JPH0814582B2 - 免疫反応物定量用多層分析要素 - Google Patents

免疫反応物定量用多層分析要素

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JPH0814582B2
JPH0814582B2 JP61033988A JP3398886A JPH0814582B2 JP H0814582 B2 JPH0814582 B2 JP H0814582B2 JP 61033988 A JP61033988 A JP 61033988A JP 3398886 A JP3398886 A JP 3398886A JP H0814582 B2 JPH0814582 B2 JP H0814582B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗原または抗体などの抗原・抗体反応をする
免疫反応物を定量する多層分析要素に関するものであ
る。
（従来技術） 抗原抗体反応は互いに対応する抗原または抗体のみに
特異的に反応・結合する免疫反応であり、生体内微量物
質の検出、自己免疫疾患の診断など臨床検査に広く利用
されている。これらの操作は熟練を要するためルーティ
ン化した臨床検査では、より簡便な操作で再現性よく測
定する方法が望まれている。また大量処理のためには自
動操作化も可能なように微量試料で短時間の内に分析で
きる方法が望まれる。
このような簡便で自動操作化可能な抗原量測定方法と
して多層分析要素を用いた測定方法が本出願人により既
に提案されている（特開昭57−200862、特開昭59−7735
6）。特開昭57−200862に記載の多層分析要素は、固定
化抗体を含有する反応層と親水性高分子からなる検出層
とを重ねたものである。この反応層に被検物たる抗原と
所定量の標識抗原との混合物を添加すると、反応層中の
固定化抗体との間の競争的抗原抗体反応により固定化抗
体と結合しなかった抗原と標識抗原のみが検出層に移行
することになる。この検出層に移行した標識抗原を光学
的に検出することにより被検物の抗原量を測定するもの
である。
特開昭59−77356記載の多層分析要素は螢光標識抗原
を含有する展開層と、多孔質媒体からなる保液量の大き
な分配層と、固定化抗体を含有する反応層とを順次重ね
たものである。被検物たる抗原を展開層に滴下すると、
この抗原は展開層中の螢光標識抗原と共に分配層に移動
し保液される。反応層に抗体がなければ抗原と標識抗原
は分配層と反応層の保液量比に応じた量だけしか反応層
に移動し得ないが、反応層には予め固定化抗体があるた
め反応層の保液量に応じた量よりも抗体と結合した抗原
と標識抗原の量の分だけ多く反応層に移行する。従って
抗原と標識抗原との間の競争的抗原抗体反応により、被
検物たる抗原の量は反応層の螢光強度の減少として測定
できるというものである。
これらの多層分析要素は分析操作を簡素化し、自動操
作化を可能にする点で画期的なものであった。しかし両
要素とも抗原に標識された色素や蛍光色素を直接検出す
るものであるため、検出感度を高めるのは原理的に限界
があった。
そこで、検出感度を上げる方法としてエンザイムイム
ノアッセイを応用することが考えられる。この方法は抗
原（または抗体）を酵素標識し、抗原抗体反応をした
（またはしなかった）抗原（または抗体）に標識された
酵素の活性を検出するものである。この方法では抗体と
結合した酵素標識抗原（Ｂ）と抗体と未結合の酵素標識
抗原（Ｆ）とを分離（いわゆるB/F分離）するか、また
はB,Fで活性が変化する酵素系が必要となる。
B/F分離を必要としない系としては、補酵素とアポ酵
素との親和性が、補酵素に予め結合した抗原に抗体が結
合することにより減少することを利用したものが知られ
ている（特開昭55−2997）。また同じ（または異なる）
担体に固定相を分離して酵素と抗体とを結合した複合物
と、抗原と酵素阻害剤（または酵素活性剤）との結合物
とを組合せて、競争的抗原抗体反応で抗体に結合しない
抗原に標識された酵素阻害剤等が酵素と結合して酵素活
性を低下（または活性化）させる系も知られている（特
開昭58−209994）。これらはいずれも被検物たる未標識
抗原の量を、酵素活性の阻害率または活性化率により測
定するものであり、原理的に感度が低く、感度を上げる
ためには酵素反応時間を長くしなければならないという
不都合があった。
従ってエンザイムイムノアッセイを適用した多層分析
要素には、要素内で実質的にB/F分離でき、短時間で感
度よく定量できるものが望まれる。
（発明の目的） 本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、
抗原または抗体などの免疫反応物を少量の試料で簡便か
つ短時間に感度良く定量でき、自動操作化にも適した免
疫反応物定量用多層分析要素を提供することを目的とす
る。
（発明の構成） 本発明はこれらの目的を達成するため、被免疫反応物
（抗原または抗体）と酵素基質とをそれぞれ担体に固定
化した反応層で、被検物たる免疫反応物（抗体または抗
原）と、この免疫反応物と酵素との複合体とを競争反応
させ、固定化被免疫反応物と結合しなかった免疫反応物
・酵素複合体のみを固定化基質と反応させ、この結果生
じる酵素反応生成物を発色試薬層に移動させ、発色検出
試薬により検出するようにした。
すなわち本発明の目的は、被検物である免疫反応物
を、この免疫反応物と特異的に結合する被免疫反応物
と、前記免疫反応物と標識酵素との複合体との競争反応
によって、定量するための分析要素であって、水不透過
性透光性支持体と、この支持体の片面に設けられた親水
性高分子をバインダーとして含有する発色試薬層と、こ
の発色試薬層を被覆する多孔性媒体からなる反応層とを
備え、前記反応層は、不溶性担体に固定された被免疫反
応物と、別の不溶性担体に固定された前記標識酵素の酵
素基質とを含有し、前記発色試薬層は、前記反応層内で
前記酵素基質より生成される酵素反応生成物を検出して
発色する検出試薬を含有していることを特徴とする免疫
反応物定量用多層分析要素により達成される。
（作用） 固定化被免疫反応物（抗原または抗体）と固定化基質
とは反応層内で空間的に離れて存在する。そのため、酵
素と結合した免疫反応物（抗体または抗原）が固定化被
免疫反応物と結合すると、もはや酵素は固定化基質に近
付くことができず酵素反応を起こさない。ここで被検物
たる免疫反応物（酵素で標識されていない）が併せて添
加されると、競争反応により固定化被免疫反応物に結合
できなかった免疫反応物・酵素複合体は固定化基質に近
付くことができ、酵素反応が可能となる。こうして生じ
た酵素反応生成物は検出層（発色試薬層）へ浸透・移動
する。これを検出試薬で発色させ、透光性支持体を介し
て比色測定する。
（第１実施態様） 第１図は本発明の一実施態様による免疫反応物定量用
