oder ähnlichem gelöst und in die Vorrichtung vor der Einführung einer Testprobe eingeführt. Wenn sie eingeführt sind, diffundieren diese Substanzen in die Reaktionsvorrichtung und kommen in einen gleichmäßigen Zustand. Der Signalsubstanzerzeuger wird in die Vorrichtung zusammen mit oder nach der Einführung einer Testprobe eingeführt. Die Bewegung und die Reaktion von jeder Substanz in der Matrix (b), die Erzeugung eines Signals in der Detektionsvorrichtung (c) und anderes Verhalten dieser Substanzen sind, wie im Fall der vorstehenden Assayvorrichtung, die alle notwendigen Substanzenenthält.
Auf diese Weise sind das Assayverfahren und die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben worden. Im folgenden wird ein Assayverfahren beschrieben, bei dem eine zu untersuchende Substanz (hCG) unter Verwendung von α- Galactosidase als Bestandteilselement (Markierungsmittel) des Signalsubstanzerzeugers verwendet wird und indem ein Signal basierend auf einer elektrochemischen Vorrichtung detektiert wird, und eine Vorrichtung zur Verwendung in einem solchen Assayverfahren, als darstellendes Beispiel des spezifischen Bindungsassayverfahrens und der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Zwei monoklonale Anti-hCG-Antikörper, HM21 und HM81, die verschiedene Epitope des hCG-Moleküls erkennen, werden verwendet, wobei einer von ihnen (HM21) als immobilisierter Antikörper in der Matrix (b) vorliegt und der andere (HM81) als Bestandteilselement des Signalsubstanzerzeugers vorliegt. Das heißt, daß der Signalsubstanzerzeuger der α-Galactosidase-markierte HM81- Antikörper ist. Der HM21-Antikörper ist adsorbiert und an einen porösen Nylonfilmträger immobilisiert, eine Vielzahl der erhaltenen Filme werden laminiert, entsprechend dem hCG- Meßbereich und das Laminat wird als Matrix (b) verwendet. Die Detektionsvorrichtung (c) wird durch Druck einer Ag/AgCl Referenz/Gegenelektrode und einer Kohlenstoff-Arbeitselektrode hergestellt. Auf die so präparierte Detektionsvorrichtung (c) wird ein poröser Nylonfilm (Substratschicht, die einen Teil der Matrix (b) bildet) aufgelagert, der mit p-Aminophenyl-α-D- Galactopyranosid als Enzymreaktionssubstrat (die Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist) imprägniert wurde. Auf das resultierende Laminat werden ferner die Matrix (b), wie oben präpariert, und ein Filterpapier als Probeneinführungsvorrichtung (a) in dieser Reihenfolge aufgelagert. Die Adhäsion dieser Schichten wird durch die Verwendung von einem hydrophilen Gel, wie z.B. Agarose, bewirkt. Das so hergestellte Laminat wird als Teststück für den hCG-Assay verwendet. Vor der hCG-Messung wird ein elektrisches Potential von +400 mV pro Ag/AgCl Referenzelektrode an die Arbeitselektrodenseite der Detektionsvorrichtung (c) angelegt, die weiterhin so arrangiert ist, daß Stromstärke oder Ladungen die zur Arbeitselektrode oder zur Gegenelektrgde fließen gemessen werden können.
Wenn eine Testprobe in die Probeneinführungsvorrichtung (a) zusammen mit einer vorbestimmten Menge des Signalsubstanzerzeugers (α-Galactosidase-markierter HM81-Antikörper) eingeführt wird und man ihm ermöglicht, in die Matrix (b) zu permeieren, wird ein spezifischer Bindungsreaktionskomplex (immobilisierter HM21-Antikörper/zu untersuchende Substanz (hCG)/α- Galactosidase-markierter HM81) in der Matrix (b) gebildet. In diesem Fall wird der spezifische Bindungsreaktionskomplex mit einer hohen Effizienz gebildet, wenn die Menge von hCG in der Testprobe groß ist und im Ergebnis bewegt sich die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers zur stromaufwärts gelegenen Seite in der Matrix (b) (entfernt von der Detektionsvorrichtung (c)). Im Gegensatz dazu verlegt sich die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers zur stromabwärts gelegenen Seite der Matrix (b) (nahe der Detektionsvorrichtung (c)), wenn die Menge von hCG in der Testprobe gering ist. In diesem Fall nähert sich ein Bereich des Signalsubstanzerzeugers, insbesondere der, der nicht mit hCG reagiert hat, einem Bereich nahe der Detektionsvorrichtung (c). Die Testprobe permeiert weiter in die Substratschicht (am meisten stromabwärts gelegene Seitenschicht der Matrix (b), wo ein Substrat, wie z.B. p-Aminophenyl-α-D-Galactosid lokalisiert ist), erreicht die Detektionsvorrichtung (c) und führt zu einer Flüssigverbindung zwischen der Arbeitselektrode und der Referenz/Gegenelektrode. Die Permeation der Testprobe wird an dieser Stelle im wesentlichen gestoppt.
In diesem Zustand ist das Substrat in der Substratschicht gelöst und zur stromaufwärts gelegenen Seite der Matrix (b) diffundiert. Wenn das so diffundierte Substrat den Signalsubstanzerzeuger kontaktiert, wird das Substrat durch das Enzym (Markierungsmittel) hydrolysiert und in eine Signalsubstanz (p-Aminophenol) umgewandelt. Die so gebildete Signalsubstanz beginnt um ihre Erzeugungsquelle (Signalsubstanzerzeuger) als Zentrum zu diffundieren. Ein Teil der Signalsubstanz, der in die Detektionsvorrichtungs-(c)Seite diffundiert, wird einer Elektrodenreaktion an der Detektionsvorrichtung (c) unterzogen, um ein Elektron freizusetzen. Die Elektronenübertragung, die auf diesem Weg auftritt, wird als elektrochemisches Signal gemessen. Da die Diffusionsentfernung dieser Signalsubstanz von der Entfernung zwischen dem Signalsubstanzerzeuger als Erzeugungsquelle der Signalsubstanz und der Detektionsvorrichtung (c) abhängt, kann ein Signalsubstanzerzeugerbereich nahe der Detektionsvorrichtung (c) die Signalsubstanz für die Detektionsvorrichtung (c) effizienter zur Verfügung stellen, als ein Bereich, der in einem Teil lokalisiert ist, der weiter von der Detektionsvorrichtung (c) entfernt ist. Demzufolge übt die Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix (b) einen Einfluß auf die Stärke eines Signals aus (Stromstärke, Ladung oder ähnliches), wie gemessen an der Detektionsvorrichtung (c). Zusätzlich, da sich eine solche Verteilung des Signalsubstanzerzeugers im Verhältnis zu der Menge des hCG in einer Testprobe ändert, kann die Konzentration (Quantität) von hCG in der Testprobe basierend auf der Signalstärke gemessen werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu erläutern. Es soll jedoch verstanden werden, daß die Beispiele nur der Darstellung dienen und die Erfindung nicht weiter begrenzen sollen.

(Beispiel 1)

Es wurde eine spezifische Bindungsassayvorrichtung konstruiert und hCG-Konzentrationen in Testproben wurde unter Verwendung der Vorrichtung gemessen.

(1) Präparation eines Konjugats von Anti-hCGβ-Antikörper und α-Galactosidase (markierter Antikörper)

Monoklonaler Antikörper HM81 aus Maus (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die β-Kette von hCG erkennt, wurde ir einer Pufferlösung gelöst, die aus 100 mM Natriumchlorid bestand, 1 mM EDTA und 60 mM Triethanolamin (pH 8,0, im weiterer als "TEA-Puffer" bezeichnet) zu einer Endkonzentration von 5,0 mg/ml und die resultierende Lösung wurde vollständig gegen TEA-Puffer dialysiert, der mit Stickstoffgas gereinigt war. Ein 10 µl Teil der 50 mM 2-Iminothiolanhydrochlorid(Pierce Chemical Company)-lösung wurde zu 0,5 ml der so praparierten Antikörperlösung hinzugefügt und die Mischung wurde gerührt und dann ließ man sie 2 Stunden bei 4ºC in einer Stickstoffgasatmosphäre stillstehen. Danach wurde die resultierende Lösung gegen TEA-Puffer dialysiert, der mit Stickstoffgas gereinigt war und dann gegen eine 50 mM Phosphatpufferlösung, die 100 mM Natriumchlorid enthielt, 1 mM EDTA (pH 6,0, im weiteren bezeichnet als "EDTA-PB"), der ebenfalls mit Stickstoffgas gereinigt war. Auf diese Weise wurde ein Anti-hCGβ-Antikörper- HM81 mit eingeführten SH-Gruppen erhalten.
Ein 50 Einheiten-Bereich von α-Galactosidase (Melibiase, Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) wurde in 0,5 ml eines 50 mM Natriumboratpuffers (pH 7,6) gelöst und die resultierende Lösung wurde vollständig gegen denselben Puffer dialysiert und dann mit 1 mg Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Company) gemischt. Nach 1,5 Stunden der Reaktion bei 30ºC wurde die resultierende Reaktionsmischung gegen EDTA-PB dialysiert, das mit Stickstoffgas gereinigt worden war, um maleimidierte α-Galactosidase zu erhalten.
Ein 0,5 ml Teil der Anti-hCGβ-Antikörper-HM81-Lösung mit eingeführten SH-Gruppen wurde mit 0,5 ml der maleimidierten α- Galactosidaselösung gemischt und die Mischung wurde bei 4ºC 20 Stunden in einer Stickstoffgasatmosphäre inkubiert. Nach der Reaktion wurden 10 µl von 50 mM Cysteaminlösung der Reaktionsmischung zugefügt und die Reaktion wurde bei 4ºC für 30 Minuten in einer Stickstoffgasatmosphäre fortgeführt. Daraufhin wurde die resultierende Reaktionsmischung einer Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-200 (Pharmacia K.K)-Säule und einer Sephacryl S-300HR (Pharmacia K.K.)-Säule unterzogen, die mit EDTA-PB equilibriert waren, und mit Stickstoff gereinigt.
Jede der so eluierten Fraktionen wurde auf ihrer Absorption bei 280 nm überprüft und auf ihre α-Galactosidaseaktivität unter Verwendung einer Färbesubstratlösung für α-Galactosidase (10 mM p-Nitrophenyl-α-D-Galactopyranosid, Sigma Chemical Co.) um Fraktionen zu sammeln und zu konzentrieren, die das AntihCGβ-Antikörper-HM81/α-Galactosidase-verbundene Produkt, aber keine freien Enzymmoleküle enthielten. Die so konzentrierte Präparation des verbundenen Produkts (im weiteren bezeichnet als "α-Galactosidase-HM81") wurde auf sein Molekulargewicht durch eine Phast-Systemelektrophorese (Pharmacia K.K.) überprüft und als Signalsubstanzerzeuger in den Meßexperimenten verwendet.

(2) Präparation einer Detektionsvorrichtung (Elektrode)

Zwei Kohlenstofflinien, jede mit einer Weite von 2 mm und einer Länge von 30 mm wurden in einem Intervall von 2 mm auf eine Polyvinylchloridplatte (30 mm in der Länge, 15 mm in der Breite und 0,5 mm in der Dicke) gedruckt unter Verwendung einer leitenden Kohlenstofftinte (Electrodag 114 oder Electrodag 109, erhältlich von Acheson Japan, Ltd.). Ein 1/2 Teil in Längsrichtung (15 mm) von einer der Kohlenstofflinien wurde weiterhin mit einer leitenden Silbertinte gedruckt (Fujikura Kasei Co., Ltd.) und der so mit Silbertinte überlagerte Bereich wurde einer Elektrolyse in 0,1 M wäßriger Natriumchlorid-Lösung unterzogen, um eine Silberchloridschicht auf der Oberfläche zu bilden.

(3) Herstellung eines Anti-hCGα-Antikörper-immobilisierten porösen Nylonfilms

Monoklonaler Antikörper HM21 von Maus (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die α-Kette von hCG erkennt, wurde in einer nach 0,076 M Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (im weiteren als "PBS" bezeichnet) zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Ein 5 x 10 mm Bereich eines porösen Nylonfilms mit einer Porengröße von 3,0 µm (Immunodyne BIAO30HC5, Pall Process Filtration, Inc.) wurde mit 5 µl der so präparierten Antikörperlösung imprägniert, um einen porösen Nylonfilm zu erhalten, der die HM21-Lösung enthielt. Nach 1 Stunde Inkubation dieser Nylonfilmbereiche bei Raumtemperatur in einer feuchten Box wurden 1 bis 3 ml einer 0,1%-igen Rinderserumalbumin/PBS- Lösung zu jedem Bereich zugefügt (5 x 10 mm), gefolgt von 2 bis 15 Stunden einer Blockierungsreaktion bei 4ºC mit Schütteln. Daraufhin wurden die so behandelten Bereiche in eine 0,1%-ige Tween 20/PBS-Lösung gestellt und für 2 Stunden bei 4ºC geschüttelt, um sie zu waschen. Indem der Waschschritt 3 bis 4 mal durchgeführt wurde, wurden Anti-hCGα- Antikörper(HM21)-immobilisierte, poröse Nylonfilme erhalten.

