JPH0191795A - 分析要素 - Google Patents

分析要素

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JPH0191795A
JPH0191795A JP24874887A JP24874887A JPH0191795A JP H0191795 A JPH0191795 A JP H0191795A JP 24874887 A JP24874887 A JP 24874887A JP 24874887 A JP24874887 A JP 24874887A JP H0191795 A JPH0191795 A JP H0191795A
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substance
substrate
enzyme
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JP24874887A
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Mitsunori Ono
光則 小野
Hiroshi Shinoki
篠木　浩
Yukio Sudo
幸夫 須藤
Shigeki Kageyama
茂樹 景山
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Fuji Photo Film Co Ltd
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
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    • G01N33/523—Single-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、水性液体、特に体液中の酵素活性の測定や酵
素標識を利用する免疫学的分析に有用な分析要素に関す
る。
［従来技術］ 血液や尿などの体液に含まれる生体成分、薬物等の分析
は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、
臨床検査の分野で重要な役割を持っている。乾式分析要
素を用いて体液などに含有されている生化学物質を定呈
する分析方法が知られている。乾式分析要素では一般に
、被検成分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応
生成物または未反応成分の量を、光学的に、例えば発色
、変色、蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成
分を定量する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に
、しかも高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的
活性物質の分析ができる。
−血清中の各種酵素の活性は診断、治療の上で特に重要
である。乾式分析要素は酵素活性測定にも有用で、かよ
うな乾式分析要素は＾ｎａｌｙｔｉｅａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　　Ｖｏｌ、５５　　Ｎｏ、４．　　ｐ、５０
４＾、　５０６＾（＾ｐｒｉ１１９８３）、　特開昭５
５−１２４４９９号、同５８−１５５１００号。
同６０−４３４００号、同５７−４０６４９号、同５７
−１４４９９６号。
同５７−２０８９９８号、同５９−３００６３号、同５
９−４２８９７号。
同６０−９５３４９号、同６１−１１００５８号等の記
載により知られている。
乾式分析要素は免疫学的分析にも有用である。
例えば特開昭４９−５３８８８号、特開昭５９−７７３
５８号、特開昭５９−１０２３８８号、米国特許４，４
５９，３５８号等に記載されている。免疫学的分析に利
用される抗原抗体反応は、抗原または抗体が互いに対応
する抗体または抗原のみに特異的に反応し結合する反応
であり、自己免疫疾患の診断、生体内機ＩＩ物質の検出
などに広く利用されている。検出感度の比較的高い免疫
分析法として、酵素免疫分析（ＥＩＡ）が知られている
。典型的な方法は特公昭５３−２７７６３号に開示され
ており、酵素を抗原またはその誘導体に結合させて、酵
素標識抗原をつくり、酵素活性に対する抗原の効果の測
定により、被検液中の抗原を分析する方法である。
特開昭５３−１３１０８９号に記載された乾式分析要素
は、酵素の基質、例えば澱粉に、染料のごとき検出可能
の分光吸収を有する発色団を有する化７基を、予め結合
させた非拡散性基質を含む試薬層と、被検物質すなわち
酵素の作用により生じた拡散性の反応生成物を受容する
検出表示層をそなえた多層分析要素である０分析要素の
検出表示層に受容された反応生成物の１に対応して、そ
れの有する染料等の有色化学基が与える吸収の光学濃度
を測定して、被検物質の量が決定される。
しかしこの分析要素では、非拡散性基質に検出可能の分
光吸収を有する発色団を予め結合させているので、未反
応の基質と反応生成物とを光学測定に際し識別できるこ
とが必須である。同公開明細書では、その方法の一つと