多層分析要素の断面図である。
符号10は透光性支持体であり、この支持体上には親水
性高分子からなる発色試薬層12、多孔性媒体からなる反
応層14が順次積層されている。反応層14は水不溶性担体
に固定された抗体、別の水不溶性担体に固定された酵素
基質とを含有する。発色試薬層12には反応層14で生じた
酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬を含有す
る。さらに本実施態様の反応層14は色を遮蔽するルチル
型またはアナターゼ型等の酸化チタンの微粒子を併せて
分散含有している。
反応層14に含有される酵素基質と発色試薬層12に含有
される検出試薬はこの多層分析要素に滴下される抗原と
酵素によって定まる。すなわち酵素反応生成物の量が発
色色素量として検出できる検出試薬が適用できるような
酵素・基質・検出試薬の組合せを用いる。
次に本発明による多層分析要素の各構成物質について
説明する。
支持体 支持体10は、光透過性（透明な）水不透過性物質、す
なわち波長約200nmから約900nmの範囲内の少なくとも一
部の波長範囲の電磁輻射線を透過させる物質であるばよ
く、例えばポリエチレンテレフタレート，ビスフェノー
ルＡのポリカルボネート，ポリスチレン，セルロースエ
ステル（セルロースジアセテート，セルローストリアセ
テート，セルロースアセテートプロピオネート等）等の
ポリマーの平滑な表面を有するフィルム状（シート状）
または平板状の公知の支持体を用いることができる。そ
の厚さは約50μｍから約1mm,好ましくは約80μｍから約
300μｍの範囲である。
この支持体の中には必要に応じて二酸化チタン微粒
子，硫酸バリウム微粒子，カーボンブラック等を分散含
有させて光学的性能を調節することができる。支持体の
表面には必要に応じて公知の下塗層を設けて支持体の上
に設けられている発色試薬層と支持体との接着を強固に
することができる。
多孔性媒体 反応層14を構成する多孔性媒体は、これに点着される
試料液中の抗原，抗体，酵素等と実質的に反応せず、抗
体または基質を固定化する担体を保持できるものであれ
ばよく、繊維質多孔性シートまたは非繊維質多孔性シー
トを用いることができる。
繊維質多孔性シートとして、織物生地、編物生地、有
機ポリマー繊維パルプ含有抄造紙および濾紙、ガラス繊
維パルプ含有抄造紙および濾紙、繊維質不織布等を用い
ることができる。
織物生地としては、特開昭55−164356,同60−222770
等に記載の展開層用の平織物が好ましく、平織物のうち
では細布生地，金巾生地，ブロード生地，ポプリン生地
等が好ましい。織物生地を構成する糸としては紡績糸
（加捻糸）が好ましい。織物生地の糸の太さは綿紡績糸
番手で表わして約20Sから約150S、好ましくは約40Sから
約120S相当の範囲、または絹糸デニールで表わして約35
Dから約300D、好ましくは約45Dから約130Dの範囲、織物
生地の厚さは約100μｍから約500μｍ、好ましくは約12
0μｍから約350μｍの範囲、織物生地の空隙率は約40％
から約90％、好ましくは約50％から約85％の範囲であ
る。
編物生地としては、特開昭60−222769,同60−222770
等に記載の展開層用の経（たて）メリヤス編生地が好ま
しく、経メリヤス編生地のうちではトリコット編生地、
ラッシェル編生地、ミラニーズ編生地、ダブルトリコッ
ト編生地が好ましい。編物生地を構成する糸としては紡
績糸（加捻糸）が好ましい。編物生地の糸の太さは綿紡
績糸番手で表わして約40Sから約150S、好ましくは約60S
から約120S相当の範囲、または絹糸デニールで表わして
約35Dから約130D、好ましくは約45Dから約90Dの範囲、
編物生地の編成工程時のゲージ数としては約20から約50
の範囲、編物生地の厚さは約100μｍから約600μｍ、好
ましくは約150μｍから約400μｍの範囲、編物生地の空
隙率は約40％から約90％、好ましくは約50％から約85％
の範囲である。
抄造紙，濾紙，不織布，に用いられる繊維質素材とし
ては、ガラス繊維，石綿等の無機繊維，木綿，麻，絹等
の天然有機繊維，銅アンモニアレーヨン，セルロースア
セテート，部分ホルマール化ポリビニルアルコール，ポ
リエチレン，ポリエステル類（例えばポリエチレンテレ
フタレート等）等の半合成繊維、合成繊維が用いられ
る。
また、繊維質素材としては、太さが0.1〜５μｍで長
さが500〜4000μｍの範囲にあることが好ましい。
有機ポリマー繊維パルプ含有抄造紙としては、特開昭
57−148250等に記載のポリエチレン繊維だけのパルプか
らの抄造紙、およびポリエチレン繊維（30〜70％）とセ
ルロース繊維等に天然繊維の混合パルプからの抄造紙が
好ましい。紙の厚さは約80μｍから約400μｍ、好まし
くは約100μｍから約250μｍの範囲、紙の空隙率は約20
％から約80％、好ましくは約50％から約70％の範囲であ
る。
繊維質多孔性シートのうち織物生地および編物生地
（以下、両者をあわせて布ということがある）は水洗等
の脱脂処理により少なくとも糸製造時または布製造時に
供給または付着した油脂類を実質的に除去した布を用い
る。抄造紙および抄造濾紙は油脂類を実質的に付着して
いないものを用いる。繊維質多孔性シートは特開昭57−
66359等に記載の物理的活性化処理（好ましくはグロー
放電処理、またはコロナ放電処理）をその片面または両
面に施すか、あるいは特開昭55−164356、同57−6635
9、同57−148250等に記載の界面活性剤、好ましくはノ
ニオン性界面活性剤水溶液の含浸処理，塗布またはスプ
レイ処理することができる。
非繊維質多孔性シートとして特公昭53−21677,米国特
許1,421,341,同3,992,158等に記載のセルロースアセテ
ート等のセルロースエステル、ナイロン−６、ナイロン
−66等のポリアミド、ビスフェノールＡのポリカルボネ
ート等からなるメンブレンフィルタ（ブラッシュポリマ
ー層）、第９回プラスチックフィルム研究会講座講演要
旨集（高分子学会,1984年２月22日発行）,Membrane,In
c.カタログ（1982年７月発行）等に記載のポリエチレン
微多孔性膜，ポリプロピレン微多孔膜等のポリオレフィ
ン微多孔膜、特公昭53−21677、米国特許3,992,158等に
記載のポリマーミクロビーズ，ガラスミクロビーズ，珪
藻土等の微粒子が親水性ポリマーバインダーに保持され
てなる連続微空隙含有多孔性層、特開昭55−90859に記
載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しないポリマー接
着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有多孔性
層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊維質等方的多
