JPS62138198A - 自己顕色性基質を含む乾式液体分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 パラニトロフエノール色素を解離する自己顕色性基質は
近年中広く開発されて来た。特に各種オリゴ糖（ｆｌＩ
えばＧ５．Ｇ７）にパラニトロフエノール色素（ＰＮＰ
と略記される）を導入した例えばＧ５ＰＮＰやＧ７ＰＮ
Ｐと、グルコシダーゼ酵素を用いたアミラーゼ分析法は
従来の澱粉を反応性染料で染着した色素澱粉基質例えば
ブルースターチ、アミロペクチンアズールを用いて分子
量分布の差異を利用して沈澱を生成させ定量する“色素
澱粉法”　（例えばＨ，Ｕ、ベルブマイヤー１、Ｕ、Ｂ
ｅｒｇｌｅｙｅｒ著　メソッズ・オプ・エンザイマテツ
ク・アナリシス　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　　Ｅｍｚｙｍ
ａｔｉｅＡｎａｌｙｓｔｓ　　８９４ページ参照）に比
較して定量性、正確度の点で秀れており、かつ又酵素反
応の連続監視分析（狭義のレイトアッセイ）できる利点
を有する。

しかしながら、パラニトロフエノール色素は、ｐｎ指示
薬であり、反応系のｐＨによって吸光度が大きく変わる
、すなわちｐＨによって解離状態が大きく変化する欠点
を有する。

例えばパラニトロフエノールのρＫ（解離定数の逆数の
対数）は７．２であり、アミラーゼの至適ｐＨ７，０附
近では、基質から放出されたパラニトロフエノールの内
で５０％囚の解離しかしていない、（臨床病理６月臨時
増刊特集５５号、降矢震著、Ｐ、２０５参照） そこで、Ｇ５ＰＮＰやＧ７ＰＮＰを基質とするアミラー
ゼ活性測定においては、この本来の連続監視分析能を犠
牲にしてイ）酵素反応及び口）高ｐｎ液を添加した酵素
反応停止後の測光の二段階反応によって、解離したパラ
ニトロフエノール色素を完全解離させ（検出感度を上げ
て）測光する方式が多く採用されている。

このオリゴ糖にパラニトロフエノールを導入した修飾オ
リゴ糖とグルコシダーゼ酵素を用いたアミラーゼ分析法
を乾式分析要素に導入した場合も、アミラーゼ反応次い
でグルコシダーゼ反応にょって放出されたパラニトロフ
エノールの解離は不充分であり感度が低い重大欠点を有
していた。特に一体型多層分析要素では層が互に液体接
触の状態にあり、ｐＨは実際上等しくなるため、アミラ
ーゼ及びグルコシダーゼの至適ｐＨとパラニトロフエノ
ールの充分な解離の両方を満足させることが困難であっ
た。また前記の二段階反応による方法は、乾式分析法の
利点である簡便性と迅速性を著しく損うものである。

一方、バラニトロフェニルフォスフェートを自己顕色性
基質として用い酸性フォスファターゼの活性を測定する
場合にも、一体型多層分析要素の試薬層を酵素の至適ｐ
ＨであるｐＨ４に緩衝したのでは、遊離したパラニトロ
フエノールが全く解離せず、全く発色は得られなかった
。パラニトロフエノールが解離し発色するｐＨ領域、す
なわちｐＨ７゜２以上に試薬層のｐｔ＋を保つと、酵素
による基質からのパラニトロフエノールの解離が進まず
、短時間内にはパラニトロフエノールの発色が得られな
い。

〔発明の目的〕

本発明の目的はパラニトロフエノールを解離する自己顕
色性基質を、水保持性を有する担体中に含み、該基質に
対して活性を有する酵素の活性を測定するための乾式分
析要素において、パラニトロフエノールが充分に解離し
ないｐＨ域に至’１４ｐＨを有する酵素に対しても充分
高い感度を実現することにある。

〔発明の要旨〕

上記目的は、パラニトロフエノールを解離する自己顕色
性基質を、水保持性を有する担体中に含み、該基質に対
して活性を有する酵素の水性液体中の活性を測定するた
めの乾式分析要素であって、パラニトロフエノールをエ
ーテル結合又はエステル結合で分子中に有する自己顕色
性基質とカチオン性ポリマーをそれぞれ水保持性を有す
る担体の少くとも一つに含有する乾式分析要素によって
達成された。該基質と該ポリマーは、同じ担体中に含ま
れてもよく、異なる担体中に含まれてもよい。