(4) Herstellung einer Matrix (ein Teil) mit einer Probeneinführungsvorrichtung, indem Anti-hCGα-Antikörper-immobilisierte, poröse Nylonfilmbereiche laminiert werden

Fünf Bereiche des Anti-hCGα-Antikörper(HM21)-immobilisierten, porösen Nylonfilms wurden auf ein Filterpapier gelegt, um die Feuchtigkeit zu entfernen und in einer PBS-Lösung durchtränkt, die 0,25% Agarose und 0,01% Tween 20 enthielt (im weiteren bezeichnet als "heiße Agaroselösung"), die im voraus erhitzt war, um Agarose zu lösen und bei 50ºC gehalten wurde und dann sofort auf eine Glasplatte laminiert wurde.
Danach wurde ein 4 x 8 mm Teil eines quantitativen Filterpapiers 5C (Advantech Toyo Co., Ltd.), das als Probeneinführungsvorrichtung verwendet werden sollte, in der heißen Agaroselösung durchtränkt und dann auf die oberste Schicht des Nylonfilterlaminats aufgelagert. Direkt danach wurde die Feuchtigkeit in dem oberen Bereich durch ein Filterpapier entfernt und die laminierten Schichten wurden fest miteinander befestigt, indem sie mit einem Druck von 61,3 kPa (200 g/Bereich) qepreßt wurden, gefolgt von einer Trocknung in einem Exsikkator.

(5) Verbindung der Matrix mit der Detektionsvorrichtung

Ein Stück des Anti-hCGα-Antikörper-immobilisierten, porösen Nylonfilms, wie hergestellt in dem obigen Schritt (3) (ein Filmteil, imprägniert mit PBS-Lösung, die 0,5 mg/ml HM21 enthält) wurde getrocknet und auf die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt im obigen Schritt (2), in einer derartigen Weise aufgelagert, daß der Filmbereich sowohl die Kohlenstofflinie als auch die Ag/AgCl-Linie überdeckte. Der so aufgelagerte Nylonfilm wurde mit 10 µl einer Substratlösung imprägniert, die durch Lösung eines Enzymsubstrats (p- Aminophenyl-α-D-Galactopyranosid, Sigma Chemical Co.) in einer heißen Agaroselösung zu einer Endkonzentration von 10 mM hergestellt wurde und der resultierende Nylonfilm wurde getrocknet. Die Matrix (ein Teil) mit einer Probeneinführungsvorrichtung, wie hergestellt in dem obigen Schritt (4), wurde auf die so präparierte Detektionsvorrichtung aufgelagert und fest damit verbunden, indem sie mit einem Druck von 61,3 kPa (200 g/Bereich) gepreßt wurde. Indem das resultierende Laminat in einem Exsikkator unter reduziertem Druck getrocknet wurde, wurde eine spezifische Bindungsassayvorrichtung zur Verwendung bei der Messung der hCG-Konzentration erhalten. Diese Vorrichtung ähnelt dem Typ, wie dargestellt in Fig. 9(1).

(6) Messung

Die so konstruierte, spezifische Bindungsassayvorrichtung wurde mit einem Potentiostat HA-150 (Hokuto Denko Co., Ltd.) verbunden, unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode. Die Assayvorrichtung wurde weiterhin mit einem Coulombmeter HF-203D (Hokuto Denko Co., Ltd.) zur Verwendung bei der Messung von Coulombwerten, einem Function Generator HB-104 (Hokuto Denko Co., Ltd.) zur Verwendung für die Aufstellung der Elektrodenpotentiale und einem Recorder F- 45 (Riken Denshi Co., Ltd.) zur Verwendung der Aufnahme der Signale verbunden. Der Recorder wurde mit einem Computer über eine GPIB-Linie verbunden, um die Messung und die Datenverarbeitung durchzuführen. Wenn die Messung ausgeführt wurde, wurde ein Potential von +400 mV an der Kohlenstofflinien- Elektrodenseite angelegt, basierend auf der Silber/Silberchloridlinien-Elektrodenseite.
Eine Testprobe, die hCG enthielt oder nicht enthielt, wurde mit demselben Volumen von α-Galactosidase-HM81-Lösung gemischt, präpariert in dem obigen Schritt (1), das in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0) gelöst wurde, die 2,0% Rinderserumalbumin und 100 mM Natriumchlorid enthielt zu einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml, um eine Lösung (A) zu präparieren, die 0 mIU/ml hCG enthielt und 5 U/ml α- Galactosidase-HM81, eine Lösung (B), die 5 mIU/ml hCG enthielt und 5 U/ml α-Galactosidase-HM81 und eine Lösung (C), die 50 mIU/ml hCG und 5 U/ml α-Galactosidase-HM81 enthielt.
Ein 45 µl Teil von jeder der so präparierten Lösungen (A), (B) und CC) wurde auf die Probeneinführungsvorrichtung der spezifischen Bindungsassayvorrichtung getüpfelt, um der Probe zu ermöglichen, in die Matrix zu permeieren und Veränderungen mit der Zeit in dem Coulombwert wurden gemessen, um Coulombwerte, während einer Minute nach der Probenauftragung zu finden.
Die Messung wurde dreimal für jede der Lösungen (A), (B) und (C) wiederholt.

(7) Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 als Durchschnittswerte von drei Wiederholungen dargestellt. Wie sich deutlich aus der Tabelle ergibt, ändert sich die Verteilung des Enzym-markierten Antiköpers HM81 in der Matrix (b) in Abhängigkeit von der Konzentration von hCG in der Testprobe und Veränderungen in einer solchen Verteilung können als Veränderungen in dem Coulombwert an der Detektionsvorrichtung (c) gemessen werden, wodurch bestätigt wird, daß eine quantitative Bestimmung der hCG- Konzentration in einer Testprobe einfach und schnell durch die Verwendung der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann.
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn dieselbe Art von Assayvorrichtung konstruiert wurde und bei der hCG-Messung verwendet wurde, außer daß ein PBS-Puffer, der 2,0 mg/ml oder 5,0 mg/ml HM21 enthielt, anstelle von 0,5 mg/ml verwendet wurde, wenn die Matrix hergestellt wurde (Daten nicht gezeigt). Tabelle 4 Beziehung zwischen hCG-Konzentrationen in Testproben und gemessenen Coulombwerten

(Beispiel 2)

Eine Matrix der spezifischen Bindungsassayvorrichtung wurde hergestellt und eine Testprobe und ein Signalsubstanzerzeuger (markierter Antikörper) wurden in die Probeneinführungsvorrichtung eingeführt, um Veränderungen in der Verteilung des markierten Antikörpers in der Matrix zu überprüfen.

(1) Herstellung einer Matrix mit einer Probeneinführungsvorrichtung

Eine Matrix (ein Teil) mit einer Probeneinführungsvorrichtung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1(4) hergestellt. Daraufhin wurde ein Stück des Anti-hCGα-Antikörper-immobilisierten, porösen Nylonfilms, wie hergestellt in Beispiel 1(3) (ein Filmteil, imprägniert mit PBS-Lösung, die 0,5 mg/ml HM21 enthielt), getrocknet und auf eine Polyvinylchloridplatte (30 mm in der Länge, 15 mm in der Breite und 0,5 mm in der Dicke) aufgelagert. Der so aufgelagerte Nylonfilm wurde mit 10 µ1 der heißen Agaroselösung imprägniert und der resultierende Nylonfilm wurde getrocknet. Die Matrix (ein Teil), wie oben präpariert, wurde auf den so getrockneten Nylonfilm aufgelagert und durch Druck befestigt. Indem das resultierende Laminat in einem Exsikkator unter reduziertem Druck getrocknet wurde, wurde ein laminierter Körper, bestehend aus einer Matrix (b), einer Probeneinführungsvorrichtung (a) und einem Träger (e) erhalten. Diese Vorrichtung ähnelt der Vorrichtungsart, wie dargestellt in Fig. 11, bei der eine Permeationsrichtung 22 einer flüssigen Testprobe durch einen Pfeil angedeutet ist.

(2) Messung

Eine Testprobe, die hCG enthielt oder nicht enthielt, wurde mit demselben Volumen der α-Galactosidase-HM81-Lösung, wie hergestellt in Beispiel 1(1), gemischt, die in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0) gelöst war, die 2,0% Rinderserumalbumin und 100 mM Natriumchlorid enthielt zu einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml, um eine Lösung (D) zu präparieren, die 0 mIU/ml hCG enthielt und 5 U/ml α-Galactosidase- HM81, eine Lösung (E), die 10 mIU/ml hCG und 5 U/ml α- Galactosidase-HM81 und eine Lösung (F), die 100 mIU/ml hCG und 5 U/ml α-Galactosidase-HM81 enthielt.
Ein 45 µl Teil von jeder der so präparierten Lösungen (D), (E) und (F) wurde auf die Probeneinführungsvorrichtung der spezifischen Bindungsassayvorrichtung, wie hergestellt im obigen Schritt (1), aufgetüpfelt.
Danach wurden das Filterpapier und der Anti-hCGα-Antikörper- immobilisierte, poröse Nylonfilm, beide als Bestandteilselemente der Matrix, voneinander in jeweilige Bereiche getrennt und die Menge von α-Galactosidase-HM81 (markierter Antikörper) in jedem Bereich wurde gemessen, indem die α-Galactosidaseaktivität unter Verwendung einer Färbesubstratlösung für α- Galactosidase (10 mM p-Nitrophenyl-α-D-Galactopyranosid, Sigma Chemical Co.) bestimmt wurde.

(3) Ergebnisse

Die so gemessene Menge von α-Galactosidase-HM81 in jedem Bereich wurde als α-Galactosidase-HM81(α-Galactosidaseaktivitäts)-Verteilung in der Matrix neu angeordnet, mit den Ergebnissen wie dargestellt in Fig. 12. In der Figur wurde die α-Galactosidaseaktivität in jedem Bereich (Schicht), der 0, 10 oder 100 mIU/ml hCG enthielt, durch eine Prozentzahl ausgedrückt, basierend auf der Aktivität in dem 0 mIU/ml Bereich als 100%.
Wie sich deutlich aus Fig. 12 ergibt, wird die Verteilung des markierten Antikörpers in den oberen Schichten (erste und zweite Schicht) sehr häufig und weniger häufig in den unteren Schichten (dritte bis sechste Schicht), wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz (hCG) in der Testprobe von 0 mIU/ml auf 100 mIU/ml ansteigt.
In Fig. 12 ist das ansteigende Verhältnis der Menge des markierten Antikörpers in den oberen Schichten, ausgelöst durch die zu untersuchende Substanz in der Testprobe, gering im Auftreten im Vergleich mit dem abnehmenden Verhältnis in den unteren Schichten. Der Grund für dieses liegt darin, daß die Verteilung des markierten Antikörpers in der Matrix selbst eine abnehmende Tendenz von der oberen Schichtseite zur unteren Schichtseite hatte, wenn die Menge der zu untersuchenden Substanz (hCG) in der Testprobe 0 mIU/ml (Grundverteilungswert) betrug.
Demzufolge schien es, daß die durch das Verfahren von Beispiel 1 gemessenen Signale (dargestellt durch Coulombwerte) im wesentlichen diejenigen Signale waren, die den markierten Antikörper betrafen (Signalsubstanzerzeuger), der in den unteren Schichten verteilt war und Veränderungen in der Verteilung des markierten Antikörpers in der Matrix durch die zu untersuchende Substanz in der Testprobe nahmen an der Modulation der Signale teil.
Im folgenden wird illustrativ eine Assayvorrichtung für das spezifische Bindungsassayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben, um die Verteilung eines Markers (eines Enzyms) in der Matrix zu messen.

(Beispiel 3)

Unter Verwendung eines Laminats eines porösen Materials mit einer α-Galactosidase-immobilisierten Schicht, wurden Veränderungen in den Stromstärkewerten abhängig von der Entfernung zwischen einer Kohlenstoffelektrode und einer Enzymschicht gemessen, um die Wirkungen der positionalen Beziehung zwischen der Detektionsvorrichtung und einem Marker (α-Galactosidase) auf die Stromstärkewerte zu bestimmen.

(1) Präparation eines α-Galactosidase-immobilisierten, porösen Nylonfilms und eines Nylonfilms mit immobilisiertern Kaninchennormalserum

Ein 5 x 8 mm Bereich eines porösen Nylonfilms mit einer Porengröße von 3,0 µm (Immunodyne BIAO30HC5, Pall Process Filtration, Inc.) wurde mit 5 µl einer PBS-Lösung imprägniert, die 400 U/ml α-Galactosidase enthielt (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) oder mit 5 µl normalem Kaninchenserum (im weiteren als "NRS" bezeichnet) (erhältlich von Japan Biomaterial Center). Nach 1 Reaktionsstunde bei Raumtemperatur wurden die so behandelten Bereiche für 15 Stunden in einer 0,1%-igen Rinderserumalbumin (BSA)/PBS-Lösung bei 4ºC geschüttelt, um eine Blockierung zu bewirken. Danach wurden die so behandelten Bereiche in eine 0,1% Tween 20/PBS-Lösung gestellt und 2 Stunden bei 4ºC geschüttelt, um sie zu waschen. Indem der Waschschritt fünfmal oder öfter wiederholt wurde, wurden α-Galactosidase- immobilisierte Nylonfilme und NRS-immobilisierte Nylonfilme erhalten.

