DE3642189C2

DE3642189C2 - Trockenes analytisches Element zur Verwendung bei der Analyse einer Flüssigkeit

Info

Publication number: DE3642189C2
Application number: DE3642189A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Amano; Kaoru Terashima; Harumi Katsuyama
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1985-12-10
Filing date: 1986-12-10
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2006-12-11
Also published as: GB8629577D0; GB2183832B; US5077011A; JPS62138198A; JPH0550274B2; DE3642189A1; GB2183832A

Description

Die Erfindung betrifft ein integrales analytisches Element zur Messung der Enzymaktivität in einer wäßrigen Flüssigkeit, welches eine oder mehrere wasserzurückhaltende Schichten be sitzt und wobei das Enzym einen optimalen pH-Wert in einem pH-Bereich, bei dem die Dissoziation des p-Nitrophenols für die Farbbildung ungenügend ist, besitzt.

In den vergangenen Jahren wurden sich selbst entwickelnde Substrate, welche ein p-Nitrophenolpigment dissoziieren kön nen, vielfach verwendet. Insbesondere ist das Amylase-Analy severfahren, bei dem ein Glucosidaseenzym und G5PNP oder G7PNP, die durch Einführung eines p-Nitrophenolpigments (im folgenden als PNP bezeichnet) in Oligosaccharide (wie G5 oder G7) erhalten wurden, verwendet werden, hinsichtlich der Analyse und Genauigkeit besser als das bekannte Pigmentstär keverfahren (beispielsweise "Methods of Enzymatic Analysis", Seite 894, von H.U. Bergmeyer), bei dem ein Pigmentstärke substrat, das durch Färben von Stärke mit einem reaktiven Farbstoff erhalten wurde, wie blaue Stärke oder Amylopectin azur, verwendet wird und wobei die Analyse durchgeführt wird, indem man ein Präzipitat erzeugt, wobei man die Unterschiede in der Molekulargewichtsverteilung ausnutzt. Das Amylase-Analyseverfahren besitzt den Vorteil, daß eine kontinuierli che Monitoranalyse (Geschwindigkeitsanalyse in engem Sinn) durchgeführt werden kann.

p-Nitrophenolpigment ist jedoch ein pH-Indikator, und daher wird seine Absorptionsfähigkeit stark durch den pH-Wert in den Reaktionssystemen beeinflußt. Es besitzt dementsprechend den Nachteil, daß der Dissoziationszustand stark in Abhän gigkeit von dem pH-Wert variiert.

Beispielsweise beträgt der pK-Wert (Logarithmus des rezipro ken Wertes der Dissoziationskonstanten) von p-Nitrophenol 7,2, und weniger als 50% des p-Nitrophenols, welches aus dem Substrat freigesetzt wird, ist bei einem pH-Wert von etwa 7,0 dissoziiert. Dieser pH-Wert ist der optimale pH-Wert für Amylase (vgl. Clinical Pathology, Extraheft Juni, Nr. 55, Seite 205, von Shin Takaya, in japanischer Sprache).

Bei der Messung der Amylaseaktivität unter Verwendung von G5PNP oder G7PNP wird häufig ein Verfahren angewendet, bei dem das freigesetzte p-Nitrophenolpigment vollständig gemäß einer Zweistufenreaktion dissoziiert wird, welche (a) eine enzymatische Reaktion und (b) eine photometrische Messung nach Beendigung der enzymatischen Reaktion durch Zugabe ei ner Lösung mit einem hohen pH-Wert umfaßt. Die Photometrie wird (durch erhöhte Nachweisempfindlichkeit) durchgeführt, wobei die ursprüngliche kontinuierliche Monitoranalysefunk tion geopfert wird.

Selbst wenn das Amylase-Analyseverfahren, bei dem Glucosida seenzym und das modifizierte Oligosaccharid, das durch Ein führung von p-Nitrophenol in Oligosaccharide erhalten wird, in dem trockenen analytischen Element verwendet wird, treten große Nachteile auf, da die Dissoziation des durch die Amy lase freigesetzten p-Nitrophenols und die Glucosidasereaktion nicht zufriedenstellend sind und die Empfindlichkeit niedrig ist. Insbesondere sind in integralen mehrschichtigen analyti schen Elementen die Schichten in fluidem Kontakt miteinan der, und der pH-Wert dieser Schichten ist praktisch gleich, so daß es schwierig ist, die Erfordernisse für den optimalen pH-Wert für Amylase und Glucosidase zu erfüllen wie auch ei ne zufriedenstellende Dissoziation von p-Nitrophenol zu er halten. Das Verfahren, bei dem die zuvor erwähnte zweistufi ge Reaktion angewendet wird, beeinträchtigt die Einfachheit und Geschwindigkeit stark, Vorteile, die für das trockene analytische Verfahren beansprucht werden.

Bei der Messung der Aktivität saurer Phosphatase unter Ver wendung von p-Nitrophenylphosphat als sich selbst entwickeln des Substrat dissoziiert das freigesetzte p-Nitrophenol über haupt nicht, und es tritt keine Farbbildung auf, wenn die Reagenzschicht des integralen mehrschichtigen analytischen Elements auf einen pH-Wert von 4 gepuffert ist, welcher der optimale pH-Wert für Enzyme ist. Wenn die Reagenzschicht auf einem pH-Bereich gehalten wird, in dem p-Nitrophenol dis soziiert und eine Farbe entwickelt, d. h. wenn die Reagenz schicht bei einem pH-Wert von 7,2 oder darüber gehalten wird, findet keine Dissoziation von p-Nitrophenol aus dem Substrat durch das Enzym statt, und p-Nitrophenol entwickelt in kur zer Zeit keine Farbe.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein trockenes analytisches Element der eingangs erwähnten Art bereit zustellen, welches als selbstentwickeln des Substrat aktiv ist und p-Nitrophenol dissoziieren kann, wobei das Substrat in einem wasserzurückhaltenden Träger eingearbeitet ist. Das Verfahren soll dadurch gekennzeich net sein, daß das Element hochempfindlich gegenüber einem Enzym ist, dessen optimaler pH-Wert in einem pH-Bereich liegt, in dem p-Nitrophenol nicht ausreichend dissoziiert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in den Ansprü chen definierte integrale analytische Element gelost.