さらに、本発明の前記目的は、水下滲透性支持５一 体と液体計量作用を有する多孔性液体展開層を少くとも
有する多層乾式分析要素であって、パラニトロフエノー
ルをエーテル結合またはエステル結合により分子内に有
する自己顕色性基質を該液体展開層中に含み、かつカチ
オン性ポリマーを該液体展開層または該液体展開層と液
体接触関係にある他の適宜の水滲透性の層に含むことを
特徴とする多層乾式分析要素によって、より好ましく達
成された。

〔発明の具体的構成〕

本発明によって分析するに好適な酵素の代表例を、それ
ぞれの酵素に対して用いられる自己顕色性基質に対応さ
せて、第１表に示した。酵素としては１つでも良く、ア
ミラーゼとグルコシダーゼとの組合せの様に組合せても
良い。

第１表に示したちの以外にもアミラーゼに対する自己顕
色性基質として、非還元末端がブロックされたオリゴ糖
のバラフェニルグルコシドを用いることができ、それら
の例は特開昭５９−３１６９９号、同５９−５１８００
号に記載されている。

６一 本発明に用いることのできるカチオン性ポリマーとは、
二級及び三級アミノ基を含むポリマー、含窒素複素環部
分をもつポリマー、これらの４級カチオン基を含むポリ
マーなどで分子量が５，０００〜２００，０００、特に
１０，０００〜５０゜０００のものである。

例えば 米国特許２，５４８．５６４号、同２，４８４゜４３０
号、同３，１４８．０６１号、同３，７５６．８１４号
、特開昭５２−１３６６２６号、明細書等に開示されて
いるビニルピリジンポリマー、及びビニルピリジニウム
カチオンポリマー；米国特許３，６２５．６９４号、同
３，８５９゜０９６号、同４，１２８．５３８号、英国
特許１゜２７７．４５３号明細書等に開示されているゼ
ラチン等と架橋可能なポリマー； 米国特許３，９５８．９９５号、同２，７２１゜８５２
号、同２，７９８．０６３号、特開昭５４−１１５２２
８号、同５４−１４５５２９号、同５４−１２６０２７
号明細書等に開示されている水性ゾル型カチオン性ポリ
マー； 米国特許３，８９８，０８８号や特開昭５５−３３１７
２号明細書に開示されている水不溶性カチオン性ポリマ
ー； 米国特許４，１６８．９７６号（特開昭５４−１３７３
３３号）明細書等に開示の染料と共有結合を行うことの
できる反応性媒染剤； 更に米国特許３，７０９，６９０号、同３，７８８．８
５５号、同第３，６４２．４８２号、同第３．４８８．
７０６号、同第３，５５７．０６６号、同第３．２７１
．１４７号、同第３，２７１．１４８号、特開昭５０−
７１３３２号、同５３−３０３２８号、同５２−１５５
５２８号、同５３−１２５号、同５３−１０２４号明細
書に開示しであるカチオン性ポリマーを挙げることが出
来る。

その他、米国特許２，６７５，３１６号、同２゜８８２
．１５６号明細書に記載のカチオン性ポリマーも挙げる
ことができる。

これらの内、親水性コロイド層から他の層に移動しにく
いものが好ましく、例えば、ゼラチン等の親水性コロイ
ドと架橋反応するもの、水不溶性カチオン性ポリマー、
及び水性ゾル（又はラテックス分散物）を好ましく用い
ることが出来る。

特に好ましいカチオン性ポリマーを以下に示す。

（１）４級アンモニウム基をもち、かつゼラチンと共有
結合できる基（例えばアルデヒド基、クロロロアルカノ
イル基、クロロアルキル基、ビニルスルホニル基、ピリ
ジニウムプロピオニル基、ビニルカルボニル基、アルキ
ルスルホノキシ基など）を有するポリマー 例えば （２）下記一般式（■）で表わされるモノマーの繰り返
し単位と他のエチレン性不飽和七ツマ−の繰り返し単位
とからなるコポリマーと、架橋剤（例えばビスアルカン
スルホネート、ビスアレンスルホネート）との反応生成
物。