孔性層等を用いることができる。
非繊維質多孔性シートの空隙サイズは約20nmから約30
μｍ、好ましくは約50nmから約10μｍの範囲、空隙率は
約20％から約90％、好ましくは約40％から約85％の範囲
である、厚さは約20μｍから約500μｍ、好ましくは約8
0μｍから約350μｍの範囲である。
非繊維質多孔性シート中には全血中のヘモグロビンの
赤色等の反射光学濃度測定の光学的妨害排除のために特
公昭53−21677,米国特許3,992,158,特開昭55−90859等
に記載の方法に従って光遮蔽性微粒子及び（または）光
反射性微粒子をいずれか１層または２層に含有させるこ
とができる。３次元格子状粒状構造物層を用いる場合に
は光遮蔽性及び（または）光反射性微粒子が接着剤で点
接触状に接着されてなる３次元格子状粒状構造物層を用
いることができる。光遮蔽性及び（または）光反射性微
粒子の例として二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒
子、カーボンブラック、アルミニウム微粒子または微小
フレーク等がある。これらのうちでは二酸化チタン微粒
子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。
非繊維質多孔性シート層には公知の界面活性剤、好ま
しくはノニオン性界面活性剤を含浸保持させることがで
きる。これにより水性液体試料の拡散、浸透、通過が均
一になる。
担体 抗体または酵素基質を固定する担体は、水不溶性で、
抗原抗体反応や酵素反応に影響を与えないものであり、
抗体または基質を固定化し得る官能基を有するもの、ま
たこのような官能基を導入できるものであればよい。
一般にはアガー、アガロース、デキストランなどの多
糖類；ポリアクリルアミド、または重合可能なエチレン
系モノマーの重合（もしくは共重合）により形成された
ラテックス；セルロースパウダーなどの非繊維質微粒子
状物質を用いる。この内でも、アガー、アガロースのよ
うな非繊維質微粒子状物質は、反応層の厚さ当りの保液
量を増大させることができるために好ましい。
なお担体を繊維質素材で構成して、これを抄いて得ら
れる抄造紙を反応層14としての多孔性シートとしてもよ
い。
担体と抗体または基質との結合・固定は特開昭53−72
37、同53−7238、同53−7239などに記載の公知技術によ
り行なうことができる。例えばカルボニルジイミダゾー
ル処理によるアシル化処理を含む方法、CNBr（ブロムシ
アン）による活性化処理を含む方法、さらにはグルタル
アルデヒド等の官能基架橋剤による処理を含む方法など
がある。
抗体 被検物たる抗原の特異抗体を用いる。常法により得ら
れる抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いればより
感度が向上する。
発色試薬層 発色試薬層12は水を吸収して膨潤する親水性高分子を
バインダー成分とする層で、反応層で生成された酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含む。この発色
試薬層は吸水層としても機能する層である。
発色試薬層に用いられる親水性高分子は水吸水時の膨
潤率が30℃で約150％から約2000％、好ましくは約250％
から約1500％の範囲の高分子である。親水性高分子の具
体例としての特開昭59−171864、特開昭60−115859等に
開示の酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等のゼラチ
ン、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフ
トゼラチン等のゼラチン誘導体、特開昭59−171864、特
開昭60−115859等に開示のアガロース、プルラン、プル
ラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン等がある。これらの親水性高
分子は単独で、あるいは２種以上を組合せて用いること
ができる。発色試薬層には一般的にはゼラチンまたはゼ
ラチン誘導体が好ましいが、被検物が抗体である場合
や、被検物を抗原とする場合でも、この抗原が蛋白質で
ある場合等には、蛋白誘導体のゼラチン以外の親水性高
分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を
用いるのが好ましい。
発色試薬層の乾燥時の厚さは約３μｍから約50μｍ、
好ましくは約５μｍから約30μｍの範囲、被覆量では約
3g/m2から約50g/m2の範囲、好ましくは約5g/m2から約30
g/m2の範囲である。発色試薬層には公知のpH緩衝剤、有
機カルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有
させて使用時（分析操作実施時）のpHを調節することが
できる。さらには発色試薬層には公知の媒染剤、ポリマ
ー媒染剤等を含有させることができる。発色試薬層は実
質的に透明であることが好ましいが、必要に応じて発色
試薬層中に二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、
カーボンブラック等を少量分散含有させて光学的性能を
調節することができる。
なお発色試薬層と支持体との間には吸水層を設けるこ
とができる。吸水層は発色試薬層と同様な親水性高分子
を主成分とする層で、その乾燥時の厚さは約１μｍから
約100μｍ、好ましくは約３μｍから約30μｍの範囲、
被覆量では約1g/m2から約100g/m2の範囲、好ましくは約
3g/m2から約30g/m2の範囲である。吸水層には公知のpH
緩衝剤、有機カルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマ
ー等を含有させて使用時（分析操作実施時）のpHを調節
することができる。吸水層に媒染剤、ポリマー媒染剤、
塩基性ポリマーまたは酸性ポリマーを含有させた場合に
は、検出層としても機能する。
酵素−基質−検出試薬 反応層14に含有される酵素基質と、発色試薬層に含有
される検出試薬は、この多層分析要素で分析する抗原に
標識する酵素との関係で定まる。すなわち酵素反応生成
物量が発色色素量として検出できる検出試薬が適用でき
るような酵素・基質・検出試薬の組合せを用いる。
検出試薬例１ 抗原の標識酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、基質に
ガラクトースオリゴマーを用いた場合には、ガラクトー
スオキシダーゼとペルオキシダーゼと発色試薬組成物と
の組合せを検出試薬とすることができる。ガラクトース
オキシダーゼはガラクトースオリゴマーの酵素反応生成