して、非拡散性の未反応基質を含む試薬層と、拡散性の
反応生成物を受容する検出表示層の間に、酸化チタン粒
子等を含む光遮断層を設けることを提案している。この
ような配置をもつ分析要素によって定量的な分析をおこ
なうなめには、試薬層中に生じた拡散性反応生成物が光
道１ｔｌｒＮを経て検出表示層に充分拡散するまでの時
間を考慮せねばならず、迅速な定量を特長とする乾式化
学分析において、明らかな不利益をもたらす。
反応生成物の拡散を速めるため、拡散性化合物の色素部
位（検出可能の分光吸収を有する発色団を有する化学基
の部分）に、カルボキシル基やスルホ基のような拡散性
基を２個以上導入する試みがなされている。しかしこれ
らの置換基を導入し得る位置は限られており、またその
導入により、分析の感度を支配する色素部位の分子吸光
係数を低下させる。
［解決すべき技術的課題］ 本発明において解決すべき技術的課題は、検出可能な拡
散性化合物を放出する非拡散性基質を利用して、酵素活
性を測定するか酵素標識体の酵素活性測定を利用する乾
式多層化学分析要素において、迅速な分析を可能にし、
高い分析感度と分析精度を得ることにある。
より具体的には、上記原理に基づく分析要素において、
非拡散性基質を含む層と拡散性化合物を受容する層の間
に光遮断層を必要とせず、従って生成した拡散性化合物
の拡散が速められ、被検物質の活性または量に応じて非
拡散性基質から、検出波長での吸光係数が高く容易に拡
散し得る拡散性化合物が放出されるよう改良された、乾
式分析要素を提供することである。
「発明の構成］ 本発明の上記目的は、少なくとも２つの水浸透性層を有
し、水性液体試料中に含まれる酵素または含有量に応じ
て酵素担持物質を生成もしくは減少するような被検物質
の定量に適する多層乾式化学分析要素であって、前記少
なくとも２つの水浸透性層の１つは酵素の基質を含む基
質層であり、他の１つは呈色反応層であって、前記基質
は一時的に短波化した分光吸収を有する色素部を分子中
に有する非拡散性物質であり、酵素活性物質（酵素活性
を有する物質の意）の存在下で反応して、一時的に短波
化した分光吸収を有する色素部を分子中に有する拡散性
物質を生成することができ、呈色反応層には前記拡散性
物質と反応して一時的に短波化した色素部の分光吸収を
長波化させる反応物質を含むことを特徴とする多層化学
分析要素によって、達成された。
以下、本発明の多層化学分析要素の構成および組成を具
体的に説明する０本発明の実施態様の一例について断面
を第１図に示す、第１図の多層化学分析要素では、光透
過性水不浸透性支持体１０の上に、呈色反応層２０、基
質Ｈ３０がこの順に積層されている。
基質層３０は、極大吸収波長が一時的に短波化した色素
部を有し、酵素である被検物質または被検物質の量に応
じて生成もしくは減少する酵素担持物質（酵素自身ある
いは酵素結合物質）の作用により、水透過性媒体中を水
の存在下に拡散し得る拡散性化合物を生成し得る非拡散
性基質を含む。
この拡散性ｆヒ合物は、前記非拡散性基質に由来する、
極大吸収波長が一時的に短波化した色素部を有する。
呈色反応層２０は、極大吸収波長が一時的に短波化した
色素部を有する拡散性化合物を受容し、この拡散性化合
物の色素部と反応して極大吸収波長を長波長に復色させ
る反応剤を水透過性媒体中に含む。
基質層と呈色反応層はそれぞれ、親水性結合剤から成る
連続層としてもよい０両者とも親水性結合剤から成る場
合、親水性結合剤は互いに同じであっても異なってもよ
い、被検物質、非拡散性基質、拡散性化合物、復色反応
剤の各々またはその組合せに応じて、適当な親水性結合
剤をそれぞれ選択することができる。
非拡散性基質と復色反応剤は、互いに隔離されているこ
とが好ましい、第２図に示すように、基質層３０と呈色
反応層２０の間に、基質と復色反応剤の接触を防止する
ための隔離層４０を設けてもよい、第３図は、本発明の
分析要素の好ましい実施Ｒ称を示す断面図で、光透過性
水不浸透性支持体１０の上に、呈色反応層２０、接触防
止層４０、基質層３０そして展開層５０をこの順に積層
した構成よりなる。
この図について本発明の分析要素の動作（分析の際の過
程）を説明する。被検物質を含有する試料水性液の一滴
が展開層に付着されると、展開層でほぼ均一に展開され
基質層３０に侵入する。基質中では、試料中に含まれる
酵素である被検物質または被検物質の量に応じて生成も
しくは減少する酵素担持物質の作用により、非拡散性基
質から拡散性化合物が生成し、基質Ｎｌ３０から隔離層
４０を通過して、呈色反応層２０に拡散していく。
反応生成物たる拡散性化合物には、非拡散性基質に由来
する一時的に短波化した色素部位が連結しているので、
呈色反応層２０に到達すると、復色反応剤と反応して速
やかに長波長へと復色される。
この反応における波長のシフト幅は３０ｎｍがら１５０
ｎｍの間であり、望ましくは５０ｎｍがら１５０ｎｍで
ある０色素を一時的に短波化し、またそれを速やかに復
色する技術の詳細は後述する。
前記した被検物質は、直接非拡散性基質に作用する酵素
でもよいし、また、被検物質と特異的な蛋白質結合反応
（典型的には免疫学的抗原抗体反応）の結果生成もしく
は減少する酵素担持￥＠質、例えば抗原または抗体の酵
素標識物の酵素反応により、間接的に基質に作用するも
のでもよい、被検物質と被検物質類縁体との競争的な蛋