Ｑ；　２価基 Ｒ３，Ｒ，、Ｒ５；アルキル基、アリール基、またはＲ
３〜Ｒ５の少くとも２つが結合してヘテロ環を形成して
もよい。

Ｘ；　アニオン （上記のアルキル基、アリール基は置換されたものも含
む。） （３）下記一般式（■）で表わされるポリマー一般式（
■） 青。

Ｘ；　約０．２５〜約５モル％ ｙ；　約０〜約９０モル％ ２；　約１０〜約９９モル％ Ａ；　エチレン性不飽和結合を少な（とも２つもつモノ
マー Ｂ；　共重合可能なエチレン性不飽和モノマーＱ；Ｎ、
Ｐ Ｒ，、Ｒ２，Ｒ３ｉアルキル基、環状炭化水素基、また
Ｒ１−Ｒ２の少くとも二つは結合して環を形成してもよ
い。

（これらの基や環は置換されていてもよい、） （４）下記一般式（ＩＸ）で表わされる（ａ）、　（ｂ
）及び（（１）から成るコポリマー 一般式（ＩＸ） Ｘ；　水素原子、アルキル基またはハロゲン原子。（ア
ルキル基は置換されていてもよい、） 山）寡　　アクリル酸エステル （Ｃ）；　　アクリルニトリル （５）下記一般式（Ｘ）で表わされる（り返し単位を１
／３以上有する水不溶性ポリマー 一般式（Ｘ） Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３；それぞれアルキル基を表わし、Ｒ１
−Ｒ３の炭素数の総和が１２以上のもの。（アルキル基
は置換されていてもよい。） Ｘ；　アニオン 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することがで
きる。特に自己顕色性基質とカチオン性ポリマーと被検
液体がいずれも浸透し得る固体担体を含む要素に適用す
ることができる。要素は単一層で構成されててもよく、
また試薬層、反射層、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過層
、係留（ｒｅｆｉｓｔｒａｔｉｏｎ）層、吸水層、支持
体、下塗層および業界公知のその他の層を含む多重層で
あってもよい。

かような分析要素には米国特許第３９９２１５８号およ
び同４０４２３３５号各明細書に開示のものがある。

支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成は、（１）
支持体上に試薬層を兼ねる液体展開層を有するもの （２）支持体上に吸水層、その上に試薬層を兼ねる液体
展開層を有するもの （３）支持体上に試薬層と液体展開層を有するもの （４）支持体上に吸水層、試薬層、液体展開層をこの順
に有するもの （５）支持体上に試薬層、反射層または濾過層、液体展
開層をこの順に有するもの （６）支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、液体展開層
をこの順に有するもの などである。しかし、光透過性・水不透過性支持体、吸
水層および自己顕色性基質を含有する液体展開層を順次
積層一体化してなる一体型多層分析要素とすることが好
ましい。

本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系は、液体
試料中における様々な種類の酵素活性の測定に使用する
ことができる。すなわち、本発明の乾式分析要素は、自
己顕色性基質からパラニトロフエノールを放出させる全
ての酵素の測定が可能である。

さらに、本発明の乾式分析要素は、他の化学反応を上記
検出反応と共役させることにより、前記以外の酵素活性
あるいは物質濃度の測定に用いることも可能である。こ
の場合においては、共役させる化学反応に必要な試薬類
を、上記検出試薬系に含ませる。

例えば酵素標識免疫分析法において酵素標識抗原、酵素
標識抗体、抗原、抗体等反応様式に従って任意に共役反
応試薬を展開層又は展開層の上層につけた補助展開層等
に設置できる。この場合用いられる酵素として好ましい
のはアルカリフォスファターゼ、ガラクトシダーゼ等で
ある。

本発明の乾式分析要素の自己顕色性基質を含有する層に
は、親水性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽性微粒子等
を必要に応じて含有させることができる。

本発明の乾式分析要素の自己顕色性基質を含有する層に
さらに含有させることができる親水性ポリマーの例とし
ては、澱粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよび
これらの誘導体（例、ヒドロキシメチル化およびヒドロ
キシプロピル化等）、アクリルアミド重合体、アクリル
アミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピ
ロリドン重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノ
マーとの共重合体、アクリレート重合体およびアクリレ
ートと各種ビニル性モノマーとの共重合体を挙げること
ができる。上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリ
ドン重合体、アクリルアミド重合体またはセルロース誘
導体が好ましい。