物（分解物）であるＤ−ガラクトースを脱水素し、その
副生成物としてH2O2を生成する。ペルオキシダーゼの作
用によりこのH2O2と発色試薬組成物とが反応し、呈色物
質（色素）が生成される。なおガラクトースオキシダー
ゼはガラクトースオリゴマーとも反応するが、本発明で
はこのガラクトースオリゴマーが固定化基質として反応
層に隔離されているから、発色試薬層内でのＤ−ガラク
トースを検出する邪魔にはならない。
抗原を標識するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとしては馬
場、和田、北村、奥田編著「臨床酵素ハンドブック」
（講談社、1982年）、T.E.Barman著「Enzyme Handboo
k」（Springer Verlag,1969年）等に記載のβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ（EC 3.2.1.23）を用いることができ
る。特にDiplococcus pneumoniae起源のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼが好ましい。
ガラクトースオキシダーゼとしては、馬場，和田，北
村，奥田編著「臨床酵素ハンドブック」（講談社,1982
年）、丸尾，田宮監修「酵素ハンドブック」（朝倉書
店,1982年）、T.E.Barman著「Enzyme Handbook」（Spri
nger Verlag,1969年）等に記載のPolyporus circinatu
s,Dacntylium dendoroides等微生物起源のガラクトース
オキシダーゼ（EC 1.1.1.48）を用いることができる。
ガラクトースオキシダーゼは必要に応じてその補酵素,C
u2+イオンとともに用いることができる。分析操作時にp
H6.5からpH8.0、好ましくはpH6.8からpH7.5の範囲に維
持されるようにガラクトースオキシダーゼが含有される
層またはその隣接層等に公知のpH緩衝剤を含有させるこ
とができる。ガラクトースオキシダーゼの含有量は通常
多層分析要素1m2当り約１千Ｕから約10万Ｕ、好ましく
は約２千Ｕから約５万Ｕの範囲である。
ペルオキシダーゼとしては、馬場，和田，北村，奥田
編著「臨床酵素ハンドブック」（講談社,1982年）、丸
尾，田宮監修「酵素ハンドブック」（朝倉書店,1982
年）、T.E.Barman著「Enzyme Handbook」（Springer Ve
rlag,1969年）、特公昭56−45599,特公昭57−5520等に
記載の植物起源および動物起源のペルオキシダーゼ（EC
1.11.1.7），特公昭58−5035等に記載の微生物起源の
ペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）を用いることができ
る。これらのうちでは植物起源または微生物起原の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。好ましいペルオキシ
ダーゼの例として、西洋わさびペルオキシダーゼ，大根
ペルオキシダーゼ,Cochliobolus属,Curvularia属の微生
物から抽出したペルオキシダーゼがある。
分析操作時にpH5.0からpH8.0、好ましくはpH6.0からp
H7.0の範囲に維持されるようにペルオキシダーゼが含有
される層またはその隣接層等に公知のpH緩衝剤を含有さ
せることができる。ペルオキシダーゼの含有量は通常多
層分析要素1m2当り約１千Ｕから約10万Ｕ、好ましくは
約２千Ｕから約６万Ｕの範囲である。
ペルオキシダーゼは必要に応じて特公昭55−25840等
に記載のヘキサシアノ鉄（II）酸イオンを含む化合物ま
たはヘキサシアノ鉄（II）酸イオンを放出しする化合物
とともに用いることができる。
発色試薬組成物は、H2O2とペルオキシダーゼとの存在
下において呈色物質（色素）を形成するものであって、
酸化発色色素（ロイコ色素）を含むもの（特公昭56−45
599,同58−18628等に記載）、酸化カップリングにより
呈色物質（色素）を形成するもの（「Annales of clini
cal chemistry」，６,24−27（1969），米国特許第3,99
2,158、特公昭55−25840,同56−45599,同58−18628,特
開昭59−54962等に記載）、自己カップリング等により
発色または変色する色素前駆体化合物（特公昭56−4559
9,同58−18628等に記載）等を用いることができる。
好ましい発色試薬組成物の例として次の化合物があ
る。
水素供与体（色原体）とカプラーの組合せ； ［水素供与体］４−アミノアンチピリン、４−アミノ
−２−メチル−３−フェニル−１−（2,4,6−トリクロ
ロフェニル）−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミ
ノアンチピリンホモログまたは誘導体 ［カプラー］1,7−ジヒドロキシナフタレン、１−ヒ
ドロキシナフタレン−２−スルホン酸ナトリウム（また
はカリウム）等の１−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素； 4,5−ビス［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−２
−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）イミ
ダゾール、４−（ジメチルアミノ）フェニル−２−（４
−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−５−フェ
ネチルイミダゾール等 色素前駆体化合物； ジアニシジン、４−メトキシ−１−ナフトール等 検出試薬例２ 検出試薬としてガラクトースデヒドロゲナーゼとNAD
とNADH検出試薬との組合せを用いてもよい。ガラクトー
スデヒドロゲナーゼは、固定化基質の分解物,D−ガラク
トースを脱水素して、その際NADをNADHに還元する。従
ってこのNAD減少量またはNADH生成量を測定することに
より標識酵素の酵素反応生成物の量を測定できる。
NADまたはNADHの量を比色定量する呈色試薬組成物の
例として、Clinica Chimica Acta,12,210（1965），特
開昭59−44658,同59−88097に記載のラクテートデヒド
ロゲナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、Clinica Chimic
a Acta,28,431（1970），特開昭50−44894,同57−20899
8,同59−44658,同59−88097記載のアスパルテートアミ
ノトランスフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成