(2) Herstellung eines Laminats aus porösem Material mit einer α-Galactosidase-immobilisierten Schicht

Ein α-Galactosidase-immobilisierter Nylonfilm und fünf NRS- immobilisierte Nylonfilme wurden auf ein Filterpapier gelegt, um die Feuchtigkeit zu entfernen und die resultierenden Filme wurden auf einen Objektträger aufgelagert, um ein Laminat herzustellen. In diesem Fall wurden 6 verschiedene Laminate hergestellt, in denen eine einzige Schicht des α-Galactosidase- immobilisierten Nylonfilms als erste (oberste) Schicht verwendet wurde, als zweite Schicht, dritte Schicht, vierte Schicht, fünfte Schicht oder sechste (unterste) Schicht zusätzlich zu einem Laminat, das nur aus sechs NRS-immobilisierten Nylonfilmen bestand. Auf die oberste Schicht von jedem der so präparierten Laminate wurde ein 4 x 6 mm Bereich eines Filterpapiers (Nr. 165, Whatman Corp.) aufgelagert, das daraufhin mit 40 µl einer PBS-Lösung imprägniert wurde, die 0,25% Agarose und 0,01% Tween 20 (heiße Agaroselösung) enthielt, die im voraus erhitzt worden war, um die Agarose zu lösen und bei 50ºC gehalten wurde. Daraufhin wurde die Feuchtigkeit im oberen Bereich mit einem Filterpapier entfernt und die laminierten Schichten wurden fest verbunden, indem sie mit einem Druck von 61,3 kPa (200 g/Bereich) gepreßt und in einem Exsikkator getrocknet wurden, um das Laminat aus porösem Material mit einer α-Galactosidase-immobilisierten Schicht zu erhalten.

(3) Herstellung einer Substratschicht

Ein 5 x 8 mm Bereich eines porösen Nylonfilms mit einer Porengröße von 3,0 µm (Immunodyne BIAO30HC5, Pall Process Filtration, Inc.) wurde mit 5 µl einer heißen Agaroselösung imprägniert, die 100 mM eines Enzymsubstrats enthielt (p- Aminophenyl-α-D-galactopyranosid, Sigma Chemical Co.) und dann getrocknet, um eine Substratschicht zu erhalten.

(4) Verbindung des Laminats aus porösem Material mit einer α- Galactosidase-immobilisierten Schicht mit einer Detektionsvorrichtung

Eine einzelne Schicht der Substratschicht, die so erhalten wurde, wurde auf die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 1(2), aufgelagert, in einer derartigen Weise, daß die Substratschicht sowohl die Kohlenstofflinie als auch die Silber/Silberchloridlinie bedeckte. Auf die so hergestellte Detektionsvorrichtung wurde das Laminat aus porösem Material aufgelagert, das eine α-Galactosidase-immobilisierte Schicht, wie hergestellt im obigen Schritt (2), enthielt und eine Acrylplatte mit einem Loch (3 mm im Durchmesser) für die Probeneinführungsverwendung in dieser Reihenfolge. Das resultierende Laminat wurde als laminierte Vorrichtung aus porösem Material verwendet, das eine α-Galactosidase-immobilisierte Schicht enthielt. In diesem Fall wurde das Loch für die Probeneinführungsverwendung direkt oberhalb der obersten Filterpapierschicht des Laminats angeordnet und die Acrylplatte wurde in einer derartigen Weise angeordnet, daß sie eine Entfernung von 1200 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt.
Das heißt, wie dargestellt in Fig. 13, es wurde eine laminierte Vorrichtung aus porösem Material konstruiert, die aus einer Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 bestand, einer Nullschicht als Filterpapierteil für Probenauftragungs(Einführungs)-Verwendung 30, erste bis sechste Schichten von porösen Nylonfilmbereichen, einer siebten Schicht als Substratschicht und einer Detektionsvorrichtung, angeordnet in dieser Reihenfolge, in Permeationsrichtung 20 einer flüssigen Testprobe.

(5) Messung der elektrischen Stromstärke unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer α- Galactosidase-immobilisierten Schicht

Die in dem obigen Schritt (4) konstruierte Vorrichtung wurde mit den notwendigen Meßeinrichtungen verbunden, wie z.B. einem Potentiostaten und ähnlichen, wie beschrieben in Beispiel 1(6), unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode. Wenn die Messung durchgeführt wurde, wurde ein elektrisches Potential von +400 mV an die Kohlenstofflinien-Elektrodenseite angelegt, basierend auf der Silber/Silberchloridlinien-Elektrodenseite. Als Reaktionspuffer wurden 30 µl einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,0) in die Assayvorrichtung eingeführt, die 2% Rinderserumalbumin und 100 mM Natriumchlorid enthielt, um die Stromstärkewerte aufzuzeichnen.

(6) Ergebnisse

Periodische Veränderungen in der elektrischen Stromstärke, wenn gemessen unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer α-Galactosidase-immobilisierten Schicht sind in Fig. 14(a) und (b) dargestellt. Die elektrische Stromstärke war groß, wenn sich die α-Galactosidase- immobilisierte Schicht nahe an der Kohlenstoffelektrode (Detektionsvorrichtung) befand, während die Stromstärke gering war, wenn sich die α-Galactosidase-immobilisierte Schicht weit von der Detektionsvorrichtung entfernt befand. Das heißt, unter diesen experimentellen Bedingungen können die Enzymmoleküle zur elektrischen Stromstärke beitragen, wenn sie innerhalb der Entfernung von mindestens ungefähr 1000 µm von der Detektionsvorrichtung lokalisiert sind und ein solcher Beitrag zu der elektrischen Stromstärke wird schrittweise größer, wenn sich die Enzymmoleküle der Detektionsvorrichtung nähern. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die vorliegende Erfindung sehr genau die Verteilung von Enzymmolekülen in der Matrix, wie im Fall des Beispiels 1, messen kann.

(Beispiel 4)

Unter Verwendung eines Laminats aus porösem Material mit einer Meerrettich-Peroxidase(HRPO)-immobilisierten Schicht, einer Glucoseoxidase(GOD)-immobilisierten Schicht oder einer HRPO- immobilisierten und GOD-immobilisierten Schichten, können Veränderungen in der elektrischen Stromstärke abhängig von der Entfernung zwischen einer Kohlenstoffelektrode und der HRPO- immobilisierten Schicht, der GOD-immobilisierten Schicht oder den HRPO- und GOD-immobilisierten Schichten gemessen werden, um die Wirkung der positionalen Beziehung zwischen der Detektionsvorrichtung und einem Marker (GOD) auf die elektrische Stromstärke zu bestimmen.

(1) Herstellung einer Enzym-immobilisierten porösen Membran

Sowohl Meerrettich-Peroxidase (HRPO, Toyobo Co., Ltd.) als auch Glucoseoxidase (GOD, Boehringer Mannheim Corp.) wurden in 0,076 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu einer Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst. Eine Membran aus einer Mischung von Cellulosenitrat-Celluloseacetat mit einer Porengröße von 3,0 µm (Cat. No. SSWP 14200, Millipore Corp.) wurde in einen rechtwinkligen Bereich geschnitten, mit einer Größe von 5 x 8 mm, der als Immobilisierungsträger verwendet werden sollte. Eine notwendige Anzahl der so ausgeschnittenen Bereiche wurde zwischen zwei Stücke eines quantitativen Filterpapiers mit einem Durchmesser von 90 mm (5A, Advantech Toyo Co., Ltd.) gelegt und die resultierende Präparation wurde weiterhin zwischen zwei Acrylplatten eingefügt. Zwei Sets der so hergestellten Präparationen mit zwei Einfügungen wurden hergestellt. Der Filterpapierbereich von jeder der so erhaltenen Präparationen mit zwei Einfügungen mit jeder der oben hergestellten Enzymlösungen imprägniert. Nachdem die Acrylplatten versiegelt wurden, ließ man die Präparationen mit zwei Einfügungen stillstehen bei 4ºC für mindestens 24 Stunden, um sie aneinander zu befestigen und das Enzym an die Membranbereiche zu fixieren. Die so behandelten Membranbereiche wurden wiedergewonnen, mit PBS gewaschen, in ein 100 ml Becherglas (capacity beaker), das 60 ml 0,1%-iges Rinderserumalbumin enthielt (BSA)/PBS-Lösung gestellt und bei 4ºC für mindestens 1 Tag geschüttelt, um eine Blockierung zu bewirken. Daraufhin wurden die so behandelten Bereiche in eine 0,1%-igen Tween 20/PBS-Lösung gestellt und bei 4ºC geschüttelt, um sie zu waschen. Indem der Waschschritt viermal oder öfter wiederholt wurde, wurden HRPO-immobilisierte Membranbereiche und GOD- immobilisierte Membranbereiche erhalten.

(2) Herstellung eines porösen Materiallaminats mit einer HRPO- immobilisierten Schicht

Es wurde ein Laminat hergestellt, das aus einem getrockneten Stück des HRPO-immobilisierten Membranbereichs bestand, wie hergestellt in dem obigen Schritt 1, und 5 Stücken (5 x 8 mm für jedes) eines Nr. 54 Filterpapiers (Whatman Corp.). In diesem Fall wurde eine Gesamtzahl von 5 verschiedenen Laminaten hergestellt, bei denen eine einzelne Schicht der HRPO- immobilisierten Schicht als erste (oberste) Schicht verwendet wurde, als zweite Schicht, dritte Schicht, vierte Schicht oder fünfte (unterste) Schicht. Jedes der so erhaltenen Laminate wurde auf die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 1 (2), derartig aufgelagert, daß die Substratschicht sowohl die Kohlenstofflinie als auch die Silber/Silberchloridlinie bedeckte. Auf die so hergestellte Detektionsvorrichtung wurde eine Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 (3 mm im Durchmesser) aufgelagert. Das resultierende Laminat wurde als laminierte Vorrichtung aus porösem Material mit einer HRPO-immobilisierten Schicht verwendet. In diesem Fall wurde das Probeneinführungsloch direkt oberhalb der obersten Filterpapierschicht des Laminats angeordnet und die Acrylplatte 22 war derartig angeordnet, daß sie eine Entfernung von 1.200 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt.
Das heißt, daß, wie dargestellt in Figur 15, eine laminierte Vorrichtung aus porösem Material hergestellt wurde, die aus einer Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 bestand, einer Nullschicht als Filterpapierteil für die Probenaufbringungs(Einführungs)-Verwendung 30, erste bis fünfte Schichten und einem Elektrodenbereich als Detektionsvorrichtung, angeordnet in dieser Reihenfolge in der Permeationsrichtung 20 einer flüssigen Testprobe.

(3) Messung der elektrischen Stromstärke unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer HRPO- immobilisierten Schicht.

Die in dem obigen Schritt (2) hergestellte Vorrichtung wurde mit den notwendigen Meßeinrichtungen, wie z. B. einem Potentiostaten und ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), verbunden, unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode. Getrennt davon wurden die folgenden wäßrigen Lösungen hergestellt.

(1) wäßrige Hydrochinon-Lösung (HQ-Lösung)

100 mM Hydrochinon (Wako Pure Chemincal Industries)
50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0)
100 mM Natriumchlorid

(2) Wasserstoffperoxidlösung

3,4 % Wasserstoffperoxid
50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0)
100 mM Natriumchlorid

3) Elektrolytlösung

50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0)
100 mM Natriumchlorid
Direkt vor der Messung wurden 10 µl der HQ-Lösung, 40 µl der Wasserstoffperoxidlösung und 950 µl der Elektrolytlösung vollständig vermischt, um eine Mischungslösung zu erhalten, die 1 mM Hydrochinon enthielt, und ungefähr 40 mM Wasserstoffperoxid als Endkonzentrationen. Ein 40 µl Teil der so hergestellten Mischungslösung wurde in die Assayvorrichtung durch das Probeneinführungsloch der Acrylplatte eingeführt. Wenn das Ruhe- Potential der Arbeitselektrode stabil wurde (1 Minute nach der Probeneinführung), wurde ein elektrisches Potential von -200 mV an die Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, um die elektrische Stromstärke aufzunehmen. Die Ergebnisse sind in Figur 16 dargestellt.

(4) Herstellung eines Laminats aus porösem Material mit einer GOD-immobilisierten Schicht.

Es wurde ein Laminat hergestellt, das aus einem getrockneten Stück des GOD-immobilisierten Membranbereichs bestand, der in dem obigen Schritt (1) hergestellt wurde, und 5 Stücken (5 x 8 mm für jedes) eines Nr. 54 Filterpapiers. (Whatman Corp.). In diesem Fall wurde eine Gesamtzahl von 5 verschiedenen Laminaten hergestellt, bei denen eine einzelne Schicht der GOD- immobilisierten Schicht als erste (oberste) Schicht verwendet wurde, als zweite Schicht, dritte Schicht, vierte Schicht oder fünfte (unterste) Schicht. Jedes der so erhaltenen Laminate wurde auf die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 1 (2), derartig aufgelagert, daß die Substratschicht sowohl die Kohlenstofflinie als auch die Silber/Silberchloridlinie bedeckte. Auf die so hergestellte Detektionsvorrichtung wurde eine Acrylplatte aufgelagert, die ein Probeneinführungsloch (3 mm im Durchmesser) aufwies. Das resultierende Laminat wurde als laminierte Vorrichtung aus porösem Material mit einer GOD-immobilisierten Schicht verwendet. In diesem Fall wurde das Probeneinführungsloch direkt oberhalb der obersten Filterpapierschicht des Laminats angeordnet, und die Acrylplatte wurde derartig angeprdnet, daß sie Entfernung von 1.200 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt.
Das heißt, wie dargestellt in Figur 17, daß eine laminierte Vorrichtung aus porösem Material hergestellt wurde, die aus einer Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 bestand, einer ersten Schicht als Filterpapierteil für die Probenauftragungs-(Einführungs)-Verwendung 30, zweite bis sechste Schichten als Matrix und einem Elektrodenbereich der Detektionsvorrlchtung, angeordnet in dieser Reihenfolge in der Permeationsrichtung 20 einer flüssigen Testprobe.