白質結合反応の結果として、基質に対する作用が変調し
うるような標−された蛋白質を介在させることも可能で
ある。上記の酵素担持物質は、分析要素外の水性媒体中
であらかじめ生成させてもよいし、本発明の多層化学分
析要素の適当な層で生成させてもよい。
被検物質から酵素または酵素担持体を生成するための反
応層を別に設けてもよい、この層は、゛分析要素と一体
化されてもよいし、一時的に接触し得るものでもよい。
非拡散性基質は基質層３０に留まり、酵素反応の結果生
じた拡散性化合物のみが呈色反応１２０に拡散して復色
する。拡散性化合物の量は非拡散性基質に対する酵素活
性に依存するので、結果として酵素活性に対応して色素
が復色されることになり、復色色素量を測定することに
より酵素活性を知ることができる。被検物質が酵素でな
く、被検物質がその景に応じて生成もしくは減少する酵
素担持物質を生成するか減少させる物質である場合には
、酵素担持物質の酵素活性を知ることができるので、被
検物質の量を知ることができる。
色素量の測定には、色素の吸収波長領域における透過又
は反射による光学的測定が適しているが、目的や必要精
度によっては、目視により判定してもよい。
次に本発明の基質層に含まれる一時的に短波化した色素
部を有する非拡散性基質と、呈色反応層に含まれる復色
反応剤との反応を原理的に説明する。これは、色素の助
色団が解離した状態と非解離の状態で波長の吸収極大値
が変化するいわゆる１１ｏ１ｏｅｌ＋ｒｏｍｉｓｍとい
う現象に基づいている。
Ｈｏｌｏｅｈｒｏｍｉｓ＋ｓを示す色素の具体的例につ
いては、例えばＪ、Ｆａｂｉａｎ、　Ｉｌ、ｔｌａｒＬ
＋５ａｎｎ著、Ｌｉｇｌ＋ｔ　Ａｂｓｏｒｐ−Ｌｉｏｎ
　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏ１ｏｒａｎＬｓ＋Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ刊に詳しく記載されている６
本発明において検出に用いられる色素部位の極大吸収波
長は、４５０ｎｎ〜６５０ｒｏａであり、望ましくは５
００ｎａｒ〜０５０ｎｍである。
本発明において用いられる色素部位の助色団は、呈色反
応後、例えば中性の水性雲囲気下においても、解離して
いる必要がある。従って助色団のｐＫａ値は６．０以下
のものが望ましい、しかし呈色反応層または検出層に媒
染剤を含む場合は、この限りではない、非拡散性基質の
色素部助色団を非解離の状態に固定する目的で使われる
基としては、（有機化学的に言えば、反応性基を保護す
る目的と換言できる）求核剤の攻撃で開裂する基であれ
ばどのようなものでもよく、これに関しては、例えばＪ
、ＦＪｌ、マコーミー編の「プロテクテイブ・グループ
・イン・オーガニック・ケミストリーＪプレナムプレス
社刊（１９７３年）や、ＴＪ、グリーン著「プロテクテ
イプ・グループ・イン・オーガニック・シンセシス」ウ
ィリーインターサイエンス社刊（１９８１年）に詳しく
記載されている中から選択することができる。また呈色
′反応層において、拡散性基質の非解離色素部を解離さ
せる目的で使われる化合物は、求核剤であれば任意のも
のでもよいが、具体的には、１級アミン、２級アミン、
チオール、アルコキシドのような化合物、または通常の
ｐＫａ値から予測される以上に高い求核力を持つヒドロ
キサム酸、オキシム類、ヒドラジン類、ヒドロキシルア
ミン類のようないわゆる「α効果を有する」求核剤を挙
げることができる。α効果に関しては、Ｇ、クロップマ
ン編「ケミカル・アクティビティ−・アンド・リアクシ
ョン・パス」ウィリイー・インターサイエンス社刊（１
９７４年）の２０３頁〜２２１頁に詳細に解説されてい
る。上記の求核剤はそのまま用いることもできるし、場
合によっては、高分子化して用いてもよい。
またこれら求核剤を耐拡散化させるために、求核剤をあ
らかじめ疎水性の油状物質中に溶解、又は粒子中に局在
させた状態で、親水性バインダー中に分散させてもよい
。
本発明において、非拡散性基質に、助色団が保護された
色素部を結合させる方法には、染料業界で広く用いられ
ている「反応性染料」の技術が用いられる。染料業界で
は、各種天然ＩＢ維に染料化合物を物理的に吸着させる
他に、化学結合を形成させ、より好ましい染色状態を得
ている。この時用いられる染料が反応性染料であり、 に、Ｖｅｎｋａｔａｒｍａｎ編”ＴＩ＋ｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｂｅＬｉｃＤｙｅｓ”第４巻
、Ａｃａｃｌｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社刊（１９７２年）
にこの反応性染料が詳しく述べられている。特に天然高
分子である多糖類、例えばセルロースやでんぷん、蛋白
質繊維である羊毛、絹等の分子と染料分子を結合する「
連結基」は詳しく記載されており、これらの技術を参考
にして非拡散性基質の合成を行うことができる。保護さ
れた色素部を有する非拡散性基質は、例えば酵素反応に
より、低分子化され、基質層から呈色反応層へ親水性媒
体中を拡散する必要があるので、可溶性基、例えばスル
ホ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、四級アンモニ