上記親水性ポリマーを、乾式分析要素の自己顕色性基質
を含有する展開層に含有させる場合には、約２８／ｒＪ
から約１５ｇ／ｒｄの範囲で含有させることが好ましい
、上記含有量のうち特に好ましいのは、約２　ｇ／ｒｒ
ｒから約１０ｇ／ｎ（の範囲である。

本発明の乾式分析要素の自己顕色性基質を含有する層に
含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、
ホウ酸塩、燐酸塩やグツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤などの
公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は
ｒ蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊ　（掘尾武−１他著、南
江堂、１９８１）等の公知文献を参考にして選択し、使
用することができる。

本発明の乾式分析要素の自己顕色性基質を含有する層に
はさらに、後述する光遮蔽層に用いられる光遮蔽性微粒
子を含有させることもできる。

自己顕色性基質を含有する層に該基質および必要に応じ
て加えられる親水性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽性
微粒子等を含有させるに際しては、上記試薬等を含有す
る塗布液を展開層の上から塗布または噴霧し乾燥する方
法を用いることができる。

また自己顕色性基質を含有する層が織物、編物、濾紙、
不織布およびガラス繊維濾紙等からなる展開層である場
合には、上記試薬等を含有する溶液に展開層を浸漬した
のち乾燥する方法を用いることができる。また、一体型
多層分析要素とするため、上記のような展開層をラミネ
ートにより積層する場合には、上記のように浸漬した展
開層を乾燥または半乾燥状態で他の層に積層し一体化す
る方法を用いることもできる。

塗布により形成される層、例えばプラッシュポリマ一層
やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体等からなる層の
場合には、この層の塗布液と試薬等の塗布液を混合して
塗布してもよい。

なお、展開層に試薬等を含有させる場合に、いくつかの
試薬毎に異なる方法を用いることもできる。また、いく
つかの試薬毎に数回に分けて行なうこともできる。

本発明において、検出試薬系を含む層は、二つ以上の層
から成ってもよい。この場合に、自己顕色性基質および
カチオン性ポリマーは、全ての層に均一に含有されても
よい。しかし自己顕色性基質は支持体から遠い層に、カ
チオン性ポリマーは支持体に近い層により多く分布させ
ることが好ましい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテ
ート、セルローストリアセテート、セルロースアセテー
トプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０
μｍか一２〇− ら約１ｍｍ、好ましくは約８０．ｃｒｒｎから約３００
μｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明支持体
を挙げることができる。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光反射性支
持体としては、上記ポリマー中に光反射性色材を含有さ
せることにより容易に作成することができる。また、上
記ポリマー等からなる透明支持体表面に光反射性色材を
塗布する、または光反射性色材からなる粘着テープを貼
る等によっても容易に作成することができる。

これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支
持体の上に設けられる吸水層あるいは検出試薬系とカル
ボン酸系補酵素安定剤を含有する層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに
、支持体の表面に物理的あるいは化学的な活性化処理を
施して接着力の向上を図ってもよい。

本発明の乾式分析要素が一体型多層分析要素である場合
には、光透過性・水不透過性支持体の上に（場合によっ
ては下塗層等の他の層を介して）吸水層が設けられる。

本発明の乾式分析要素に備えられる吸水層は親水性結合
剤よりなる層、すなわち水を吸水して膨潤する親水性ポ
リマーを層形成成分として利用している層であることが
好ましい。

吸水層に用いることができる親水性ポリマーは、一般に
は水吸水時の膨潤率が３０℃で約１．５から２０、好ま
しくは約２．５から１５の範囲の天然または合成親水性
ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例として
は、ゼラチン（例、酸処理ゼラチン、税イオンゼラチン
等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロ
キシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、
プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげるこ
とができる。ポリアクリル酸やポリスチレンスルホン酸
等のアニオン性ポリマーは好ましくない。

吸水層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範
囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから
約３０μｍの範囲である。また吸水層は実質的に透明で
あることが好ましい。さらに吸水層には、必要に応じて
界面活性剤（非イオン性、両性が好ましい）や緩衝剤を
含有させることもできる。