Die DE 28 34 713 A1 beschreibt ein Element zur Analyse von Flüs sigkeiten, mit einer strahlungsdurchlässigen Reagenzschicht, die für einen vorgegebenen Analyt permeabel ist und ein Mit tel enthält, das in Gegenwart des Analyts eine Reaktion er gibt, die zu einem radiometrisch erfaßbaren Produkt führt, sowie einer porösen, strahlungsblockierenden Schicht, die für den Analyt ebenfalls permeabel ist, bei der zwischen der Rea genzschicht und der porösen strahlungsblockierenden Schicht eine strahlungsdurchlässige, eine Wanderung des erfaßbaren Produkts hemmende Schicht angeordnet ist, die für den Analyt permeabel ist, jedoch die Wanderung des erfaßbaren Produkts zur porösen, strahlungsblockierenden Schicht hemmt. Diese Druckschrift zeigt zwar einen repräsentativen Aufbau eines integralen analytischen Elements, enthält aber keine Hinweise bezüglich der Verwendung von Substraten, die freisetzbares p-Nitrophenol enthalten.

Die DE 28 22 364 A1 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der α-Amylaseaktivität einer Probe, bei dem ein chromogenes Oli gosaccharidsubstrat einer Lösung, die eine bestimmte Proben menge sowie α- und β-Glucosidase enthält, zugesetzt und die Amylaseaktivität durch die Freisetzung des Chromophors be stimmt wird. Der Offenbarungsgehalt dieses Dokuments ist aber auf ein Naßsystem beschränkt, während erfindungsgemäß ein trockenes analytisches Element bereitgestellt wird.

Die DE 28 01 476 A1 und die DE 25 32 918 A1 betreffen trockene ana lytische Elemente zur Verwendung bei der Messung der Enzymak tivität in wäßrigen Flüssigkeiten, wobei die sich bildenden Farbstoffe durch kationische Polymere fixiert werden. Diese Druckschriften enthalten aber keine Hinweise aufanalytische Elemente mit Substraten, die freisetzbares p-Nitrophenol ent halten.

Typische Beispiele für Enzyme, die erfindungsgemäß analysiert werden können, sind in Tabelle I angegeben, wobei jedes sich selbst entwickelnde Substrat, das bei der Analyse jedes Enzyms verwendet wird, ebenfalls als Beispiel angegeben ist. Das zu analysierende Enzym kann allein oder zusammen mit zwei oder mehreren vorliegen, beispielsweise kann ein Gemisch aus Amy lase und Glucosidase vorliegen.

Zusätzlich zu den in Tabelle I aufgeführten kann man als sich selbst entwickelnde Substrate für Amylase p-Phenylglu coside von Oligosacchariden verwenden, in denen die nichtre duzierenden Endgruppen blockiert sind. Beispiele für solche Substrate werden in den japanischen Patentanmeldungen 59(1984)-31699 und 59(1984)-51800 beschrieben.

Tabelle I

Die kationischen Polymeren, welche bei der vorliegenden Er findung verwendet werden können, sind Polymere, welche se kundäre und tertiäre Aminogruppen enthalten, Polymere, die einen stickstoffhaltigen heterocyclischen Molekülteil auf weisen, und Polymere, die quaternäre kationische Gruppen enthalten, mit Molekulargewichten im Bereich von 5000 bis 200 000, insbesondere 10 000 bis 50 000.

Beispiele für solche Polymere sind Vinylpyridinpolymere und kationische Vinylpyridiniumpolymere, die in den US-PS 2 548 564, 2 484 430, 3 148 061 und 3 756 814 und der japa nischen Patentanmeldung 52(1977)-136626 beschrieben werden; mit Gelatine vernetzbare Polymere, die in den US-PS 3 625 694, 3 859 096 und 4 128 538 und der GB-PS 1 277 453 beschrieben werden; kationische Polymere des wäßrigen Sol typs, die in den US-PS 3 958 996, 2 721 852 und 2 798 063 und den japanischen Patentanmeldungen 54(1979)-115228, 54-(1979)-145529 und 54(1979)-126027 beschrieben werden; wasser unlösliche kationische Polymere, die in der US-PS 3 898 088 und der japanischen Patentanmeldung 55(1980)-331 72 beschrie ben werden; reaktive Beizmittel, die eine kovalente Bindung fit Farbstoffen bilden können, die in der US-PS 4 168 976 und der japanischen Patentanmeldung 54(1979)-137333 beschrie ben werden; kationische Polymere, die in den US-PS 3 709 690, 3 788 855, 3 612 182, 3 188 706, 3 557 066, 3 271 117 und 3 271 118 und den japanischen Patentanmeldun gen 50(1975)-71332, 53(1978)-30328, 52(1977)-15528, 53(1978)-125 und 53(1978)-1024 beschrieben werden; und kationische Polymere, die in den US-PS 2 675 316 und 2 882 156 be schrieben werden.

Von diesen werden jene bevorzugt, die aus der hydrophilen Kolloidschicht in andere Schichten praktisch nicht wandern. Beispielsweise sind bevorzugte Polymere solche, die mit ei nem hydrophilen Kolloid der Gelatine vernetzen können, was serunlösliche kationische Polymere und wäßrige Sole (oder Latexdispersionen).

Die folgenden kationischen Polymeren sind besonders bevor zugt:

(1) Polymere mit einer quaternären Ammoniumgruppe und ei ner Gruppe, welche mit Gelatine eine kovalente Bindung bil den kann (beispielsweise Aldehyd-, Chloralkanoyl-, Chloral kyl-, Vinylsulfonyl-, Pyridiniumpropionyl-, Vinylcarbonyl- und Alkylsulfonoxygruppen), wie eine Verbindung der folgen den Formel
(2) Reaktionsprodukte eines Vernetzungsmittels (beispiels weise Bisalkansulfonat oder Bisallensulfonat) mit einem Co polymeren, welches aus einem Monomeren mit sich wiederholen den Einheiten der Formel VII und einer anderen ethylenisch ungesättigten Monomereneinheit besteht, worin R¹ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe bedeu tet; R² Wasserstoff, eine Alkyl- oder eine Arylgruppe bedeu tet; Q eine zweiwertige Gruppe bedeutet; R³, R⁴ und R⁵ Alkyl- oder Arylgruppen bedeuten oder mindestens zwei der Substi tuenten R³, R⁴ und R⁵ zusammen einen heterocyclischen Ring bilden; und X ein Anion bedeutet (die obigen Alkyl- und Aryl gruppen können unsubstituiert oder substituiert sein).
(3) Polymere der Formel VIII: worin x etwa 0,25 bis etwa 5 Mol-% bedeutet, y etwa 0 bis etwa 90 Mol-% bedeutet, z etwa 10 bis etwa 99 Mol-% bedeu tet, A ein Monomeres bedeutet, welches mindestens zwei ethy lenisch ungesättigte Bindungen enthält, B ein copolymerisier bares ethylenisch ungesättigtes Monomeres bedeutet, Q Stick stoff oder Phosphor bedeutet, R¹, R² und R³ Alkyl- oder cy clische Kohlenwasserstoffgruppen bedeuten oder mindestens zwei der Substituenten R¹, R² und R³ zusammen einen Ring bil den (diese Gruppen und der Ring können unsubstituiert oder substituiert sein).
(4) Copolymere, welche aus der Komponente (a) der Formel IX, der Komponente (b) und der Komponente (c) bestehen:
(a) worin X Wasserstoff, eine unsubstituierte oder substituierte Alkylgruppe oder Halogen bedeutet;
(b) Acrylatester;
(c) Acrylnitril.
(5) Wasserunlösliche Polymere, welche eine sich wiederho lende Einheit der Formel x in einem Verhältnis von mindestens 1/3, bezogen auf die Gesamtmenge, enthalten: worin R¹, R² und R³ je eine unsubstituierte oder substituier te Alkylgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Summe der Kohlenstoffatome von R¹, R² und R³ 12 beträgt oder darüber liegt.

Die vorliegende Erfindung kann bei allen bekannten verschie denen trockenen analytischen Elementen verwendet werden. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders für Ele mente geeignet, welche einen festen Träger enthalten, der irgendeines der sich selbst entwickelnden Substrate erlaubt, wobei das kationische Polymere und die zu analysierenden Flüssigkeiten dadurch durchwandern können. Das Element kann aus einer einzigen Schicht bestehen oder mehrere Schichten aufweisen, wie eine Reagenzschicht, eine Reflexionsschicht, eine poröse Ausbreitschicht, eine Lichtabschirmungsschicht, eine Filterschicht, eine Aufzeichnungsschicht, eine Wasser absorptionsschicht, einen Träger, eine Unterschicht und an dere bekannte Schichten. Solche analytischen Elemente werden in den US-PS 3 992 158 und 4 042 335 beschrieben.

Die folgenden Strukturen sind praktisch bevorzugt, wenn ein Träger verwendet wird:

(1) ein Element, welches eine flüssige Ausbreitschicht enthält, die ebenfalls als Reagenzschicht auf dem Träger wirkt;
(2) ein Element solcher Struktur, daß eine wasserabsorbie rende Schicht auf dem Träger vorhanden ist, und eine Flüssig keitsausbreitschicht darauf, die ebenfalls als Reagenzschicht wirkt, vorgesehen ist;
(3) ein Element, das eine Reagenzschicht und eine Flüssig keitsausbreitschicht auf dem Träger umfaßt;
(4) ein Element, das eine Wasserabsorptionsschicht, eine Reagenzschicht und eine Flüssigkeitsausbreitschicht in die ser Reihenfolge auf einem Träger umfaßt;
(5) ein Element, das eine Reagenzschicht, eine Reflexions schicht oder eine Filterschicht und eine Flüssigkeitsaus breitschicht in dieser Reihenfolge auf dem Träger umfaßt; und
(6) ein Element, das eine Wasserabsorptionsschicht, eine Reagenzschicht, eine Filterschicht und eine Flüssigkeitsaus breitschicht in dieser Reihenfolge auf dem Träger umfaßt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des analytischen Ele ments gemäß der Erfindung liegt das analytische Element in Form eines mehrschichtigen analytischen Elements vor, wel ches einen wasserundurchlässigen Träger und eine poröse Flüs sigkeitsausbreitschicht mit einer Flüssigkeitsmeßwirkung um faßt, wobei die poröse Flüssigkeitsausbreitschicht das sich selbst entwickelnde Substrat und das kationische Polymere enthält.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des analyti schen Elements gemäß der Erfindung liegt das analytische Ele ment in Form eines mehrschichtigen analytischen Elements vor, welches einen wasserundurchlässigen Träger, eine Wasserhal teschicht und eine poröse Flüssigkeitsausbreitschicht mit einer Flüssigkeitsmeßwirkung umfaßt, wobei die Wasserzurück halteschicht so angeordnet ist, daß sie einen Flüssigkeits kontakt mit der Ausbreitungsschicht ermöglicht, und wobei die poröse Flüssigkeitsausbreitschicht das sich selbst ent wickelnde Substrat enthält und die Wasserzurückhalteschicht das kationische Polymere enthält.

Nachweismittel, welche in trockenen analytischen Elementen nach der Erfindung vorhanden sind, können für die Messung der Aktivität der verschiedenen Enzyme in den flüssigen Pro ben verwendet werden. Die erfindungsgemäßen trockenen analy tischen Elemente können zur Messung der Aktivität irgendei nes Enzyms verwendet werden, welches bewirkt, daß das sich selbst entwickelnde Substrat p-Nitrophenol freisetzt.

Das trockene analytische Element kann zur Messung der Kon zentration von Substanzen oder zur Aktivitätsbestimmung ei nes anderen Enzyms als oben angegeben verwendet werden, wenn die obige Nachweisreaktion mit einer anderen chemischen Reaktion gekoppelt ist. In diesem Fall werden die Reagenzien, die zur chemischen Reaktion erforderlich sind und für die Kupplung eingesetzt werden, in das Nachweisreagens eingear beitet.

Beispielsweise können gekuppelte Reaktionsreagenzien in die Ausbreitschicht oder eine Hilfsausbreitschicht, die auf der Ausbreitschicht vorgesehen ist, entsprechend dem Reaktions typ eingearbeitet werden, wie ein mit Enzym markiertes Anti gen, mit Enzym markierter Antikörper, mit Enzym markiertes Antigen, Antikörper etc. bei der mit Enzym markierten Immu noanalyse. Bevorzugte Enzyme sind alkalische Phosphatase und Galactosidase.