ウム基を有することが好ましい。このような可溶性基は
、連結基の一部に導入されていても、助色団の保護基に
導入されていてもよい。
次に助色団が保護された色素部の具体例を示す。
ここに示すのは一例であり、これらに限定されるもので
はない。
（次ページに続く） Ｄ−１解離１！ｔ　　λＩＩＩａｘ　５２０ｎｍ（Ｈ２
Ｏ）ε：３００００　（Ｈ２Ｏ） ε：２７０００　（ＩＩ□０） ＳＯ７ＣＨ３ Ｄ−３解Ｍ、後　λｗａｘ　６４０ｎｍ（ＨｚＯ）ε：
６００００　（Ｈ２Ｏ） Ｄ−４解離後　λＩＩＩａｘ　５２０ｎｍ（Ｈ２Ｏ）ε
：３５０００　（Ｈ２Ｏ） Ｄ−７解離後　λｗａｘ　５３０ｎｍ（Ｈ２Ｏ）ε：３
２０００　（Ｉｔ□０） ε：８９０００　（Ｉ（２０） ＳＯ，Ｎａ Ｄ−１２解離後　λｍａｘ　６３０ｎｍ（ＨｚＯ）ε・
６８０００　（１１２０） Ｄ−１３解離後　　λｍａｘ　５１５ｎｍ（ＩＩ２０）
ε・３５ＱＱＱ　　／１１．Ｑ：Ｉ ＳＯ，ＮＨ− Ｄ−１７解離後　λｍａｘ　６１０ｎｍ（Ｈ２Ｏ）ε・
８９０００　（ＩＩ□０〉 Ｄ−１８、解ｉ後　λｗａｘ　５２０ｎｍ（１１２０）
ε＝３３０００　（ＬＯ） ＯＪａ Ｄ−１９解離後　λｗａｘ　６３０ｎ＋ａ（Ｈ２Ｏ）ε
：９２０００　（８２０） 以下に本発明で用いられる一時短波化した色素部を有す
る非拡散性基質のき成の具体例を示す。
上記反応式中、化合物λの合成： メタノール（２５０ｉ１）　、エチレンゲルコールモノ
メチルエーテル（２５ｚ１）　、酢酸ソーダ（１３，５
ｇ）の混合液に化合物１　（１９，５ｇ、０．０５ｍｏ
ｌ）を加える。
この溶液にスルファニル酸ナトリウムのジアゾ溶液’　
（０，０５２５ｍｏｌ　）を１０℃を越えないようにし
て滴下する。５℃〜１０℃で一時間、その後室温で１時
間撹拌する。析出して来る赤色結晶を濾取し、メタノー
ル／エタノールの混合溶媒で再結晶し、化合物２工（１
６，２ｇ　　５４．４％）を得た。
ｍ、ｐ、２４５°〜７６　λｍａｙ＝５０５ｎｍＩＩ４
．Ｆ、Ｆｉｅｓｅｒ；　Ｏｒｂ、　５ｙｎｔｈ、　Ｃｏ
１１．Ｖｏｌ、ＩＩ、　ｐ、３５化合物ｌの合成： 水酸化ナトリウム（５ｙ）　、水（１０４ｘｌ　）の溶
液に化合物２（１５ｇ、８．３９ｍ＋ａｏｌ　）を結晶
のまま加える。室温で１．５時間撹拌後、飽和飽和食塩
水（５００ｘｉ）を加え、次に酢酸（１０１１１）を滴
下する。析出して来る黒赤色の結晶を濾取し、デシケー
タ−で乾燥し、化合物３　（１０，９５ｇ、８７％）を
得た。
ｍ、ｐ、＞２５０’ 化合物工の合成ニ アセトニトリル（１０ｚｉ））　、メタースルホ安息香
酸シク０　！Ｊ　Ｆ　（３００履ｙ、１．２５ｍｍｏｌ
　）の溶液に化合物３　（５００ｚｇ、ｌｓｍｏｌ）の
水（１０ｚ１）　、　１，１，３．３−テトラメチル尿
素（０，５ｚ１）溶液を滴下する。室温で１０分間撹拌
後、飽和食塩水（１５０ｘ１）に反応液を注ぐ、析出し
て来る物質を濾取し、これをクロロホルム、アセトンに
溶解し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し
、化合物４（２７０ｙｔｇ、３，８４％）を得た。
鴎、ｐ＞２５０゜ λ−ａｘ−５１Ｏｎ糟分子吸光係数（ε値）　＝２３０
００化合物ｉの合成： 化合物４（１，Ｏｙ、１．４２ｍｍｏｌ）を７セ）　＞
　（８０＋＋１）に溶解し、０〜５℃に冷却する。この
溶液にトリエチルアミン（０，８ｚ１）をゆっくり滴下
する。次にアセチルクロリド（１，２ａ＋Ｉｌ）を加え
、徐々に室温まで上げる。室温で一時間撹拌後、ろ過す
る。濾液に酢酸エチルエステル（３０ｈｌ　）を加える
。
３％塩酸水（５０ｄＸ３）　、飽和食塩水（５０ｚｌ　
Ｘ　３　）で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶
媒を減圧留去し化合物５　（５５０℃ｇ、５１．９％〉
を得た。
輪、ｐ＞２５０゜ ニトロアミロペクチン体の合成： ピリジン（２４（ｈｌ　）に、アミロペクチン（シグマ
社ボデト由来）１４ｇ、ｐ−ニトロフェニルイソシアネ
ー）　（２，４５ｇ）を加え１００℃で２０時間撹拌す
る。冷却後、アセトン（１１）を加え、濾取する。
アセトン、エタノール〈１１）で良く洗浄後、真空ポン
プで乾燥し、ニトロアミロペクチン体（１５ｇ）を得た
０元素分析（窒素の含有率）よりグルコース単位で４０
個に１個置換されたことに相当する。
アミノアミロペクチン体の合成： 水（５２０ｘ１）に上記のニトロアミロペクチン体（１
３ｙ）　、ハイドロサルファイドナトリウム（３，９２
）を加え、７０〜７５℃で一時間撹拌す、冷却後エタノ
ール（５００ｍ１’　）をぬっくり加える。デカントに
より析出する塊を分離し、この塊をエタノール−水（１
：１）溶液で良く洗浄する。乾燥し、アミノアミロペク
チン（５，３ｂ）を得た。
化合物β−の合成； ＤＭＡＣ（１６ｚｉ’）　、水（１ｍｌ　）の混合溶媒
にアミノアミロペクチン（８２０ｚｆＩ）を加え良＜ｔ
ａ甘する。この溶液に化合物５　（３２０ａｙ）　ノＤ
ＭＡＣ（２ｚｆ）溶液を加えると黄色物質が析出する。
濾取し、メタノール／クロロホルムで十分に洗浄する。
乾燥し、−時短波化色素アミロペクチン（化合物、Ω−
に相当）３００′ＩＦＩを得た。
本発明において、−時短波化した色素部を有する拡散性
基質を長波長に復色させるために用いる求核性反応剤の