本発明に必須のカチオン性ポリマーは、吸水層に含有さ
せることが好ましい、親水性ポリマー全体に対して重量
比で約５％から約７０％までの範囲で含有させるのが適
当であるが、ポリマーの種類により最適の値が選択され
る。

上記吸水層の上には、必要に応じて光遮蔽層を設けるこ
とができる。光遮蔽層は、光遮蔽性、または光遮蔽性と
光反射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単
に光速へい性徴粒子という）が少量の皮膜形成能を有す
る親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透
過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は吸水層にて
発生した検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性
を有する支持体側から反射測光する際に、検出試薬系と
カルボン酸を含有する展開層に点着供給された水性液体
の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色
等を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機
能する。

光遮蔽性と光反射層とを兼ね備えた微粒子の例としては
、二酸化チタン微粒子（ルチン型、アナターゼ型または
ブルツカイト型の粒子径が約０゜１μｍから約１．２μ
ｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウ
ム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光
遮蔽性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブ
ラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができる
。

これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微
粒子が好ましい、特に好ましいのは、アナターゼ型二酸
化チタン微粒子である。

光遮蔽層に用いられる皮膜形成能を有する親水性ポリマ
ーバインダーの例としては、前述の吸水層の製造に用い
られる親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに
、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテート等
を挙げることができ、これらのうちではゼラチン、ゼラ
チン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい、なお、
ゼラチン、ゼラチン誘導体には公知の硬化剤（架橋剤）
を添加することができる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により吸水層の上に塗布し乾燥する
ことにより設けることができる。

また、光遮蔽層を設ける代りに、展開層中に光遮蔽性微
粒子を含有させてもよい。

なお、吸水層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を
介して、展開層を接着しＳ層するために接着層を設けて
もよい、接着層は水で湿潤しているとき、または水を含
んで膨潤したときに展開層を接着することができるよう
な親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層に用
いることができる親水性ポリマーの例としては、吸水層
に用いられると同様な親水性ポリマーがあげられる。こ
れらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリ
ルアミド等が好ましい、接着層の乾燥膜厚は一般に約０
．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１
０μｍの範囲である。なお、接着層は吸水層上以外にも
、他の眉間の接着力を向上させるため所望の層上に設け
てもよい、接着層は親水性ポリマーと、必要によって加
えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支
持体や吸水層等の上に塗布する方法などにより設けるこ
とができる。

展開層は、液体計量作用を有する展開層であることが特
に好ましい。液体計量作用を有するとは、その表面に点
着供給された液体試料を、その中に含有している成分を
実質的に偏在させることなく、横（水平）方向に単位面
積当りほぼ一定量の割合で広げる作用を有することであ
る。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、濾紙、
不織布、織物生地（例、ブロード、ボブリン等の平織等
）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編
、ミラニーズ編等）、ガラス繊維濾紙、プラッシュポリ
マーより形成されるメンブランフィルタ−１あるいはポ
リマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を
用いることができる。これらのうちでは、試薬類の保持
性の点で、織物生地および編物生地に代表される繊維質
層を用いることが好ましい。これらの詳細については特
開昭５５−１６４３５６号、同５７−６６３５９号およ
び同６０−２２２７６９号を参照すればよい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる織物生地ま
たは編物生地は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製
造時、織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着
した油脂類を実質的に除去した織物または編生地が好ま
しい。

上記織物または編物生地を一体型多層分析要素の展開層
として用いる場合には、さらにその織物または編物生地
に特開昭５７−６６３５９号公報に開示された物理的活
性化処理（好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電
処理等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるいは特
開昭５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号
公報に開示された親水性ポリマー含浸処理、特開昭６０
−２２２７７０号に開示された方法等の親水化処理また
はこれらの処理工程を逐次実施することにより織物また
は編物を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。

織物または編物生地からなる一体型多層分析要素の展開
層を前述した吸水層または接着層に接着、積層するには
、特開昭５５−１６４３５６号および特開昭５７−６６
３５９号各公報等に開示の方法に従って作成することが
できる。すなわち、吸水層または接着層の塗布後未乾燥
のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活性剤を
少量含む水）を実質的に均一に供給して層を膨潤させ、
ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤している層
の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層
し一体化する。

また展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィ
ルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号公報
等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状構造物
である場合には特開昭５５−９０８５９号公報等、濾紙
または不織布からなる場合には特開昭５７−１４８２５
０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けることが
できる。