Gewünschtenfalls können ein hydrophiles Polymeres, ein Puf fermittel oder feine Lichtabschirmungsteilchen in die Schicht, welche das sich selbst entwickelnde Substrat enthält, des er findungsgemäßen analytischen Elements eingearbeitet werden.

Beispiele für hydrophile Polymere sind Stärke, Cellulose, Agarose, Gelatine und ihre Derivate (beispielsweise hydroxy methylierte Derivate, hydroxypropylierte Derivate), Acryl amidpolymere, Copolymere von Acrylamid mit verschiedenen Vi nylmonomeren, Vinylpyrrolidonpolymere, Copolymere aus Vinyl pyrrolidon mit verschiedenen Vinylmonomeren, Acrylatpolymere und Copolymere aus einem Acrylat mit verschiedenen Vinylmo nomeren. Von diesen sind Vinylpyrrolidonpolymere, Acrylamid polymere und Cellulosederivate bevorzugt.

Wenn das hydrophile Polymere in die Ausbreitschicht, welche das sich selbst entwickelnde Substrat enthält, eingearbeitet wird, wird das Polymere in einer Menge von etwa 2 bis etwa 15 g/m² , bevorzugt etwa 2 bis 10 g/m², verwendet.

Beispiele für Puffermittel, welche in die Schicht, die das sich selbst entwickelnde Substrat des trockenen analytischen Elements gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, eingear beitet werden können, sind die an sich bekannten Puffermit tel, wie Carbonate, Borate, Phosphate und Good′s-Puffermit tel. Diese Puffermittel können entsprechend ausgewählt wer den, wobei auf die Literaturstelle "Experimental Method for Protein and Enzyme", in japanischer Sprache, von T. Horio u. a. (Nankodo, 1981), Bezug genommen wird.

Die Schicht, welche das sich selbst entwickelnde Substrat enthält, kann feine Lichtabschirmungsteilchen enthalten, wel che ebenfalls in der Lichtabschirmungsschicht, die im fol genden beschrieben wird, verwendet werden.

Das sich selbst entwickelnde Substrat und gegebenenfalls das hydrophile Polymere, das Puffermittel oder die Lichtabschir mungsteilchen können in die Schicht, in der das Substrat enthalten ist, eingearbeitet werden, indem man auf die Aus breitschicht eine Beschichtungslösung, welche das Reagens etc. enthält, aufträgt oder damit besprüht. Wenn die Schicht, welche das sich selbst entwickelnde Substrat ent hält, die Ausbreitschicht ist, welche aus gewebtem Textilma terial, gestricktem Textilmaterial, nichtgewebtem Textilma terial oder Glasfaserfilterpapier besteht, kann die Ausbrei tungsschicht in eine Lösung, welche die Reagenzien etc. ent hält, eingetaucht und getrocknet werden. Wenn die Ausbreit schicht unter Bildung eines integralen mehrschichtigen ana lytischen Elements laminiert wird, kann die eingetauchte Ausbreitschicht in trockenem Zustand oder in halbtrockenem Zustand auf die andere Schicht laminiert werden.

Wenn die Schicht, die durch Beschichten gebildet wird, eine Schicht ist, welche aus einer gebürsteten Polymerschicht be steht oder eine dreidimensionale Gitterstruktur aus Mikrokü gelchen aufweist, kann ein Gemisch aus einer Beschichtungs lösung für diese Schicht und der obigen Beschichtungslösung, welche die Reagenzien enthält, aufgebracht werden.

Schichten, die die Nachweismittel enthalten, können aus zwei oder mehreren Schichten bei der vorliegenden Erfindung be stehen. Das sich selbst entwickelnde Substrat und das kationi sche Polymere können einheitlich in alle Schichten eingear beitet sein. Es ist jedoch bevorzugt, daß mehr sich selbst entwickelndes Substrat in einer Schicht eingearbeitet ist, welche recht weit von dem Träger entfernt ist, und daß mehr kationisches Polymeres in einer Schicht verteilt ist, die nahe am Träger liegt.

Beispiele für wasserundurchlässige lichtdurchlässige Träger, die in dem erfindungsgemäßen trockenen analytischen Element verwendet werden, umfassen einen transparenten Film oder ei ne Folie, die etwa 50 µm bis etwa 1 mm, bevorzugt etwa 80 bis etwa 300 µm, dick sind, hergestellt aus einem Polymeren, wie Polyethylenterephthalat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol und Celluloseester (beispielsweise Cellulosedi acetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatpropionat etc.).

Ein lichtreflektierender Träger, welcher in dem erfindungs gemäßen Element verwendet werden kann, kann leicht herge stellt werden, indem man einen lichtreflektierenden Farb stoff in das Polymere einarbeitet. Alternativ kann der Trä ger hergestellt werden, indem man das lichtreflektierende Farbmaterial auf die Oberfläche des transparenten Trägers, welcher aus dem Polymeren hergestellt worden ist, anwendet oder indem man ein druckempfindliches Klebstoffband, welches den Farbstoff enthält, auf die Oberfläche des Trägers klebt.

Man kann eine Unterschicht auf dem Träger vorsehen, um die Adhäsion zwischen dem Träger und der Wasserabsorptionsschicht zu verbessern, oder man kann eine Schicht, welche ein Nach weisreagens und einen Carbonsäurecoenzymstabilisator ent hält, auf dem Träger vorsehen. Anstatt daß man eine Unter schicht vorsieht, kann die Oberfläche des Trägers durch phy sikalische oder chemische Behandlung zur Verbesserung der Adhäsion aktiviert werden.

Wenn das erfindungsgemäße trockene analytische Element ein integrales mehrschichtiges analytisches Element ist, wird eine Wasserabsorptionsschicht auf dem wasserundurchlässigen lichtdurchlässigen Träger vorgesehen (gegebenenfalls unter brochen durch eine andere Schicht, wie eine Unterüberzugs schicht). Bevorzugt sollte die Wasserabsorptionsschicht des trockenen analytischen Elements gemäß der vorliegenden Erfin dung eine Schicht sein, welche ein hydrophiles Bindemittel enthält, d. h. eine Schicht, welche als Schichtbildungskompo nente ein hydrophiles Polymeres enthält, welches unter Quel lung Wasser absorbiert.