物、特公昭46−9988に記載のクレアチンキナーゼ活性測
定用呈色試薬組成物、特開昭49−11395,同59−44658,同
59−88097記載のクレアチンホスホキナーゼ活性測定用
呈色試薬組成物、米国特許3,791,933に記載のテストス
テロン活性測定用呈色試薬組成物およびアンドロステロ
ン活性測定用呈色試薬組成物、特公昭56−39637に記載
のアミラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公昭53−21
677に記載のグリセロール分析用呈色試薬組成物、特開
昭50−126494,同53−24893、特公昭56−38199に記載の
トリグリセリド分析用呈色試薬組成物等がある。
これらの内では、遊離NADH量を特公昭56−38199,同56
−46799に記載されたように、テトラゾリウム塩を用い
てジアホラーゼ存在下、ホルマザン色素を生成させ比色
定量するのが有利である。
ガラクトースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.48）,NAD
は公知のものを用いることができる。
検出試薬例３ 抗原の標識酵素にβ−Ｄ−グルコシダーゼ、基質にグ
ルコースオリゴマーを用いた場合には、検出試薬例1,2
のガラクトースオキシダーゼをグルコースオキシダーゼ
に代えたものを用いることができる。
β−Ｄ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）は従来公知
のものを用いることができる。
グルコースオリゴマーはβ−Ｄ−グルコースよりなる
オリゴマーが最も好ましく、次いで２−デオキシ−Ｄ−
グルコースが好ましい。
グルコースオキシダーゼとしては、馬場，和田，北
村，奥田編著「臨床酵素ハンドブック」（講談社,1982
年）、丸尾，田宮監修「酵素ハンドブック」（朝倉書
店,1982年）、T.E.Barman著「Enzyme Handbook」（Spri
nger Verlag,1969年）等に記載のAspergillus niger,Pe
nicillium notatum,Penicillium amagasakiense等微生
物起源のグルコースオキシダーゼ（EC 1.1.3.4）を用い
ることができる。グルコースオキシダーゼは必要に応じ
てその補酵素FAD,鉄イオンとともに用いることができ
る。分析操作時にpH4.0からpH8.0、好ましくはpH5.0か
らpH6.5の範囲に維持されるようにグルコースオキシダ
ーゼが含有される層またはその隣接層等に公知のpH緩衝
剤を含有させることができる。グルコースオキシダーゼ
の含有量は通常多層分析要素1m2当り約１千Ｕから約10
万Ｕ、好ましくは約２千Ｕから約５万Ｕの範囲である。
検出試薬例４ 抗原の標識酵素にβ−アミラーゼ（EC 3.2.1.2）を，
基質にテンプンを用いた場合には、特公昭56−39637に
記載のアミラーゼ活性測定用呈色試薬組成物を検出試薬
としてもよい。
なおこの場合デンプンとして水不溶性デンプンを用い
れば、この不溶性デンプン自体を担体かつ固定化基質と
することができ、本発明はこのようなものも包含する。
緩衝剤 本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適用して
の分析操作実施時のpH値を6.5から8.0,好ましくは7.0か
ら7.5の範囲の所望の値に緩衝できる公知の緩衝剤から
適宜選択して含有させることができる。
用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧
基礎編」（東京，丸善（株）,1966年発行）1312−1320
頁、R,M,C,Dawson et al編「Data for Biochemical Res
earch」第２版（Oxford at the Clarendon Press,1969
年発行）476−508頁、「Biochemistry」５,467頁以降
（1966年），「Analytical Biochemistry」104,300−31
0頁（1980年）等に記載のpH緩衝剤系がある。
pH4.5から8.0の範囲のpH緩衝剤の具体例としてトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）を含む緩衝
剤；燐酸塩を含む緩衝剤；ホウ酸塩を含む緩衝剤；クエ
ン酸またはクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩
衝剤；リンゴ酸；コハク酸；マロン酸；酒石酸；グルタ
ル酸;3,3−ジメチルグルタル酸;N,N−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）グリシン（Bicine）;N−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（HEPE
S）；およびこれらのいずれかと必要により組合せられ
る酸，アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤の具体
例として、リンゴ酸；コハク酸；マロン酸；酒石酸;3,3
−ジメチルグルタル酸；燐酸二水素カリウム−燐酸水素
二ナトリウム;Tris−ホウ酸ナトリウム;Tris−ホウ酸ナ
トリウム−EDTA・2Na塩;Tris−クエン酸；酢酸−酢酸ナ
トリウム；クエン酸−燐酸二水素ナトリウム;Bicine;HE
PES等がある。
一体型多層分析要素の製造方法 本発明の乾式多層分析要素は前述の諸特許明細書に記
載の公知の方法により調製することができる。
本発明の多層分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方
形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭
57−28331,実開昭56−142454,特開昭57−63452,実開昭5
8−32350,特表昭58−501144等に記載のスライド枠に収
めて化学分析スライドとして用いることが、製造，包
装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目
的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジン
に収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。
一体型多層分析要素による被検物定量方法 本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載
の操作と同様の操作により水性液体試料中の被検物（抗
原）の定量分析ができる。
まず被検物たる抗原と同じまたは少なくとも１以上の