具体例を以下に示す。
（Ｃ２Ｈ５ｈＮＣＨｚＣＯＮＣＨｓ ■ Ｈ （Ｃ＋ｉＨ２１）２Ｎ　ＣＨ２ＣＯＮ　ＣＨｙ■ 　Ｒ （Ｃ＋ｚＨｚｓ）２Ｎ　ＣＨｚＣＯＮ　ＨＯＨ−（ＣＨ
２−ＣＨ）ｎ　− ０ＮＣＨ３ ＣＨｚｃ　ＯＮ　Ｉ（（ＣＨ２）２Ｎ　Ｈ２分子量２万
ないし５ｏ万 −（ＣＨ２−ＣＨ）ｎ　　− ＣＨ，ＮＨ２ 分子量２万ないし８万 −（ＣＨｔ−ＣＨ）ｎ　− ＣＯＮＨＣＨｚＣＯＮＨ（ＣＨｚ）ｚＮＨ２ＴｏｓＬｔ
ｐ−トルニジスル番トド　アニオンを示す。
分子Ｊ１２万ないし５０万 （次ページに続く） 本発明の分析要素において基質層は、分析要素の最上層
であってもよいし、最上層と呈色反応層の間にある層で
もよい、基質層が層状の連続相に非拡散性基質を含むも
のである場合、基質層は塗布により形成することができ
る。この場合、基質自身が高分子であるので、結合剤を
用いずに溶液を塗布して基質層を形成することもできる
。
また１種又は２種以上の親水性ポリマー溶液中に基質を
溶解又は分散した液を、塗布、乾燥する方法を用いるこ
とができる。基質層の塗布に用いうる親水性高分子とし
ては例えば、ゼラチンおよびその誘導体（例えばフタル
化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリルアミド、
ポリメタアクリルアミド、アクリルアミドまたはメタア
クリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ポ
リヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体、
マレイン酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体等があ
げられる。
これらのうちから、試料液や被検物質の特性、反応系、
塗布特性などを考慮して適当なものを選択する。
基質層にはその他に塗布性能、拡散性化合物の拡散性、
反応性、保存性などの諸性能の向上を目的とし７て、酵
素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ″Ａ節用試薬
、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物
からなる各種添加剤を加えることができる。
基質層は、多孔質層であってもよい、多孔質層は繊維質
であってもよいし、非繊維質でもよい。
天然繊維から成る布、合成または半合成１１維から成る
布、不織布、紙、酢酸セルロース等から成るメンブラン
フィルタ−２無機物または有機物粒子の結合体等のいず
れでもよい０例えば特開昭５５−１６４３５６号、同６
０−２２２７６９号等に記載された繊維質層のほか、特
開昭４９−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３号、
同６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号、同
６〇−２７９８５９号、同６０−２７９８６０号、同６
〇−２７９８６１号等に記載されたような多孔性層も好
適である。多孔質層は、供給される液体の量にほぼ比例
した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する
液体展開層（以下、展開層ということもある）であって
もよいし、それ以外でもよい。
例えば紙、布、高分子から成る多孔質膜などに、基質を
予め含浸または塗布した後；支持体上に設けた他の水浸
透性層、例えば呈色反応層の上に、特開昭５５−１６４
３５６号のような方法で接着させるのも有用な方法であ
る。基質を予め含浸、塗布等により含有させた多孔性層
を、支持体上に設けた他の多孔質層、例えば呈色反応層
の上に、例えば特開昭６１−４９５９号等のような方法
で接着させる方法も適用できる。別の方法として、多孔
性層を他の水浸透性層（例えば呈色反応層）の上に前記
のような方法で接着させた後、基質を含む組成物を多孔
性層に塗布してもよい。
多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。
基質層の厚さは特に制限はないが、塗布層として設ける
場合には１μｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３
０μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など
塗布以外の方法による場合、厚さは数十μｍから数百μ
ｍの範囲で大きく変化し得る。
本発明の分析要素の呈色反応層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１−４９５９号、特願
昭６０＝２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、同
６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に記
載されたような多孔性層も利用できる。親水性ポリマー
として例えば、ゼラチンおよびその誘導体（例えばフタ
ル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシ
エチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウ
ム、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合体
、アクリルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニ
ル性モノマーとの共重合体、ポリヒドロキシエチルメタ
クリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体、マレイン酸と各種ビニル
性モノマーとの共重合体等が利用できる。
多孔性層に復色反応剤を含浸または塗布するには公知の
方法を利用できる。塗布には例えばデイツプ塗布、ドク
ター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を利用できる
。
呈色反応層には親水性バインダーのほか、塗布特性、拡
散性化合物の拡散性、反応性、保存安定性などの諸性能
の向上を目的として、界面活性剤、ｐ）［調節用試薬、
微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物か
らなる各種添加剤を加えることができる。呈色反応層に
含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、
ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏｅｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ誌　第
５巻　第２号、４６７ページより４７７ページ（１９６
６年）に記載されているグツド（Ｇｏｏｄ　）の緩衝剤
などを挙げることができる。
免疫分析によって体液中のｉｔ量の被検物質（以下、リ
ガンドと言う）を測定する際、酵素免疫測定法は有効な
測定手段である０本発明の分析要素は、酵素免疫測定法
における酵素標識体の活性（またはその存在量）を測定
するのに有用であり、本発明の分析要素により前記リガ
ンドの存在量を測定する事ができる。
前記標識酵素は、前記リガンドまたはその誘導体と結合
していてもよいし、リガンドに対する抗体に結合してい
てもよい、リガンドの誘導体とはりガントにアミノ基、
カルボキシル基、チオール基等、あるいはそれらのさら
に置換基を有するものが導入されたものを言う０例えば
１７−α−ヒドロキシプロゲストロンに対して１７−α
−ヒドロキシプロゲストロン−４−カルボキシエチルチ
オエーテルがその誘導体である。リガンドの誘導体の他
の例は、石川栄治編「酵素免疫測定法１第２版　医学書
院１９８２年に記載されている。
抗原または抗体の酵素標識体を用いる場合、標識のため
に種々の酵素を選ぶことができる。充分高い酵素活性が
得られること、酵素の安定性、酵素活性への結合の影響
等を考慮して、酵素が選択される。特表昭５６−５００
９０１号明細書の第１表および第２表に記載されたもの
から選ぶことができる０代表的なものは、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、
セルラーゼ、デキストラナーゼ等である。
抗原または抗体に酵素を結合させる方法および本発明に
用いることができる酵素標識抗原については、石川栄治
ら：「酵素免疫測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）、　
河合忠編：「臨床検査技術全書４免疫血清検査」（医学
書院、１９７７年発行）、９７−１０２頁、Ｂ　ｉｏｃ
ｂｅｍ　、　Ｂ　１ｏｐｂｙｓ　、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ
ｍｕｎ、　、７４．５３８（１９７７）、Ｃｌ１ｎｉｃ
ａ　　Ｃ１＋１ｍ１ｃａ　　Ａｃｔａ　　、８３，１６
１（１９７８）等の記載が参照できる。標識抗原および
抗体の具体例として　α−アミラーゼ結合ヒト免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ）、ＡＬＰ結合ＩｇＧ、セルラーゼ標識
α−フェトプロティン等がある。
本発明の分析要素が酵素免疫測定法に利用される際、好
ましいのは次の“ような実施態様である。
例えば、リガンドを含有していることが期待される検体
と、リガンド又はその誘導体と酵素との結合物（標識リ
ガンド）、及びリガンドに対する抗体を、あらかじめ水
性媒体中で反応させる。その後、本発明の分析要素に前
記反応液を滴下する方法がある。この時、抗体に結合／
非結合の標識リガンドを分離する操作を含んでもよい。
分離操作は例えば　石川栄治ら：酵素免疫測定法（医学
書院、１９８２年）に記載されている。
また他の例として、リガンドを含有していることが期待
される検体と、リガンドに対する抗体又はその誘導体と
酵素との結合物（標識抗体）を、あらかじめ水性媒体中
で反応させる。その後、本発明の分析要素に前記反応液
を滴下する方法がある。この時、リガンドが結合／非結
合の標識抗体を分離する操作を含んでもよい。
さらに好ましい例として、前記標識リガンドおよびリガ
ンドに対する抗体、または標識抗体のすべてまたは一部
が、本発明の分析要素の適当な層に含有されていてもよ