Das hydrophile Polymere, das in der Wasserabsorptionsschicht verwendet wird, ist ein natürliches oder synthetisches hydro philes Polymeres, welches ein Quellverhältnis von etwa 1,5 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 2,5 bis 15, bei 30°C zeigt, wenn das Polymere Wasser absorbiert. Beispiele für hydrophi le Polymere sind Gelatine (beispielsweise mit Säure verarbei tete Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), Gelatinederiva te (beispielsweise phthalatisierte Gelatine, hydroxyacrylat gepfropfte Gelatine etc.), Agarose, Pullulan, Pullulanderi vate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrroli don. Anionische Polymere, wie Polyacrylsäure und Polystyrol sulfonsäure, sind nicht bevorzugt.

Die trockene Dicke der Wasserabsorptionsschicht liegt bevor zugt im Bereich von etwa 1 µm bis etwa 100 µm, besonders be vorzugt etwa 3 µm bis etwa 30 µm. Es ist bevorzugt, daß die Wasserabsorptionsschicht im wesentlichen transparent ist. Gegebenenfalls kann die Wasserabsorptionsschicht ein ober flächenaktives Mittel (nichtionische und ampholytische ober flächenaktive Mittel sind bevorzugt) und ein Puffermittel enthalten.

Vorzugsweise wird das kationische Polymere, welches ein we sentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist, in die Wasserabsorptionsschicht eingearbeitet. Das kationische Polymere wird in einer Menge von etwa 5 bis etwa 70 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des hydrophilen Polymeren, ver wendet, aber die Menge variiert in Abhängigkeit vom Typ des Polymeren.

Gewünschtenfalls kann man auf der Wasserabsorptionsschicht eine Lichtblockierungsschicht vorsehen. Die Lichtblockie rungsschicht bzw. Lichtabschirmungsschicht ist eine was serpermeable Schicht, in der feine Teilchen oder ein feines Pulver mit Lichtblockierungseigenschaften oder Lichtblockie rungs- und Lichtreflexionseigenschaften (die im folgenden einfach als Lichtblockierungsteilchen bezeichnet werden) in einer geringen Menge aus einem filmbildenden hydrophilen Po lymerbindemittel eingearbeitet sind. Die Lichtblockierungs schicht wirkt als Lichreflexionsschicht oder als Hintergrund schicht wie auch als Blocker für die Farbe einer wäßrigen Flüssigkeit, die auf der Ausbreitungsschicht verteilt wurde, welche das Nachweismittel und eine Carbonsäure enthält, wie das Hämoglobinrot in einer Gesamtblutprobe, wenn eine nach weisbare Änderung (eine Farbänderung, eine Farbbildung etc.) in der Wasserabsorptionsschicht von der Seite des Lichttrans missionsträgers durch Reflexionsphotometrie gemessen wird.

Beispiele für Lichtblockierungs- und Lichtreflexionsteilchen sind feine Titandioxidteilchen (mikrokristalline Teilchen mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis etwa 1,2 µm des Ru tiltyps, des Anatastyps und des Brookittyps), feine Barium sulfatteilchen und feine Aluminiumteilchen oder -flocken. Beispiele für feine lichtblockierende Teilchen sind Carbon Black (Kohlenstoff), Gas-Black und Kohlenstoffmikroperlen. Von diesen sind feine Titandioxidteilchen und feine Barium sulfatteilchen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind feine Ti tandioxidteilchen des Anatastyps.

Beispiele für hydrophile polymere Bindemittel, die in der Lichtblockierungsschicht verwendet werden, sind schwach hy drophile Polymere, wie regenerierte Cellulose und Cellulose acetat wie auch hydrophile Polymere, die in der Wasserabsorp tionsschicht verwendet werden. Von diesen sind Gelatine, Ge latinederivate und Polyacrylamid bevorzugt. Gelatine und Ge latinederivate können zusammen mit bekannten Härtungsmitteln (Vernetzungsmitteln) verwendet werden.

Die Lichtblockierungsschicht kann auf solche Weise vorgese hen sein, daß eine wäßrige Dispersion, welche die feinen Lichtblockierungsteilchen und das hydrophile Polymere ent hält, auf die Wasserabsorptionsschicht aufgetragen wird und dann nach an sich bekannten Verfahren getrocknet wird. An statt daß man eine Lichtblockierungsschicht vorsieht, kön nen die feinen Lichtblockierungsteilchen in die Ausbreitungs schicht eingearbeitet werden.

Man kann eine Klebstoffschicht auf der Wasserabsorptions schicht vorsehen, wobei gegebenenfalls andere Schichten, wie eine Lichtblockierungsschicht, dazwischen liegen können, um die Ausbreitschicht festkleben zu können. Die Klebstoff schicht wird bevorzugt aus einem hydrophilen Polymeren ge bildet, welches die Ausbreitschicht an die andere Schicht klebt, während das Polymere mit Wasser benetzt oder gequol len wird. Beispiele für hydrophile Polymere sind solche, wie sie in der Wasserabsorptionsschicht verwendet werden. Von diesen sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid be vorzugt. Die trockene Dicke der Klebstoffschicht liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 µm bis etwa 20 µm, bevor zugt etwa 1 µm bis etwa 10 µm. Gewünschtenfalls kann eine Klebstoffschicht auf anderen Schichten wie auch auf der Was serabsorptionsschicht vorhanden sein, um das Verkleben der Schichten zu erleichtern. Die Klebstoffschicht kann auf sol che Weise hergestellt werden, daß eine wäßrige Lösung, wel che das hydrophile Polymere und gegebenenfalls andere Mittel, wie oberflächenaktive Mittel, enthält, auf den Träger, die Wasserabsorptionsschicht oder andere Schichten aufgebracht wird.

Die Ausbreitschicht besitzt bevorzugt eine Flüssigkeitsmeß wirkung. Der Ausdruck "Flüssigkeitsmeßwirkung" bedeutet ei ne Funktion, die das Ausbreiten der Flüssigkeitsprobe auf der Ausbreitschicht auf solche Weise erlaubt, daß die ausge breitete Fläche der Flüssigkeit ungefähr im Verhältnis zu der Menge der Flüssigkeit steht, wenn die Flüssigkeit ange wendet wird.