共通する抗原決定基を有する抗原を用意し、この抗原と
酵素との結合体を作る。この結合体は前記した抗体と担
体とを結合する従来技術により作ることができる。
この抗原酵素複合体の水溶液と、被検物たる抗原を含
む全血、血漿、血清等の水性液体試料を混合し、この混
合液を約５μｌ〜約30μｌ、好ましくは８〜15μｌを反
応層14に点着する。点着した多層分析要素を約20℃〜約
40℃の範囲の一定温度で、好ましくは37℃近傍の一定温
度で１〜10分間インキュベーションすると、競争的抗原
抗体反応で抗体に結合しなかった抗原に結合された酵素
のみが固定化基質を分解し、この分解物は発色試薬層12
に浸透・移動し、検出試薬を発色させる。こうして試料
液中の抗原量は、発色試薬層12で生成した呈色物質（色
素）量を透光性支持体10を通して反射光学濃度を測定す
ることにより、比色法の原理から定量することができ
る。なお本実施態様では色を遮蔽する微粒子を反応層14
に分散含有させたので、全血などの有色試料液との混合
液を用いても発色試薬層に侵入できない赤血球等によっ
て反射光学濃度の測定が妨害されることはない。
（第２実施態様） 第２図は本発明の第２実施態様による多層分析要素で
ある。この実施態様では、反応層24は、担体に固定され
た抗体を含有する第１反応層24Aと、担体に固定された
酵素基質を含有する第２反応層24Bとからなり、発色試
薬層22の上面を第２反応層24B、第１反応層24Aの順に積
層している。
前記第１実施態様では同一反応層14内に固定化抗体と
固定化基質を混在させ、抗原・抗体間の親和力が極めて
大きいことを利用して抗原・酵素複合体を固定化抗体と
の結合する方向に平衡をずらし、実質的にB/F分離する
ものであった。
これに対し第２実態様は第１反応層24Aの固定体抗体
に結合しなかった抗原・酵素複合体のみを第２反応層24
B内の固定化基質と反応させるものであり、物理的なB/F
分離を達成するものである。従って親和力の差を利用し
た第１実施態様にくらべて、より完全にB/F分離でき、
検出感度がさらに向上する。
なお第２実施態様の多層分析要素の各構成物質は第１
実施態様と同じものを用いることができる。
（第３実施態様） 第１実施態様の反応層14には予め抗原・酵素複合体を
含有させてもよい。この場合には被検物たる水性液体試
料をそのまま反応層14に点着すればよく、さらに簡便に
抗原量を定量測定することができる。
なお水性液体試料点着前は、反応層14は乾燥保持され
ているから、反応層14内で抗原・酵素複合体中の酵素と
固定化基質とが反応することはない。第２実施態様のよ
うに反応層24を第１反応層24Aと第２反応層24Bとの２層
にする場合は、固定化基質が含まれていない第１反応層
24Aのみに抗原・酵素複合体を含有させておくのが好ま
しい。
（第４実施態様） 第１実施態様の発色試薬層12に予め抗原・酵素複合体
を含有させてもよい。
この場合は、反応層14に点着された水性液体試料が発
色試薬層12に浸透し、この発色試薬層12から反応層14へ
抗原・酵素複合体が移動する。すなわち、被検物たる抗
原は抗原・酵素複合体よりも早く固定化抗体と接触する
ことができ、単なる競争的抗原抗体反応の場合よりも優
位に固定化抗体と結合できる。
従ってこの第４実施態様によれば、より簡便に抗原量
を測定できるばかりでなく、S/N比に優れ、より鋭敏に
抗原を検出することが可能となる。
（第５実施態様） 第3,4実施態様のようにより簡便に測定するため、抗
原・酵素複合体を含有する展開層を反応層14または第１
反応層24Aの上面に設けてもよい。
この場合の展開層は、その上面に点着された水性液体
試料が展開層内を単位面積当り一定容量に分配されて反
応層14または第１反応層24Aに浸透・到達し、この反応
層14または第１反応層24Aに単位面積当り一定容量の割
合で供給する作用（展開作用またはメータリング作用）
を有するものであればよい。
展開層には、前記多孔性媒体に用いられる繊維質多孔
性シートや非繊維質多孔性シート等を用いることができ
る。とくに織物、編物からなる布を用いるのが好まし
い。
このような展開層を用いた本実施態様では、点着する
水性液体試料の量を厳密に一定にする必要がなく、さら
に簡便な操作になるという効果もある。
以上の各実施態様では反応層と発色試薬層とを別の層
としたが、反応層と発色試薬層とを同一層にしてもよ
い。例えば固定化抗体と固定化基質を保持する布に検出
試薬を含有するゼラチン等の親水性高分子を含侵・保持
させたり、あるいは検出試薬を含侵・保持させたりする
ことにより反応層と発色試薬層を同一層にすることがで
きる。
以上の実施態様では被検物を抗原とした場合の抗原定
量方法とその多層分析要素について説明したが、被検物
を抗体とした場合には、上記実施態様において固定化抗
体の代りに固定化抗原を、酵素と抗原との複合体の代り
に酵素と抗体との複合体を用いればよく、本発明はこれ
らも包含するものである。
以下実施例により本発明をより詳細に説明する。
（実施例１） （１） T4−MEMIDAの調製 T4（チロキシン）を抗原として用いる。低分子である
T4を酵素と結合させるため、また効率よく抗T4抗体をつ
くるためスペーサを導入したＮ−メチル−Ｎ−カルボキ
シメチルグリシルチロキシンメチルエステル（T4−MEMI
DA）を調製する。
チロキシンメチルエステル塩酸塩2gを15mlのジメチル
ホルムアミド（DMF）に溶解し、これに500μトリエチ
ルアミンを加え−15℃に冷却下で、クロロギ酸イソブチ
ル460μを添加反応させた。10分後に、この溶液にＮ
−メチルイミノ二酢酸0.55gをテトラヒドロフラン（TH
F）5mlに溶解したものを加え、０℃で10分間、さらに室
温30分間反応させた後、減圧濃縮した。この残渣を50ml
のTHFに溶解し、さらに酢酸エチル150mlを加え、振とう
撹拌し、酢酸エチル層を分取した。これを蒸留水で３
回、飽和食塩水で１回洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を20
mlのTHFに溶解し、ｎ−ヘキサンを少量加え結晶化させ
た。結晶を濾別し減圧乾燥したところ2.3gの標品を得た
（収率69％）。
（２） 抗T4（チロキシン）血清の調製 上記（１）で調製したT4−MEMIDA 100mgを乾燥したDM
F 2.0mlに溶解し、これにＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド15mgを加え、さらに25mgの１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ECDI）を氷冷
下に加え、４℃で一夜反応させた。この反応液を氷冷
下、牛血清アルブミン（マイルス・ラボラトリーズ製、
フラクションＶ）100mgを含む0.05M炭酸緩衝液（pH9.