(5) Messung der elektrischen Stromstärke unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer GOD- immobilisierten Schicht.

Die in dem obigen Schritt (2) hergestellte Vorrichtung wurde mit den notwendigen Meßeinrichtungen, wie z. B. einem Potentiostaten und ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), verbunden, unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode. Getrennt davon wurden die folgenden wäßrigen Lösungen hergestellt. In diesem Fall wurde die Glucoselösung in einem Kühlschrank für mindestens 48 Stunden vor ihrer Verwendung aufbewahrt.

(1) Wäßrige Hydrochinonlösung (HQ-Lösung)

5 mM Hydrochinon (Wako Pure Chemical Industries)
100 InM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid

(2) Glucoselösung

1,5 M Glucose
100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid
Direkt vor der Messung wurden 50 µl der HQ-Lösung vollständig mit 50 µl der Glucoselösung gemischt, um eine Mischungslösung zu erhalten, die 2,5 mM Hydrochinon und 0,75 M Glucose als Endkonzentrationen enthielt. Ein 40 µl Teil der so hergestellten Mischungslösung wurde in die Assayvorrichtung durch das Probeneinführungsloch der Acrylplatte eingeführt. Sobald das Ruhe-Potential der Arbeitselektrode stabil wurde (eine Minute nach der Probeneinführung), wurde ein elektrisches Potential von +300 mV an die Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, um die elektrische Stromstärke zu messen. Die Ergebnisse sind in Figur 18 dargestellt.

(6) Herstellung eines Laminats aus porösem Material mit HRPO- immobilisierten und GOD-immobilisierten Schichten.

Ein siebenschichtiges Laminat wurde hergestellt, das aus einem getrockneten Stück des HRPO-immobilisierten Membranbereichs und einem getrockneten Stück des GOD-immobilisierten Membranbereichs bestand, beide wie hergestellt in dem obigen Schritt (1), und fünf Stücken (5 x 8 mm für jedes) eines Nr. 54 Filterpapiers (Whatman Corp.). In diesem Fall wurde eine Gesamtzahl von 5 verschiedenen Laminaten hergestellt, wobei eine einzelne Schicht der HRPO-immobilisierten Schicht immer als unterste Schicht verwendet wurde, und eine einzelne Schicht der GOD-immobilisierten Schicht als erste (oberste) Schicht verwendet wurde, zweite Schicht, dritte Schicht, vierte Schicht oder fünfte Schicht. Jedes der so erhaltenen Laminate wurde auf die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 1 (2), derartig aufgelagert, daß die Substratschicht sowohl die Kohlenstofflinie als auch die Silber/Silberchloridlinie bedeckte. Auf die so hergestellte Detektionsvorrichtung wurde eine Acrylplatte aufgelagert mit einem Probeneinführungsloch (3 mm im Durchmesser). Das resultierende Laminat wurde als laminierte Vorrichtung aus porösem Material verwendet, mit einer HRPO-immobilisierten Schicht und einer GOD-immobilisierten Schicht. In diesem Fall wurde das Probeneinführungsloch direkt oberhalb der obersten Filterpapierschicht des Laminats angeordnet, und die Acrylplatte wurde derartig angeordnet, daß sie eine Entfernung von 1.200 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt.
Das heißt, wie dargestellt in Figur 19, daß eine laminierte Vorrichtung aus porösem Material hergestellt wurde, die aus einer Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 bestand, einer Nullschicht als Filterpapierteil für die Probenauftragungs(Einführungs)-Verwendung 30, ersten bis fünften Schichten, einer sechsten Schicht als HRPO-immobilisierte Schicht und einem Elektrodenteil als Detektionsvorrichtung, angeordnet in dieser Reihenfolge in Permeationsrichtung 20 einer flüssigen Testprobe.

(7) Messung der elektrischen Stromstärke unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer HRPO- immobilisierten Schicht und einer GOD-immobilisierten Schicht.

Die in dem obigen Schritt (2) hergestellte Vorrichtung wurde mit den notwendigen Meßeinrichtungen , wie z. B. einem Potentiostaten und ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), verbunden, unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode. Getrennt davon wurden die folgenden wäßrigen Lösungen hergestellt. In diesem Fall wurde die Glucoselösung in einem Kühlschrank für mindestens 48 Stunden vor ihrer Verwendung aufbewahrt.

(1) Wäßrige Hydrochinonlösung (HQ-Lösung)

10 mM Hydrochinon (Wako Pure Chemical Industries)
100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid

(2) Glucoselösung

1,5 M Glucose
100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid

(3) Elektrolytlösung

100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid
Direkt vor der Messung wurden 45 µl der HQ-Lösung, 300 µl der Glucoselösung und 555 µl der Elektrolytlösung vollständig durchmischt, um eine Mischungslösung zu erhalten, die 0,5 mM Hydrochinon enthielt und 0,5 M Glucose als Endkonzentrationen. Ein 40 µl Teil der so hergestellten Mischungslösung wurde in die Assayvorrichtung über das Probeneinführungsloch der Acrylplatte eingeführt. Wenn das Ruhe-Potential der Arbeitselektrode stabil war (eine Minute nach der Probeneinführung), wurde ein elektrisches Potential von -200 mV an der Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, um die elektrische Stromstärke zu messen. Die Ergebnisse sind in Figur 20 dargestellt.

(8) Ergebnisse

Figur 16 zeigt periodische Veränderungen in der elektrischen Stromstärke, wie gemessen unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer HRPO- immobilisierten Schicht, wie hergestellt im obigen Schritt (3). Die elektrische Stromstärke war groß, wenn sich die HRPO- immobilisierte Schicht nahe an der Kohlenstoffelektrode (Detektionsvorrichtung) befand, während die Stromstärke gering war, wenn sich die HRPO-immobilisierte Schicht weit entfernt von der Detektionsvorrichtung befand. Figur 18 zeigt periodische Veränderungen der elektrischen Stromstärke, wie gemessen unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit einer GOD-immobilisierten Schicht, wie hergestellt im obigen Schritt (5). Die elektrische Stromstärke war groß, wenn sich die GOD-immobilisierte Schicht nahe an der Kohlenstoffelektrode (Detektionsvorrichtung) befand, während die Stromstärke gering war, wenn sich die GOD-immobilisierte Schicht weit entfernt von der Detektionsvorrichtung befand.
In beiden Fällen nahm der Beitrag der Enzymschicht zur elektrischen Stromstärke stark ab, wenn sich die Entfernung zwischen der Enzymschicht und der Elektrode (Detektionsvorrichtung) vergrößerte, und ein solcher Beitrag der Enzymschicht zur elektrischen Stromstärke war fast vernachlässigbar, wenn sich die Enzymschicht zwei Schichten oder mehr von der Elektrode (Detektionsvorrichtung) entfernt befand. Es wird angenommen, daß ein Kreislauf einer Signalsubstanz (wahrscheinlich Hydrochinon/Benzochinon-Paar) zwischen dem Enzym und der Elektrode unter diesen experimentellen Bedingungen stattfand. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, daß die Enzymmoleküle zur elektrischen Stromstärke am meisten beitragen können, wenn sie sich innerhalb der Entfernung von mindestens ungefähr 500 µm von der Detektionsvorrichtung befinden, und ein solcher Beitrag zu der elektrischen Stromstärke wird sehr schnell groß, wenn sich die Enzymmoleküle der Detektionsvorrichtung nähern. Diese Ergebnisse bestätigen auch, daß die vorliegende Erfindung sehr genau die Verteilung von Enzymmolekülen in einer dünnen Schicht von einer Dicke von mehreren Hundert µm messen kann.
Figur 20 zeigt periodische Veränderungen der elektrischen Stromstärke, gemessen unter Verwendung der laminierten Vorrichtung aus porösem Material mit HRPO-immobilisierten und GOD-immobilisierten Schichten, wie hergestellt im obigen Schritt (5). Die elektrische Stromstärke war groß, wenn sich die GOD-immobilisierte Schicht nahe an der HRPO-Schichtbedeckten Kohlenstoffelektrode (Detektionsvorrichtung) befand, während die Stromstärke gering war, wenn sich die GOD- immobilisierte Schicht weit entfernt von der Detektionsvorrichtung befand. Anders als in den obigen beiden Fällen, nahm der Beitrag der Enzym(GOD)-Schicht zur elektrischen Stromstärke relativ schrittweise ab, in dem Maße, in dem sich die Entfernung zwischen der Enzymschicht und der HRPO-bedeckten Elektrode (Detektionsvorrichtung) vergrößerte, und ein solcher Beitrag der Enzymschicht zu der elektrischen Stromstärke war selbst dann nicht vernachlässigbar, wenn sich die Enzymschicht fünf Schichten oder mehr von der Elektrode (Detektionsvorrichtung) entfernt befand. Es wurde bestätigt, daß ähnlich wie im Fall des Beispiels 3, Signale an der Detektionsvorrichtung durch einen relativ breiten Bereich einer Markerverteilung moduliert werden, wenn der Beitrag eines Signalsubstanzkreislaufes klein oder vernachlässigbar ist. Das heißt, es wurde bestätigt, daß die Enzymmoleküle zur elektrischen Stromstärke beitragen können, wenn sie innerhalb der Entfernung von mindestens ungefähr 1000 µm von der Detektionsvorrichtung lokalisiert sind, und ein solcher Beitrag zur elektrischen Stromstärke wird schrittweise groß, wenn sich die Enzymmoleküle der Detektionsvorrichtung annähern. Ein solcher Beitragsmodus des Enzyms bestätigt, daß die vorliegende Erfindung genau die Verteilung von Enzymmolekülen sogar in einer relativ dicken Matrix messen kann. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, daß die Verteilung eines Markers (ein Enzym z. B.) in einer Matrix, benachbart zu einer Detektionsvorrichtung, präzise, einfach und schnell mit einer breiten Anwendbarkeit durch die Verwendung des Assayverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bewirkt werden kann.
Als anderes Beispiel des spezifischen Bindungs-Assayverfahrens und der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird im folgenden ein Assayverfahren beschrieben, bei dem hCG als eine zu untersuchende Substanz verwendet wird, Glucoseoxidase als Bestandteilselement (Markierungsmittel) eines Markers (Signalsubstanzerzeuger) verwendet wird, und die Signaldetektion durch die Messung einer elektrischen Stromstärke bewirkt wird, wie auch eine Assayvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren.
Ähnlich wie im Fall des Beispiels 1 wurde Anti-hCG Antikörper HM21 als immobilisierter Antikörper in der Matrix (b) verwendet, und Anti-hCG Antikörper HM81 wurde als Bestandteilselement des Signalsubstanzerzeugers verwendet. Das heißt, Glucoseoxidase-markierter HM81-Antikörper wurden als Marker verwendet (Signalsubstanzerzeuger). Im Hinblick auf die Matrix (b) wurde eine einzelne Schicht eines rechteckigen Bereichs eines porösen Nylonfilmträgers in horizontaler Richtung verwendet, an den HM21-Antikörper befestigt und immobilisiert worden war.

(Beispiel 5)

Eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung wurde hergestellt und hCG-Konzentrationen in Testproben wurden unter Verwendung dieser Vorrichtung gemessen.

(1) Herstellung eines Konjugats aus Anti-hCGβ-Antikörper und Glucoseoxidase (markierter Antikörper).