Beispiele für Materialien für die Matrix der Ausbreitschicht sind Filterpapier, nichtgewebtes Flächengebilde, gewebtes Flächengebilde (beispielsweise einfach gewebte Textilmate rialien, wie Stoffe aus Kammgarn (broadcloth) und Popeline), gestricktes bzw. gewirktes Flächengebilde (beispielsweise gewirktes bzw. gestricktes Trikottuch, gestricktes bzw. ge wirktes Doppeltrikottuch und gestricktes bzw. gewirktes Mai länder Tuch), Glasfaserfilterpapier, Membranfilter, welches aus streichfähigem Polymeren hergestellt wurde, und dreidi mensionale Gitterstrukturen, welche aus polymeren Mikroper len hergestellt wurden. Von diesen sind gewebte Textilmate rialien bzw. Flächengebilde und gestrickte bzw. gewirkte Flächengebilde bzw. Textilmaterialien bevorzugt, da eine fa serförmige Schicht der gewebten oder gestrickten bzw. gewirk ten Flächengebilde bzw. Textilmaterialien die Reagenzien gut zurückhalten kann. Solche bevorzugten Schichten werden im einzelnen in den japanischen Patentanmeldungen 55(1980)-164356, 57(1982)-66359 und 60(1985)-222769 beschrieben.

Der Ausdruck "Flächengebilde " umfaßt in der vorliegenden An meldung jegliche Art von Textilmaterial. Der Ausdruck "ge strickte Materialien" umfaßt auch gewirkte Materialien. Als gewebtes Flächengebilde und gestricktes Flächengebilde, die in dem erfindungsgemäßen trockenen analytischen Element ver wendet werden, sind Flächengebilde bevorzugt, von denen ab geschiedene Öle und Fette im wesentlichen durch eine Entfet tungsbehandlung entfernt werden können, wenn das Garn oder Flächengebilde hergestellt wird oder das Stricken durchge führt wird.

Wenn das gewebte Flächengebilde oder das gestrickte Flächen gebilde in der Ausbreitungsschicht des integralen mehrschich tigen analytischen Elements verwendet wird, kann das Flächen material bearbeitet werden, damit es hydrophiler wird, um die Adhäsion der darunter liegenden Schicht (nahe am Träger) zu verbessern. Beispiele für solche Verfahren, gemäß denen Flächenmaterialien hydrophil gemacht werden, sind physikali sche Aktivierungsverfahren (bevorzugt ein Glühentladungsver fahren oder ein Coronaentladungsverfahren), wie in der japa nischen Patentanmeldung 57 (1982)-66359 beschrieben, wobei mindestens eine Seite des Tuches behandelt wird, ein hydro philes Polymerimprägnierverfahren, wie es in den japanischen Patentanmeldungen 55(1980)-164356 und 57(1982)-66359 be schrieben wird, und ein Verfahren, das in der japanischen Pa tentanmeldung 60(1985)-222770 beschrieben wird. Diese Ver fahren können entweder allein oder kombiniert durchgeführt werden.

Bei der Herstellung des integralen mehrschichtigen analyti schen Elements kann die Ausbreitungsschicht, welche aus ge webtem Flächengebilde oder gestricktem Flächengebilde be steht, auf die Wasserabsorptionsschicht oder die Klebstoff schicht entsprechend den Verfahren laminiert werden, wie sie in den japanischen Patentanmeldungen 55(1980)-164356 und 57-(1982)-66359 beschrieben werden. Beispielsweise kann das ge webte oder gestrickte Flächengebilde auf die Wasserabsorp tionsschicht oder die Klebstoffschicht laminiert werden, während man einheitlich darauf gelinden Druck anwendet, wo bei die Schicht noch naß ist, nachdem sie aufgetragen wurde oder mit Wasser benetzt oder gequollen wurde (oder mit Was ser, welches eine geringe Menge eines oberflächenaktiven Mittels enthält), wobei dies nach dem Trocknen erfolgt.

Die Ausbreitungsschicht, welche aus einem streichfähigen Po lymeren oder Membranfilter besteht, kann entsprechend dem Verfahren hergestellt werden, wie es in der japanischen Pa tentanmeldung 53(1978)-21677 beschrieben wird, diejenige, die aus dreidimensionaler Gitterstruktur hergestellten Mi kroperlen besteht, kann entsprechend dem Verfahren herge stellt werden, wie es in der japanischen Patentanmeldung 55-(1980)-90859 beschrieben wird, und die, welche aus Filterpa pier oder nichtgewebtem Flächenmaterial besteht, kann ent sprechend dem Verfahren hergestellt werden, wie es in der japanischen Patentanmeldung 57(1982)-148250 beschrieben wird.

Wenn das hydrophile Polymerbindemittel für die Wasserabsorp tionsschicht oder die Klebstoffschicht Gelatine oder ein De rivat davon ist, kann ein Material (gewebtes Flächengebilde oder gestricktes Flächengebilde) für die Ausbreitungsschicht auf die Schicht laminiert werden, während Gelatine(oder ein Derivat) noch in Form des ungetrockneten Gels nach dem Be schichten vorliegt.

Es ist möglich, daß das trockene erfindungsgemäße analyti sche Element aus einem einzigen Blatt bzw. einer einzigen Platte besteht, welche aus einer Schicht besteht, die das sich selbst entwickelnde Substrat und das kationische Poly mere umfaßt.

Wenn das erfindungsgemäße trockene analytische Element in Form eines integralen mehrschichtigen analytischen Elements vorliegt, ist es bevorzugt wegen der Herstellung, des Ver packens, des Transports, des Lagerns und des Meßvorgangs, daß das Element in Stücke von 15 bis 30 mm² oder Kreise mit einem Durchmesser von 15 bis 30 mm geschnitten wird und in ein Rähmchen bzw. Diarähm chen gelegt wird, wobei ein analytisches Dia entsteht, wie es in den japanischen Patentanmeldungen 57(1982)-63452 und 54(1979)-156079, den japanischen Gebrauchsmusteranmeldungen 56(1981)-142454 und 58(1983)-32350 und der japanischen Pa tentanmeldung 58(1983)-501144 beschrieben wird.