0）20ml中に滴下し、反応させた。この反応液を同じ緩
衝液に対し２日間透析（２×４回）し、さらに蒸留水
に対し２日間（２×４回）透析を行ない脱塩したのち
凍結乾燥し、固形分130mgを得た。この固形分を赤外吸
収スペクトルおよび塩酸加水分解後アルカリ中で紫外吸
収スペクトル測定したところ、牛血清アルブミン１分子
に対し約20個のT4−MEMIDAがハプテンとして導入された
いることがわかった。
上記方法で得られた乾燥固形分を用い常法に従いウサ
ギに免疫処理し、抗チロキシン（抗T4）血清を得た。
（３） T4−β−ガラクトシダーゼ複合体の調製 （１）で調製したT4−MEMIDA 50mgをDMF 2mlに溶解
し、これを−15℃に冷却下、クロロ蟻酸イソブチル７μ
とトリエチルアミン８μを加え混合した。β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ（E.coli由来:Sigma社製）2.0gを50mM
炭酸緩衝液（pH8.5）10mlに溶解し、氷冷下でこれにT4
−MEMIDA反応物を滴下反応させた。２時間反応後、反応
液を20mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に一夜４℃で
透析し、さらに蒸留水で１日透析脱塩した。この脱塩溶
液をセファロースCL−4B（ファルマシア・ファインケミ
カルズ社製）を用いてクロマトグラフィーを行いT4−β
−ガラクトシダーゼ分画を得た。溶出には50mM燐酸緩衝
液（pH7.0）を用いた。
（４） 抗T4抗体固定化アガロースの調製 氷冷下、抗チロキシン（T4）抗血清1.5mlに飽和硫安
溶液1mlを添加して、IgG分画を硫安沈殿させた。得られ
たIgG分画を透析脱塩して抗T4抗体とした。
アガロースとしてセファロースを用いた。
CNBr活性化セファロース4B（ファルマシア・ファイン
ケミカルズ社製）15gを水100mlで膨潤させ、グラスフィ
ルタ上で0.001N塩酸２で洗浄した。次に、0.1M重炭酸
緩衝液（pH8.5,0.5M NaCl含有）30mlに溶解した上記抗T
4抗体IgGフラクションを、洗浄済のCNBr活性化セファロ
ース4Bに加え、４℃にて撹拌下16時間反応させた。反応
後、グラスフィルタ上で反応液を除去し、次に1Mエタノ
ールアミン（塩酸でpH8〜8.5に調製）50mlを加え、再び
４℃にて２〜５時間反応させた。次いでグラスフィルタ
上で0.1M酢酸緩衝液pH4.0（1M NaCl含有）と0.1Mホウ酸
緩衝液pH8.0（1M NaCl含有）で交互に３回ずつ洗浄し
た。洗浄後、0.1Mグリシン緩衝液pH9.0（0.1M NaClおよ
び0.1％アジ化ナトリウム含有）により1ml中に、アガロ
ース乾燥重量200μｇ含有するように懸濁液を調製し
た。
（５） ガラクトースオリゴマー固定化アガロース 常法（生化学実験講座 ４巻、日本生化学会編）によ
り、ガラクトースのオリゴマーを合成した。
このオリゴマーを（４）と同様の方法によりCNBr活性
化セファロース4Bと反応させ、アガロース（セファロー
ス）に固定化したガラクトースオリゴマーを調製した。
さらにこの液を蒸留水で希釈し、1ml中に乾燥重量200μ
ｇのアガロースを含有するように調製した。
（６） T4の分析 下記の組成からなる発色液および試料液を調製した。
・発色液 オルトフェニレンジアミン 2 mg/ml H2O2 0.03％ を含む0.1M Trs−HCl緩衝液（pH6.5）。
・試料液 ヒト血清アルブミン（Sigma社製） 1 mg/ml １−アニリノナフタレン−８−スルホン酸ナトリウム1
mg/ml T4−β−ガラクトシダーゼ 10μg/ml T4 ０〜２μg/ml を含む0.1M Trs−HCl緩衝液（pH6.5）。
（４）で調製した抗T4抗体固定化アガロース懸濁液2m
l,（５）で調製したガラクトースオリゴマー固定化アガ
ロース懸濁液2ml,上記発色液0.5mlおよび上記試料液0.5
mlを混合して反応液とした。なおガラクトースオリゴマ
ー固定化アガロース懸濁液の代わりに、同濃度のガラク
トースオリゴマー水溶液を用いたものを比較用反応液と
した。
この反応液と比較用反応液を25℃下、60分間転倒混合
して反応させた。2N硫酸2mlを加えて反応を停止し、蛋
白沈殿、アガロース等を遠心分離（3000rpm,20分）し
て、その上清の490nmにおける吸光度を測定した。その
結果を以下の表に示す。
このように抗体と酵素基質双方が固定化されると、抗
原・酵素複合体の酵素活性が減少すること、すなわち固
定化抗体に結合した抗原・酵素複合体（Ｂ）と未結合の
抗原・酵素複合体（Ｆ）とを物理的にB/F分離しなくて
も、これらは微視的にB/F分離でき、同一溶液内にB/F分
離したものとして検出できることが示された。
また競争的抗原抗体反応により生じる酵素活性の差と
して、抗原を検出できることが示された。
（実施例２） （１） 検出シート（発色試薬層）の作製 ゼラチン用の下塗処理を施した厚さ185μｍの無色透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルム上に下
記組成からなるガラクトース定量用の試薬層を乾燥後の
厚さがおよそ15μｍになるように塗布した。
ガラクトースオキシダーゼ ２重量部 ペルオキシダーゼ １重量部 1,7−ジヒドロキシナフタレン ５重量部 ４−アミノアンチピリン ５重量部 アルカリ処理ゼラチン 200重量部 ノニオンHS210（日本油脂（株）製活性剤：ポリオキシ
エチレンオクチルフェニルエーテル） ２重量部 この試薬層の上に更に乾燥ゼラチン１に対して二酸化
チタン微粉末８（重量比）の割合で混合された水分散液
を用いて色遮蔽層を乾燥後の厚さがおよそ15μｍになる
ように塗布し、更にその上に0.2％ノニオン界面活性剤
（HS210）を含むゼラチン層を乾燥後の厚さが約５μｍ
になるように塗布し、検出シート（発色試薬層）とし
た。
（２） 反応シート（反応層）の作製 ガラス繊維濾紙GA−100（東洋濾紙製）2gを3mm角に切
って、400mlの水中でホモゲナイザー（日本精機製）に
かけて分散させた（15000rpm,10分間）。分散物を2m/m
角及び1m/m角のステンレス製メッシュで順にこしわけ、
1m/mメッシュ上のガラス繊維を0.1Mグリシン緩衝液pH9.