Monoklonaler Antikörper HM81 aus Maus (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die β-Kette von hCG erkennt, wurde in einer Pufferlösung gelöst, die aus 100 mM Natriumchlorid bestand, 1 mM EDTA und 60 mM Triethanolamin (pH 8,0, TEA-Puffer) zu einer Endkonzentration von 3,9 mg/ml, und die resultierende Lösung wurde vollständig gegen den TEA-Puffer dialysiert, der mit Stickstoffgas gereinigt worden war. Ein 55 µl-Teil der 50 mM und 2-Iminothiolanhydrochlorid (Pierce Chemical Company)- Lösung wurde zu 1,0 ml der so hergestellten Antikörperlösung hinzugefügt, und die Mischung wurde gerührt, und man ließ sie dann für 1,5 Stunden bei 4ºC in einer Stickstoffatmosphäre stillstehen. Daraufhin wurde die resultierende Lösung vollständig gegen eine Pufferlösung dialysiert, die aus 100 mM Natriumchlorid bestand, 1 mM EDTA und 100 mM Phosphat (pH 7,0 EDTA-PB), das mit Stickstoffgas gereinigt worden war. Auf diesem Wege wurden Anti-hCGβ-Antikörper mit eingeführten SH- Gruppen HM81 erhalten.
Glucoseoxidase (GOD, Boehringer Mannheim Corp.) wurde in 1,43 ml eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) zu einer Endkonzentration von 70 µM gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 20 µl von 50 mM Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Company) gemischt, während die Lösung vorsichtig bei 30ºC gerührt wurde. Nach 45 Minuten der Reaktion bei 30ºC wurde die resultierende Reaktionsmischung vollständig gegen EDTA-PB dialysiert, das mit Stickstoffgas gereinigt worden war, um maleimidiertes GOD zu erhalten.
Ein 1,5 Mol-Teil des HM81 Antikörpers mit eingeführten SH- Gruppen wurde mit 1 Mol des maleimidierten GODs gemischt, und die Mischung wurde bei 4ºC 20 Stunden in einer Stickstoffgasatmosphäre inkubiert. Nach der Reaktion wurden 50 µl einer 50 mM Cysteaminlösung der Rekationsmischung hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 4ºC 30 Minuten in einer Stickstoffatmosphäre fortgeführt. Danach wurde die resultierende Reaktionsmischung einer Gelfiltrations-Chromatographie unterzogen, unter Verwendung von einer Sephacryl 300HR (Pharmacia K.K.)- Säule, die mit EDTA-PB equilibriert worden war, das mit Stickstoff gereinigt worden war.
Jeder der so eluierten Bereiche wurde auf seine Absorption bei 280 nm und 452 nm überprüft und auf seine GOD-Aktivität in Übereinstimmung mit dem Verfahren, wie offenbart in "Biochemical Information" durch Boehringer Mannheim Corp., um Fraktionen zu sammeln und zu konzentrieren, die das HM81/GOD- verbundene Produkt, aber keine freien Enzymmoleküle enthielten. Die so konzentrierte Präparation des verbundenen Produkts (im weiteren bezeichnet als "GOD-HM81") wurde auf ihr Molekulargewicht durch Phast-System-Elektrophorese (Pharmacia K. K.) überprüft und als Signalsubstanzerzeuger in Meßexperimenten verwendet.

(2) Präparation eines Anti-hCGα-Antikörper-immobilisierten porösen Nylonfilms.

Monoklonaler Antikörper HM21 von Mäusen (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die α-Kette von hCG erkennt, wurde in einer 0,1 M wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung (pH 8,3) zu einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml gelöst. Ein 4 x 15 mm-Bereich eines porösen Nylonfilms mit einer Porengröße von 3,0 µm (Immunodyne BIAO30HC5, Pall Process Filtration, Inc.) wurde mit 8 µl der so hergestellten Antikörperlösung imprägniert. Nach einer 1 Stunde der Reaktion bei Raumtemperatur wurde der so behandelte Bereich in einen 100 ml Becherglas gestellt, der 60 ml 0,1 %iges Rinderserumalbumin (BSA)/PBS-Lösung enthielt und 2 Tage bei 4ºC geschüttelt, um eine Blockierung zu bewirken. Daraufhin wurde der resultierende Nylonfilmbereich gewaschen, indem er in einer 1%igen Tween 20/PBS-Lösung bei 4ºC geschüttelt wurde. Indem der Waschschritt 4mal oder öfter wiederholt wurde, wurde ein Anti-hCGα-Antikörper (HM21)-immobilisierter poröser Nylonfilm erhalten.

(3) Konstruktion einer spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung mit einer Probeneinführungsvorrichtung und einer Wasserabsorptionsvorrichtüng, indem eine einzelne Schicht eines Anti-hCGα Antikörper-immobilisierten, porösen Nylonfilmbereichs auf einer Elektrode angeordnet wird.

Wie dargestellt in Figur 21 wurden die Arbeitselektrode 25 und die Gegen/Referenzelektroden 24, wie hergestellt in Beispiel 1 (2), als Detektionsvorrichtung (c) (Elektrode) verwendet. Ein einzelnes Blatt des getrockneten HM21 Antikörper-immobilisierten, porösen Nylonfilms als spezifische Bindungsmatrix (b) wurde auf der Detektionsvorrichtung (c) (Elektrode) derartig angeordnet, daß die Richtung der Kohlenstofflinie der Arbeitselektrode 23 mit der Längsrichtung des Nylonfilms übereinstimmte, und daß der Nylonfilm einen Teil der Kohlenstofflinie bedeckte. Vier Schichten von 5 x 8 mm-Bereichen von Whatman Filterpapier Nr. 54 wurden auf jeder Seite des resultierenden Nylonfilms derartig aufgelagert, daß die 8 mm-Richtung vertikal auf den Elektrodenlinien stand. In diesem Fall waren die Filterpapierbereiche, die auf der näheren Seite zum Ende der Elektrode laminiert waren, derartig angeordnet, daß das Filterpapierlaminat sowohl die Silber/Silberchloridlinie als auch die Kohlenstofflinie bedeckte, und das so angeordnete Laminat wurde als Probeneinführungsvorrichtung (a) verwendet. Die anderen Filterpapierbereiche, die an der von dem Ende der Elektrode entfernten Seite laminiert waren, wurden in einer derartigen Weise angeordnet, daß das Filterpapierlaminat nicht die Silber/Silberchlorid, aber die Kohlenstofflinie bedeckte, und das so angeordnete Laminat wurde als Absorptionsvorrichtung (d) verwendet. Danach wurde eine Acrylplatte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21 (3 mm im Durchmesser) auf die Probeneinführungsvorrichtung (a) aufgelagert, um eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung zur Verwendung bei der Messung der hCG- Konzentration zu komplettieren. In diesem Fall wurde das Loch 21 für die Probeneinführungsverwendung direkt über der obersten Filterpapierschicht der Probeneinführungsvorrichtung (a) angeordnet, und die Acrylplatte 22 war derartig angeordnet, daß sie eine Entfernung von 1.200 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt. Diese Vorrichtung ähnelt der Art, wie dargestellt in Figur 9 (5).

(4) Messung

Die Vorrichtung, wie hergestellt im obigen Schritt (3), wurde mit den notwendigen Meßeinrüstungen ausgestattet, wie z. B. einem Potentiostaten und ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchlöridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode.
Jede der drei Testproben, die verschiedene Mengen von hCG enthielten, wurden mit demselben Volumen einer GOD-HM81 Lösung gemischt, die auf eine Antikörper-basierende Konzentration von 7,5 µg/ml eingestellt worden war, unter Verwendung eines 100 mM Natriumchlorid/0,1 molaren Phosphatpuffer (pH 7,0), supplementiert mit 0,1 % BSA (im weiteren bezeichnet als "PB zur Reaktionsverwendung"). Ein 55 µl Teil der so hergestellten Mischungslösung wurde vollständig mit 55 µl einer 400 µ- molaren Hydrochinonlösung gemischt, die hergestellt worden war unter Verwendung von 0,1 % BSA enthaltendem PB zur Reaktionsverwendung und weiterhin mit 110 µl einer 1,5-molaren Glucoselösung, hergestellt unter Verwendung des PB zur Reaktionsverwendung. Auf diesem Wege wurde eine Lösung (A) mit einer hCG-Konzentration von 0 IU/l, eine Lösung (B) mit einer hCG- Konzentration von 0,31 IU/l und einer Lösung (C) mit einer hCG-Konzentration von 3,1 IU/l hergestellt, wobei jede Lösung 0,94 µg/ml GOD-HM81 in auf Antikörper-basierender Konzentration enthielt, 100 µM Hydrochinon und 0,75 M Glucose.
Ein 55 µl-Teil von jeder dieser Lösungen (A), (B) und CC) wurde auf die Probeneinführungsvorrichtung über das Probeneinführungsloch der Acrylplatte der spezifischen Bindungs- Assayvorrichtung aufgetüpfelt. Wenn die Testprobe in die Matrix permeierte und weiter in die Wasserabsorptionsmatrix (3 Minuten nach der Probenauftragung), wurde ein elektrisches Potential von +300 mV an die Arbeitselektrode, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, angelegt, um die elektrische Stromstärke zu messen.

(5) Ergebnisse

Tabelle 5 zeigt Veränderungen in der elektrischen Stromstärke 2, 4, 6 und 8 Minuten nach dem Anlegen des elektrischen Potentials an die Arbeitselektrode. Bei jeder gemessenen Zeit wurde die elektrische Stromstärke groß in Abhängigkeit von der Konzentration von hCG. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, daß die quantitative Bestimmung der Konzentration von hCG in einer Testprobe einfach und schnell durch die Verwendung der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann.
Tabelle 5 Beziehung zwischen der hCG-Konzentration in der Reaktionslösung und der gemessenen elektrischen Stromstärke
Als ein anderes Beispiel des spezifischen Bindungs-Assayverfahrens und der -vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird im folgenden ein Assayverfahren beschrieben, bei dem hCG als zu untersuchende Substanz verwendet wird, Glucoseoxidase als Bestandteilselement (Markierungsmittel) des Signalsubstanzerzeugers verwendet wird, und die Signaldetektion durch die Messung von periodischen Veränderungen der elektrischen Stromstärke bewirkt wird, wie auch eine Assayvorrichtung zur Verwendung in diesem Verfahren.
Ähnlich wie im Fall des Beispiels 1 wurde der Anti-hCG Antikörper HM21 als immobilisierter Antikörper in der Matrix (b) verwendet, und der Anti-hCG Antikörper HM81 wurde als Bestandteilselement des Signalsubstanzerzeugers verwendet. Das heißt, Glucoseoxidase-markierter HM81 Antikörper wurde als Signalsubstanzerzeuger verwendet. Im Hinblick auf die Matrix (b) wurden rechtwinklige Bereiche, ausgeschnitten aus einer porösen Zellulosenitrat/Zelluloseacetat-Mischungsmembran verwendet, an die der HM21 Antikörper angelagert und immobilisiert war, indem sie in derselben Weise, wie beschrieben in Beispiel 1, laminiert wurden.

(Beispiel 6)

Eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung wurde hergestellt, und hCG-Konzentrationen in Testproben wurden unter Verwendung der Vorrichtung gemessen.

(1) Herstellung von Anti-hCGα Antikörper-immobilisierter, poröser Membran und HRPO-immobilisierter, poröser Membran.

Eine Zellulosenitrat/Zelluloseacetat-Mischungsmembran mit einer Porengröße von 3,0 µm (Katalog Nr. SSWP 14200, Millipore Corp.) wurde in rechteckige Bereiche geschnitten (5 x 8 mm für jedes), und die so erzielten Bereiche wurden in ein Becherglas gestellt, der 50 ml einer 0,1%igen BSA/PBS-Lösung enthielt. Die Sektionen wurden für 60 Stunden bei 4ºC geschüttelt und dann auf 60ºC für 30 Minuten erhitzt, um BSA an den Membranbereichen zu immobilisieren. Daraufhin wurden die resultierenden Membranbereiche gewaschen, indem die BSA/PBS-Lösung durch PBS ersetzt wurde, und die Sektionen 1,5 Stunden oder mehr bei 4ºC geschüttelt wurden. Der Waschschritt wurde 5mal wiederholt, und die resultierenden Sektionen wurden getrocknet. Getrennt hiervon wurde monoklonaler Antikörper HM21 aus Mäusen (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die α-Kette von hCG erkennt, in PBS gelöst zu einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml. Jeder der getrockneten Membranbereiche, wie oben erhalten, wurde mit 15 µl der so hergestellten Antikörperlösung, und dann mit 15 µl einer 0,1%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd (GA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) imprägniert. Indem die so behandelten Sektionen getrocknet wurden, wurden Anti-hCGα Antikörper-immobilisierte, poröse Membranbereiche erhalten. Getrennt hiervon wurde jeder der oben erhaltenen, getrockneten Membranbereiche mit 15 µl einer PBS-Lösung, die 5 mg/ml HRPO (Toyobo Co., Ltd.) enthielt, und dann mit 15 µl einer 0,1%igen wäßrigen Lösung Glutaraldehyd (GA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) imprägniert. Indem die so behandelten Sektionen getrocknet wurden, wurden HRPO-immobilisierte, poröse Membranbereiche erhalten. Jeder der so erhaltenen Anti-hCGα Antikörper- immobilisierten HRPO-immobilisierten, porösen Membranbereiche wurde in ein 100 ml Becherglas gestellt, der 60 ml 0,1%ige Rinderserumalbumin(BSA)/PBS-Lösung enthielt, und für mindestens 15 Stunden bei 4ºC geschüttelt, um eine Blockierung zu bewirken. Daraufhin wurden die resultierenden Bereiche gewaschen, indem sie in einer 0,1%igen Tween 20/PBS-Lösung bei 4ºC geschüttelt wurden. Der Waschschritt wurde 4mal oder öfter wiederholt.

(2) Herstellung einer Matrix, indem 9 Schichten der Anti-hCGα Antikörper-immobilisierten, porösen Membranbereiche auf eine Elektrode geschichtet werden, die mit einer Schicht der HRPO- immobilisierten, porösen Membran bedeckt ist.