前述した吸水層または接着層の親水性ポリマーバインダ
ーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、層の塗
布後ゼラチン（または誘導体）が未乾燥のゲル状態の間
に上記展開層を構成する材料（織物または編物生地等）
を接着、積層し一体化する方法を採用することができる
。

本発明の乾式分析要素は、自己顕色性基質とカチオン性
ポリマーを含有する層よりなる単一のシートから構成す
ることも可能である。

本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素とした場
合には、−通約１５ｍｍから約３０ｍｒｎの正方形また
はほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特開昭５７−
６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭５
６−１４２４５４号、実開昭５８−３２３５０号および
特開昭５８−５０１１４４号各公報等に開示のスライド
枠等に納めて分析スライドとして用いるのが製造、包装
、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ましい
。

本発明の乾式分析要素は、約５μｌから約３゜μＥ１好
ましくは約８μＦから約１５μ！の水性液体試料を展開
層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５℃の
範囲の実質的に一定の温度でインクベーションする。そ
の後、一方の側から（一体型多層分析要素においては光
透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色等
の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液体
試料中の測定対象成分を分析する。

〔発明の効果〕

本発明によると、パラニトロフエノールを解離する自己
顕色性基質を水保持性担体中に含む乾式水性液分析要素
によって、パラニトロフエノールが充分にまたは実質的
に解離しないｐｎ域に至適１）Ｈを有する酵素に対して
も、充分高い感度で分析を実行することができる。たと
えば、Ｇ５−ＰＮＰやＧ７−ＰＮＰを用いるアミラーゼ
の分析や、パラニトロフエノールフォスフェートを用い
る［１フオスフアターゼの分析において、高い感度を得
ることができる。

〔実施例１〕 セルロースアセテートより成るメンブランフィルタ−Ｆ
Ｍ３００（富士写真フィルム■製）に次の水溶液を含浸
して乾燥した。

次いでこの含浸法フィルターを１０ｍ角に切り出し、両
面粘着テープでプラスチック片に固着して、アミラーゼ
検出用乾式分析要素とした。

これに酵素活性の異なる唾液希釈液又は血清を１０μ！
点着するとやがて黄色に着色し、目視による標準色片と
の比較又は測定波長４００ｎｍの反射濃度針で検量線に
よりアミラーゼ活性を定量できた。

ここで、検量線は次のようにして作成した。

１０種の酵素活性濃度既知の血清１０μｌを点着し、３
７℃にて約５分間反応させる。各々の血清についてこの
間２分および５分の反射濃度を測定し、３分間の発色量
（△ＯＤ）を５分のＯＤより３分のＯＤの差として求め
、各へ〇Ｄ値と各々の酵素活性値と相関させて、検量線
を作成する。

〔実施例２〕 ゼラチン下塗りがされている厚さ１８０μｍのポリエチ
レンテレフタレート無色透明平滑フィルム上に下記の組
成の水溶液を乾燥後の厚さが１０μｍになるように塗布
（１００ｇ／％）　Ｉ、、乾燥する。

次に上記ゼラチン層に約３０　ｇ／ｎｒの割合で水を全
面に均一供給して湿潤させた後、その上にトリコット編
物（ポリエステル製４０ゲージ）を軽（圧力をかけてラ
ミネートし、乾燥させる。

次にこの布上に下記の組成の水溶液を２００ｃｅ／ｒｒ
ｌの割合でほぼ均一に塗布し、乾燥させアミラーゼ測定
用一体型多層分析要素を調製した。

ゼラチン層のボリーコ−（スチレン−Ｎ−メチルモルホ
リニウムメチルスチレン−ジビニルベンゼン）５５：４
３：２を除いた以外は実施例１と同じようにして、α−
アミラーゼ測定用一体型多層分析要素を調製した。これ
を比較用と称する。

実施例２の本発明及び比較例用の分析要素にアミラーゼ
活性がそれぞれ０ＩＩＪ／Ｌ、？２１０／Ｌ、３０８１
１１／Ｌ、８８２１υ／Ｌ、　！　２００１１１／Ｌの
コントロール血清（市販コントロール血清またはそれに
必要に応じてヒトだ液アミラーゼを添加したもの）を１
０μｉ点着し３７℃でインクベーシッンし、３分後から
６分後の間の１分あたりの反射濃度変化を波長４００ｎ
ｍで測定した。