い。また、本発明の分析要素の上に分析の実施の際に、
これらを含有する新たな層を設けてもよい。
本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接着層、ろ過層、吸水層、下塗り
層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい、かよ
うな分析要素として、米国特許第３，９９２，１５８号
、同４，０４２，３３５号および特開昭５５−１６４３
５６号各明細書に開示されたものがある。
光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に呈
色反応層、その上に基質を含む展開層を有するもの。
（２）支持体上に検出層、呈色反応層、基質を含む展開
層をこの順に有するもの。
（３）支持体上に検出層、光反射層、呈色反応層、基質
を含む展開層をこの順に有するもの。
（４）支持体上に呈色反応層、基質層、展開層をこの順
に有するもの。
（５）支持体上に検出層、呈色反応層、基質層、展開層
をこの順に有するもの。
（６）支持体上に検出層、光反射層、呈色反応層、基質
層、展開層をこの順に有するもの。
呈色反応層は複数の層から成ってもよい。支持体と、呈
色反応層または検出層との間には吸水層を設けてもよい
、上記（４）ないしく６）において基質層と展開層の間
に光反射層を設けてもよい。
基質層と展開層または呈色反応層との間にはろ過層を設
けてもよい、光反射層と展開層の間などにも、ろ過層を
設けてもよい。
検出層とは一般に、被検成分の存在下で生成した色素等
が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得
る層で、親水性ポリマーにより構成することができる。
媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリ
マーを、含んでもよい、吸水層は一般に、被検成分の存
在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言
い、膨潤しやすい親水性ポリマーにより構成することが
できる。
光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンテレフタレートである０ｍ水性層を強固に
接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親水化処理
を施す。
多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、面の方向に単
位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。
展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、濾紙
、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例
えば、トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。展開層としては、織物、編物等が好ましい、
織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載されたような
グロー放電処理をしでもよい、展開層には、展開面積、
展開速度等を調節するため、特開昭６０−２２２７７０
号、特願昭６１−１２２８７５号、６１−１２２８７６
号、６１−１４３７５４号に記載したような親水性高分
子あるいは界面活性剤を含有してもよい。
多孔性層を接着し積層するための接着層を呈色反応層、
光反射層、濾過層、吸水層等の層の上に設けてもよい、
接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着することが
できるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなることが
好ましい。
光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試ト１が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を
遮蔽するとともに、背景層としても機能する。光反射層
は、親水性ポリマーをバインダーとして、酸化チタン、
硫酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸透性
の層であることが好ましい、バインダーとしてはゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい
０分析要素には、光反射層を設ける代わりに、またはそ
れと同時に、展開層、基質層、呈色反応層、検出層等の
少なくとも１つに、酸化チタン等の光反射粒子を含有さ
せてもよい。
［参考例］ （１）呈色試験素子の作製 ゼラチン下塗りしである１８０μ瀧のポリエチレンテレ
フタレート無色透明平滑フィルム上に、下記の組成［Ａ
］の溶液を乾燥後の厚さが１２μｌとなるように塗布し
、乾燥した（試薬層）。
［Ａコ ゼラチン　　　　　　　　１０ｇ 蒸留水　　　　　　　　１９０ｄ 化合物例　Ｎ−５３ｇ 上記試薬層の上に５％ゼラチン水溶液を乾燥後の厚さが