Eine Gesamtzahl von 9 Schichten der Anti-hCGα Antikörper- immobilisierten, porösen Membran wurde auf eine einzelne Schicht der HRPO-immobilisierten, porösen Membran, wie oben in Schritt (1) erhalten, aufgelagert, gefolgt von zusätzlichen Auflagerungen von 2 Schichten von 5 x 8 mm geschnittenen Sektionen von Filterpapier (Nr. 54, Whatman Corp.) auf die oberste Schicht der Anti-hCGα Antikörper-immobilisierten porösen Membran, um ein Laminat aus 12 Schichten zu erhalten. Das so erhaltene Laminat wurde auf der Detektionsvorrichtung (c) (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 1 (2) derartig angeordnet, daß das Laminat sowohl die Silber/Silberchloridlinie als auch die Kohlenstofflinie bedeckte. Danach wurde eine Acrylplatte, die ein Probeneinführungsloch (3 mm im Durchmesser) enthielt, auf das Laminat aufgelagert, um eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung zur Verwendung für die Messung der hCG-Konzentration zu vervollständigen. In diesem Fall wurde das Loch für die Probeneinführungsverwendung direkt über der obersten Filterpapierschicht des Laminats angeordnet, und die Acrylplatte wurde derartig angeordnet, daß sie eine Entfernung von 1.800 µm von der Oberfläche der Elektrode während der Messung einhielt. Diese Vorrichtung ähnelte der Art, wie dargestellt in Figur 9 (1).

(3) Messung

Die spezifische Bindungs-Assayvorrichtung, wie hergestellt im obigen Schritt (2), wurde mit der notwendigen Meßausrüstung verbunden, wie z. B. einem Potentiostaten oder ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), unter Verwendung der Kohlenstofflinienseite als Arbeitselektrode und der Silber/Silberchloridlinienseite als Gegen/Referenzelektrode.
Jede der vier Testproben, die verschiedene Mengen von hCG enthielten, wurde mit demselben Volumen einer GOD-HM81-Lösung gemischt, die auf eine auf Antikörper-basierende Konzentration von 4 µg/ml eingestellt war, unter Verwendung eines 100 mM Natriumchlorid/0,1-molarem Phosphatpuffers (pH 7,0), supplementiert mit 0,1% BSA (PB zur Reaktionsverwendung). Auf diese Weise wurde eine Lösung (A) mit einer hCG-Konzentration von 0 IU/l, eine Lösung (B) mit einer hCG-Konzentration von 10 IU/l, eine Lösung (C) mit einer hCG-Konzentration von 100 IU/l und einer Lösung (D) mit einer hCG-Konzentration von 1.000 IU/l hergestellt, wobei jede Lösung 2,0 µg/ml GOD-HM81 in auf Antikörper-basierender Endkonzentration enthielt.
Getrennt hiervon wurde die folgende wäßrige Hydrochinon- Glucoselösung (HQ-Glucoselösung) hergestellt. In diesem Fall wurde die 100 mM Glucoselösung in einem Kühlschrank für mindestens 48 Stunden vor ihrer Verwendung gelagert.

(HQ-Glucoselösung)

0,5 mM Hydrochinon (Wako Pure Chemical Industries)
100 mM Glucose
0,1 % BSA
100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
100 mM Natriumchlorid
Ein 50 µl-Teil der so hergestellten HQ-Glucoselösung wurde in die spezifische Bindungs-Assayvorrichtung durch das Probeneinführungsloch der Acrylplatte eingeführt. Sobald das Ruhe- Potential der Arbeitselektrode stabil wurde (ungefähr 2 Minuten nach der Einführung der HQ-Glucoselösung) wurde ein elektrisches Potential von -200 mV an die Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, um die elektrische Stromstärke zu messen. Eine Minute nach Einstellung des elektrischen Potentials wurde ein 10 µl Teil von jeder der Lösungen (A), (B), (C) und (D) in die Probeneinführungsvorrichtung durch das Probeneinführungsloch der Acrylplatte der spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung eingeführt, und die Aufzeichnung der elektrischen Stromstärke wurde fortgesetzt, um den Unterschied in den elektrischen Stromstärken, gemessen nach 3 Minuten und 9 Minuten nach der Probeneinführung, zu kalkulieren.

(4) Ergebnisse

Veränderungen in der elektrischen Stromstärke pro Minute wurden aus dem Unterschied in der elektrischen Stromstärke, gemessen nach 3 Minuten und 9 Minuten nach der Probeneinführung, kalkuliert, mit den Ergebnissen wie dargestellt in Tabelle 6. Wie in der Tabelle gezeigt, wurde das Veränderungsverhältnis der elektrischen Stromstärke gering in Abhängigkeit von der Konzentration von hCG. Es scheint wahrscheinlich, daß die Häufigkeit des in dem oberen Bereich der vielschichtigen Matrix festgehaltenen markierten Antikörpers sehr groß wird, mit einer Zunahme der hCG-Konzentration als Ergebnis der spezifischen Bindungsreaktion, was zu einer Verlagerung der Markerverteilung zur oberen Seite der Matrix führt. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, daß eine quantitative Bestimmung der Konzentration von hCG in einer Testprobe einfach und schnell durch die Verwendung der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann. Tabelle 6 Beziehung zwischen der hCG-Konzentration in der Reaktionslösung und dem Veränderungsverhältnis der elektrischen Stromstärke
Im weiteren wird die Anwendung von feinen Partikeln auf einen spezifischen Bindungssubstanz-immobilisierten Träger beschrieben als anderes Beispiel des Verfahrens zur Matrixherstellung gemäß der vorliegenden Erfindung.

(Beispiel 7)

Rinderserumalbumin (BSA)-immobilisierte Feinpartikel und Anti- C-reaktives Protein (CRP) Antikörper-immobilisierte Feinpartikel wurden als Beispiele für Antigenimmobilisierung bzw. Antikörperimmobilisierung hergestellt, und eine Matrix für die Verwendung in der spezifischen Bindungsreaktion wurde hergestellt

(1) Herstellung von BSA-immobilisierten und Anti-CRP Antikörper-immobilisierten Feinpartikeln

Ein 4,28 g-Teil Natriumperiodat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurde in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf 4ºC abgekühlt. Ein 1,0 g-Teil von kristalliner Zellulose mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 6 µm (AVICEL PH-M06, Asahi Chemical Industry Co., Led.) wurde in der obigen Lösung suspendiert und vorsichtig für 16 Stunden bei 4ºC im Dunkeln gerührt. Die resultierende Suspension wurde einer Lösung zugefügt, die hergestellt worden war, indem 1,5 g Ethylenglykol (Wako Chemical Industries, Ltd.) in 100 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, und die resultierende Mischung wurde bei 4ºC 1 Stunde gerührt. Daraufhin wurden die so behandelten Zellulosepartikel auf einem Glasfilter durch Saugfiltration gewonnen, und mindestens 8mal mit 1 mM Acetatpuffer (pH 4,4) gewaschen und dann in demselben Puffer zu einer Konzentration von 100 mg Avicel/ml resuspendiert.
Jede Lösung BSA (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) und Kaninchenantimenschlicher CRP Antikörper (erhältlich von Nippon Bio- Test Laboratories, Inc.) wurden vollständig gegen 1 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,4) dialysiert. Jede wie oben behandelte kristalline Zellulose und eine nicht-behandelte kristalline Zellulosepräparation, beide in 1 mM Acetatpuffer (pH 4,4) suspendiert, wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen, gerührt und dann mit der BSA-Lösung oder der Anti-CRP- Antikörperlösung gemischt, um die folgenden Suspensionen A bis L herzustellen.
(CRP Ab*, Anti-CRP Antikörper)
Jede der so hergestellten Suspensionen wurde bei 4ºC 5 Stunden geschüttelt, und dann mit 1/20 Volumen von 0,2 M Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) gemischt. Nach 1 Stunde Schütteln bei 4ºC wurde die so behandelte Suspension einer Zentrifugation unterzogen, und die Absorption (280 nm) der resultierenden Überstandsflüssigkeit wurde gemessen, um die Menge von Restprotein zu kalkulieren. Die präzipitierten Zellulosepartikel aus der Zentrifugation wurden gewaschen, indem sie in PBS resuspendiert wurden, und die Suspension einer Zentrifugation unterzogen wurde. Der Waschschritt wurde mindestens 5mal wiederholt. Danach wurden die Suspensionen A und K als BSA-immobilisierte Feinpartikel ausgewählt, bzw. als Anti-CRP Antikörper- immobilisierte Feinpartikel und aus jeder der zwei Präparationen wurde eine 50%ige kristalline Zellulose/10% Gelatine/PBS- Lösung hergestellt.

2) Ergebnisse

Der Unterschied zwischen der Menge des ursprünglich zugefügten BSA oder Anti-CRP Antikörpers und der Menge des Restproteins in der Überstandsflüssigkeit, gemessen in obigem Schritt (1), wurde als Menge des Proteins, gebunden an kristalline Zellulose, verwendet. Tabelle 7 zeigt die tatsächliche Menge von gebundenem Protein, die als Unterschied zwischen der Menge von an die behandelte kristalline Zellulose gebundenem Protein und die Menge an die unbehandelte kristalline Zellulose von gebundenem Protein ausgedrückt ist. Tabelle 7 Menge von an kristalline Zellulose gebundenem Protein

(3) Herstellung einer Matrix für die Verwendung in der spezifischen Bindungsreaktion, unter Verwendung von BSA-immobilisierten Feinpartikeln

Ein 0,8 µl-Teil der BSA-immobilisierten Feinpartikellösung mit einer Zusammensetzung von Ultraschall-behandelter 50%iger kristalliner Zellulose/10% Gelatine/PBS wurde vollständig mit 0,2 ml einer wäßrigen 10%igen Glycerinlösung gemischt. Die so hergestellte Mischung wurde in eine Vertiefung gegossen, die auf einer horizontal gehaltenen Elektrodenbasis angeordnet war, und einem Exsikkator getrocknet, um eine Matrix zur Verwendung in der spezifischen Bindungsreaktion zu erhalten.

(Beispiel 8)

Als anderes Beispiel des spezifischen Bindungs-Assayverfahrens und -vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird folgendes Assayverfahren beschrieben, bei dem hCG als zu untersuchende Substanz, Meerrettich-Peroxidase als Bestandteilselement (Markierungsmittel) des Signalsubstanzerzeugers verwendet wird, und die Signaldetektion durch Messung der elektrischen Stromstärke bewirkt wird, wie auch eine Assayvorrichtung zur Verwendung in dem Verfahren.
Ähnlich wie im Fall von Beispiel 1, wurde der Anti-hCG Antikörper HM21 als immobilisierter Antikörper in der Matrix (b) verwendet wurde, und der Anti-hCG Antikörper HM81 wurde als Betandteil des Signalsubstanzerzeugers verwendet. Das heißt, Meerrettich-Peroxidase-markierter HM81 Antikörper wurde als Signalsubstanzerzeuger verwendet. Im Hinblick auf die Matrix (b) wurde auf eine einzelne Schicht eines kreisförmigen Ausschnitts eines porösen Membranträgers verwendet, an den HM21 Antikörper gebunden und immobilisiert war.
Eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung wurde hergestellt, und hCG-Konzentrationen in Testproben wurden unter Verwendung dieser Vorrichtung gemessen.
Figur 22 zeigt ein Anordnungsdiagramm der spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung 1, wie verwendet in diesem Beispiel. In dieser Vorrichtung verläuft, wie angedeutet durch Pfeile, die Permeationsrichtung einer flüssigen Testprobe vertikal in der Probeneinführungsvorrichtung (a), wird jedoch horizontal auf der Matrix (b), aufgrund von Flüssigkeits-undurchlässigen Versiegelungsmitteln 28, die auf der Oberfläche der Absorptionsvorrichtung (d) angeordnet sind. Zusätzlich sind die Elektrodenteile, die als Detektionsvorrichtung (c) verwendet werden, auf der Peripherie der oberen und unteren Oberflächen von Kommunikationsmitteln 23 als Gegen/Referenzelektrode angeordnet, bzw. als Arbeitselektrode. Aufgrund dieser Tatsache kann die Verteilung einer spezifischen Bindungsreaktion in seitlicher Richtung in der Matrix (b) gemessen werden, die unter den Kommunikationsmitteln 23 angeordnet ist, und einen größeren Durchmesser als die Kommunikationsmitteld 23 aufweist.
Im folgenden wird diese Vorrichtung im Detail beschrieben. Jedoch ist die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf die im folgenden beschriebene Struktur begrenzt, und jede andere Struktur ist anwendbar, vorausgesetzt, daß sie die eben beschriebenen Probenflußrichtungen aufweist, die spezifische Bindungsreaktionsverteilung und die Elektrodenanordnung.
Die Assayvorrichtung, wie dargestellt in Figur 22, enthält, von der stromaufwärts gelegenen Seite zur stromabwärts gelegenen Seite, eine obere Platte 22 mit einem Probeneinführungsloch 21, eine Probeneinführungsvorrichtung (a), die aus Filterpapier oder ähnlichem besteht und eine Detektionsvorrichtung (c). Die Detektionsvorrichtung (c) weist eine Durchbohrung 29 in Richtung des Probenflusses auf, eine Gegen/Referenzelektrode 24 ist entlang der Peripherie der oberen Oberfläche der Durchbohrung 29 angeordnet, und eine Arbeitselektrode 25 ist entlang der Peripherie der unteren Oberfläche der Durchbohrung 29 angeordnet. Unter Verwendung eines Referenzelektrodenendes 26 kann die Gegen/Referenzelektrode 24 elektrisch mit einem externen Meßinstrument verbunden werden, das in der Zeichnung nicht dargestellt ist. Die Arbeitselektrode 25 kann ebenfalls in gleicher Weise unter Verwendung eines Arbeitselektrodenendes 27 verbunden werden.
Die Innenseite der Durchbohrung 29 wird durch ein Verbindungsmittel 23, bestehend aus Filterpapier und ähnlichem, verbunden, als Ort für eine Flüssigpermeation von der Probeneinführungsvorrichtung (a) zur Matrix (b), die genau unterhalb der Durchbohrung 29 angeordnet ist. Die Matrix (b) weist einen Durchmesser auf, der größer ist als der der Durchbohrung 29 und besteht aus einer Membran und ähnlichem, an die Antikörpermoleküle immobilisiert sind. Noch weiter stromabwärts von der Matrix (b) ist eine Absorptionsvorrichtung (d) angeordnet, auf der flüssigkeitsundurchlässige Versiegelungsmittel 28 angeordnet sind. Die Versiegelungsmittel 28 weisen einen Durchmesser auf, der größer ist als der der Durchbohrung 29 aber geringer als der der Matrix (b). Der niedrigste Teil der Assayvorrichtung wird durch einen Träger (e) gehalten.
Figur 23 (A) ist ein perspektivisches Diagramm, das die Bedingungen der spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung von Figur 22 zur Zeit der Messung zeigen, und Figur 23 (B) ist eine Teilansicht der Vorrichtung.