その結果を第２表に示す。

第２表 第２表より明らかなように本発明の発色層にボリーコー
（スチレン−Ｎ−メチルホリニウムメチルスチレンージ
ビニルベンゼン）５５：４３：２を添加したアミラーゼ
測定用分析要素は比較用の分析要素より感度が高いこと
がわかる。

〔参考例〕

実施例２の本発明の多層分析要素及び比較用の多層分析
要素に種々の濃度のパラニトロフェノール（ＰＮＰ）水
溶液を１０μ１点着し、１０分後に反射濃度を４００ｎ
ｍで測定した。

その結果を第３表に示す。

第３表 第３表より明らかなように、ゼラチン層にボリーコー（
スチレン−Ｎ−メチルモルホリニウムメチルスチレン−
ジビニルベンゼン）５５：４３：２を添加したアミラー
ゼ測定用一体型多層分析要素（実施例２の多層分析要素
）は比較用の多層分析に比べ、パラニトロフエノールの
検出感度が高いことがわかる。

〔実施例３〕 下記のようにして酸性ホスファターゼ活性測定用多層分
析要素を作製した。

＋１）　　支持体 厚さ１５０μｍの下塗済ポリエチレンテレフタレートフ
ィルム。

（２）発色層 下記組成の塗布液を、乾燥膜厚が１０μｍになるように
支持体の上に塗布、乾燥した。

３６一 （３）　　緩衝層 発色層の上に、下記組成の塗布液を乾燥膜厚が１０μｍ
になるように塗布し乾燥した。

（４）接着層 前記緩衝層の上に、下記組成の塗布液を乾燥膜厚が５μ
ｍになるように塗布し、乾燥した。

（５）液体展開層 上記接着層の上に０．４％ノニルフエノキシボリグリシ
ドール水溶液を塗布し、次に３６ゲージ５０Ｄポリエチ
レンテレフタレート紡績糸からなるトリコット編物を圧
着して液体展開層とした。

（６）　　自己顕色性基質含浸 上記液体展開層上に下記組成の液を塗布した。

以上の方法により本発明の酸ホスファターゼ活性測定用
一体型分析要素を作製した。

実施例３のボリーコ（スチレン−Ｎ−メチルピペリジニ
ウムメチルスチレン）５５：４５を取り除いた以外は、
全て実施例３と同様にして比較用の酸ホスファターゼ活
性測定用分析要素を調整した。

特開昭５７−６３４５２号公報記載のプラスチックマウ
ントに各々のスライドを封入し、次いで活性値　３００
Ｕ／Ｌ、６００Ｕ／Ｌ及び１２００ｔＪ／Ｌのコントロ
ール血清と人血清由来耐性フォスファターゼとよりｍ製
した基準液を各マウントに１０μｌづつ点着し３７℃に
て、ポリエステルチーブでシールして水分の蒸発を防止
した状態で１０分間インキュベーションを実施しその間
波長４００ｎｍでの反射濃度測光を実施した。

その結果を第４表に示す。表中△０Ｄ（５分−２分）は
点着後５分後と２分後の反射濃度の差を示す。

第４表 比較例では酵素の存在にかかわらず実質上全（吸光度の
変化はなかった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）パラニトロフエノールを解離する自己顕色性基質
   を、水保持性を有する担体中に含み、該基質に対して活
   性を有する酵素の水性液体中の活性を測定するための乾
   式分析要素であつて、パラニトロフエノールをエーテル
   結合又はエステル結合で分子中に有する自己顕色性基質
   とカチオン性ポリマーをそれぞれ水保持性を有する担体
   の少くとも一つに含有する乾式分析要素（該基質と該ポ
   リマーは、同じ担体中に含まれてもよく、互いに液体接
   触関係にある異なる担体中に含まれてもよい）。
2. （２）特許請求の範囲（１）において、乾式分析要素が
   水不滲透性支持体と液体計量作用を有する多孔性液体展
   開層を少くとも有し、前記自己顕色性基質を該液体展開
   層中に含み、かつカチオン性ポリマーを該液体展開層ま
   たは該液体展開層と液体接触関係にある他の水滲透性の
   層に含むことを特徴とする多層乾式分析要素。