0（0.5M NaCl含有）500mlに分散させた。この液の一定
容量を取り、メンブレンフィルターでガラス繊維をこし
とり、水切り乾燥後、秤量してガラス繊維濃度（mg/m
l）を測定した。
上記の分散液からガラス繊維30mgを含む容量をビーカ
ーにはかり取り、これに実施例１の（４）で調製した抗
T4抗体固定化アガロース懸濁液1mlおよび実施例１の
（５）で調製したガラクトースオリゴマー固定化アガロ
ース懸濁液1mlをよく混合し、この混合液をメンブレン
フィルター濾過器（フィルター：ミリポア社製HAWP0.45
μｍ孔径、47mmφ）上に展開、抄紙し反応シート（反応
層）とした。
なお抗T4抗体固定化アガロースのかわりにアガロース
（セファロース4B）を用いたものを比較用検出シートと
した。
（３） 多層分析要素の作製 （１），（２）で作製した反応シート及び検出シート
を直径12mmの円に裁断した後、検出シートのPETフィル
ムとは反対側に反応シートを重ね、多層分析要素を作製
した。
さらに比較用反応シートを用いて同様に比較用多層分
析要素を作製した。
（４） T4の測定 下記の成分を含有する0.1Mグリシン緩衝液（pH8）を
作り試料液とした。
ヒト血清アルブミン（Sigma社製） 1 mg/ml １−アニリノナフタレン−８−スルホン酸ナトリウム1
mg/ml T4−β−ガラクトシダーゼ複合体 50μg/ml T4 ０〜10μg/ml この試料液100μを（３）で作製した多層分析要素
に点着し、この多層分析要素を37℃で８分間インキュベ
ーション後、PETフィルム側から中心波長500nmの可視光
で反射光学濃度を測定した。
測定結果を第３図に示す。本実施例の多層分析要素は
図中のＩで示されるようにT4濃度変化に対応して反射光
学濃度が変化し、T4を定量するための検量線を作成する
ことができた。このように本発明の多層分析要素を用い
ることによりB/F分離操作をすることなくT4をきわめて
短時間で測定できた。また従来発明のように酵素活性の
阻害率等を測定するのではなく、酵素活性そのものから
定量するので検出感度に優れている。
なお第３図のII（黒丸）は比較用多層分析要素の実験
結果である。
（発明の効果） 以上のように本発明の免疫反応物定量用多層分析要素
は、被免疫反応物（抗体または抗原）と基質とを別の担
体に固定化・含有した反応層で被検物たる免疫反応物
（抗原または抗体）と、この免疫反応物と酵素との複合
体とを競争反応させ固定化被免疫反応物と結合しなかっ
た免疫反応物・酵素複合体の酵素活性のみを測定するよ
うにしたので、少量の試料で簡便かつ短時間に感度よく
免疫反応物を定量測定することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の一実施態様による多層分析要素の断面
図、第２図は他の実施態様による多層分析要素の断面
図、第３図は実施例の測定結果を示す図である。 10,20……透光性支持体、 12,22……親水性高分子をバインダーとして含有する発
色試薬層 14,24……多孔性媒体からなる反応層。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三浦 研二 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (56)参考文献 特開 昭58−76763（ＪＰ，Ａ)

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被検物である免疫反応物を、この免疫反応
    物と特異的に結合する被免疫反応物と、前記免疫反応物
    と標識酵素との複合体との競争反応によって、定量する
    ための分析要素であって、 水不透過性透光性支持体と、この支持体の片面に設けら
    れた親水性高分子をバインダーとして含有する発色試薬
    層と、この発色試薬層を被覆する多孔性媒体からなる反
    応層とを備え、 前記反応層は、不溶性担体に固定された被免疫反応物
    と、別の不溶性担体に固定された前記標識酵素の酵素基
    質とを含有し、 前記発色試薬層は、前記反応層内で前記酵素基質より生
    成される酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬を
    含有していることを特徴とする免疫反応物定量用多層分
    析要素。
  2. 【請求項２】前記反応層が、前記標識酵素と免疫反応物
    との複合体を含有していることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  3. 【請求項３】前記発色試薬層が、前記標識酵素と免疫反
    応物との複合体を含有していることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  4. 【請求項４】前記反応層の上面は、前記標識酵素と免疫
    反応物との複合体を含有する展開層で被覆されているこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫反応物
    定量用多層分析要素。
  5. 【請求項５】前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫
    反応物が抗体である特許請求の範囲第１〜４項のいずれ
    かに記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  6. 【請求項６】前記免疫反応物が抗体であり、前記被免疫
    反応物が抗原である特許請求の範囲第１〜４項のいずれ
    かに記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  7. 【請求項７】前記反応層が、不溶性担体に固定化された
    被免疫反応物を含有する第１反応層と、不溶性担体に固
    定化された酵素基質を含有する第２反応層とからなり、
    前記発色試薬層の上を第２反応層、第１反応層の順に被
    覆している特許請求の範囲第1,3,4項のいずれかに記載
    の免疫反応物定量用多層分析要素。
  8. 【請求項８】前記反応層が、前記標識酵素と免疫反応物
    との複合体および不溶性担体に固定化された被免疫反応
    物を含有する第１反応層と、不溶性担体に固定化された
    酵素基質を含有する第２反応層とからなり、前記発色試
    薬層の上を第２反応層、第１反応層の順に被覆している
    特許請求の範囲第２項に記載の免疫反応物定量用多層分
    析要素。
  9. 【請求項９】前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫
    反応物が抗体である特許請求の範囲第７項または第８項
    に記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  10. 【請求項１０】前記免疫反応物が抗体であり、前記被免
    疫反応物が抗原である特許請求の範囲第７項または第８
    項に記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
  11. 【請求項１１】前記反応層が、色を遮蔽する微粒子を含
    有している特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載
    の免疫反応物定量用多層分析要素。
  12. 【請求項１２】前記第２反応層が、色を遮蔽する微粒子
    を含有している特許請求の範囲第７〜10項記載の免疫反
    応物定量用多層分析要素。
  13. 【請求項１３】前記多孔性媒体が、繊維質多孔性媒体で
    ある特許請求の範囲第１〜12項のいずれかに記載の免疫
    反応物定量用多層分析要素。
  14. 【請求項１４】前記多孔性媒体が、非繊維質多孔性媒体
    である特許請求の範囲第１〜12項のいずれかに記載の免
    疫反応物定量用多層分析要素。
  15. 【請求項１５】前記多孔性媒体が、前記不溶性担体によ
    って構成されている特許請求の範囲第１〜12項いずれか
    に記載の免疫反応物定量用多層分析要素。
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