Etwa 5 bis etwa 30 µl, bevorzugt etwa 8 bis etwa 15 µl, einer wäßrigen flüssigen Probe werden auf der Ausbreitschicht des trockenen analytischen Elements nach der Erfindung ausgestri chen. Gegebenenfalls wird das analytische Element bei einer im wesentlichen konstanten Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 45°C inkubiert. Eine nachweisbare Änderung wie eine Änderung der Farbe oder Farbbildung innerhalb des Elements wird von einer Seite des Elements (von der Seite des licht durchlässigen Trägers, wenn das integrale mehrschichtige ana lytische Element verwendet wird) durch Reflexionsphotometrie gemessen, und eine Substanz, die analysiert wird (Analyt in der flüssigen Probe), wird nach dem Prinzip der Kolorimetrie analysiert.

Das Enzym mit einem optimalen pH-Wert im pH-Bereich, in dem p-Nitrophenol ungenügend dissoziiert oder im wesentlichen nicht dissoziiert, kann mit ausreichend hoher Empfindlich keit analysiert werden, indem man das erfindungsgemäße troc kene analytische Element zur Verwendung bei der Analyse von wäßrigen Flüssigkeiten verwendet, wobei das Element einen wasserzurückhaltenden Träger aufweist, der das sich selbst entwickelnde Substrat enthält, welches p-Nitrophenol disso ziieren kann. Die Analyse von Amylase unter Verwendung von G5-PNP oder G7-PNP oder die Analyse von saurer Phosphatase unter Verwendung von p-Nitrophenolphosphat kann mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ("M" bedeutet im folgenden "mol l^-1").

Beispiel 1

Ein Membranfilter FM 300 (hergestellt von Fuji Photo Film CO., Ltd.), welches aus Celluloseacetat besteht, wird mit einer wäßrigen Lösung, welche die folgenden Bestandteile ent hält, imprägniert und getrocknet.

p-Nitrophenyl-α-D-maltheptaosid: 100 mg
α-Glucosidase: 150 U
0,5 M Phosphatpuffermittel (pH 7,0): 10 ml
Poly-co-(styrol-N-methylmorpholinium-methylstyroldivinylbenzol) 55 : 43 : 2 (50% Latexlösung): 2 ml

Das entstehende imprägnierte Filter wird in Stücke von 10 mm² geschnitten, und jedes Stück wird auf einem Kunst stoffstück mittels eines doppeltbeschichteten Klebstoffban des geklebt, wobei ein trockenes analytisches Element erhal ten wird, welches beim Nachweis von Amylase verwendet werden kann.

10 µl von jedem der Seren oder verdünnt mit Salivalösungen (Salzlösungen), welche Enzym mit unterschiedlichen Konzentra tionen enthalten, werden auf das Element aufgebracht, welches sich dann gelb färbt. Die Amylaseaktivität konnte visuell durch Vergleich mit einer Standardfarbe bestimmt werden, oder die Aktivität konnte mittels einer Eichkurve mit einem Refle xionsdensitometer bei einer Meßwellenlänge von 400 nm bestimmt werden.

Die Eichkurve wird wie folgt hergestellt.

10 µl von je zehn Arten von Serum, welche Enzym bekannter Konzentrationen enthalten, werden auf dem Element abgeschie den und bei 37°C während etwa 5 Minuten umgesetzt. Die Re flexionsdichte jedes Serums wird nach Beendigung der Inkuba tion während zwei Minuten und fünf Minuten gemessen. Die Menge (ΔOD) der Farbbildung während drei Minuten wird als Unterschied zwischen den OD-Werten von drei Minuten und fünf Minuten gemessen. Jeder der ΔOD-Werte wird mit den Enzymak tivitätswerten in Korrelation gebracht, wobei die Eichkurve erhalten wird.

Beispiel 2

Die Oberfläche eines farblosen transparenten glatten Poly ethylenterephthalatfilms mit einer Gelatineunterschicht und einer Dicke von 180 µm wird mit einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung so beschichtet, daß man eine troc kene Filmdicke von 10 µm (in einer Beschichtungsmenge von 100 g/m²) erhält, und der beschichtete Film wird getrocknet.

Gelatine: 300 g
Oberflächenaktives Mittel 10G (Olin Corp.): 5 g
Poly-co-(styrol-N-methylmorpholinium-methylstyroldivinylbenzol), Polymerisationsverhältnis 55 : 43 : 2 (15% Latexlösung): 280 g
Wasser: 2150 g

(Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wird mit verdünnter NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt.)

Die obige Gelatineschicht wird einheitlich benetzt, indem man Wasser in einer Menge von etwa 30 g/m² auf die gesamte Oberfläche aufbringt. Ein gestricktes bzw. gewirktes Trikot flächengebilde (hergestellt aus Polyester, 40 gauges) wird darauf bei geringem Druck laminiert, und das entstehende La minat wird getrocknet.

Die Oberfläche des Flächengebildes wird einheitlich mit ei ner wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung in einer Beschichtungsmenge von 200 ml/m² beschichtet und getrocknet, wobei man ein integrales mehrschichtiges analytisches Element zur Messung der Amylase erhält.

p-Nitrophenyl-α-D-maltheptaosid: 0,6 g
α-Glucosidase: 160 mg
NaCl: 90 mg
Wasser: 17 g
Kaliumphosphat: 0,6 g (pH 7,0)

Zu Vergleichszwecken wird ein integrales mehrschichtiges analytisches Element zur Messung von α-Amylase auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, ausgenom men, daß das Poly-co-(styrol-N-methylmorpholiniummethylsty roldivinylbenzol) 55 : 43 : 2 in der Gelatineschicht weggelas sen wurde.

10 µl von jedem der Kontrollseren (im Handel erhältliches Kontrollserum oder solche, die gegebenenfalls humane Saliva amylase dazu zugegeben enthalten) mit einer Amylaseaktivität von 0, 72, 308, 882 und 1200 IU/L werden auf jedes der ana lytischen Elemente des Beispiels 2 entsprechend der Erfin dung und dem Vergleichsbeispiel abgeschieden. Die Elemente werden bei 37°C inkubiert. Die Änderung in der Reflexions dichte pro Minute im Verlauf einer Zeit von drei Minuten bis sechs Minuten wird mit einem Licht von 400 nm gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Aus Tabelle II folgt, daß das analytische Element für die Messung der Amylase, erhalten durch Zugabe von Poly-co-(sty rol-N-methylmorpholiniummethylstyroldivinylbenzol) 55 : 43 : 2 zu der Farbbildungsschicht gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Empfindlichkeit besitzt als das analytische Ver gleichselement.