２μｌどなるように塗布し、乾燥した（タイミング層）
。
試薬層とタイミング層を約３０ｙ／１１２の水で湿らせ
た後、ポリエチレンテレフタレート紡績糸（３６ゲージ
）からなるトリコット編物を圧着し乾燥させて展開層と
した。こうして作製した呈色試験フィルムを１５×１５
ｍｍに裁断し、直径１０ｍｍの窓を有する２４×２８ｍ
ｍのプラスチック製フレームに装着して、呈色試験素子
を作製した。
比較のために、上記組成［Ａ］から化合物例Ｎ−５を省
いた呈色試験素子も作製した。
（２）呈色試験 合成例の化合物ｉの０　、５　ｍｇ／社水溶水溶液１０
μｌ上記呈色試験素子の展開層の上に滴下した。
富士ドライケム１０００（富士写真フィルム株式会社製
）アナライザーを用いて、温度３７℃における波長５１
０ｎｍの反射光Ｓ？−濃度の変化を観察した。結果は第
４図の通りであった０合成例の化合物ｉは呈色試験素子
内で脱アシル化されて、吸収波長が長波にシフトするこ
とがわかる。
［実施例］ ゼラチン下塗りしである１８０μ肩のポリエチレンテレ
フタレート無色透明平滑フィルム上に、下記の組成［Ａ
］の溶液を乾燥後の厚さが１２μｌとなるように塗布し
、乾燥した（試薬層）。
［Ａ］ ゼラチン　　　　　　　　１０ｇ 蒸留水　　　　　　　　１９０ｍ＋１ 化合物例　Ｎ−５３ｇ 上記試薬層の上に５％ゼラチン水溶液を乾燥後の厚さが
２μｌとなるように塗布し、乾燥した（タイミング層）
。
試薬層とタイミング層を約３０ｇ／ＩＩ２の水で湿らせ
た後、ポリエチレンテレフタレート紡績糸（３６ゲージ
）からなるトリコット編物を圧着し乾燥させて展開層と
した。
上記展開層に下記組成［Ｂ］を有する塗布液を１２０　
ｖ＊１／ｗ”の割合で塗布し、乾燥した。
［Ｂコ 合成例の化合物β−３ｇ ノニルフェノキシ ポリエトキシエタノール＊　　　０．２ｚｇ蒸留水　　
　　　　　　　ＬＯＯｘｌ ＊ｎ＝＝１０ こうして作製した呈色試験フィルムを１５×１５＋１輪
に裁断し、直径１０ｍｍの窓を有する２４×２８−一の
プラスチック製フレームに装着して、アミラーゼ活性測
定用乾式分析要素（１）を完成した。
比較のため、上記組成［Ａ］から化合物例Ｎ−５を省い
た分析要素（２）も作製した。
上記分析要素にヒト唾液アミラーゼ（シグマ社製）をそ
れぞれ０，２５０，５００．１０００単位７ｍｌ含有す
る緩衝溶液（Ｔｒｉｓ　−１−Ｉ　Ｃ１５０ｍＭ、ｐｉ
−１７）を各１０μｌ点着し、富士写真フィルム（株）
製「富士ドライツム１００ＯＪアナライザの光学系を用
いて温度３７℃で６分反応後の波長５１０ｎｍでの反射
光学濃度を測定した。得られた結果を第１表に示す。第
１表から明らかなように、本発明のアミラーゼ活性分析
要素は２５０〜１０００単位／ａｌｌの範囲のアミラー
ゼ活性に対し良好な呈色（復色）を示す。
第１表
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図、第３図は分析要素の断面図である。 第４図は、呈色試験素子の光学濃度変化を示すグラフで
ある。 出願人　　富士写真フィルム株式会社 第１図 第２図 第３図 第４図 反応時間（分） 手続補正書 （自発） １、事件の表示 昭和６２年特許願第２／１８７４１ 、発明の名称 分析要素 ３、補正をする者 事イ１どの関係　　　　特許出願人 性　所　　　神奈川県南足柄市中沼２１Ｏｆｆｌ地名　
称（５２０）富士写真フィルム株式会社連絡先　東京都
港区西麻布２丁目２６番３０月富士写真フィルム株式会
社　東京本社 電話（４０６）２５３７ ４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 、〜ゝ、　　　←−−−　４　− ５、補正の内容 明細書のｒ発明の詳細な説明」の欄の記載を下記の通り
補正する。 １）明細書第１２ページ第１行および第２行のｒ　Ｈｏ
１ｏｃｈｒｏ請ｉｓ＋＊　Ｊをそれぞれｒ　ｈａｌｏｃ
ｈｒｏｍｉｓｍ　Ｊに補正する。 ２）同第１３ページ第１３行の「ケミカル・ア」を「ケ
ミカル・リア」と補正する。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）少なくとも２つの水浸透性層を有し、水性液体中
    の特定成分の分析に適する多層乾式化学分析要素であつ
    て、 前記少なくとも２つの水浸透性層の１つは酵素の基質を
    含む基質層であり、他の１つは呈色反応層であって、 前記基質は一時的に短波化した分光吸収を有する色素部
    を分子中に有する非拡散性物質であり、酵素活性物質の
    存在下で反応して、一時的に短波化した分光吸収を有す
    る色素部を分子中に有する拡散性物質を生成することが
    でき、 呈色反応層には前記拡散性物質と反応して一時的に短波
    化した色素部の分光吸収を長波化させる反応物質を含む
    こと を特徴とする分析要素。
  2. （２）前記基質が被検物質の酵素活性により前記拡散性
    物質を生成する特許請求の範囲（１）の分析要素。
  3. （３）前記基質が被検物質の量に応じ生成または減少す
    る酵素担持物質の酵素活性により前記拡散性物質を生成
    する特許請求の範囲（１）の分析要素。
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