(1) Herstellung eines Konjugats aus Anti-hCGβ Antikörper und Meerrettich-Peroxidase (markierter Antikörper).

Monoklonaler Antikörper HM81 aus Mäusen (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die β-Kette von hCG erkennt, wurde in einer Pufferlösung gelöst, die aus 100 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA und 60 mM Triethanolamin (pH 8,0, TEA-Puffer) bestand, zu einer Endkonzentration von 8,3 mg/ml, und die resultierende Lösung wurde vollständig gegen den TEA-Puffer dialysiert, der mit Stickstoffgas gereinigt worden war. Ein 61 µl-Teil von 50 mM 2-Iminothiolanhydrochlorid (Pierce Chemical Company)-Lösung wurde zu 1,1 ml der so präparierten Antikörperlösung hinzugefügt, und die Mischung wurde gerührt, und dann ließ man sie für 1,5 Stunden bei 4ºC in einer Stickstoffatmosphäre stillstehen. Daraufhin wurde die resultierende Lösung vollständig gegen eine 100 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) dialysiert, die 100 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (EDTA-PB) enthielt, das mit Stickstoffgas gereinigt worden war. Auf diesem Wege wurde Anti-hCGβ Antikörper HM81 mit eingeführten SH-Gruppen erhalten.
Meerrettich-Peroxidase (HRPO, Toyobo Co., Ltd.) wurde in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml gelöst. Unter Rühren bei 30ºC wurden 500 µl der so hergestellten Enzymlösung mit 500 µl 50 mM Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Company) gemischt. Nach 20 Minuten der Reaktion bei 30ºC ließ man die resultierende Reaktionsmischung durch eine Sephadex G-25 (Pharmacia K. K.)-Säule (2,6 x 15 cm Durchmesser) passieren, die mit Stickstoffgas gereinigt worden war, um Sulfo-SMCC zu entfernen, das nicht reagiert hatte, und dann unter Verwendung eines Konzentrator (CENTRIPREP -10, Amicon Corp.) konzentriert, um maleimidiertes HRPO zu erhalten. Die Konzentration des maleimidierten HRPOs wurde basierend auf der Absorption bei 403 nm bestimmt.
Eine Lösung des maleimidierten HRPOs (1,25 x 10&supmin;&sup8; Mol oder 1,56 x 10&supmin;&sup8; Mol) wurde mit der HS-Gruppen-eingeführten HM81 Antikörperlösung gemischt (3mal oder 1/3mal im molaren Verhältnis), und die Mischung wurde bei 4ºC 12 Stunden in einer Stickstoffgasatmosphäre inkubiert. Nach der Reaktion wurden 50 µl 50 mM Cysteaminlösung zu jeder der Reaktionsmischungen hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 4ºC 60 Minuten in einer Stickstoffatmosphäre fortgeführt. Danach wurde die resultierende Reaktionsmischung einer Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer ULTROGEL AcA34 (IBF Biotechniques)- Säule unterzogen, die mit EDTA-PB equilibriert worden war, gereinigt mit Stickstoff.
Jede der so eluierten Fraktionen wurde auf ihre Absorptionen bei 280 nm und 403 nm geprüft, um Fraktionen zu sammeln und zu konzentrieren, die das HM81/HRPO-verbundene Produkt, aber keine freien Enzymmoleküle enthielten. Die so konzentrierte Präparation des verbundenen Produkts (im weiteren bezeichnet als "HRPO-HM81") wurde auf ihr Molekulargewicht durch eine Phast- Systemelektrophorese (Pharmacia K. K.) überprüft und als Signalsubstanzerzeuger in Meßexperimenten verwendet.

(2) Herstellung eines Anti-hCGα Antikörper-immobilisierten porösen Films

Eine Gesamtmenge von 200 kreisförmigen Stücken (13 mm im Durchmesser) einer porösen Membran (Zelluloseacetat/Zellulosenitrat) mit einer Porengröße von 8,0 µm (Katalog Nr. SCWP01300, Nippon Millipore Kogyo Co., Ltd.) wurde in ein Becherglas gesetzt, gefüllt mit 200 ml einer PBS-Lösung, die 1,0 % (w/v) Rindergammaglobulin (Ca. Nr. G7516, Sigma Chemical Co.) enthielt und auf 60ºC für 2 Stunden unter vorsichtigem Rühren erhitzt. Nachdem die Überstandsflüssigkeit entfernt worden war, und außerdem die restliche Flüssigkeit durch Zug entfernt worden war, wurden die so behandelten kreisförmigen Stücke gewaschen, indem sie in einem ausreichenden Volumen PBS gerührt wurden, und dann das verwendete PBS entfernt wurde. Der Waschschritt mit PBS wurde 2mal wiederholt, und die gewaschenen Stücke wurden mit destilliertem Wasser weitere 7mal gewaschen. Nach Abschluß der Waschschritte wurden die kreisförmigen Stücke in 200 ml 1%ige wäßrige Glutaraldehyd-Lösung gelegt, und bei 25ºC für 3 Stunden unter leichtem Rühren inkubiert.
Nach der Reaktion wurden die so behandelten kreisförmigen Stücke der porösen Membran mit destilliertem Wasser 10mal gewaschen und dann auf einer Glasplatte jeweils einzeln angeordnet, um sie zu trocknen. Getrennt davon wurde monoklonaler Antikörper HM21 aus Mäusen (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), der die α-Kette von hCG erkennt, in einer Lösung gelöst, die 0,05 M Natriumbicarbonat und 0,05 M Natriumchlorid enthielt, zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml. Jedes Stück (13 mm im Durchmesser) der porösen Membran wurde auf einer Glasplatte getrocknet und mit 25 µl der gerade hergestellten Antikörperlösung vom Zentralbereich des kreisförmigen Stückes imprägniert. Nach 1 Stunde der Reaktion bei Raumtemperatur wurden die resultierenden kreisförmigen Stücke der porösen Membran in 200 ml 0,2%ige Rinderserumalbumin (BSA)/PBS-Lösung gelegt und bei 4ºC für 2 Tage geschüttelt, um eine Blockierung zu bewirken. Daraufhin wurden die 50 behandelten Stücke 3mal mit einer 0,1%igen Tween 20/PBS-Lösung gewaschen und dann 7mal mit PBS, um eine Anti-hCGα Antikörper (HM21)-immobilisierte poröse Membran zu erhalten.

(3) Herstellung einer Detektionsvorrichtung (Elektrode)

Sowohl auf der Frontseite als auch auf der Rückseite einer transparenten Vinylchloridplatte (40 mm in der Länge, 20 mm in der Breite und 0,3 mm in der Dicke) wurde ein kreisförmiger Bereich (6 mm im Durchmesser) gedruckt und eine Elektrodenendlinie (1,5 mm in der Breite), verbunden mit dem kreisförmigen Bereich unter Verwendung einer leitenden Kohlenstofftinte (Electrodag 109, erhältlich von Acheson Japan, Ltd.). In diesem Fall wurden der kreisförmige Bereich mit einem Durchmesser von 6 mm auf der Frontseite und der andere kreisförmige Bereich auf der Rückseite an derselben Stelle der Vinylchloridplatte gedruckt (siehe Figur 22). Auf den kreisförmigen Bereich der Frontseite wurde weiterhin eine leitfähige Silbertinte gedruckt (Fujikura Kasei Co., Ltd.). Daraufhin wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm im Zentrum des kreisförmigen Bereichs unter Verwendung eines Bohrers hergestellt, damit es als Durchbohrung verwendet werden kann und die Ringzonen, die sowohl auf der Frontseite als auch auf der Rückseite in den kreisförmigen Bereichen nach dem Bohren übrigblieben, wurden als leitende Teile verwendet. Nach dem Bohren wurde bestätigt, daß der leitende Bereich auf der Frontseite und der leitende Bereich auf der Rückseite elektrisch unabhängig voneinander waren. Daraufhin wurde der mit leitfähiger Silbertinte überzogene Bereich 2 Stunden einer Elektrolyse in 0,1 M wäßriger Natriumchlorid-Lösung (+1,0 V gegen Silber/Silberchloridelektrode) unterzogen, um eine Silberchloridschicht auf der Oberfläche zu bilden. Die Frontseiten und Rückseitenbereiche der Kunststoffplatte wurden versiegelt, indem sie mit einem Haftband verklebt wurden (Sumitomo 3M Co., Ltd.), ausschließlich der Ringzonen und der Endlinien. Von den exponierten Ringzonen wurde die Frontseitenringzone, die mit einer Silber/Silberchloridschicht laminiert war, als Gegen/Referenzelektrode verwendet, und die andere Ringzone, die nur aus dem leitenden Kohlenstoff bestand, wurde als Arbeitselektrode verwendet. Die so hergestellte Arbeitselektrode wurde als Detektionsvorrichtung in Meßexperimenten verwendet.

(4) Herstellung einer spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung, mit einer Probeneinführungsvorrichtung und einer Absorptionsmatrix, in der eine einzelne Schicht der Anti-hCGα Antikörper-

immobilisierten, porösen Membran unter der Arbeitselektrode angeordnet ist (siehe Figur 22).

Zwei ringförmige Stücke mit einem Durchmesser von 12 mm wurden aus einem chromatographischen Filterpapier (17 Chr, Whatman Corp.) ausgestanzt und als Absorptionsvorrichtung auf einen unteren Träger, bestehend aus Acrylatharz, aufgelagert. An dem zentralen Bereich der Oberfläche der oberen Schicht der kreisförmigen Filterpapiere wurde ein Siegel mit einem Durchmesser von 6 mm aufgebracht, das hergestellt wurde, indem ein Haftband (Sumitomo 3M Co., Ltd.) ausgestanzt wurde. Ein kreisförmiges Stück (13 mm im Durchmesser) der Anti-hCGα Antikörper (HM21)-immobilisierten, porösen Membran, wie hergestellt in Beispiel 8 (2), wurde getrocknet und auf den Zentralbereich der Absorptionsvorrichtung (Filterpapier), die mit einer Versiegelung ausgestattet war, aufgelagert, und die poröse Membran wurde als Matrixbereich verwendet. Die Detektionsvorrichtung (Elektrode), wie hergestellt in Beispiel 8 (3), deren Silber/Silberchloridelektroden-enthaltende Seite die obere Seite war, wurde auf den Matrixbereich derartig aufgelagert, daß der zentrale Punkt der 3 mm Durchmesser-Durchbohrung der Detektionsvorrichtung mit dem der kreisförmigen porösen Membran des Matrixbereiches übereinstimmte. Ein kreisförmiges Stück mit einem Durchmesser von 3 mm wurde aus einem Glasfaserfilterpapier (GF75, Advantech Toyo Co., Ltd.) ausgestanzt und in die Durchbohrung der Elektrode zur Verwendung als Kommunikationsmittel eingeführt. Ein kreisförmiges Stück mit einem Durchmesser von 12 mm wurde aus einem Glasfaserfilterpapier (GA200, Advantech Toyo Co., Ltd.) ausgestanzt und als Probeneinführungsvorrichtung derartig auf die Elektrode aufgelagert, daß der zentrale Punkt des kreisförmigen Stückes mit dem der Durchbohrung der Elektrode übereinstimmte. Auf die so hergestellte Probeneinführungsvorrichtung wurde weiterhin eine obere Platte (5 mm in Dicke), bestehend aus einem Acrylharz mit einem Probeneinführungsloch (4 mm im Durchmesser) derartig aufgelagert, daß der zentrale Punkt des Probeneinführungsloches mit dem der kreisförmigen Probeneinführungsvorrichtung (Filterpapier) übereinstimmte. Auf diesem Wege wurde eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung zur Verwendung in der Messung der hCG-Konzentration hergestellt (siehe Figuren 22 und 23). In diesem Fall wurde die Entfernung zwischen der unteren Oberfläche der oberen Platte und der oberen Oberfläche des unteren Trägers auf 3.200 µm eingestellt. Diese Vorrichtung ist ähnlich der Art, wie dargestellt in Figur 9 (1).