Bezugsbeispiel

10 µl jeder der wäßrigen Lösungen, welche p-Nitrophenol (PNP) in verschiedenen Konzentrationen enthalten, wird auf jedem der mehrschichtigen analytischen Elemente von Beispiel 2 ge mäß der vorliegenden Erfindung und dem Vergleichsbeispiel abgeschieden. Nach zehn Minuten wird die Reflexionsdichte mit einem Licht von 400 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß das integrale mehr schichtige analytische Element (Beispiel 2) zur Messung von Amylase, erhalten durch Zugabe von Poly-co-(styrol-N-methyl morpholiniummethylstyroldivinylbenzol) zu der Gelatine schicht eine höhere Nachweisempfindlichkeit besitzt im Ver gleich zu derjenigen des Vergleichselements.

Beispiel 3

Ein mehrschichtiges analytisches Element zur Messung von sau rer Phosphataseaktivität wird auffolgende Weise hergestellt.

(1) Träger

Ein mit einer Unterschicht versehener Polyethylenterephtha latfilm von 150 µm Dicke.

(2) Farbbildungsschicht

Die Oberfläche des Trägers wird mit einer Beschichtungslö sung der folgenden Zusammensetzung derart beschichtet, daß der trockene Film 10 µm dick erhalten wird. Dann wird getrocknet.

Alkalibehandelte entionisierte Gelatine: 40 g
Wasser: 642,5 g
Nonylphenoxypolyglycidol: 4,5 g
Poly-co-(styrol-N-methylpiperidiniummethylstyrol)polymeres 55 : 45: 250 g

(3) Pufferschicht

Die Oberfläche der Farbbildungsschicht wird mit einer Be schichtungslösung der folgenden Zusammensetzung in einer solchen Menge bestrichen, daß ein trockener Film mit einer Dicke von 10 µm erhalten wird, und dann wird getrocknet.

Entionisierte Gelatine: 96 g
Nonylphenoxypolyglycidol: 5,5 g
Citratpufferlösung (pH 5,0) (0,1 mol/l): 800 g
1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan: 2 g

(4) Klebstoffschicht

Die Oberfläche der Pufferschicht wird mit einer Beschich tungslösung der folgenden Zusammensetzung auf solche Weise beschichtet, daß man einen trockenen Film von 5 µm Dicke er hält, und dann wird getrocknet.

Gelatine: 40 g
Wasser: 934,6 g
Nonylphenoxypolyglycidol: 4,3 g

(5) Flüssigkeitsausbreitschicht

Die Oberfläche der Klebstoffschicht wird mit einer wäßrigen Lösung aus 0,4% Nonylphenoxypolyglycidol beschichtet. Ein aus Polyethylenterephthalat bestehendes gesponnenes Garn (50 D, 36 gauges) wird darauf unter Druck unter Bildung ei ner flüssigen Ausbreitschicht laminiert.

(6) Imprägnierung des sich selbst entwickelnden Substrats

Eine Lösung der folgenden Zusammensetzung wird auf die flüs sige Ausbreitschicht aufgetragen.

p-Nitrophenylphosphatdicyclohexylaminsalz: 30 mmol
Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von 100 000: 5 g
Ethanol: 20 g
Aceton: 25 g

Ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die Messung der sauren Phosphataseaktivität entsprechend der Er findung wird gemäß der oben beschriebenen Art hergestellt.

Zum Vergleich wird ein analytisches Element für die Messung der sauren Phosphataseaktivität auf gleiche Weise wie in Bei spiel 3 beschrieben hergestellt, ausgenommen, daß Poly-co- (styrol-N-methylpiperidiniummethylstyrol) 55 : 45 weggelassen wurde.

Jedes Blättchen wurde in einen Plastikrahmen, wie er in der japanischen Patentanmeldung 57(1982) -63452 beschrieben wur de, befestigt. 10 µl jeder der Standardlösungen mit einem Aktivitätswert von 300, 600 und 1200 U/L, hergestellt aus Kontrollserum und resistenter Phosphatase, welche aus Human serum stammt, wird auf jedes Dia aufgetragen, und das Ele ment wird bei 37°C während zehn Minuten inkubiert, während verhindert wurde, daß Wasser verdampfte, indem man das Dia mit einem Polyesterband abdichtete. Während der Inkubation wird die Reflexionsdichte mit einem Licht mit einer Wellen länge von 400 nm gemessen.

In Tabelle IV sind die Ergebnisse aufgeführt. ΔOD bedeutet einen Unterschied in der Reflexionsdichte zwischen 5 Minuten Inkubation und 2 Minuten Inkubation nach dem Auftragen.

Tabelle IV

In der Absorption des Vergleichsbeispiels wird nur eine ge ringe Änderung beobachtet, obgleich Enzym vorhanden ist.

Claims

1. Integrales analytisches Element zur Messung der Enzym aktivität in einer wäßrigen Flüssigkeit, welches eine oder mehrere wasserzurückhaltende Schichten besitzt und wobei das Enzym einen optimalen PH-Wert in einem pH-Bereich, bei dem die Dissoziation des p-Nitrophenols für die Farbbildung un genügend ist, besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichten ein sich selbst entwickelndes Substrat mit einer p-Nitrophenolgruppe, gebunden an dessen Molekülstruk tur über eine Etherbindung oder eine Esterbindung, und ein kationisches Polymeres enthalten, wobei das sich selbst ent wickelnde Substrat und das kationische Polymere in die glei che wasserzurückhaltende Schicht eingearbeitet sind oder wo bei sie getrennt in unterschiedliche wasserzurückhaltende Schichten eingearbeitet sind, welche so angeordnet sind, daß die Schichten Flüssigkeitskontakt miteinander haben.

2. Integrales analytisches Element nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß das kationische Po lymere eine quaternäre Ammoniumgruppe und eine Gruppe, wel che eine kovalente Bindung mit Gelatine bilden kann, ent hält.

3. Integrales analytisches Element nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, daß das kationische Polymere Poly-co-(styrol-N-methylmorpholiniummethylstyrol divinylbenzol) oder Poly-co-(styrol-N-methylpiperidinium methylstyrol) ist.