(5) Messung

Die so hergestellte Assayvorrichtung wurde mit den notwendigen Meßeinrichtungen verbunden, wie z. B. einem Potentiostaten und ähnlichem, wie beschrieben in Beispiel 1 (6), unter Verwendung der Kohlenstoffringseite als Arbeitselektrode und der Silber/ Silberchloridringseite als Gegen/Referenzelektrode.
Jede der fünf Testproben, die verschiedene Mengen von hCG enthielten, wurden mit demselben Volumen einer HRPO-HM81-Lösung gemischt, die auf einer auf Antikörper-basierenden Konzentration von 0,1 µm/ml eingestellt war, unter Verwendung eines 100 mM Natriumchlorid/0,1 M Phosphatpuffers (pH 6,0), supplementiert mit 0,1% BSA (PB zur Reaktionsverwendung). Ein 285 µl- Teil der so hergestellten Mischungslösung wurde vollständig mit 12,5 µl einer 2,5 mmolaren p-Benzochinonlösung gemischt, die unter Verwendung von 100 mM Natriumchlorid/0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) hergestellt worden war, und weiterhin mit 12,5 µl von ungefähr 0,25 M Wasserstoffperoxidlösung, hergestellt unter Verwendung von 100 mM Natriumchlorid/0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0). Auf diesem Wege wurde eine Lösung (A) mit einer hCG-Konzentration von 0 IU/l, eine Lösung (B) mit einer hCG- Konzentration von 1 IU/l, eine Lösung (C) mit einer hCG- Konzentration von 10 IU/l und eine Lösung (D) mit einer hCG- Konzentration von 100 IU/l und eine Lösung (E) mit einer hCG- Konzentration von 1000 IU/l hergestellt, wobei jede Lösung 0,046 µg/ml der HRPO-HM81 auf Antikörpern basierenden Konzentration enthielt, 100 µM p-Benzochinon und ungefähr 10 mM Wasserstoffperoxid.
Ein 260 µl-Teil von jeder dieser Lösungen (A), (B), (C), (D) und (E) wurde in die Probeneinführungsvorrichtung durch das Prdbeneinführungsloch der oberen Acrylplatte der spezifischen Bindungs-Assayvorrichtung eingeführt (aufgetüpfelt). Sobald die Testprobe in die Matrix permeiert war und weiter in die Wasserabsorptionsmatrix (1 Minute nach der Probeneinführung) wurde ein elektrisches Potential von -200 mV an der Arbeitselektrode angelegt, basierend auf der Gegen/Referenzelektrode, um die elektrische Stromstärke zu messen.

(6) Ergebnisse

Tabelle 8 zeigt Veränderungen der elektrischen Stromstärken 3 Minuten nach der Anlegung des elektrischen Potentials an der Arbeitselektrode. Die elektrische Stromstärke nahm zu mit der Konzentration von hCG. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, daß die quantitative Bestimmung der Konzentration von hCG in einer Testprobe einfach und schnell durch die Verwendung der Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann. Tabelle 8 Beziehung zwischen der hCG-Konzentration in der Reaktionslösung und der gemessenen elektrischen Stromstärke
So ist es offensichtlich, daß, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren für allgemeine Zwecke zur Verfügung gestellt wird, das nützlich ist für einen schnellen qualitativen oder quantitativen Assay, das ein homogenes Verfahren ist, basierend auf dem Prinzip des spezifischen Bindungsassays, das aber nicht einen Schritt für eine Trennung von den Substanzen benötigt, die nicht reagiert haben, sowie eine spezifische Bindungs-Assayvorrichtung, die geeignet ist für die Praxis des Verfahrens.
Das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann für verschiedene spezifische Bindungsreaktionen verwendet werden, einschließlich der Sandwich-artigen Reaktion, der Kompetitionsreaktion und ähnlichen, unabhängig von den Eigenschaften der Testproben und den Eigenschaften der zu untersuchenden Substanzen, wie z. B. Molekulargewicht und ähnliches, und eine Beurteilung der Ergebnisse kann basierend auf einer Farbreaktion, einer Fluoreszenzreaktion, einer Lumineszenzreaktion, einer elektrochemischen Reaktion und ähnlichen bewirkt werden. Das heißt, daß das Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für verschiedene Assayarten anwendbar ist, da die Ergebnisse durch visuelle Beobachtung oder unter Verwendung von geeigneten externen Meßinstrumenten nachgewiesen oder gemessen werden können, entsprechend der Eigenschaft des erzeugten Signals.
Zusätzlich kann die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung jede gewünschte Art annehmen, die geeignet ist für den Zweck von jeder Messung, so wie Minimierung ihrer Größe, da die erfindungsgemäße Assayvorrichtung nicht durch Form und Größe ihrer Matrix und Anordnung ihrer Detektionsvorrichtung begrenzt ist. Demzufolge kann die Assayvorrichtung sogar dann verwendet werden, wenn eine Testprobe nur in geringer Quantität vorhanden ist. Zusätzlich kann die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung als Wegwerfvorrichtung verwendet werden, da sie einfach mit einem externen Meßinstrument verbunden und wieder davon gelöst werden kann.

Claims

1. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay, bei dem eine zu untersuchende Substanz in einer Testprobe qualitativ oder quantitativ durch mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit einer spezifischen Bindungssubstanz bestimmt wird, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Einführung einer Testprobe, die die zu untersuchende Substanz vermutlich enthält, in eine Matrix,

(2) Bildung einer Verteilung eines Signalsubstanzerzeugers in der Matrix durch eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit der spezifischen Bindungssubstanz,

(3) Erzeugung einer Signalsubstanz von dem Signalsubstanzerzeuger, der die Verteilung bildet,

(4) Diffusion der Signalsubstanz von dem Signalsubstanzerzeuger zu einer Detektionsvorrichtung,

(5) und Messung der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix als Grad der Signalmodulation an der Detektionsvorrichtung über eine Signalsubstanz, die direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das nur an der Detektionsvorrichtung nachweisbar ist.

2. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay, bei dem eine zu untersuchende Substanz in einer Testprobe qualitativ oder quantitativ durch mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit einer spezifischen Bindungssubstanz bestimmt wird, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Einführung einer flüssigen Testprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, in eine Matrix, wo die zu untersuchende Substanz entwickelt wird, worin man (a) die zu untersuchende Substanz, mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz in der Matrix reagieren läßt oder (b) die zu untersuchende Substanz, mit der ersten spezifischen Bindungssubstanz auf der Außenseite der Matrix vor der Einführung der Testprobe in die Matrix reagieren läßt,

(2) daß man einem Signalsubstanzerzeuger, basierend auf der obigen spezifischen Bindungsreaktion, eine Verteilung in der Matrix ermöglicht, wobei der Signalsubstanzerzeuger eine zweite spezifische Bindungssubstanz für die zu untersuchende Substanz ist oder eine Substanz, die mit der zu untersuchenden Substanz um die erste spezifische Bindungssubstanz kompetitiert und eine Signalsubstanz erzeugt, die direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das nur an der Detektionsvorrichtung nachweisbar ist und

(3) Nachweis von Veränderungen in der Verteilung in Abhängigkeit von der Menge der zu untersuchenden Substanz an der Detektionsvorrichtung als eine Modulation des Signals, das durch den Massetransfer der von dem Signalsubstanzerzeuger erzeugten Signalsubstanz in seiner Geschwindigkeit begrenzt ist.

3. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay, bei dem eine zu untersuchende Substanz in einer Testprobe qualitativ oder quantitativ durch mindestens eine spezifische Bindungsreaktion der zu untersuchenden Substanz mit einer spezifischen Bindungssubstanz bestimmt wird, die spezifisch an die zu untersuchende Substanz bindet, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Einführung einer flüssigen Testprobe, die vermutlich die zu untersuchende Substanz enthält, in eine Matrix, wo die zu untersuchende Substanz entwickelt wird, worin (a) man die zu untersuchende Substanz in der Matrix mit einer Substanz reagieren läßt, die mit der zu untersuchenden Substanz um eine spezifische Bindungssubstanz, kompetitiert, in Wettstreit um einen Signalsubstanzerzeuger, der eine spezifische Bindungssubstanz ist und eine Signalsubstanz erzeugt, die direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das nur an einer Detektionsvorrichtung nachweisbar ist oder (b) Einführung der Testprobe in die Matrix, nachdem man der zu untersuchenden Substanz ermöglicht hat, an der Außenseite der Matrix mit einer Substanz zu reagieren, die mit der zu untersuchenden Substanz um eine spezifische Bindungssubstanz kompetitiert, in Wettstreit um einen Signalsubstanzerzeuger, der eine spezifische Bindungssubstanz ist und eine Signalsubstanz erzeugt, die direkt oder indirekt ein Signal erzeugt, das nur an einer Detektionsvorrichtung nachweisbar ist,

(2) daß man dem Signalsubstanzerzeuger ermöglicht, sich in der Matrix, basierend auf der obigen spezifischen Bindungsreaktion, zu verteilen und

(3) Nachweis von Veränderungen in der Verteilung in Abhängigkeit von der Menge der zu untersuchenden Substanz an der Detektionsvorrichtung als Modulation des Signals, das durch den Massetransfer der Signalsubstanz, die von dem Signalsubstanzerzeuger erzeugt wurde, in seiner Geschwindigkeit begrenzt ist.

4. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Signal eine Elektronenübertragung ist.

5. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 4, wobei die Messung durch eine Messung der Quantität von Elektrizität oder Strom durchgeführt wird.

6. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Signal eine Färbung, Fluoresenz oder Lumineszenz ist.

7. Verfahren für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Signalsubstanzerzeuger ein Enzym enthält.

8. Elektrochemische, spezifische Bindungsassayvorrichtung zur Messung der Menge einer zu untersuchenden Substanz in einer flüssigen Testprobe, die eine Probeneinführungsvorrichtung enthält (a), eine Matrix (b), eine Detektionsvorrichtung (c), die fähig ist, eine Veränderung in der Verteilung des Signalsubstanzerzeugers in der Matrix als ein Signal nachzuweisen, das durch den Massetransfer der von dem Signalsubstanzerzeuger erzeugten Signalsubstanz in seiner Geschwindigkeit begrenzt und, falls nötig, eine Absorptionsvorrichtung (d).

9. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 8, wobei eine Vorrichtung für die Einführung einer Probe (a), eine Matrix (b), eine Detektionsvorrichtung (c) und, falls nötig, eine Absorptionsvorrichtung (d) in dieser Reihenfolge angeordnet sind, beginnend von der stromaufwärts gelegenen Seite der Flußrichtung einer Testprobe, die voraussichtlich eine zu untersuchende Substanz enthält und wobei mindestens eine Substanz, die an der Erzeugung einer Signalsubstanz beteiligt ist, in mindestens der Vorrichtung zur Probeneinführung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d), die - falls nötig - angeordnet ist, enthalten ist.

10. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 9, wobei die Substanz, die an der Erzeugung der Signalsubstanz beteiligt ist, in der Nachbarschaft der Detektionsvorrichtung (c) und/oder in der Absorptionsvorrichtung (d) enthalten ist.

11. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Matrix (b) aus einem porösen Material besteht.

12. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Matrix (b) ein Material enthält, das in den Zustand eines Gels oder Sols übergeht, wenn eine Testprobe absorbiert wird.

13. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Matrix (b) ein laminiertes Material ist.

14. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Matrix (b) die spezifische Bindungssubstanz enthält, die spezifisch für die zu untersuchende Substanz ist.

15. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 14, wobei die spezifische Bindungssubstanz in der Matrix (b) immobilisiert ist.

16. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei die spezifische Bindungssubstanz mit einem Konzentrationsgradienten verteilt ist.

17. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 16, wobei ein Signalsubstanzerzeuger in der Vorrichtung zur Probeneinführung (a) und/oder in einem stromaufwärts gelegenen Bereich der Matrix (b) angeordnet ist.

18. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 17, wobei die Detektionsvorrichtung (c) ein Elektrodenpaar ist.

19. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 18, wobei die Substanz, die an der Erzeugung der Signalsubstanz beteiligt ist, in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) enthalten ist, ein Substrat als Vorläufer der Signalsubstanz ist.

20. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß Anspruch 18, wobei die Substanz, die an der Erzeugung der Signalsubstanz beteiligt ist, in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) enthalten ist, ein Substrat einer Enzymreaktion und/oder ein Elektronenüberträger ist.

21. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 17, bei dem, wenn dies verwendet wird, ein Signal als Ergebnis einer zweistufigen Enzymreaktion erzeugt wird, wobei die Detektionsvorrichtung (c) eine Enzymelektrode ist.

22. Vorrichtung für einen spezifischen Bindungsassay gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 17, bei dem, wenn es verwendet wird, ein Signal als Ergebnis einer zweistufigen Enzymreaktion erzeugt wird, wobei die Detektionsvorrichtung (c) ein Teil ist, an dem ein Enzym und/oder ein Substrat, das an der zweiten Stufe der zweistufigen Enzymreaktion beteiligt ist, im wesentlichen immobilisiert ist, und wobei die Substanz, die an der Erzeugung der Signalsubstanz beteiligt ist und in mindestens der Probeneinführungsvorrichtung (a), der Matrix (b), der Detektionsvorrichtung (c) oder der Absorptionsvorrichtung (d) enthalten ist ein Substrat ist, das an der ersten Stufe der zweistufigen Enzymreaktion teilnimmt.